Obrazowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i egzocytozy w żywych plemnikach myszy

Celem naszych badań jest lepsze zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących pracę plemników, w tym procesów takich jak kapacytacja i zapłodnienie. W szczególności badamy, w jaki sposób lipidy błonowe aktywują sygnalizację wapniową i dostępność akrosomów. Protokół ten wypełnia lukę w naszym zrozumieniu zależności między pojemnością, aktywacją plemników, sygnalizacją wapniową i egzocytozą akrosomów.

Do zalet tego protokołu należy obrazowanie plemników w warunkach fizjologicznych, a także jego zdolność do jednoczesnego monitorowania zarówno sygnalizacji wapniowej, jak i egzocystozy akrosomów bez konieczności wykonywania skomplikowanych procedur wstępnego ładowania lub stania. Zacznij od pobrania plemników z najądrza wyizolowanego z transgenicznego modelu myszy wykazującej ekspresję AcroSensE. Wykonaj pobranie nasienia w 3,5-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 0,5 mililitra pożywki MW, umożliwiając 15-minutową procedurę pływania w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie usuń tkankę najądrza z naczynia do zbierania wody. Przenieść pożywkę zawierającą plemniki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego odwirować zawiesinę o sile 100 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Za pomocą plastikowej pipety zbierz supernatant MW zawierający plemniki, odrzucając wszelkie osadki dużych resztek tkanek i przenieś je do probówki z okrągłym dnem.

Dostosuj objętość supernatantu do jednego mililitra, dodając 500 mikrolitrów pożywki MW, wstępnie podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Odwirować tę mieszaninę przy 400 G przez osiem minut w temperaturze pokojowej w probówce okrągłodennej. Następnie ostrożnie usuń supernatant, pozostawiając luźno granulowane plemniki.

Używając pipety do przenoszenia o dużym otworze, ponownie zawiesić plemniki, delikatnie stukając ręcznie w rurkę, co jest znane jako przesuwanie palcem. Gdy plemniki zostaną równomiernie zawieszone, przenieś je do nowej rurki z okrągłym dnem. Aby rozpocząć, pociągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej dwóch milimetrów i średnicy wewnętrznej 1,56 milimetra, postępując zgodnie z odpowiednimi ustawieniami.

Przed wypełnieniem kapilary przed każdym eksperymentem użyj cienkiej pęsety, aby otworzyć końcówkę kapilary. Do obciążenia kapilary należy użyć roztworu stymulującego o stężeniu od trzech do pięciu razy większym niż normalne stężenie wymaganego stymulantu. Za pomocą cienkiej plastikowej pipety transferowej powoli wstrzyknąć roztwór stymulujący do kapilary, aż wypełni się trzy czwarte jej długości.

Wyeliminuj wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą powstać podczas procesu napełniania, delikatnie przesuwając kapilarę. Następnie zamontuj wypełnioną kapilę na mikromanipulatorze. Skonfiguruj ustawienia systemu dostarczania pojedynczych komórek, aby zapewnić dziesięciosekundowy impuls przy 5 PSI.

Podłącz kapilę borokrzemianową zamontowaną na mikromanipulatorze do uchwytu na pipety systemu dostarczania pojedynczych komórek. Zastosuj krótkie zaciągnięcie trwające dwie sekundy pod ciśnieniem 20 PSI, obserwując końcówkę kapilarną, aby potwierdzić, że roztwór jest dozowany przez koniec końcówki. Zestaw jest teraz gotowy do użycia z mikroskopią do obrazowania w czasie rzeczywistym pojedynczego plemnika myszy.

Zacznij od pokrycia 35-milimetrowych nakrywek nakrywkowych poli-D-lizyną lub PDL. Aby to zrobić, dozuj 0,5 mikrolitra kropli PDL na środek naczynia z przykrywką. Za pomocą pipety z podziałką o pojemności 10 mikrolitrów rozsmaruj kroplę PDL na szkiełku nakrywkowym.

Pozostaw powlekane naczynie do wyschnięcia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. W celu zobrazowania świeżo pobranych plemników z mysiego modelu wykazującego ekspresję AcroSensE, należy dodać 80 mikrolitrów wstępnie przygotowanej zawiesiny nasienia do środka naczynia z szkiełkiem nakrywkowym pokrytym PDL. Następnie powoli dodaj do naczynia trzy mililitry uzupełnionej zmodyfikowanej pożywki bazowej Whittena, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza.

Przystąp do wykonywania obrazowania za pomocą kombinacji mikroskopu z zestawem do dostarczania stymulantu z pojedynczych komórek. Najpierw zamontuj naczynie zawierające plemniki na mikroskopie. Następnie za pomocą mikromanipulatora umieść końcówkę kapilary systemu dostarczania stymulantu około 100 mikronów z boku i pięć do 10 mikronów powyżej płaszczyzny interesującej nas komórki.

Umieść kapilarnę w odległości 100 mikronów od główki plemnika. Następnie rozpocznij sekwencję obrazowania pod mikroskopem. Obrazuj plemniki z dużą liczbą klatek na sekundę, najlepiej większą niż 10 klatek na sekundę.

10 sekund po rozpoczęciu akwizycji obrazu aktywuj system dostarczania pojedynczej komórki, aby dostarczyć dziesięciosekundowe zaciągnięcie się stymulantem. Kontynuuj przechwytywanie obrazów komórek przez 10 do 15 minut. W podobny sposób wyobraz sobie wiele komórek z jednego naczynia zgodnie z lokalizacjami pokazanymi na ekranie.