Indukowanie długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w neuronach grzbietowego bocznego jądra kolębiastego
20 września 2024
Tutaj opisujemy protokół indukowania długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronów w neuronach przekaźnikowych z grzbietowego bocznego jądra kolankowatego utrzymywanego w wycinkach mózgu ex vivo.
Nasze badania koncentrują się na roli kanałów jonowych w plastyczności funkcjonalnej w zaburzeniach mózgu. W szczególności badamy tutaj, czy neurony ze wzgórza wzrokowego mogą ulegać plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej. Po raz pierwszy ustaliliśmy, że neurony z jądra kolankowatego bocznego wyrażają plastyczność wewnętrznej pobudliwości neuronalnej po deprywacji jednoocznej lub po stymulacji regionalnych bodźców.
Zapewniamy prosty sposób na wywołanie długotrwałej plastyczności pobudliwości neuronalnej w wzrokowych neuronach wzgórzowych szczura in vitro. W tym celu wykorzystujemy zapisy elektrofizyczne typu patch-clamp oraz narzędzia farmakologiczne na tkance mózgowej ex vivo. Nasze wyniki stwarzają możliwość zbadania wewnętrznej plastyczności innych podkorowych jąder wzrokowych mózgu.
Na początek przygotuj narzędzia preparacyjne i dwie platformy lodowe. Umieść lód w zewnętrznym zbiorniku i napełnij komorę krojenia wibratomu lodowatym roztworem do cięcia. Umieść głowę szczura poddanego eutanazji na pierwszej oblodzonej platformie i za pomocą małych nożyczek przetnij skórę głowy w kierunku ogonowym, a następnie czaszkę obustronnie.
Za pomocą kleszczy i szpatułki otwórz czaszkę, szybko wyjmij mózg z czaszki i umieść go na drugiej platformie lodowej. Wykonaj nacięcie w płaszczyźnie czołowej, aby usunąć korę przednią i opuszki węchowe, a następnie drugie cięcie na poziomie dolnego wzgórka, aby usunąć tylną korę i móżdżek. Przymocuj blok mózgowy do płytki wibratomu stroną rostralną do góry.
Regularnie podlewaj mózg podczas zabiegu, aż zostanie całkowicie zanurzony w komorze krojenia. Za pomocą wibratomu wytnij 350 mikrometrowych plastrów zawierających grzbietowe boczne jądro kolankowate. Następnie za pomocą ołówka delikatnie usuń korę i hipokamp ze śródmózgowia.
Na początek zdobądź wycinek mózgu szczura zawierający grzbietowe jądro kolankowate boczne lub dLGN i zamontuj go w zanurzonej komorze pod pionowym mikroskopem. Umieść platynowy drut w kształcie litery U na plasterku. Korzystając z mikroskopii wideo w podczerwieni z kontrastem różnicowym, zidentyfikuj zdrowy neuron w dLGN w celu rejestracji patch-clamp.
Za pomocą mikromanipulatora umieść pipetę plastrową na wybranym neuronie ze stałym dodatnim ciśnieniem. Ustaw wzmacniacz w trybie VC i wstrzyknij krok napięcia 10 miliwoltów. Ustaw napięcie na minus 65 miliwoltów.
Następnie ustaw wzmacniacz w trybie CC, zrównoważ mostek, aby skompensować opór dostępu i utrzymuj neuron na minus 65 miliwoltach. W celu pozyskania danych ustaw okres kontrolny na około 10 minut z dodatnim impulsem prądu o częstotliwości 0,1 herca i monitoruj pobudliwość neuronów. Następnie obserwuj opór wejściowy neuronu przez cały czas za pomocą krótkiego ujemnego impulsu prądu.
Po okresie kontrolnym wywołaj ciągi 15 impulsów wywołanych przez 15 krótkich kroków od dwóch do pięciu milisekund prądu depolaryzującego, dostarczanego z częstotliwością 40 Hz przez 10 minut. Wybierz amplitudę impulsu prądowego, aby za każdym razem wywołać pojedynczy potencjał czynnościowy. Na koniec przetestuj pobudliwość neuronów po protokole indukcji.
Neurony dLGN zarejestrowano w konfiguracji całej komórki, a LTP-IE indukowano potencjałem czynnościowym wystrzeliwanym z częstotliwością 40 Hz przez 10 minut w obecności jonotropowego glutaminianu i antagonistów receptora GABA. Trzykrotny wzrost liczby potencjałów czynnościowych zaobserwowano od 20 do 30 minut po indukcji LTP-IE bez zmiany rezystancji wejściowej.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół indukowania długotrwałej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w neuronach przekaźnikowych z grzbietowo-bocznego jądra kolliculi (dLGN) z wykorzystaniem skrawków mózgu ex vivo. Głównym pytaniem badawczym jest to, czy neurony dLGN mogą wykazywać zmiany w pobudliwości wewnętrznej po stymulacji lub deprywacji. Wyniki wskazują na znaczący wzrost pobudliwości neuronalnej po indukcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Plastyczność neuronalna
Wprowadzenie
- Zrozumienie plastyczności wewnętrznej jest niezbędne dla uzyskania wiedzy na temat funkcji mózgu oraz zaburzeń neurologicznych.
- Neurony przekaźnikowe w wzgolkowiu wzrokowym mogą odgrywać rolę w przetwarzaniu sensorycznym i plastyczności.
- Poprzednie badania wykazały, że pobudliwość neuronalna może być modyfikowana przez czynniki środowiskowe.
- dLGN jest kluczowe dla przekazywania informacji wzrokowych, co czyni je odpowiednim obiektem badań nad plastycznością.
Cel badania
- Zbadanie plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w neuronach wzrokowej części wzgórza.
- Opracowanie niezawodnej metody indukowania i pomiaru tej plastyczności.
- Umożliwienie dalszych badań nad powiązanymi podkorowymi jądrami wzrokowymi.
Zastosowane metody
- Wykorzystano skrawki mózgu szczura ex vivo, celując konkretnie w dLGN.
- Zastosowano elektrofizjologię patch-clamp w celu oceny właściwości neuronalnych.
- Indukcja długotrwałej plastyczności została przeprowadzona za pomocą potencjałów czynnościowych o wysokiej częstotliwości.
- Kluczowe etapy obejmowały przygotowanie tkanki oraz rejestracje elektrofizjologiczne w kontrolowanych warunkach.
Główne wyniki
- Wykazano trzykrotny wzrost liczby potencjałów czynnościowych po zastosowaniu protokołu indukcji.
- Nie zaobserwowano zmian w oporności wejściowej, co wskazuje na swoistą zmianę pobudliwości.
- Wyniki wspierają hipotezę, że neurony dLGN są zdolne do plastyczności wewnętrznej.
- Modyfikacje elektrofizjologiczne sugerują potencjalne ścieżki do dalszych badań.
Wnioski
- Niniejsze badanie waliduje metodę indukowania i pomiaru zmian pobudliwości wewnętrznej neuronów w dLGN.
- Wyniki dostarczają istotnych informacji na temat neuronalnych mechanizmów plastyczności, co ma znaczenie dla zrozumienia przetwarzania bodźców wzrokowych oraz potencjalnych celów terapeutycznych.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zastosowanie tych metod na inne obszary podkorowe w celu zbadania plastyczności.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie przemysłowe
Plastyczność wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w grzbietowej części ciała kolankowatego bocznego (dLGN) stanowi kluczowy punkt zwrotny w rozumieniu przetwarzania sensorycznego i adaptacyjnych obwodów neuronalnych. Niezawodna indukcja i kwantyfikacja długotrwałego wzmocnienia wewnętrznej pobudliwości (LTP-IE) w neuronach przekaźnikowych dLGN umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka i walidację celów w badaniach nad lekami na OUN we wczesnej fazie odkryć. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną w translacyjnych portfolio neuronauki skoncentrowanych na modulacji szlaku wzrokowego i wzgórzowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju sektora biofarmaceutycznego
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Umożliwia badanie funkcji kanałów jonowych i mechanizmów plastyczności neuronów przekaźnikowych wzgórza.
- Wspiera biologiczną ocenę ryzyka poprzez izolowanie zmian pobudliwości wewnętrznej niezależnie od wkładu synaptycznego.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla szlaków OUN zaangażowanych w adaptację sensoryczną i plastyczność.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowany system ex vivo do ilościowego określania zmian pobudliwości neuronalnej z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp.
- Ustanawia powtarzalne protokoły indukcji LTP-IE, wspierając standaryzację testu i porównywalność wyników między laboratoriami.
- Umożliwia ilościowy pomiar generowanych potencjałów czynnościowych jako punktu końcowego w badaniach przesiewowych modulatorów plastyczności wewnętrznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami przetwarzania sensorycznego i dysfunkcji wzgórza istotnymi dla przebiegu chorób.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po walidację przedkliniczną celów w OUN wpływających na pobudliwość neuronalną.
- Stanowi platformę do oceny translacyjnych biomarkerów plastyczności wewnętrznej w drogach wzrokowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół sytuuje badania nad plastycznością wewnętrznej pobudliwości na styku wczesnych odkryć i przedklinicznych badań OUN, łącząc mechanistyczną walidację celów z opracowywaniem modeli translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów kanałów jonowych i plastyczności neuronalnej w komórkach przekaźnikowych wzgórza.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe odczyty pobudliwości, odpowiednie do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Zapewnia częstotliwość potencjałów czynnościowych oraz oporność wejściową jako wiarygodne i porównywalne parametry do oceny stanu badanych próbek.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki dotyczące plastyczności wewnętrznej z modelami sensorycznymi i wzgórzowymi istotnymi w kontekście chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia platformę testową ex vivo do wielokrotnego wykorzystania w badaniu celów i szlaków w OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych w OUN i redukcji ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje indukcję i pomiar plastyczności pobudliwości neuronalnej dla skalowalnych procesów B+R.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji go/no-go w programach CNS ukierunkowanych na drogi wzgórzowe i sensoryczne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów odkrywczych i przedklinicznych w obszarze OUN z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu elektrofizjologii patch-clamp oraz przygotowywania preparatów skrawków mózgu ex vivo.
- Wymagany jest dostęp do zaawansowanej infrastruktury mikroskopowej oraz aparatury do rejestracji elektrofizjologicznej.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów indukcji i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych regionów mózgu lub innych gatunków może wymagać optymalizacji protokołu.
- Interpretacja ogranicza się do warunków ex vivo i może nie w pełni oddawać złożoność in vivo.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:09
Obtaining Acute Slices of Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus for Intrinsic Plasticity Studies
2:34
Whole-Cell Patch-Clamp Electrophysiology for Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability Induction in Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus
4:25
Representative Results
