Name: Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj analizę progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki. Ta metoda pozwala zidentyfikować unikalne sygnatury molekularne komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom FACS Core Facility na Wydziale Biomedycyny Uniwersytetu w Aarhus za wsparcie techniczne. Dziękujemy Alexandrowi Schmitzowi, kierownikowi Zakładu Cytometrii Masowej w Zakładzie Biomedycyny, za dyskusję i wsparcie. Ilustracje naukowe zostały stworzone przy użyciu Biorender.com. Praca ta została sfinansowana z grantu dla początkujących Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) oraz grantu dla początkujących (0071113) z Fundacji Novo Nordisk dla E.P.

Single-Cell CyTOF Analysis of Myogenic Progenitors in Muscle Regeneration

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Regeneracja mięśni szkieletowych to dynamiczny proces, który opiera się na funkcji dorosłych komórek macierzystych. Podczas gdy wcześniejsze badania koncentrowały się na roli komórek macierzystych mięśni podczas regeneracji, ich potomstwo in vivo było niedostatecznie zbadane, głównie z powodu braku narzędzi do identyfikacji i izolacji tych populacji komórek 15,16,17,18. W tym miejscu p...

Mięśnie szkieletowe stanowią największą pod względem masy tkankę w ciele i regulują wiele funkcji, od wzroku po oddychanie, od postawy do ruchu, a także metabolizm1. Dlatego utrzymanie integralności i funkcji mięśni szkieletowych ma kluczowe znaczenie dla zdrowia. Tkanka mięśni szkieletowych, która składa się z ciasno upakowanych wiązek wielojądrowych włókien mięśniowych otoczonych złożoną siecią nerwów i naczyń krwionośnych, wykazuje niezwykły potencjał regeneracyjny1,2.
Głównymi czynnikami regeneracji mięśni szkieletowych są dorosłe komórki macierzyste mięśni (MuSC). Znane również jako komórki satelitarne, ze względu na ich unikalne położenie anatomiczne w sąsiedztwie błony plazmatycznej włókna mięśniowego i poniżej blaszki podstawnej, zostały po raz pierwszy zidentyfikowane w 1961 roku3. MuSC wyrażają unikalny marker molekularny, sparowany czynnik transkrypcyjny pole 7 (Pax7)4. Przeważnie w stanie spoczynku u zdrowych osób dorosłych, aktywują się po uszkodzeniu mięśni i namnażają się, dając początek potomstwu, które (i) różnicuje się w kompetentne do fuzji komórki mięśniowe, które tworzą nowe włókna mięśniowe w celu naprawy uszkodzeń mięśni lub (ii) odnawiają się samoczynnie, aby uzupełnić pulę komórek macierzystych5.
Na poziomie komórkowym i molekularnym proces regeneracji jest dość dynamiczny i obejmuje przejścia między stanami komórkowymi, charakteryzujące się skoordynowaną ekspresją kluczowych miogennych czynników transkrypcyjnych, znanych również jako miogenne czynniki regulacyjne (MRF)6,7. Wcześniejsze badania rozwojowe in vivo, eksperymenty ze śledzeniem linii i prace nad hodowlami komórkowymi z użyciem mioblastów wykazały, że sekwencyjna ekspresja tych czynników transkrypcyjnych napędza miogenezę, przy czym czynnik miogenny 5 (Myf5) ulega ekspresji po aktywacji, ekspresja różnicowania miogennego 1 (MyoD1) oznacza zaangażowanie w program miogenny, a ekspresja miogeniny (MyoG) oznacza różnicowanie8,9,10,11,12,13,14. Pomimo tej wiedzy i odkrycia markerów powierzchniowych komórek do oczyszczania MuSC, brakuje strategii i narzędzi do identyfikacji i izolowania dyskretnych populacji wzdłuż ścieżki różnicowania miogennego oraz rozwiązywania progresji miogennej in vivo15,16,17,18.
Tutaj prezentujemy nowatorską metodę, opartą na niedawno opublikowanych badaniach, która umożliwia identyfikację komórek macierzystych i progenitorowych w mięśniach szkieletowych oraz analizę ich dynamiki komórkowej, molekularnej i proliferacji w kontekście ostrego uszkodzenia mięśni19. Podejście to opiera się na cytometrii masowej pojedynczej komórki (znanej również jako cytometria czasu lotu [CyTOF]) w celu jednoczesnego wykrywania kluczowych markerów powierzchniowych komórek (integrynaα 7, CD9, CD44, CD98 i CD104), wewnątrzkomórkowych miogennych czynników transkrypcyjnych (Pax7, Myf5, MyoD i MyoG) oraz analogu nukleozydu (5-jodo-2′-deoksyurydyna, IdU), w celu monitorowania komórek w fazie S19, 20,21,22,23. Co więcej, w protokole przedstawiono strategię opartą na wykrywaniu dwóch markerów powierzchniowych komórek, CD9 i CD104, w celu oczyszczenia tych populacji komórek poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), umożliwiając w ten sposób przyszłe dogłębne badania ich funkcji w kontekście urazów i chorób mięśni. Podczas gdy pierwotne mioblasty były szeroko stosowane w przeszłości do badania późnych etapów różnicowania miogennego in vitro, nie wiadomo, czy podsumowują one stan molekularny komórek progenitorowych mięśni znalezionych in vivo24,25,26,27,28,29,30. Produkcja mioblastów jest pracochłonna i czasochłonna, a stan molekularny tej pierwotnej kultury zmienia się szybko podczas pasażu31. W związku z tym świeżo wyizolowane miogenne komórki progenitorowe oczyszczone tą metodą zapewnią bardziej fizjologiczny system do badania miogenezy i wpływu manipulacji genetycznych lub farmakologicznych ex vivo.
Przedstawiony tutaj protokół może być zastosowany do rozwiązywania różnych pytań badawczych, na przykład do badania dynamiki kompartmentu miogennego in vivo w zwierzęcych modelach chorób mięśni, w odpowiedzi na ostre manipulacje genetyczne lub interwencje farmakologiczne, pogłębiając w ten sposób nasze zrozumienie dysfunkcji komórek macierzystych mięśni w różnych kontekstach biologicznych i ułatwiając rozwój nowych interwencji terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>Igła 20 G</td><td>KDM</td><td>KD-fine 900123</td><td></td></tr><tr><td>28 G, strzykawka insulinowa 0,5 mL&nbsp;</td><td></td> Strzykawka insulinowa BD <td>329461</td><td></td></tr><tr><td>29 G, 0,3 ml</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 3 ml</td><td>Terumo medyczne</td><td>MDSS03SE</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m sitka komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>11587522</td><td></td></tr><tr><td>probówki polipropylenowe 5 mL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml i mikro 35 &; m sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>strzykawki 5 ml</td><td>Terumo medical</td><td>SS05LE1</td><td></td></tr><tr><td>probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>5-jodo-2-deoksyurydyna (IdU)</td><td>Merck</td><td>I7125-5g</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD104 FITC (klon: 346-11A)</td><td>Biolegend</td><td>123605</td><td>Stock = 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>anty-CD11b APC-Cy7 (klon: M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101226</td><td>Stock = 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>anty-CD31 APC-Cy7 (klon: 390)</td><td>Biolegend</td><td>102440</td><td>Stock = 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>anty-CD45 APC-Cy7 (klon: 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td>Stock = 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>anty-CD9 APC (klon: KMC8)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0091-82</td><td>Stock = 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>anty-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (klon: D7)</td><td>Biolegend</td><td>108126</td><td>Zapas = 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>anty-&alfa; 7 integryna PE (klon: R2F2))UBC</td> <td>AbLab</td><td>67-0010-05</td><td>Stock = 1 mg / mL</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III (4 lasery) instrument</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>405, 488, 561 i 633 nm</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg / ml</td><td>Ceva</td><td>Vnr 054594</td><td></td></tr><tr><td>CD104 (klon: 346-11A)</td><td>BD Biosciences</td><td>553745</td><td>Dy162; Własna koniugacja</td></tr><tr><td>CD106/VCAM-1 (klon: 429 MVCAM. a)</td> <td>Biolegend</td><td>105701</td><td>Er170; Własny sprzężony</td></tr><tr><td>CD11b (klon: M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>553308</td><td>Nd148; Własna koniugacja</td></tr><tr><td>CD29/integryny &beta; 1 (klon: 9EG7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553715</td><td>Tm169; Własny sprzężony</td></tr><tr><td>CD31 (klon: MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>557355</td><td>Sm154; Własny sprzężony</td></tr><tr><td>CD34 (klon: RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>551387</td><td>Lu175; Własna koniugacja</td></tr><tr><td>CD44 (klon: IM7)</td><td>BD Biosciences</td><td>550538</td><td>Yb171; Własny koniugowany</td></tr><tr><td>CD45 (klon: MEC 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>550539</td><td>Sm147; Własny koniugowany</td></tr><tr><td>CD9 (klon: KMC8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0091-85</td><td>Yb174; Własna koniugacja</td></tr><tr><td>CD90.2/Thy1.2 (klon: 30-H12)</td><td>BD Biosciences</td><td>553009</td><td>Nd144; Własna koniugacja</td></tr><tr><td>CD98 (klon: H202-141)</td><td>BD Biosciences</td><td>557479</td><td>Pr141; Własny sprzężony</td></tr><tr><td>roztwór do akwizycji komórek/bufor Maxpar CAS</td><td>Standard Biotools</td><td>201240</td><td></td></tr><tr><td>Interkalator Cell-ID-Iridium</td><td>Standard Biotools</td><td>201192B</td><td>Interkalator kationowych kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>Cisplatyna</td><td>Merck</td><td>P4394</td><td>Pt195</td></tr><tr><td>Cisplatyna (dichlorek cis-diaminyplatyny(II))</td> <td>Merck</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>Clear 1,5 ml probówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca</td><td>Merck</td><td>BR718620-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4/SDF1 (klon: 2B11/CXCR4 )</td><td>BD Biosciences</td><td>551852</td><td>Gd158; Własna sprzężona</td></tr><tr><td>DAPI (1 mg / ml)</td> <td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>Ciemna probówka 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>15386548</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (niska glukoza, z pirogronianem)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego)</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>Na2EDTA-2H20</td></tr><tr><td>EQ Czteroelementowe koraliki kalibracyjne (koraliki EQ)</td><td>Standardowe bionarzędzia</td><td>201078</td><td>Koraliki kalibracyjne</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, pochodzenie z Brazylii</td> Kleszcze <td>do 10270106</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Dumont #5SF</td><td>Fine Narzędzia naukowe</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #7</td><td>Hounisen.com</td><td>1606.3350</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>System Helios CyTOF</td><td>Standard Biotools</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni, inaktywowana termicznie, pochodzenie z Nowej Zelandii</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-050-088</td><td></td></tr><tr><td>IdU</td><td>Merck</td><td>I7125</td><td>I127</td></tr><tr><td>Iridium-Intercalator</td><td>Standard Biotools</td><td>201240</td><td>Ir191/193</td></tr><tr><td>Isoflurane/Attane Vet</td><td>ScanVet</td><td>Vnr 055226</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/3900/17</td><td></td></tr><tr><td>Myf5 (klon: C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-302</td><td>Yb173; Własny sprzężony</td></tr><tr><td>MyoD (klon: 5.8A)</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td>Dy164; Własny sprzężony</td></tr><tr><td>MyoG (klon: F5D)</td><td>BD Biosciences</td><td>556358</td><td>Gd160; Własnoręcznie sprzężona</td></tr><tr><td>sterylna jednorazowa butelka Nalgene Rapid-Flow 0,20 &mu; M PES Filters</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>595-4520</td><td></td></tr><tr><td>Notexin</td><td>Latoxan</td><td>L8104</td><td>Zawieszenie do 50 &mikro; g/ml w sterylnym PBS. Utrzymuj zapasy (np. 50 i mikro; l) przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Mieszanka składników odżywczych F-10 (Ham's)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31550031</td><td></td></tr><tr><td>pAkt (Klon: D9E)</td><td>Standard Biotools</td><td>3152005A</td><td>Sm152</td></tr><tr><td>Pax7 (Klon: PAX7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-81648</td><td>Eu153; Własna sprzężona</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml) (długopis/paciorkowiec)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Jednostki filtrujące PES 0,20 i mu; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15913307</td><td></td></tr><tr><td>PES Filtr strzykawkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16% klasy EM</td><td>MP Biomedicals</td><td>219998320</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10375810</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, monozasadowy,&nbsp; bezwodny (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10573181</td><td></td></tr><tr><td>pRb (klon: J112-906)</td><td>Standardowe narzędzia biologiczne</td><td>3166011A</td><td>Er166</td></tr><tr><td>kinaza pS6 (klon: N7-548)</td><td>Standardowe narzędzia biologiczne</td><td>3172008A</td><td>Yb172</td></tr><tr><td>Sca-1 (klon: E13-161.7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553333</td><td>Nd142; Własny sprzężony</td></tr><tr><td>azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10553515</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu, dwuzasadowy, siedmiowodny (Na2HPO4-6H2O)</td><td>Merck</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny roztwór soli fizjologicznej 0,9%</td><td>Fresenius</td><td>B306414/02</td><td></td></tr><tr><td>&alfa; 7 integryna (klon: 3C12)</td><td>MBL international</td><td>K0046-3</td><td>Ho165; Koniugowane wewnętrznie</td></tr></tbody></table>

identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki

Identification and Analysis of Myogenic Progenitors In Vivo During Acute Skeletal Muscle Injury by High-Dimensional Single-Cell Mass Cytometry

Regeneracja mięśni szkieletowych to dynamiczny proces napędzany przez dorosłe komórki macierzyste mięśni i ich potomstwo. Przeważnie w stanie spoczynku w stanie ustalonym, dorosłe komórki macierzyste mięśni aktywują się po urazie mięśni. Po aktywacji rozmnażają się, a większość ich potomstwa różnicuje się, tworząc kompetentne do fuzji komórki mięśniowe, podczas gdy pozostałe odnawiają się, aby uzupełnić pulę komórek macierzystych. Podczas gdy tożsamość komórek macierzystych mięśni została zdefiniowana ponad dekadę temu, w oparciu o koekspresję markerów powierzchniowych komórek, miogenne komórki progenitorowe zostały zidentyfikowane dopiero niedawno przy użyciu wielowymiarowych podejść jednokomórkowych. W tym miejscu przedstawiamy metodę cytometrii masowej pojedynczej komórki (cytometria według czasu przelotu [CyTOF]) do analizy komórek macierzystych i komórek progenitorowych w ostrym uszkodzeniu mięśni w celu wyjaśnienia dynamiki komórkowej i molekularnej, która rozwija się podczas regeneracji mięśni. Podejście to opiera się na jednoczesnym wykrywaniu nowych markerów powierzchniowych komórek i kluczowych miogennych czynników transkrypcyjnych, których dynamiczna ekspresja umożliwia identyfikację aktywowanych komórek macierzystych i populacji komórek progenitorowych, które stanowią punkty orientacyjne miogenezy. Co ważne, opisano strategię sortowania opartą na wykrywaniu markerów powierzchniowych komórek CD9 i CD104, umożliwiającą prospektywną izolację komórek macierzystych i progenitorowych mięśni za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu dogłębnych badań ich funkcji. Komórki progenitorowe mięśni stanowią krytyczne brakujące ogniwo w badaniu kontroli losu komórek macierzystych mięśni, identyfikacji nowych celów terapeutycznych w chorobach mięśni i opracowywaniu zastosowań terapii komórkowej w medycynie regeneracyjnej. Przedstawione tutaj podejście można zastosować do badania komórek macierzystych i progenitorowych mięśni in vivo w odpowiedzi na zakłócenia, takie jak interwencje farmakologiczne ukierunkowane na określone szlaki sygnałowe. Może być również wykorzystany do badania dynamiki komórek macierzystych i progenitorowych mięśni w zwierzęcych modelach chorób mięśni, pogłębiając naszą wiedzę na temat chorób komórek macierzystych i przyspieszając rozwój terapii.

W niniejszej pracy przedstawiamy przegląd konfiguracji eksperymentalnej dla zastosowania tego połączonego podejścia, które obejmuje (i) wielowymiarową analizę CyTOF w czasie po wystąpieniu ostrego urazu wywołanego wstrzyknięciem noteksyny, w celu zbadania dynamiki komórkowej i molekularnej komórek macierzystych i progenitorowych w mięśniach szkieletowych (Rycina 1, schemat górny); oraz (ii) FACS komórek macierzystych i progenitorowych z wykorzystaniem dwóch markerów powierzchniowych, CD9 i C...

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia identyfikację i wielowymiarową analizę komórek macierzystych i progenitorowych mięśni za pomocą jednokomórkowej cytometrii masowej oraz ich oczyszczanie przez FACS w celu dogłębnych badań ich funkcji. Podejście to można zastosować do badania dynamiki regeneracji w modelach chorobowych i testowania skuteczności interwencji farmakologicznych.

Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki

Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle ...

Nasze badania dotyczą mechanizmów molekularnych leżących u podstaw dysfunkcji komórek macierzystych w procesie starzenia się i choroby. Naszym celem jest zrozumienie, w jaki sposób komórki macierzyste i progenitorowe oddziałują z innymi komórkami w mikrośrodowisku mięśniowym, aby osiągnąć skuteczną regenerację. Badamy również, czy pozorna komunikacja komórkowa wpływa na funkcję komórek macierzystych mięśni w procesie starzenia się i choroby.Główną przeszkodą w badaniu komunikacji komórka-komórka w niszy komórek macierzystych jest brak technologii, które zapewniają rozdzielczość pojedynczej komórki. Cytometria masowa pojedynczej komórki umożliwia jednoczesną, wysokoprzepustową analizę ilościową wielu typów komórek i fenotypów molekularnych w złożonych tkankach. Nasz protokół umożliwia oczyszczanie i głębokie profilowanie rzadkich komórek macierzystych i ich potomstwa podczas regeneracji mięśni przy użyciu przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym komórek i miogennym czynnikom transkrypcyjnym.Badanie tych komórek pomaga nam zrozumieć, w jaki sposób kontrolowane są losy komórek macierzystych mięśni i odkryć sieci, które napędzają zmiany stanu komórki podczas skutecznej regeneracji. Jednoczesny pomiar do 50 powierzchni komórek i białka wewnątrzkomórkowego na poziomie pojedynczej komórki jest cennym podejściem do badania funkcji komórkowych w tkance mięśniowej. Technika ta może zidentyfikować unikalne sygnatury molekularne i ujawnić nowe mechanizmy dysfunkcji komórek macierzystych mięśni w procesie starzenia się i choroby.Protokół ten pozwala zbadać, w jaki sposób przejście stanu komórki wpływa na regenerację tkanek w zdrowiu i chorobie. Prezentowana przez nas sygnatura aktywowanych komórek macierzystych umożliwia prowadzenie badań nad spoczynkiem komórek macierzystych, które wcześniej nie były możliwe. Możemy teraz oczyścić aktywowane komórki macierzyste, na haju CD98, na haju CD44, opierając się wyłącznie na markerze powierzchni komórki i po raz pierwszy zbadać, w jaki sposób wracają do stanu spoczynku.Na początek umieść fiolki z buprenorfiną rozcieńczoną w sterylnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej, a notexin rozcieńczoną w PBS na lodzie. Pod ustawieniem stożka nosowego ogol tylne kończyny znieczulonej myszy za pomocą trymera, a następnie przenieś mysz z powrotem do skrzynki indukcyjnej. Przygotować strzykawki insulinowe z 15 mikrolitrami roztworu notexin do GA i 10 mikrolitrami roztworu notexin do wstrzyknięć TA.Po przeniesieniu myszy do stożka nosowego należy zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia chusteczką z etanolu. Wbij igłę skosem skierowanym w dół w brzuchu mięśnia TA pod kątem 30 stopni. Przesunąć igłę równolegle do kości piszczelowej, aby dotrzeć do środkowej części brzucha TA i powoli wstrzykiwać roztwór notexin przez 10 sekund.Aby wstrzyknąć roztwór notexin do GA, należy wprowadzić igłę pod kątem 45 stopni w środkową część bocznej głowy mięśnia GA i wstrzyknąć roztwór. Odwróć mysz i za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknij podskórnie buprenorfinę. Obliczyć objętość roztworu jododeoksyurydyny wymaganą dla każdej myszy, korzystając z tego równania.Za pomocą strzykawki insulinowej należy wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu jododeoksyurydyny w wysterylizowane miejsce wstrzyknięcia na osiem do 12 godzin przed eutanazją. Po eutanazji myszy wypreparuj mięśnie TA i GA z obu tylnych kończyn i umieść je w pokrywie szalki Petriego. Użyj nożyczek, aby pokroić tkankę na mieloną zawiesinę.Przenieś zmieloną tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów lodowatego buforu dysocjacyjnego i trzymaj ją na lodzie. Po podgrzaniu probówek z próbkami do 37 stopni Celsjusza, inkubuj je przez 45 minut na zmianę w inkubatorze, dodaj 10 mililitrów pożywki do przemywania do probówek z próbkami i zwiruj je. Odwirować probówki i odessać zawartość do czterech mililitrów.Następnie dodaj po 0,5 mililitra kolagenazy i rozlej do komórek. Następnie wiruj je i inkubuj. Po inkubacji odwirować strawioną próbkę i ponownie zawiesić osad za pomocą pięciomililitrowej pipety.Następnie wstępnie zwilż sitka o długości 40 mikrometrów umieszczone na 50-mililitrowych probówkach z pięcioma mililitrami środka myjącego. Za pomocą pięciomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 20 odessać i wysunąć zawiesinę komórek 10 razy. Następnie przecedź zawiesinę komórkową przez wstępnie zwilżone sitko o średnicy 40 mikrometrów.Po zebraniu i odcedzeniu pozostałych komórek za pomocą 10 mililitrów pożywki myjącej, zawiesinę komórek osadzić przez odwirowanie, odessać supernatant z probówki i delikatnie strzepnąć osad, aby go poluzować. Na początek ponownie zasmuś komórki mięśni szkieletowych wyizolowane od myszy zranionych przez noteksynę znakowanych jododeoksyurydyną w jednym mililitrze zimnej surowicy wolnego DMEM i policz je za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Pod wyciągiem dodaj cisplatynę, aby uzyskać końcowe stężenie 25 mikromolów.Wirować probówkę przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez minutę. Ugasić reakcję lodowatym DMEM zawierającym 10% FBS i umieścić go na lodzie. Po granulowaniu i ponownym zawieszeniu komórek, przefiltruj zawiesinę przez sitko o średnicy 35 mikrometrów.Pod wyciągiem dodaj przefiltrowany roztwór podstawowy paraformaldehydu, aby utrwalić zawiesinę komórek i wirować przez 30 sekund. Umyj go dwa razy dwoma mililitrami pożywki do barwienia komórek lub CSM przez odwirowanie. Po ostatnim myciu odessać supernatant do około 60 mikrolitrów i dokładnie zawiesić granulkę.Dodaj 40 mikrolitrów 2,5-krotnej powierzchniowej mieszanki barwiącej przeciwciała przygotowanej w CSM i inkubuj przez godzinę, wirując je co 20 minut. Po dwukrotnym przemyciu próbki CSM, odessać supernatant i strzepnąć osad. Aby przeniknąć komórki, pod wyciągiem dodaj kroplami 0,5 mililitra lodowatego metanolu podczas wirowania.Umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem CSM przez odwirowanie. Po ostatnim praniu odessać supernatant do około 60 mikrolitrów i dokładnie zawiesić granulkę. Inkubować komórki z 40 mikrolitrami wewnątrzkomórkowej mieszanki do barwienia przeciwciał przez jedną godzinę, wirując próbki co 20 minut.Po dwukrotnym umyciu komórek jednym mililitrem CSM, ponownie zawiesić próbki w 0,5 mililitra roztworu irydu interkalatora i odwirować. Na początek weź komórki mięśni szkieletowych wybarwione przeciwciałami sprzężonymi z cisplatyną i roztworem interkalatora irydu i opluj komórki przez odwirowanie. Po usunięciu supernatantu dodaj jeden mililitr CSM do zawirowanych komórek.Osadzać komórki przez odwirowanie i przemyć w jednym mililitrze buforu CAS. Po odwirowaniu odessać supernatant do około 200 mikrolitrów. Dodaj jeden mililitr buforu CAS do próbek wirowych i podwielokrotność pięciu mikrolitrów do zliczania komórek.Po odwirowaniu komórek i zasysaniu supernatantu do 50 mikrolitrów, ponownie zawieś komórki w buforze CAS do końcowego stężenia 1 miliona komórek na mililitr i dodaj kulki kalibracyjne, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1x. Załaduj próbkę do cytometru masowego, aby zebrać dane przy użyciu natężenia przepływu od 400 do 500 komórek na sekundę i znormalizować dane po pobraniu. W razie potrzeby należy połączyć poszczególne pliki wzorca cytometrii przepływowej lub FCS w jeden plik.Identyfikuj pojedyncze komórki, bramkując na dodatnich zdarzeniach interkalatora irydu. Wybierz zdarzenia, które są ujemne dla cisplatyny do bramki dla żywych komórek. Brama na populacji będącej przedmiotem zainteresowania i ilościowe określenie względnej proporcji komórek macierzystych i progenitorowych.Aby przeprowadzić analizę wysokowymiarową, wyeksportuj interesującą populację i użyj algorytmów grupowania. Aby przeprowadzić analizę przesunięcia X, pobierz pakiet oprogramowania Vortex i 64-bitową wersję Java. Prześlij wyeksportowane populacje komórek do lokalnej bazy danych i zdefiniuj parametry klastrowania.Aby zobrazować relacje przestrzenne między populacjami komórek w klastrach przesunięcia X, należy wykonać układ skierowany siłą. Analiza CyTOF pozwoliła zidentyfikować sekwencję czterech populacji, komórek macierzystych i populacji progenitorowych od jednej do trzech. Populacje progenitorowe P1 i P2 odpowiadają coraz bardziej dojrzałym komórkom progenitorowym.P3 został wcześniej zidentyfikowany, ale nie został scharakteryzowany ze względu na jego niską liczebność. Dynamikę komórek macierzystych i progenitorowych po urazie analizowano przy użyciu CD9 za pomocą dwuosiowych wykresów kropkowych C104. Zauważalny wzrost populacji komórek macierzystych zaobserwowano w trzecim dniu, co sugeruje ekspansję.Zostało to poparte zwiększoną inkorporacją jododeoksyurydyny wskazującą na proliferację komórek i zwiększoną ekspresję MyoD, jak pokazano na kolorowej nakładce. Zidentyfikowano aktywowane komórki macierzyste charakteryzujące się wysokimi poziomami CD98, CD44, MyoD i jododeoksyurydyny, co podkreśla ich wysoką proliferację i stan aktywacji w trzecim dniu po urazie.

identification-analysis-myogenic-progenitors-vivo-during-acute

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda enzymatycznej dysocjacji, znakowania powierzchniowego i oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej progenitorów fibro/adipogennych i miogennych z mięśni szkieletowych myszy.

Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół indukcji ostrej regeneracji mięśni szkieletowych u dorosłych myszy i późniejszych manipulacji mięśni, takich jak rozwarstwienie, zamrażanie, cięcie, rutynowe barwienie i analiza obszaru przekroju poprzecznego włókien mięśniowych.

Indukcja ostrej regeneracji mięśni szkieletowych przez wstrzyknięcie kardiotoksyny

Aktywna autofagia jest związana z produktywną regeneracją mięśni, która jest niezbędna do aktywacji komórek macierzystych mięśni (MuSC). W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania in situ LC3, markera autofagii w MyoD-dodatnich MuSC skrawków tkanki mięśniowej od myszy kontrolnych i rannych.

In Situ Barwienie immunofluorescencyjne autofagii w komórkach macierzystych mięśni

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Różnicowanie mięśni szkieletowych jest bardzo dynamicznym procesem, który szczególnie opiera się na pozycjonowaniu jądra. W tym miejscu opisujemy metodę śledzenia ruchów jąder za pomocą obrazowania żywych komórek podczas różnicowania mioblastów i tworzenia miotubek oraz przeprowadzania ilościowej charakterystyki dynamiki jąder poprzez ekstrakcję informacji z automatycznego śledzenia.

Wykorzystanie obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania i fuzji mioblastów

Prezentujemy techniki izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) uzyskanych z tkanki biopsji mięśni szkieletowych.  hMPC uzyskane i scharakteryzowane za pomocą tych metod mogą być wykorzystane do późniejszego rozwiązywania problemów badawczych związanych z ludzką miogenezą i regeneracją mięśni szkieletowych.

Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych

Opisujemy metodę in vivo do badania funkcjonalnej utraty określonego genu w komórkach satelitarnych za pomocą kombinacji uszkodzenia mięśni szkieletowych za pośrednictwem kardiotoksyny i wstrzyknięcia samodostarczającego siRNA.

Analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA in vivo

Ten protokół przedstawia metodę izolowania komórek progenitorowych fibro-adipogennych (FAP) i miogennych (MP) z mięśni szkieletowych szczurów. Wykorzystanie szczura w modelach urazów mięśni zapewnia zwiększoną dostępność tkanek z mięśni zanikowych do analizy oraz szerszy repertuar zwalidowanych metod oceny siły mięśni i chodu u zwierząt poruszających się swobodnie.

Identyfikacja, izolacja i charakterystyka włóknisto-adipogennych progenitorów (FAP) i miogennych progenitorów (MP) w mięśniach szkieletowych u szczura

W tym protokole opisana jest metoda hodowli in vitro i analizy funkcjonalnej komórek macierzystych mięśni, która zachowuje większość ich interakcji z ich endogenną niszą.

Test pojedynczej hodowli włókien mięśniowych do oceny funkcjonalności dorosłych komórek macierzystych mięśni ex vivo

Precyzyjna identyfikacja fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) i komórek macierzystych mięśni (MuSCs) jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące izolacji, oczyszczania i hodowli FAP i MuSC z mięśni dorosłych myszy.

FACS-Izolacja i hodowla włóknisto-adipogennych progenitorów i mięśniowych komórek macierzystych z niezakłóconych i uszkodzonych mięśni szkieletowych myszy

Poznaj analizę progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki. Ta metoda pozwala zidentyfikować unikalne sygnatury molekularne komórek macierzystych.

Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki

Przeglądaj więcej filmów