Name: Indukowanie długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w neuronach grzbietowego bocznego jądra kolębiastego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: Poznaj metodę indukowania długoterminowej plastyczności pobudliwości w neuronach grzbietowego bocznego jądra kolębiastego szczura przy użyciu patch-clamp. Protokół umożliwia badanie mechanizmów plastyczności nerwowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez INSERM, CNRS (do DD), AMU (do MR), FRM (DVS20131228768 do DD i DEQ20180839583 do DD), NeuroSchool (program "Francja 2030" za pośrednictwem A*Midex (Initiative d'Excellence d'Aix-Marseille Université, AMX-19-IET-004) i finansowanie ANR (ANR-17-EURE-0029 do AW) oraz ANR (LoGiK, ANR-17-CE16-0022 do DD, Plastinex, ANR-21-CE16-013 do DD). Dziękujemy firmie A Venture & K Milton za doskonałą opiekę nad zwierzętami.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi europejskimi i instytucjonalnymi (Dyrektywa Rady 86/609/EWG i Francuska Krajowa Rada ds. Badań Naukowych oraz zatwierdzone przez lokalny organ ds. zdrowia (Służby Weterynaryjne, Préfecture des Bouches-du-Rhône, Marsylia)).
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Przeprowadzaj eksperymenty na 19-25-dniowych szczurach Long Evans obojga płci (o wadze od 50 do 90 g).</li>
	<li>Trzymaj zwierzęta w konwencjonalnych plastikowych klatkach razem z matką i rodzeństwem z miotu. Utrzymuj stałą temperaturę w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność i dostęp ad libitum do wody i pożywienia.</li>
</ol>
2. Ostre kawałki szczura dLGN
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory do cięcia/odzyskiwania i nagrywania zewnątrzkomórkowego.
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór do cięcia/odzyskiwania, zmieszaj 92 mM n-metylo-D-glutaminy, 30 mM NaHCO3, 25 mM D-glukozy, 10 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, 0,5 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 20 mM Hepes, 5 mM askorbinianu sodu i 3 mM pirogronianu sodu i bąbelkuj z 95% O2-5% CO2 (pH 7,4). Utrzymuj roztwór do krojenia w niskiej temperaturze podczas procedury krojenia.</li>
		<li>Przygotować roztwór rejestrujący (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, ACSF) mieszając 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 2,5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,8 mM NaH2PO4 i 10 mM D-glukozy i trwale zrównoważyć go z 95% O2-5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj narzędzia do preparowania i dwie platformy lodowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Umieść lód w zewnętrznym zbiorniku i napełnij komorę krojenia wibratomu roztworem do cięcia na zimno (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Głęboko znieczulić młodego szczura Long Evans (wiek: P19-P25) izofluranem (5%). Po potwierdzeniu, że zwierzę jest głęboko znieczulone (poprzez mocne uszczypnięcie stopy bez reakcji), należy poddać zwierzę eutanazji poprzez ścięcie głowy nożyczkami lub gilotyną (w zależności od wieku/wielkości zwierzęcia) na poziomie rdzenia. Umieść głowę na pierwszej lodowatej platformie i podlewaj izolowaną tkankę co 10 s utlenionym, lodowatym roztworem do krojenia. 
	UWAGA: Zabiegi znieczulenia i eutanazji muszą być wykonywane w oddzielnym pomieszczeniu w pomieszczeniu dla zwierząt.</li>
	<li>Przetnij skórę głowy w kierunku ogonowym i za pomocą małych nożyczek przetnij czaszkę obustronnie. Za pomocą kleszczy otwórz czaszkę i szybko wyjmij mózg z czaszki za pomocą szpatułki i połóż go na drugiej platformie lodowej. 
	UWAGA: Czas od ścięcia głowy do ekstrakcji mózgu nie powinien przekraczać 2 minut.</li>
	<li>Wykonaj 2 nacięcia w przedniej płaszczyźnie mózgu na całej powierzchni mózgu; pierwsze, aby usunąć przednią część kory i opuszki węchowe (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1C), a drugie na poziomie wzgórka dolnego, aby usunąć tylną część kory i móżdżku.</li>
	<li>Przyklej blok mózgu do płytki wibratomu stroną rostralną do góry (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1D,E). Podlewaj mózg regularnie (co 10 s) podczas całej procedury, aż zostanie zanurzony w komorze krojenia wibratomu.</li>
	<li>Wykonaj cienkie plastry o grubości 350 μm zawierające dLGN za pomocą wibratomu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). Usuń korę i hipokamp ze śródmózgowia za pomocą ołówka, delikatnie pociągając za te struktury.</li>
	<li>Odsysanie plastrów za pomocą złamanej pipety Pasteura podłączonej do elastycznej gumowej przyssawki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1H).</li>
	<li>Pozwól plastrom zregenerować się przez 20-30 minut w roztworze regeneracyjnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I).</li>
</ol>
3. Elektrofizjologia z klamrą krosową całej komórki
UWAGA: Do nagrań z całych komórek z neuronów przekaźnikowych dLGN, użyj specjalnego wzmacniacza patch-clamp.
<ol>
	<li>Włączyć pompy urządzenia, aby zewnątrzkomórkowy roztwór soli fizjologicznej (patrz skład w kroku 2.1) krążył w komorze rejestracyjnej.</li>
	<li>Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy, mieszając 120 mM K-glukonianu, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,5 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 2 mM Na2ATP i 0,3 mM NaGTP (pH 7,4). 
	UWAGA: Roztwór wewnątrzkomórkowy można przygotować wcześniej i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80°C. Po rozmrożeniu roztwór utrzymuje się w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać bloker kanału GABAA, pikrotoksynę (100 μM stężenie końcowe) i antagonistę jonotropowego receptora glutaminianu, kynurenian (2 mM, stężenie końcowe), do soli fizjologicznej.</li>
	<li>Przenieś plasterek do zanurzonej komory zamontowanej na pionowym mikroskopie. Komora jest kontrolowana pod względem temperatury 30 °C i stale perfuzjowana zrównoważonym aCSF.</li>
	<li>Umieść platynowy drut w kształcie litery U na plasterku i ustaw plasterek, aby wyświetlić dLGN (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Przygotować pipety do plastrów z probówek ze szkła borokrzemianowego ciągniętych za pomocą ściągacza. Upewnij się, że pipety z plastrem mają rezystancję 5-10 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.</li>
	<li>Wizualizuj dLGN w dużym powiększeniu (40x lub 60x) i wybierz neuron do rejestracji patch-clamp za pomocą mikroskopii wideo w podczerwieni z kontrastem interferencji różnicowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Wybierz neurony na podstawie ich zdrowego wyglądu (tj. lekko spuchnięte z ostrymi konturami błony).</li>
	<li>Umieść pipetę z plastrem na wybranym neuronie ze stałym dodatnim ciśnieniem za pomocą mikromanipulatora.
	<ol>
		<li>Ustaw wzmacniacz w trybie VC i wstrzyknij krok napięcia 5 mV. Ustaw napięcie na -65 mV. Następnie zwolnij nadciśnienie, aby uzyskać uszczelnienie o wysokiej rezystancji (odpowiadającej zmniejszeniu prądu w odpowiedzi na kroki napięcia). Lekko przecisnąć pipetę, aby uzyskać wyraźne stany nieustalone.</li>
		<li>Ustaw wzmacniacz w trybie CC, zrównoważ mostek, aby skompensować opór dostępu i utrzymuj neuron na poziomie -65 mV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Odbieraj sygnały o częstotliwości 20 kHz, aby lepiej wykrywać szybkie potencjały czynnościowe. Ustaw filtr dolnoprzepustowy na 10 kHz dla sygnałów napięciowych i prądowych.</li>
	<li>Monitoruj pobudliwość neuronów w okresie kontrolnym trwającym około 10 minut, wstrzykując dodatni impuls prądu (zwykle ~80-250 pA podczas 500 ms) wystarczający do wywołania 3-5 potencjałów czynnościowych w warunkach kontrolnych z częstotliwością 0,1 Hz.</li>
	<li>Monitoruj rezystancję wejściową neuronu przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą krótkiego ujemnego impulsu prądu (zwykle -20 pA przez 100 ms). Utrzymuj stałą amplitudę impulsu prądowego przed i po indukcji LTP-IE.</li>
</ol>
5. Indukcja LTP-IE
<ol>
	<li>Po okresie kontrolnym indukować LTP-IE poprzez wywoływanie ciągów 15 impulsów wywoływanych przez 15 krótkich kroków (2-5 ms) prądu depolaryzującego dostarczanego z częstotliwością 40 Hz przez 10 min.</li>
	<li>Wybierz amplitudę impulsu prądowego, aby za każdym razem wywołać pojedynczy potencjał czynnościowy (tj. 15 potencjałów czynnościowych na pociąg). 
	UWAGA: Każdy ciąg 15 impulsów jest wywoływany z częstotliwością 0,1 Hz (tj. 60 pociągów i 900 skoków).</li>
</ol>
6. Analiza danych
UWAGA: Procedura analizy jest taka sama przed (warunki kontrolne) i po indukcji LTP-IE.
<ol>
	<li>Dla każdej zarejestrowanej ścieżki należy obliczyć rezystancję wejściową (Rin) od odpowiedzi napięciowej na mały impuls prądu ujemnego wstrzyknięty przed krokiem badania prądu (Rin =krok V/krok I). Jeśli w okresie kontrolnym nastąpi wzrost lub spadek rezystancji wejściowej (więcej niż 10%), należy odrzucić eksperyment.</li>
	<li>Wybierz zarejestrowane ścieżki na podstawie potencjału membrany przed jakimkolwiek wstrzyknięciem prądu. Należy przechowywać tylko ścieżki o spoczynkowym potencjale błonowym od -67 do -63 mV.</li>
	<li>Określ ilościowo LTP-IE w okresie 10 minut, 20 minut po rozpoczęciu okresu po indukcji, mierząc liczbę AP wywołanych przez każdy impuls prądowy i uśredniając każdą minutę za pomocą domowej rutyny w oprogramowaniu do analizy danych (patrz Plik uzupełniający 1 dla procedury Igor Pro). Wykrywanie skoków, gdy sygnał napięcia przekracza 0 mV. 
	UWAGA: LTP-IE jest wyrażona jako liczba potencjałów czynnościowych wywołanych przez wstrzyknięcie impulsu prądowego po protokole indukcji w porównaniu do przed (%). Analizę wykonano w czasie -10-0 min dla linii bazowej i +20/+30 min dla testu.</li>
</ol>

<ol><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Wiesel, T. N., Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+visual+deprivation+on+morphology+and+physiology+of+cells+in+the+cat%27s+lateral+geniculate+body%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Effect of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body.</a> J Neurophysiol. 26, 978-993 (1963).</li>
<li>Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thalamus+is+more+than+just+a+relay%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The thalamus is more than just a relay.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (4), 417-422 (2007).</li>
<li>Rose, T., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+in+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity in the lateral geniculate nucleus.</a> Curr Opin Neurobiol. 53, 22-28 (2018).</li>
<li>Duménieu, M., Marquèze-Pouey, B., Russier, M., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+plasticity+in+subcortical+visual+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of plasticity in subcortical visual areas.</a> Cells. 10 (11), 3162(2021).</li>
<li>Hess, R. F., Thompson, B., Gole, G., Mullen, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+responses+from+the+lateral+geniculate+nucleus+in+humans+with+amblyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deficient responses from the lateral geniculate nucleus in humans with amblyopia.</a> Eur J Neurosci. 29 (5), 1064-1070 (2009).</li>
<li>Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+retinal+axons+converge+onto+relay+cells+in+the+adult+mouse+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Multiple retinal axons converge onto relay cells in the adult mouse thalamus.</a> Cell Rep. 12 (10), 1575-1583 (2015).</li>
<li>Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fuzzy+logic+of+network+connectivity+in+mouse+visual+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The fuzzy logic of network connectivity in mouse visual thalamus.</a> Cell. 165 (1), 192-206 (2016).</li>
<li>Rompani, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+visual+integration+in+the+lateral+geniculate+nucleus+revealed+by+single-cell-initiated+transsynaptic+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Different modes of visual integration in the lateral geniculate nucleus revealed by single-cell-initiated transsynaptic tracing.</a> Neuron. 93 (4), 767-776 (2017).</li>
<li>Sommeijer, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+inhibition+regulates+critical-period+plasticity+in+visual+cortex+and+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamic inhibition regulates critical-period plasticity in visual cortex and thalamus.</a> Nat Neurosci. 20 (12), 1715-1721 (2017).</li>
<li>Jaepel, J., Hübener, M., Bonhoeffer, T., Rose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+geniculate+neurons+projecting+to+primary+visual+cortex+show+ocular+dominance+plasticity+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral geniculate neurons projecting to primary visual cortex show ocular dominance plasticity in adult mice.</a> Nat Neurosci. 20 (12), 1708-1714 (2017).</li>
<li>Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+synaptic+plasticity%3A+role+of+nonsynaptic+plasticity+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory.</a> Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).</li>
<li>Debanne, D., Inglebert, Y., Russier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+intrinsic+neuronal+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of intrinsic neuronal excitability.</a> Curr Opin Neurobiol. 54, 73-82 (2019).</li>
<li>Sourdet, V., Russier, M., Daoudal, G., Ankri, N., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+enhancement+of+neuronal+excitability+and+temporal+fidelity+mediated+by+metabotropic+glutamate+receptor+subtype+5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term enhancement of neuronal excitability and temporal fidelity mediated by metabotropic glutamate receptor subtype 5.</a> J Neurosci. 23 (32), 10238-10248 (2003).</li>
<li>Campanac, E., Gasselin, C., Baude, A., Rama, S., Ankri, N., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+intrinsic+excitability+in+basket+cells+maintains+excitatory-inhibitory+balance+in+hippocampal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Enhanced intrinsic excitability in basket cells maintains excitatory-inhibitory balance in hippocampal circuits.</a> Neuron. 77 (4), 712-722 (2013).</li>
<li>Incontro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+tune+intrinsic+excitability+in+O-LM+interneurons+by+direct+modulation+of+postsynaptic+Kv7+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids tune intrinsic excitability in O-LM interneurons by direct modulation of postsynaptic Kv7 channels.</a> J Neurosci. 41 (46), 9521-9538 (2021).</li>
<li>Sammari, M., Inglebert, Y., Ankri, N., Russier, M., Incontro, S., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theta+patterns+of+stimulation+induce+synaptic+and+intrinsic+potentiation+in+O-LM+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Theta patterns of stimulation induce synaptic and intrinsic potentiation in O-LM interneurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2205264119(2022).</li>
<li>Cudmore, R. H., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+of+intrinsic+excitability+in+LV+visual+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation of intrinsic excitability in LV visual cortical neurons.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 341-348 (2004).</li>
<li>Nataraj, K., Le Roux, N., Nahmani, M., Lefort, S., Turrigiano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+deprivation+suppresses+L5+pyramidal+neuron+excitability+by+preventing+the+induction+of+intrinsic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visual deprivation suppresses L5 pyramidal neuron excitability by preventing the induction of intrinsic plasticity.</a> Neuron. 68 (4), 750-762 (2010).</li>
<li>Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+regulation+of+intrinsic+neuronal+excitability+improves+stimulus+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo.</a> Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).</li>
<li>Desai, N. S., Rutherford, L. C., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+the+intrinsic+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plasticity in the intrinsic excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 2 (6), 515-520 (1999).</li>
<li>Brown, A. P. Y., Cossell, L., Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+experience+regulates+the+intrinsic+excitability+of+visual+cortical+neurons+to+maintain+sensory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Visual experience regulates the intrinsic excitability of visual cortical neurons to maintain sensory function.</a> Cell Rep. 27 (3), 685-689 (2019).</li>
<li>Denman, D. J., Contreras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+parallel+streams+through+the+mouse+dorsal+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">On parallel streams through the mouse dorsal lateral geniculate nucleus.</a> Front Neural Circuits. 10, 20(2016).</li>
<li>Sriram, B., Meier, P. M., Reinagel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+tuning+of+dorsal+lateral+geniculate+nucleus+neurons+in+unanesthetized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial tuning of dorsal lateral geniculate nucleus neurons in unanesthetized rats.</a> J Neurophysiol. 115 (5), 2658-2671 (2016).</li>
<li>Duménieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+activity+enhances+neuronal+excitability+in+thalamic+relay+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Visual activity enhances neuronal excitability in thalamic relay neurons.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Chen, C., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+remodeling+of+the+retinogeniculate+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental remodeling of the retinogeniculate synapse.</a> Neuron. 28 (3), 955-966 (2000).</li>
<li>Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamus+plays+a+central+role+in+ongoing+cortical+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamus plays a central role in ongoing cortical functioning.</a> Nat Neurosci. 19 (4), 533-541 (2016).</li>
<li>Cudmore, R. H., Fronzaroli-Molinieres, L., Giraud, P., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike-time+precision+and+network+synchrony+are+controlled+by+the+homeostatic+regulation+of+the+D-type+potassium+current%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spike-time precision and network synchrony are controlled by the homeostatic regulation of the D-type potassium current.</a> J Neurosci. 30 (38), 12885-12895 (2010).</li>
<li>Zbili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+axonal+Kv1.1+channels+accounts+for+both+synaptic+and+intrinsic+modifications+in+the+hippocampal+CA3+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of axonal Kv1.1 channels accounts for both synaptic and intrinsic modifications in the hippocampal CA3 circuit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (47), e2110601118(2021).</li>
<li>Gray, C. M., Singer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+neuronal+oscillations+in+orientation+columns+of+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific neuronal oscillations in orientation columns of cat visual cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (5), 1698-1702 (1989).</li>
<li>Galuske, R. A. W., Munk, M. H. J., Singer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+between+gamma+oscillations+and+neuronal+plasticity+in+the+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Relation between gamma oscillations and neuronal plasticity in the visual cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (46), 23317-23325 (2019).</li>
<li>Inglebert, Y., Aljadeff, J., Brunel, N., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+rules+with+physiological+calcium+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity rules with physiological calcium levels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33639-33648 (2020).</li>
<li>Blitz, D. M., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+specificity+of+feed-forward+inhibition+within+the+LGN%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Timing and specificity of feed-forward inhibition within the LGN.</a> Neuron. 45 (6), 917-928 (2005).</li>
<li>Chrobok, L., Palus-Chramiec, K., Chrzanowska, A., Kepczynski, M., Lewandowski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+excitatory+actions+of+orexins+upon+thalamo-cortical+neurons+in+dorsal+lateral+geniculate+nucleus+-+implications+for+vision+modulation+by+arousal%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multiple excitatory actions of orexins upon thalamo-cortical neurons in dorsal lateral geniculate nucleus - implications for vision modulation by arousal.</a> Sci Rep. 7 (1), 7713(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Informujemy tutaj o indukcji LTP-IE w neuronach dLGN utrzymywanych przy życiu w ostrych wycinkach mózgu poprzez stymulację zarejestrowanego neuronu do wywołania potencjałów czynnościowych z częstotliwością 40 Hz przez 10 minut. Protokół ten jest prosty do wdrożenia w każdym laboratorium neurofizjologicznym, ponieważ wymaga minimalnej liczby sprzętu (slicer, mikroskop, 1 wzmacniacz, 1 płytka akwizycyjna i komputer). Jednak w celu zebrania cennych danych należy przestrzegać kilku krytycznych kroków. Pierwszym krytycznym krokiem w ramach protokołu jest jakość tkanki mózgowej. Zdrowy plasterek wzgórza zawiera wiele neuronów od powierzchni do środka wycinka (~150 μm). Zdrowe neurony wydają się lekko spuchnięte, podczas gdy umierające neurony są zwykle pomarszczone. Drugim krytycznym krokiem jest stabilność zapisu podczas linii bazowej. Liczba potencjałów czynnościowych powinna być stabilna, bez żadnego rozbiegu lub wybiegu. Ponadto rezystancja wejściowa testowana krótkim impulsem prądu hiperpolaryzacyjnego nie powinna wykazywać żadnej zmiany większej niż 10%. Wreszcie, prąd podtrzymania musi być stabilny w granicach +/- 10 pA. Taki protokół indukcji został po raz pierwszy użyty do indukcji LTP-IE w neuronach kory wzrokowej19,20. Pokazujemy tutaj, że protokół ten może również indukować wewnętrzne wzmocnienie w neuronach przekaźnikowych wzgórza układu wzrokowego26. Indukcja impulsów za pomocą wstrzyknięcia prądu stałego ma naśladować stymulację wejściową siatkówki, która normalnie napędza neurony dLGN, ponieważ stymulacja pojedynczego włókna siatkówki zwykle wywołuje pobudzający potencjał postsynaptyczny (EPSP), który jest w stanie wyzwolić potencjały czynnościowe w neuronie dLGN27,28. Mechanizmy ekspresji LTP-IE w neuronach dLGN zostały zbadane w oryginalnej publikacji26 i ujawniły, że kanały Kv1 są regulowane w dół po indukcji LTP-IE. Tak więc regulacja w dół kanałów Kv1 jest odpowiedzialna zarówno za LTP-IE w szybko rosnących interneuronach korowych16 i neuronach dLGN26, jak i plastyczność homeostatyczną w regionie CA329,30. Jednak szlak sygnałowy różni się, ponieważ kinaza białkowa A (PKA) jest zaangażowana w neurony dLGN, podczas gdy sugeruje się główną rolę mTOR w szybko rosnących interneuronach.
Niniejszy protokół zapewnia powtarzalne wyniki w zastosowanych tutaj warunkach eksperymentalnych: 3 mM Ca2+, 2 mM Mg2+, pikrotoksyna i kinureniat, 10-minutowa stymulacja przy 40 Hz u szczurów w wieku 19-25 dni26. Rzeczywiście, średnio protokół ten pozwala na 2-krotny wzrost pobudliwości. Wielkość zwiększonej pobudliwości zmniejsza się wraz z czasem trwania stymulacji, częstotliwością stymulacji lub wiekiem zwierzęcia26. Przed otwarciem oczu nie można zaobserwować LTP-IE. Częstotliwość stosowana do indukowania długotrwałej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej odpowiada paśmie gamma oscylacji mózgu, o którym wiadomo, że jest częstotliwością wiążącą percepcję zmysłową31 i promuje plastyczność układu wzrokowego32.
Jeśli jednak zastosowano niższe stężenie wapnia (tj. 1,5 mM Ca2+), protokół prawdopodobnie musi zostać zmieniony, ponieważ wcześniej wykazano to dla plastyczności synaptycznej33. W takim przypadku częstotliwość stymulacji prawdopodobnie będzie musiała zostać podniesiona do 60-80 Hz. Uważa się, że częstość występowania blokerów receptora GABA (pikrotoksyny gabazyny) stosowanych w niniejszym protokole na indukcję LTP-IE jest ograniczona, ponieważ skoki są wywoływane przez wstrzyknięcie prądu stałego. Niemniej jednak, w sytuacji in vivo , w której potencjały czynnościowe są wywoływane w neuronach dLGN przez stymulację siatkówki, rekrutowane wejście GABA-ergiczne34 prawdopodobnie podniosłoby próg skoku. W związku z tym silniejsze bodźce siatkówkowe byłyby prawdopodobnie konieczne do wyzwolenia LTP-IE w neuronach dLGN. Jednak systemy neuromodulatorów aktywne podczas pobudzenia, takie jak oreksyna, mogą obniżyć próg35.
Indukcję długotrwałej plastyczności wewnętrznej w neuronach przekaźnikowych dLGN można osiągnąć albo poprzez deprywację wzrokową, stymulację bodźców siatkówki w celu wywołania potencjałów czynnościowych, albo bezpośrednio poprzez wywołanie potencjałów czynnościowych poprzez wstrzyknięcie prądu do zarejestrowanych neuronów26. Ten ostatni protokół jest zdecydowanie najprostszą metodą, ponieważ jest szybki do wdrożenia i zapewnia wyniki równoważne z procedurą symulacji synaptycznej26.
Wykazano, że protokół ten indukuje LTP-IE zarówno w neuronach piramidowych kory wzrokowej19 , jak i w neuronach przekaźnikowych wzgórza26. Prawdopodobnie może być również wykorzystany do indukowania długotrwałej plastyczności pobudliwości neuronalnej w innych podkorowych jądrach wzrokowych, w tym w brzusznym LGN (vLGN) lub wzgórku górnym (SC).

Ogólnym celem tego artykułu metodycznego jest dostarczenie prostego sposobu na wywołanie długotrwałej plastyczności pobudliwości neuronalnej w wzrokowych neuronach wzgórzowych szczura in vitro, przy użyciu standardowego trybu zacisku prądowego techniki zacisku krosowego1,2. Uzasadnieniem rozwoju tej techniki jest jej prostota i powtarzalność. Przewagą nad technikami alternatywnymi, takimi jak stymulacja wejść synaptycznych w połączeniu lub nie z postsynaptycznym potencjałem czynnościowym dostarczanym w danym czasie, jest jego niezawodność.
Tradycyjnie uważa się, że plastyczność układu wzrokowego wyraża się wyłącznie na poziomie korowym, podczas gdy jądro kolankowate grzbietowo-boczne (dLGN), podstawowa struktura odbiorcy danych siatkówkowych na poziomie wzgórza, jest tradycyjnie uważane za przekaźnik informacji wizualnej3. Jednak ten początkowy wniosek został zakwestionowany przez ostatnie prace wskazujące, że ten uproszczony pogląd nie jest już aktualny4,5,6. Na przykład funkcjonalne deficyty w odpowiedzi wzrokowej są już obserwowane u pacjentów z niedowidzeniem na etapie LGN7. Ponadto duża część neuronów przekaźnikowych dLGN na danym terytorium monokularowym otrzymuje dane wejściowe z każdego oka, co wskazuje na potencjalną obuoczność dla dużej części neuronów dLGN8,9,10. Co więcej, deprywacja jednooczna powoduje znaczącą zmianę dominacji oka w neuronach dLGN5,11,12.
Wśród mechanizmów funkcjonalnej plastyczności, które mogą wystąpić w przypadku zmiany dominacji oka, potencjalnym kandydatem jest plastyczność wewnętrznej pobudliwości neuronalnej. Rzeczywiście, wiele obszarów mózgu, w tym obszary wzrokowe, wyraża wewnętrzną plastyczność po wykonaniu różnych zadań behawioralnych13,14. Długoterminowa wewnętrzna plastyczność została zgłoszona w neuronach ośrodkowych po stymulacji doprowadzającego glutaminianu Inputs15,16,17,18, aktywność skokowa19,20, stymulacja sensoryczna21 lub następujące działanie lub deprywacja sensoryczna20,22,23. W tym miejscu opisujemy protokół pozwalający na indukcję długotrwałego wzmocnienia wewnętrznej pobudliwości (LTP-IE) w neuronach przekaźnikowych dLGN po aktywności impulsowej z częstotliwością 40 Hz. Częstotliwość wyzwalania 40 Hz odpowiada częstotliwości obserwowanej w większości neuronów dLGN in vivo po stymulacji wzrokowej24,25.

<table><tbody><tr><td>Zautomatyzowany mikrotom z ostrzem wibracyjnym</td><td>Leica</td><td>VT-1200S</td><td>wibratom/krajalnica</td></tr><tr><td>Rurka ze szkła borokrzemianowego</td><td>Phymep</td><td>B-15086-10</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler Typ V</td><td>Luigs& </td><td>Regulator temperatury</td>Neumann <td>Typ V</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Igor</td><td>oprogramowanie do analizy</td><td>falometrii</td><td></td></tr><tr><td>Wideomikroskopia na podczerwień</td><td>Olympus</td><td>XM-10 Kamera</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenate</td><td>Merk/Sigma</td><td>K3375</td><td>Bloker receptorów AMPA/NMDA</td></tr><tr><td>System akwizycji danych o niskim poziomie szumów</td><td>Axon - Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440A</td><td>interfejs analogowo-cyfrowy</td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td><td>Luigs& Neumann</td><td>LN Mini25</td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 200B</td><td>Axon - Urządzenia molekularne</td><td>N/A</td><td>Wzmacniacz patch-clamp</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Axon - Urządzenia molekularne</td><td>N/A</td><td>Wzmacniacz patch-clamp</td></tr><tr><td>Ściągacz PC-100 Ściągacz</td> do <td>mikropipet</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td></tr><tr><td>PClamp10</td><td>Axon - Urządzenia molekularne</td><td>Oprogramowanie</td><td>do nagrywania lamlerów krosowych</td> N/A</tr><tr><td>Pikrotoksyna</td><td>AbCam</td><td>ab120315</td><td>Bloker receptorów GABAA</td></tr><tr><td>Slice mini komora&nbsp;</td><td>Luigs& Neumann</td><td>LN Chambre Slice mini I-II</td> Mikroskop pionowy z <td>zanurzoną komorą</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX51 WI</td><td></td></tr></tbody></table>

indukowanie długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w neuronach grzbietowego bocznego jądra kolębiastego

Inducing Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability in Neurons of the Dorsal Lateral Geniculate Nucleus

Grzbietowe jądro kolankowate boczne (dLGN) od dawna uważane jest za podstawowy przekaźnik informacji wizualnej przemieszczającej się z siatkówki do obszarów korowych, ale ostatnie odkrycia sugerują w dużej mierze niedocenianą funkcjonalną plastyczność głównych komórek dLGN. Jednak mechanizmy komórkowe wspierające te zmiany nie zostały w pełni zbadane. W tym miejscu przedstawiamy protokół indukowania długotrwałego nasilenia wewnętrznej pobudliwości neuronalnej (LTP-IE) w grzbietowych komórkach przekaźnikowych dLGN z ostrych wycinków mózgu młodych szczurów. Plastyczność wewnętrzna jest na ogół indukowana równolegle z plastycznością synaptyczną. Jednak w neuronach dLGN LTP-IE jest niezawodnie indukowany przez aktywność impulsową z częstotliwością 40 Hz przez 10 minut. LTP-IE w neuronach przekaźnikowych dLGN jest długotrwały, ponieważ może być obserwowany do 40 minut po protokole indukcji. Podsumowując, wyniki tego badania dostarczają pierwszych dowodów na indukcję wewnętrznej plastyczności w komórkach przekaźnikowych dLGN, wskazując tym samym na rolę neuronów wzgórzowych w plastyczności wzrokowej zależnej od aktywności.

Neurony dLGN rejestrowano w konfiguracji whole-cell, a LTP-IE indukowano poprzez wywoływanie potencjałów czynnościowych z częstotliwością 40 Hz przez 10 min w obecności antagonistów jonotropowych receptorów glutaminianu i GABA (Ryc. 3A). Trzykrotny wzrost liczby potencjałów czynnościowych zaobserwowano 20-30 min po indukcji (Ryc. 3B) bez żadnych zmian w oporności wejściowej, Rin (Ryc. 3C). Protokół ten niezawodnie indukował LTP-IE w neuronach dLGN (Ryc. 3D)26. Wyniki te pokazują, że opisany tutaj protokół jest skuteczny w indukowaniu długotrwałej plastyczności pobudliwości neuronalnej w neuronach dLGN in vitro.
<img alt="Przygotowanie i krojenie tkanki do mikroskopii; konfiguracja mikrotomu i proces krojenia; etapy eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65950/65950fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Metoda otrzymywania skrawków mózgu zawierających dLGN. (A) Narzędzia niezbędne do wyjęcia mózgu. (B) Krojarce. (C) Krojenie mózgu w płaszczyznach czołowych. (D) Klej na płytce. (E) Ułożenie mózgu na płytce. (F) Mózg przyklejony do płytki. (G) Krojenie. (H) Pobieranie skrawka. (J) Skrawki w roztworze regeneracyjnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/65950fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy mysiego dLGN i vLGN, szczegóły komórkowe. Paski skali: 150 µm, 10 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65950/65950fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Widok skrawka zawierającego dLGN i wizualizacja neuronów pod mikroskopem. (A) Widok ogólny przy użyciu obiektywu 4x skrawka zawierającego dLGN i vLGN, unieruchomionego w komorze rejestracyjnej za pomocą nylonowej nici. (B) Widok przy użyciu obiektywu 40x neuronów dLGN w przeciwległym obszarze dLGN, zaznaczonym przerywanym prostokątem na panelu A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/65950fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki elektrofizjologiczne w dLGN wykazujące zmiany AP; wykres i analiza danych odpowiedzi neuronalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65950/65950fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Indukcja LTP-IE w neuronie dLGN. (A) Konfiguracja rejestracji i bodziec indukcyjny. Bodziec użyty do indukcji LTP-IE składał się z 15 impulsów o natężeniu ~1 nA, aby wywołać potencjał czynnościowy przy każdym depolaryzującym impulsie prądowym. (B) Przebieg czasowy LTP-IE. Góra: reprezentatywne ślady przed (czarny) i po (czerwony) indukcji LTP-IE. Dół: przebieg czasowy znormalizowanej liczby potencjałów czynnościowych na impuls depolaryzujący w funkcji czasu. Zwróć uwagę na zwiększoną liczbę impulsów, która nie wykazuje spadku przez &gt;40 min. (C) Stabilność oporu wejściowego. Odchylenie potencjału wywołane ujemnym skokiem prądu przed (czarny) i po (czerwony) indukcji LTP-IE. Opór wejściowy mierzono przy stałej latencji (oznaczonej symbolem *). (D) Lewo: dane grupowe z 8 neuronów dLGN wykazujące powtarzalność LTP-IE. Prawo: dane grupowe z 8 neuronów dLGN wykazujące brak zmian Rin. Panel B został wykorzystany za zgodą Duménieu i wsp.26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/65950fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1: Analiza LTP-IE w programie Igor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/Supplementary%20File%201-Igor%20LTP-IE%20analysis.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj opisujemy protokół indukowania długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronów w neuronach przekaźnikowych z grzbietowego bocznego jądra kolankowatego utrzymywanego w wycinkach mózgu ex vivo.

Indukowanie długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w neuronach grzbietowego bocznego jądra kolębiastego

The dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) has long been held to act as a basic relay for visual information traveling from the retina to cortical ...

Nasze badania koncentrują się na roli kanałów jonowych w plastyczności funkcjonalnej w zaburzeniach mózgu. W szczególności badamy tutaj, czy neurony ze wzgórza wzrokowego mogą ulegać plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej. Po raz pierwszy ustaliliśmy, że neurony z jądra kolankowatego bocznego wyrażają plastyczność wewnętrznej pobudliwości neuronalnej po deprywacji jednoocznej lub po stymulacji regionalnych bodźców.Zapewniamy prosty sposób na wywołanie długotrwałej plastyczności pobudliwości neuronalnej w wzrokowych neuronach wzgórzowych szczura in vitro. W tym celu wykorzystujemy zapisy elektrofizyczne typu patch-clamp oraz narzędzia farmakologiczne na tkance mózgowej ex vivo. Nasze wyniki stwarzają możliwość zbadania wewnętrznej plastyczności innych podkorowych jąder wzrokowych mózgu.Na początek przygotuj narzędzia preparacyjne i dwie platformy lodowe. Umieść lód w zewnętrznym zbiorniku i napełnij komorę krojenia wibratomu lodowatym roztworem do cięcia. Umieść głowę szczura poddanego eutanazji na pierwszej oblodzonej platformie i za pomocą małych nożyczek przetnij skórę głowy w kierunku ogonowym, a następnie czaszkę obustronnie.Za pomocą kleszczy i szpatułki otwórz czaszkę, szybko wyjmij mózg z czaszki i umieść go na drugiej platformie lodowej. Wykonaj nacięcie w płaszczyźnie czołowej, aby usunąć korę przednią i opuszki węchowe, a następnie drugie cięcie na poziomie dolnego wzgórka, aby usunąć tylną korę i móżdżek. Przymocuj blok mózgowy do płytki wibratomu stroną rostralną do góry.Regularnie podlewaj mózg podczas zabiegu, aż zostanie całkowicie zanurzony w komorze krojenia. Za pomocą wibratomu wytnij 350 mikrometrowych plastrów zawierających grzbietowe boczne jądro kolankowate. Następnie za pomocą ołówka delikatnie usuń korę i hipokamp ze śródmózgowia.Na początek zdobądź wycinek mózgu szczura zawierający grzbietowe jądro kolankowate boczne lub dLGN i zamontuj go w zanurzonej komorze pod pionowym mikroskopem. Umieść platynowy drut w kształcie litery U na plasterku. Korzystając z mikroskopii wideo w podczerwieni z kontrastem różnicowym, zidentyfikuj zdrowy neuron w dLGN w celu rejestracji patch-clamp.Za pomocą mikromanipulatora umieść pipetę plastrową na wybranym neuronie ze stałym dodatnim ciśnieniem. Ustaw wzmacniacz w trybie VC i wstrzyknij krok napięcia 10 miliwoltów. Ustaw napięcie na minus 65 miliwoltów.Następnie ustaw wzmacniacz w trybie CC, zrównoważ mostek, aby skompensować opór dostępu i utrzymuj neuron na minus 65 miliwoltach. W celu pozyskania danych ustaw okres kontrolny na około 10 minut z dodatnim impulsem prądu o częstotliwości 0,1 herca i monitoruj pobudliwość neuronów. Następnie obserwuj opór wejściowy neuronu przez cały czas za pomocą krótkiego ujemnego impulsu prądu.Po okresie kontrolnym wywołaj ciągi 15 impulsów wywołanych przez 15 krótkich kroków od dwóch do pięciu milisekund prądu depolaryzującego, dostarczanego z częstotliwością 40 Hz przez 10 minut. Wybierz amplitudę impulsu prądowego, aby za każdym razem wywołać pojedynczy potencjał czynnościowy. Na koniec przetestuj pobudliwość neuronów po protokole indukcji.Neurony dLGN zarejestrowano w konfiguracji całej komórki, a LTP-IE indukowano potencjałem czynnościowym wystrzeliwanym z częstotliwością 40 Hz przez 10 minut w obecności jonotropowego glutaminianu i antagonistów receptora GABA. Trzykrotny wzrost liczby potencjałów czynnościowych zaobserwowano od 20 do 30 minut po indukcji LTP-IE bez zmiany rezystancji wejściowej.

inducing-long-term-plasticity-intrinsic-neuronal-excitability-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje metodę wywoływania ukierunkowanego uszkodzenia neuronów u larw Drosophila za pomocą lasera o dużej mocy. Po umieszczeniu larwy pod mikroskopem, laser o małej mocy skanuje w poszukiwaniu neuronów fluorescencyjnych, a następnie zwiększa moc lasera w celu wywołania miejscowego uszkodzenia. Uraz potwierdza zwiększona fluorescencja i krater w miejscu urazu.

Wywoływanie ukierunkowanego uszkodzenia neuronów za pomocą lasera o dużej mocy u larwy Drosophila

Transgeniczne i nokautujące mysie modele chorób neurologicznych są przydatne do badania roli genów w prawidłowej i nieprawidłowej neurofizjologii. W artykule opisano metodologie, które można wykorzystać do badania długotrwałego wzmocnienia, mechanizmu komórkowego, który może leżeć u podstaw uczenia się i pamięci, w transgenicznych i nokautujących, swobodnie zachowujących się mysich modelach neuropatologii.

Długotrwałe nasilenie synapsy zakrętu perforacyjnego i zębatego u swobodnie zachowujących się myszy

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Stymulacja nerwu błędnego (VNS) pojawiła się jako narzędzie do wywoływania ukierunkowanej plastyczności synaptycznej w przodomózgowiu w celu modyfikacji szeregu zachowań. Ten protokół opisuje, jak zaimplementować VNS, aby ułatwić konsolidację pamięci wygaszania strachu.

Stymulacja nerwu błędnego jako narzędzie do indukowania plastyczności w szlakach istotnych dla uczenia się wymierania

Ten protokół opisuje zestaw metod do identyfikacji specyficznej dla typu komórki funkcjonalnej łączności sygnałów dalekiego zasięgu z odległych obszarów mózgu za pomocą stymulacji optogenetycznej w wycinkach mózgu ex vivo.

Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy

Tutaj prezentujemy protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu zawierających jądro kolankowate boczne oraz badania elektrofizjologicznego funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych. Protokół ten zapewnia skuteczny sposób badania synaps z wysokim i niskim prawdopodobieństwem uwalniania w tych samych ostrych wycinkach mózgu.

Badania elektrofizjologiczne funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych

U niektórych zwierząt manipulowanych genami, użycie pojedynczego protokołu może nie wywołać LTD w komórkach Purkinjego móżdżku, a między LTD a uczeniem motorycznym może wystąpić rozbieżność. Do oceny indukcji LTD u zwierząt manipulowanych genami koniecznych jest wiele protokołów. Pokazane są standardowe protokoły.

Ocena długotrwałej indukcji depresji w wycinkach móżdżku u dorosłych

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Opisane tutaj metody opisują procedurę używaną do optogenetycznie odwracającej plastyczności wywołanej przez kokainę w behawioralnie istotnym obwodzie u szczurów. Utrzymująca się stymulacja optyczna synaps wzgórzowo-migdałowatych o niskiej częstotliwości wywołuje długotrwałą depresję (LTD). Indukowane optogenetycznie LTD in vivo u szczurów doświadczonych z kokainą skutkowało późniejszym osłabieniem poszukiwania narkotyków motywowanego sygnałem.

Wykorzystanie optogenetyki do odwrócenia neuroplastyczności i zahamowania poszukiwania kokainy u szczurów

Poznaj metodę indukowania długoterminowej plastyczności pobudliwości w neuronach grzbietowego bocznego jądra kolębiastego szczura przy użyciu patch-clamp. Protokół umożliwia badanie mechanizmów plastyczności nerwowej.

Indukowanie długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w neuronach grzbietowego bocznego jądra kolębiastego (Wideo) | JoVE Journal

Indukowanie długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w neuronach grzbietowego bocznego jądra kolębiastego

Przeglądaj więcej filmów