Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki

Nasze badania dotyczą mechanizmów molekularnych leżących u podstaw dysfunkcji komórek macierzystych w procesie starzenia się i choroby. Naszym celem jest zrozumienie, w jaki sposób komórki macierzyste i progenitorowe oddziałują z innymi komórkami w mikrośrodowisku mięśniowym, aby osiągnąć skuteczną regenerację. Badamy również, czy pozorna komunikacja komórkowa wpływa na funkcję komórek macierzystych mięśni w procesie starzenia się i choroby.

Główną przeszkodą w badaniu komunikacji komórka-komórka w niszy komórek macierzystych jest brak technologii, które zapewniają rozdzielczość pojedynczej komórki. Cytometria masowa pojedynczej komórki umożliwia jednoczesną, wysokoprzepustową analizę ilościową wielu typów komórek i fenotypów molekularnych w złożonych tkankach. Nasz protokół umożliwia oczyszczanie i głębokie profilowanie rzadkich komórek macierzystych i ich potomstwa podczas regeneracji mięśni przy użyciu przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym komórek i miogennym czynnikom transkrypcyjnym.

Badanie tych komórek pomaga nam zrozumieć, w jaki sposób kontrolowane są losy komórek macierzystych mięśni i odkryć sieci, które napędzają zmiany stanu komórki podczas skutecznej regeneracji. Jednoczesny pomiar do 50 powierzchni komórek i białka wewnątrzkomórkowego na poziomie pojedynczej komórki jest cennym podejściem do badania funkcji komórkowych w tkance mięśniowej. Technika ta może zidentyfikować unikalne sygnatury molekularne i ujawnić nowe mechanizmy dysfunkcji komórek macierzystych mięśni w procesie starzenia się i choroby.

Protokół ten pozwala zbadać, w jaki sposób przejście stanu komórki wpływa na regenerację tkanek w zdrowiu i chorobie. Prezentowana przez nas sygnatura aktywowanych komórek macierzystych umożliwia prowadzenie badań nad spoczynkiem komórek macierzystych, które wcześniej nie były możliwe. Możemy teraz oczyścić aktywowane komórki macierzyste, na haju CD98, na haju CD44, opierając się wyłącznie na markerze powierzchni komórki i po raz pierwszy zbadać, w jaki sposób wracają do stanu spoczynku.

Na początek umieść fiolki z buprenorfiną rozcieńczoną w sterylnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej, a notexin rozcieńczoną w PBS na lodzie. Pod ustawieniem stożka nosowego ogol tylne kończyny znieczulonej myszy za pomocą trymera, a następnie przenieś mysz z powrotem do skrzynki indukcyjnej. Przygotować strzykawki insulinowe z 15 mikrolitrami roztworu notexin do GA i 10 mikrolitrami roztworu notexin do wstrzyknięć TA.

Po przeniesieniu myszy do stożka nosowego należy zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia chusteczką z etanolu. Wbij igłę skosem skierowanym w dół w brzuchu mięśnia TA pod kątem 30 stopni. Przesunąć igłę równolegle do kości piszczelowej, aby dotrzeć do środkowej części brzucha TA i powoli wstrzykiwać roztwór notexin przez 10 sekund.

Aby wstrzyknąć roztwór notexin do GA, należy wprowadzić igłę pod kątem 45 stopni w środkową część bocznej głowy mięśnia GA i wstrzyknąć roztwór. Odwróć mysz i za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknij podskórnie buprenorfinę. Obliczyć objętość roztworu jododeoksyurydyny wymaganą dla każdej myszy, korzystając z tego równania.

Za pomocą strzykawki insulinowej należy wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu jododeoksyurydyny w wysterylizowane miejsce wstrzyknięcia na osiem do 12 godzin przed eutanazją. Po eutanazji myszy wypreparuj mięśnie TA i GA z obu tylnych kończyn i umieść je w pokrywie szalki Petriego. Użyj nożyczek, aby pokroić tkankę na mieloną zawiesinę.

Przenieś zmieloną tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów lodowatego buforu dysocjacyjnego i trzymaj ją na lodzie. Po podgrzaniu probówek z próbkami do 37 stopni Celsjusza, inkubuj je przez 45 minut na zmianę w inkubatorze, dodaj 10 mililitrów pożywki do przemywania do probówek z próbkami i zwiruj je. Odwirować probówki i odessać zawartość do czterech mililitrów.

Następnie dodaj po 0,5 mililitra kolagenazy i rozlej do komórek. Następnie wiruj je i inkubuj. Po inkubacji odwirować strawioną próbkę i ponownie zawiesić osad za pomocą pięciomililitrowej pipety.

Następnie wstępnie zwilż sitka o długości 40 mikrometrów umieszczone na 50-mililitrowych probówkach z pięcioma mililitrami środka myjącego. Za pomocą pięciomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 20 odessać i wysunąć zawiesinę komórek 10 razy. Następnie przecedź zawiesinę komórkową przez wstępnie zwilżone sitko o średnicy 40 mikrometrów.

Po zebraniu i odcedzeniu pozostałych komórek za pomocą 10 mililitrów pożywki myjącej, zawiesinę komórek osadzić przez odwirowanie, odessać supernatant z probówki i delikatnie strzepnąć osad, aby go poluzować. Na początek ponownie zasmuś komórki mięśni szkieletowych wyizolowane od myszy zranionych przez noteksynę znakowanych jododeoksyurydyną w jednym mililitrze zimnej surowicy wolnego DMEM i policz je za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Pod wyciągiem dodaj cisplatynę, aby uzyskać końcowe stężenie 25 mikromolów.

Wirować probówkę przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez minutę. Ugasić reakcję lodowatym DMEM zawierającym 10% FBS i umieścić go na lodzie. Po granulowaniu i ponownym zawieszeniu komórek, przefiltruj zawiesinę przez sitko o średnicy 35 mikrometrów.

Pod wyciągiem dodaj przefiltrowany roztwór podstawowy paraformaldehydu, aby utrwalić zawiesinę komórek i wirować przez 30 sekund. Umyj go dwa razy dwoma mililitrami pożywki do barwienia komórek lub CSM przez odwirowanie. Po ostatnim myciu odessać supernatant do około 60 mikrolitrów i dokładnie zawiesić granulkę.

Dodaj 40 mikrolitrów 2,5-krotnej powierzchniowej mieszanki barwiącej przeciwciała przygotowanej w CSM i inkubuj przez godzinę, wirując je co 20 minut. Po dwukrotnym przemyciu próbki CSM, odessać supernatant i strzepnąć osad. Aby przeniknąć komórki, pod wyciągiem dodaj kroplami 0,5 mililitra lodowatego metanolu podczas wirowania.

Umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem CSM przez odwirowanie. Po ostatnim praniu odessać supernatant do około 60 mikrolitrów i dokładnie zawiesić granulkę. Inkubować komórki z 40 mikrolitrami wewnątrzkomórkowej mieszanki do barwienia przeciwciał przez jedną godzinę, wirując próbki co 20 minut.

Po dwukrotnym umyciu komórek jednym mililitrem CSM, ponownie zawiesić próbki w 0,5 mililitra roztworu irydu interkalatora i odwirować. Na początek weź komórki mięśni szkieletowych wybarwione przeciwciałami sprzężonymi z cisplatyną i roztworem interkalatora irydu i opluj komórki przez odwirowanie. Po usunięciu supernatantu dodaj jeden mililitr CSM do zawirowanych komórek.

Osadzać komórki przez odwirowanie i przemyć w jednym mililitrze buforu CAS. Po odwirowaniu odessać supernatant do około 200 mikrolitrów. Dodaj jeden mililitr buforu CAS do próbek wirowych i podwielokrotność pięciu mikrolitrów do zliczania komórek.

Po odwirowaniu komórek i zasysaniu supernatantu do 50 mikrolitrów, ponownie zawieś komórki w buforze CAS do końcowego stężenia 1 miliona komórek na mililitr i dodaj kulki kalibracyjne, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1x. Załaduj próbkę do cytometru masowego, aby zebrać dane przy użyciu natężenia przepływu od 400 do 500 komórek na sekundę i znormalizować dane po pobraniu. W razie potrzeby należy połączyć poszczególne pliki wzorca cytometrii przepływowej lub FCS w jeden plik.

Identyfikuj pojedyncze komórki, bramkując na dodatnich zdarzeniach interkalatora irydu. Wybierz zdarzenia, które są ujemne dla cisplatyny do bramki dla żywych komórek. Brama na populacji będącej przedmiotem zainteresowania i ilościowe określenie względnej proporcji komórek macierzystych i progenitorowych.

Aby przeprowadzić analizę wysokowymiarową, wyeksportuj interesującą populację i użyj algorytmów grupowania. Aby przeprowadzić analizę przesunięcia X, pobierz pakiet oprogramowania Vortex i 64-bitową wersję Java. Prześlij wyeksportowane populacje komórek do lokalnej bazy danych i zdefiniuj parametry klastrowania.

Aby zobrazować relacje przestrzenne między populacjami komórek w klastrach przesunięcia X, należy wykonać układ skierowany siłą. Analiza CyTOF pozwoliła zidentyfikować sekwencję czterech populacji, komórek macierzystych i populacji progenitorowych od jednej do trzech. Populacje progenitorowe P1 i P2 odpowiadają coraz bardziej dojrzałym komórkom progenitorowym.

P3 został wcześniej zidentyfikowany, ale nie został scharakteryzowany ze względu na jego niską liczebność. Dynamikę komórek macierzystych i progenitorowych po urazie analizowano przy użyciu CD9 za pomocą dwuosiowych wykresów kropkowych C104. Zauważalny wzrost populacji komórek macierzystych zaobserwowano w trzecim dniu, co sugeruje ekspansję.

Zostało to poparte zwiększoną inkorporacją jododeoksyurydyny wskazującą na proliferację komórek i zwiększoną ekspresję MyoD, jak pokazano na kolorowej nakładce. Zidentyfikowano aktywowane komórki macierzyste charakteryzujące się wysokimi poziomami CD98, CD44, MyoD i jododeoksyurydyny, co podkreśla ich wysoką proliferację i stan aktywacji w trzecim dniu po urazie.