Name: Obrazowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i egzocytozy w żywych plemnikach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 4 s
Description: Poznaj obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki wapnia i egzocytozy akrosomu w żywych plemnikach myszy. Ta metoda pozwala badać sygnalizację wapniową i aktywację plemników w warunkach fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health R01-HD093827 i R03-HD090304 (A.J.T).

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Cornell (#2002-0095). Do niniejszego badania użyto myszy AcroSensE w wieku 8-10 tygodni2. Prośby o informacje na temat dostępności myszy AcroSensE można kierować do autora korespondencyjnego.
1. Pobieranie i mycie nasienia
<ol>
	<li>Zbierz plemniki ogona najądrza (więcej szczegółów na temat tej procedury znajduje się w11) od myszy AcroSensE. Pozostawić 15-minutową procedurę wypływania w 3,5 cm naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 0,5 ml zmodyfikowanej pożywki Whittena (MW) w temperaturze 37 °C. Naczynie powinno być przykryte w celu zmniejszenia parowania MW i powinno być przechylone tak, aby podłoże miało wystarczającą głębokość, aby pokryć najądrza ogona. 
	UWAGA: Zmodyfikowana pożywka Whittena (MW) zawiera 22 mM HEPES, 1,2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1 mM kwasu pirogronowego, 4,8 mM soli hemi-Ca2+ kwasu mlekowego, pH 7,35. Glukoza (5,5 mM), NaHCO3 (10 mM) i 2-hydroksypropylo-cyklodekstryna (CD; 3 mM) są uzupełniane (patrz tabela materiałów) w razie potrzeby do indukcji pojemności, a stężenia mogą być modyfikowane dla określonych eksperymentów. Ponadto zamiast CD można zastosować alternatywne akceptory steroli (np. albuminę surowicy bydlęcej lub lipoproteiny o dużej gęstości).</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy usuń tkankę najądrza z naczynia do pobierania wody. Przenieść pożywkę zawierającą nasienie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę o stężeniu 100 x g przez 1 minutę w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze pokojowej. Za pomocą plastikowej pipety usuń supernatant MW zawierający plemniki z wszelkich dużych resztek tkanki, które zostaną pokryte granulkami na tym etapie.</li>
	<li>Doprowadzić supernatant MW zawierający plemniki do całkowitej objętości 3 ml przez dodanie MW w temperaturze 37 °C. Wirować przy 400 x g przez 8 minut (w temperaturze pokojowej) w probówce z okrągłym dnem. Powoli usunąć supernatant MW z luźno osadzonych plemników.</li>
	<li>Jeśli jest żywotny, plemnik powinien wyglądać jak "puszysta" granulka. Delikatnie zawiesić plemniki poprzez rozcieranie za pomocą pipety transferowej o dużym otworze lub poprzez delikatne ręczne stukanie w rurkę ("przesuwanie palcem"). Po równomiernym zawieszeniu przenieś je do nowej rurki z okrągłym dnem. Użyj 10-20 μl zawiesiny nasienia, aby policzyć i ocenić ruchliwość. Rozcieńczyć plemniki w MW do stosowania. 
	UWAGA: W przypadku większości eksperymentów obejmujących kapacytację nasienia myszy stosuje się końcowe stężenie 5-10 milionów plemników / ml MW. Opisany tutaj protokół obrazowania nie wymaga kapacytacji plemników, chociaż jest to konieczne, aby plemniki nabyły zdolność do ulegania fizjologicznie istotnej egzocytozie akrosomowej. Można badać patologiczną egzocytozę lub egzocytozę indukowaną przez odczynniki, takie jak jonofor wapnia, bez kapażowania plemników. Dodatkowo można badać potencjalne zmiany w akrosomalnym wapniu w komórkach niezpojemnościowych w odpowiedzi na różne bodźce.</li>
	<li>Nasienia należy zużyć w ciągu 3-5 godzin od pobrania, zachowując jak najkrótszy czas i spójność między badaniami eksperymentalnymi.</li>
	<li>Wszystkie etapy zbierania i mycia należy wykonać w temperaturze 37 °C przy użyciu medium MW, stosując metody minimalizujące uszkodzenia membrany. Obejmuje to stosowanie plastikowych pipet transferowych o dużej średnicy lub końcówek do pipet z dużym otworem, które są zalecane do stosowania na wszystkich etapach zabiegu.</li>
</ol>
2. Powłoka poli-D-lizynowa nakrywek do obrazowania
UWAGA: Potrawy z poli-D-lizyny (PDL) powinny być przygotowywane na świeżo przed każdym eksperymentem.
<ol>
	<li>Dozować 0,5 μl kropli PDL (0,5 mg/ml, patrz Tabela Materiałów) na środek naczynia do szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Używając końcówki z podziałką 10 μl, rozprowadź kroplę PDL w poprzek szkiełka nakrywkowego (wzór krzyżowy, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Pozostawić do wyschnięcia w temperaturze 37 °C na 10 minut. Naczynia pokryte PDL przechowywać pod przykryciem w temperaturze 37 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Ciągnięcie kapilarne, ładowanie do zaciągania
<ol>
	<li>Pociągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego (OD, 2 mm, ID, 1.56 mm, patrz Tabela materiałów) używając następujących ustawień: Ciepło: 330, Ciągnięcie: 250, Prędkość: 250 i Czas: 70. Ten krok powinien być zoptymalizowany pod kątem konkretnego używanego ściągacza.</li>
	<li>Przed każdym eksperymentem należy załadować pojedynczą kapilarę roztworem stymulującym zawierającym 3-5 razy większe stężenie stymulantu (aby uwzględnić szybką dyfuzję roztworu podczas zaciągania się). Przed napełnieniem za pomocą cienkiej pęsety otwórz końcówkę kapilary w odległości około 1-2 mm od końca. Powinno to dać średnicę otworu ∼5 μm. Polerowanie na gorąco nie jest wymagane.</li>
	<li>Za pomocą cienkiej plastikowej pipety do przenoszenia powoli wstrzyknij roztwór stymulujący do kapilary, aż trzy czwarte jej długości będzie pełne.</li>
	<li>Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza powstałe podczas napełniania poprzez delikatne potrząśnięcie kapilarą.</li>
	<li>Zamontuj wypełnioną kapilarnę na mikromanipulatorze (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
4. Przygotowanie do podania stymulacji do zaciągania się
UWAGA: Aby zminimalizować ryzyko obrażeń użytkownika, podczas procedury zaciągania należy nosić okulary ochronne.
<ol>
	<li>Skonfiguruj ustawienia systemu dostarczania pojedynczej komórki, aby zapewnić impuls 10 s przy 5 psi.</li>
	<li>Podłącz kapilarnę borokrzemianową do uchwytu na pipety jednokomórkowego systemu dostarczania. Upewnij się, że uszczelki są szczelne.</li>
	<li>Obserwując końcówkę kapilarną, nałóż krótkie zaciągnięcie przez 2 sekundy przy 20 psi, aby upewnić się, że roztwór jest rzeczywiście dozowany przez koniec końcówki (niewielka kropla powinna być widoczna na końcu końcówki).</li>
</ol>
5. Mikroskopia i akwizycja obrazów
UWAGA: Dostępnych jest wiele marek mikroskopów, które mogą być używane; jednak minimalna liczba klatek na sekundę wynosi 3 klatki/s. Jeśli chodzi o kontrolę temperatury i środowiska, należy pamiętać, że rzeczywistą temperaturę medium w naczyniu należy potwierdzić, na przykład za pomocą bezdotykowego termometru na podczerwień.
<ol>
	<li>Dodać 80 μl rozcieńczonych plemników do środka naczynia nakrywkowego o średnicy 35 mm pokrytego poli-D-lizyną. W przypadku większości eksperymentów obejmujących kapacytację nasienia myszy stosuje się końcowe stężenie 5-10 milionów plemników / ml.</li>
	<li>Powoli dodawać do plemnika 3 ml ciepłej (37 °C) pożywki zasadowej MW uzupełnionej 10 mM CaCl2, 
	UWAGA: Można przeprowadzać eksperymenty w temperaturze pokojowej, aby spowolnić procesy komórkowe, ale ważne jest, aby pamiętać, że ponieważ kapacytacja jest pośredniczona przez wymianę lipidów i płynność mikro- i makrodomen, należy pamiętać, że fizjologicznie istotna kapacytacja i egzocytoza akrosomów są procesami zależnymi od temperatury.</li>
	<li>Zamontuj naczynie z plemnikami na mikroskopie (podgrzanym do 37 °C).</li>
	<li>Wzbudzić GCaMP3 za pomocą linii laserowej 488 nm i wyświetlić za pomocą filtra pasmowoprzepustowego (BP) 505-550 nm. Wzbudz mCherry za pomocą linii laserowej 555 nm i view za pomocą filtra BP 575-615 nm.</li>
	<li>Za pomocą mikromanipulatora (zaleca się przymocowanie manipulatora do stołu powietrznego, na którym ustawiono mikroskop.), umieść końcówkę kapilary około 100 μm z boku i 5-10 μm powyżej płaszczyzny interesującej nas komórki. 
	UWAGA: Roztwory stymulujące są wytwarzane w stężeniu 3-5x większym niż normalnie, aby skompensować szybką dyfuzję zachodzącą w objętości między kapilarą a komórką.</li>
	<li>Rozpocznij sekwencję obrazowania pod mikroskopem.</li>
	<li>Obrazuj plemniki z dużą liczbą klatek na sekundę, najlepiej >10 klatek/s. W tym przypadku zastosowano skaner rezonansowy, który umożliwia obrazowanie z prędkością 33 ms/klatkę.</li>
	<li>Dziesięć sekund po rozpoczęciu akwizycji obrazu pod mikroskopem aktywuj system dostarczania pojedynczych komórek, aby zainicjować 10-sekundowe zaciągnięcie stymulantem.</li>
	<li>Obrazuj komórki przez czas 10-15 min.</li>
	<li>Korzystając z systemu dostarczania pojedynczych komórek, zobrazuj wiele komórek z jednej płytki zgodnie z lokalizacjami podanymi w Rysunek 1B. 
	UWAGA: Nieleczone/niestymulowane plemniki pod mikroskopem powinny wydawać się przeważnie czerwone, z niską intensywnością zielonego sygnału. Główki plemników powinny być przymocowane do szkiełka nakrywkowego, a żywe plemniki można zidentyfikować po poruszających się ogonach. W plemnikach, które przechodzą AE, zielony sygnał GCaMP3 początkowo wzrośnie, a zarówno czerwony sygnał mCherry, jak i zielony sygnał GCaMP3 znikną, jeśli AE jest całkowite, jak pokazano w Rysunek 2. Zmniejszenie fluorescencji mCherry zapewnia bardziej szczegółowy wskaźnik czasu, w którym rozpoczyna się AE, ponieważ zmiany stężeń Ca2+ będą stale powodować zmiany intensywności fluorescencji GCaMP3.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu i danych
UWAGA: Analiza obrazu offline jest przeprowadzana za pomocą ImageJ (patrz Tabela materiałów). Wcześniej zgłaszano kilka etapów pośrednich w procesie prowadzącym do AE, w tym akrosomalny wzrost wapnia (ACR) i pełną fuzję błonową. To ostatnie prowadzi do utraty fluorescencji mCherry i dlatego reprezentuje pełne AE. W niektórych komórkach sygnały podobne do zdarzeń przed kolcem stopy (PSF) są obserwowane przy użyciu podejść amperometrycznych w badaniach egzocytozy (więcej szczegółów można znaleźć na stronie2). Dostępnych jest kilka opcjonalnych metod analizy surowych danych AcroSensE w celu ilościowego określenia ACR, AE i ich etapów pośrednich. Poniżej opisano niektóre z podstawowych metod analitycznych.
<ol>
	<li>W zależności od konkretnego rozszerzenia pliku systemu mikroskopowego, użyj narzędzia do podziału kanału (Obraz > Kolory > Podziel kanały), aby wygenerować indywidualne okna dla kanałów GCaMP3 i mCherry.</li>
	<li>Zsynchronizuj poszczególne okna za pomocą narzędzia "Synchronizuj okno" (Narzędzia do analizy > > Synchronizuj okna).</li>
	<li>Wybierz obszar zainteresowania (ROI) wokół główki plemnika w czerwonym kanale, aby uwzględnić region akrosomów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A, B). Narzędzie do synchronizacji umożliwia automatyczne zastosowanie tego samego wyboru obszaru na zielonym kanale, w którym plemniki są jeszcze zbyt ciemne, aby były widoczne.</li>
	<li>Wybierz wtyczkę "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) lub "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer), aby wykreślić zmianę intensywności fluorescencji w funkcji klatek/czasu dla każdego z dwóch kanałów.</li>
	<li>Skopiuj dane do arkusza kalkulacyjnego (np. Microsoft Excel) w celu wykreślenia i dalszej analizy. 
	UWAGA: Po skopiowaniu danych do arkusza kalkulacyjnego można wyodrębnić wiele parametrów do analizy, w tym następujące, jak pokazano na rysunku Rysunek 4.
	<ol>
		<li>Czas rozpoczęcia Fusion Pore (FP): zmierz czas od punktu czasowego 0 do punktu czasowego, w którym sygnał GCaMP3 zaczyna rosnąć. Ten parametr wskazuje opóźnienie między stymulacją a odpowiedzią ACR plemników.</li>
		<li>Czas rozpoczęcia AE: zmierz czas od punktu czasowego 0 do punktu czasowego, w którym sygnał mCherry zaczyna zanikać. Ten parametr wskazuje opóźnienie między stymulacją a odpowiedzią AE plemników. Parametr ten można również wykorzystać do obliczenia opóźnienia między powstawaniem FP a odpowiedzią AE.</li>
		<li>Szczytowa amplituda FP: zmierz sygnał fluorescencji od podstawy do szczytu wzrostu sygnału GCaMP3. Ten parametr wskazuje całkowity wzrost odpowiedzi ACR.</li>
		<li>Szybkość utraty mCherry: określ ten parametr za pomocą liniowego lub wykładniczego dopasowania na odcinku utraty sygnału mCherry (jak wskazuje "nachylenie" w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B). 
		UWAGA: Alternatywnie, określ szybkość zaniku za pomocą metody sygnału resztkowego (R) w różnych punktach czasowych (np. R60: czas trwania w sekundach do sygnału resztkowego 60% od linii podstawowej sygnału mCherry). Parametr ten można wykorzystać do ilościowego określenia szybkości, z jaką zawartość akrosomalna jest rozpraszana po AE.</li>
		<li>Spadek sygnału dla utraty mCherry: określ różnicę w amplitudzie między podstawową intensywnością fluorescencji mCherry a sygnałem następującym po AE. Ten parametr wskazuje całkowitą ilość zawartości akrosomalnej rozproszonej na AE.</li>
		<li>Wykreśl zmiany fluorescencji (F) zarówno dla kanału czerwonego, jak i zielonego jako dane surowe lub znormalizuj je przez początkową fluorescencję (F0) i wyraź je jako ΔF/F0. To ostatnie zapewnia lepszą wizualizację zmian zarówno w kolorze czerwonym, jak i zielonym na pojedynczym wykresie (np. patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3D i <silna klasa="xfig">Rysunek 3H). 
		UWAGA: Na koniec różne zmierzone parametry można porównać w różnych warunkach, aby określić związek między zmianami stężenia wapnia w akrosomach a AE. Przykłady różnych porównań warunków eksperymentalnych można znaleźć w reference2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Combining Imaging with a Stimulant Delivery System to Study Live Mouse Sperm

<ol><li>Austin, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+penetration+of+the+sperm+in+the+mammalian+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Aust+J+Sci+Res+B%22%5BJournal%5D)">Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg.</a> Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).</li>
<li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+sensor+reveals+spatial+and+temporal+dynamics+of+acrosomal+calcium+and+sperm+acrosome+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis.</a> J Biol Chem. 298 (5), 101868(2022).</li>
<li>Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+regulation+of+acrosome+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid regulation of acrosome exocytosis.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).</li>
<li>Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+resolution+of+acrosomal+exocytosis+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm.</a> J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).</li>
<li>Sosa, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+human+sperm+acrosomal+exocytosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis).</a> Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).</li>
<li>Balestrini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+Current+methods+to+observe+sperm+acrosomal+exocytosis+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time.</a> Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).</li>
<li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+observation+of+acrosomal+dispersal+from+mouse+sperm+using+GFP+as+a+marker+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein.</a> FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).</li>
<li>Kim, K. S., Gerton, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+release+of+soluble+and+matrix+components%3A+evidence+for+intermediate+states+of+secretion+during+spontaneous+acrosomal+exocytosis+in+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm.</a> Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).</li>
<li>Hasuwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+sperm+that+have+green+acrosome+and+red+mitochondria+allow+visualization+of+sperm+and+their+acrosome+reaction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+animals+%2F+Japanese+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo.</a> Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).</li>
<li>Henderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Low-Affinity+GCaMP3+Variant+%28GCaMPer%29+for+imaging+the+endoplasmic+reticulum+calcium+store%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store.</a> PloS one. 10 (10), 0139273(2015).</li>
<li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li>
<li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+modulation+of+calcium+flux+through+CaV2.3+regulates+acrosome+exocytosis+and+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization.</a> Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).</li>
<li>Sanchez-Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrosome+reaction+and+Ca%282%29%28%2B%29+imaging+in+single+human+spermatozoa%3A+new+regulatory+roles+of+%5BCa%282%29%28%2B%29%5Di%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i.</a> Biol Reprod. 91 (2), 67(2014).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma konfliktu interesów, który mógłby zgłosić w związku z tą pracą.

W tym artykule opisano metodę opartą na mikroskopii, która wykorzystuje nowo wygenerowany model myszy AcroSensE do monitorowania pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym i analizy zależności między dynamiką wapnia w akrosomach a etapami pośrednimi prowadzącymi do AE. Wraz z łatwo dostępnymi podejściami genetycznymi, takimi jak krzyżowanie z innymi modelami genetycznymi myszy lub edycja genów, ten model i metoda zapewniają potężny system do badania roli różnych składników i szlaków, które biorą udział w szlakach sygnało...

Plemniki nabywają zdolność do zapłodnienia podczas procesu zwanego capacitation1. Jednym z punktów końcowych tego procesu jest to, że plemniki nabywają zdolność do przechodzenia AE. Dane zebrane w ciągu dwóch dekad potwierdzają obecność złożonego, wieloetapowego modelu AE w nasieniu ssaków (podsumowane w2,3). Jednak badanie AE w żywych plemnikach jest wyzwaniem, a obecnie dostępne metody monitorowania tego procesu z odpowiednią rozdzielczością są kłopotliwe i wymagają wielu etapów przygotowania4, ograniczają się do wykrycia końcowego etapu AE (np. przy użyciu PNA5), ograniczają się do pomiarów zmian wapnia cytozolowego (w przeciwieństwie do dynamiki wapnia akrosomalnego), lub są ograniczone do pomiarów dynamiki wapnia cytozolowego lub AE6.
Aby przezwyciężyć niektóre z kluczowych ograniczeń badań AE w czasie rzeczywistym w warunkach fizjologicznych i umożliwić zbadanie zależności między dynamiką wapnia a AE, stworzono unikalny model myszy. W tym modelu mysim białko fuzyjne złożone z genetycznie kodowanego czujnika Ca2 + (GCaMP3) i mCherry jest eksprymowane i kierowane do akrosomu za pomocą promotora akrozyny i peptydu sygnalizacyjnego2. Ukierunkowany podwójny czujnik GCaMP3-mCherry umożliwia jednoczesne pomiary w czasie rzeczywistym stężenia wapnia i stanu zawartości akrosomalnej w żywych plemnikach w warunkach fizjologicznych przy użyciu mikroskopii i systemu dostarczania stymulantów jednokomórkowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Jako składnik macierzy akrosomalnej, fuzja błonowa i AE skutkowałyby utratą fotostabilnej i niewrażliwej na pH fluorescencji mCherry z plemników, ponieważ białko to dyfunduje z pęcherzyka akrosomowego. W związku z tym zdolność modelu do odzwierciedlania czasu i występowania AE jest zbliżona do korzyści płynących z linii myszy GFP ukierunkowanej na akrosomy7,8,9.
Wariant GCaMP3 używany w tej transgenicznej linii myszy ma przybliżoną KD 400 μM i zakres dynamiczny dla Ca2+ 10-4-10-3 M<sup class="xref">10, który jest odpowiedni dla tego pęcherzyka. Wykazaliśmy, że ta kombinacja cech GCaMP3 może ujawnić tworzenie się porów fuzyjnych między błoną plazmatyczną a zewnętrzną błoną akrosomalną (OAM)2. Wykrywanie porów fuzyjnych jest wynikiem zbyt małej wielkości porów, aby umożliwić białku AcroSensE rozproszenie się z akrosomu (poprzez utratę zawartości akrosomów), zapewniając jednocześnie "kanał" błonowy, który umożliwia napływ jonów Ca2+ do światła akrosomu, co prowadzi do wzrostu intensywności fluorescencji GCaMP3.
Jasne, monomeryczne, niewrażliwe na wapń białko fluorescencyjne mCherry wspiera wizualizację akrosomu, podczas gdy sygnał GCaMP3 jest słaby (np. przed wiązaniem Ca2+, <silna klasa="xfig">Rysunek 2), a co ważne, pozwala również na identyfikację nienaruszonych akrosomów plemników odpowiednich do obrazowania.
Poniższy protokół opisuje wykorzystanie unikalnego modelu myszy AcroSensE oraz metod mikroskopii używanych eksperymentalnie do badania AE i dynamiki wapnia plemników z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

<table><tbody><tr><td>100x obiektyw olejowy&nbsp;</td><td>Olympus Japan</td> UPlanApo,2-hydroksypropylo-b-cyklodekstryna<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C0926</td><td></td></tr><tr><td>Szalka nakrywkowa 35 mm, grubość 1,5 MatTek</td><td>Corp.&nbsp;</td><td>P35G-1.5-20-C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>5 ml rurka okrągłodenna</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Kapilarnie ze szkła borokrzemianowego</td><td>Sutter Instrument Co. CA USA</td><td>B200-156-10</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus Japan</td><td>Olympus FluoView&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka z podziałką&nbsp;</td><td>TipOne, Stany Zjednoczone Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mlekowy</td><td>Sigma</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>Systemy inkubacji mikroskopu żywego komórek&nbsp;</td><td>TOKAI HIT Shizuoka, Japonia</td><td>Model STX</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co. CA USA</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta transferowa&nbsp;</td><td>Marka rybacka&nbsp;</td><td>13-711-6M</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy</td><td>Sigma</td><td>107360</td><td></td></tr><tr><td>System dostarczania pojedynczych komórek</td><td>Parker, Hauppauge, Nowy Jork</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i egzocytozy w żywych plemnikach myszy

Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

Egzocytoza akrosomów (AE), w której pojedynczy pęcherzyk egzocytotyczny plemnika łączy się z błoną plazmatyczną, jest złożonym, zależnym od wapnia procesem niezbędnym do zapłodnienia. Jednak nasza wiedza na temat tego, w jaki sposób sygnalizacja wapniowa reguluje AE, jest nadal niekompletna. W szczególności wzajemne oddziaływanie między wewnątrzakrosomalną dynamiką wapnia a etapami pośrednimi prowadzącymi do AE nie jest dobrze zdefiniowane. W tym miejscu opisujemy metodę, która zapewnia przestrzenny i czasowy wgląd w dynamikę wapnia akrosomalnego i ich związek z fuzją błonową i późniejszą egzocytozą pęcherzyka akrosomowego. Metoda wykorzystuje nowatorską transgeniczną mysz z ekspresją czujnika egzocytozy ukierunkowanego na akrosomy (AcroSensE). Czujnik łączy genetycznie kodowany wskaźnik wapnia (GCaMP) połączony z mCherry. To białko fuzyjne zostało specjalnie zaprojektowane, aby umożliwić jednoczesną obserwację akrosomalnej dynamiki wapnia i zdarzeń fuzji błonowej. Monitorowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i AE w żywych plemnikach AcroSensE odbywa się dzięki połączeniu obrazowania z dużą liczbą klatek na sekundę i systemu dostarczania stymulantu, który może być ukierunkowany na pojedyncze plemniki. Protokół ten zawiera również kilka przykładów podstawowych metod ilościowego określania i analizy surowych danych. Ponieważ model AcroSensE jest kodowany genetycznie, jego znaczenie naukowe można zwiększyć dzięki wykorzystaniu łatwo dostępnych narzędzi genetycznych, takich jak krzyżowanie z innymi modelami genetycznymi myszy lub metody oparte na edycji genów (CRISPR). Dzięki tej strategii można rozwiązać rolę dodatkowych szlaków sygnałowych w kapacytacji plemników i zapłodnieniu. Podsumowując, opisana tutaj metoda stanowi wygodne i skuteczne narzędzie do badania dynamiki wapnia w określonym przedziale subkomórkowym - akrosomie plemników - oraz w jaki sposób ta dynamika reguluje etapy pośrednie prowadzące do fuzji błony i egzocytozy akrosomów.

Rycina 2 przedstawia uproszczoną ilustrację ukazującą sekwencję zmian fluorescencji oczekiwanych po skutecznej stymulacji plemników. Górny panel Ryciny 2 ilustruje zmiany w intensywności fluorescencji GCaMP3, gdzie sygnał jest początkowo słaby (bazowe stężenia wapnia w akrozomie są niższe niż KD GCaMP3), a po wejściu jonów wapnia via pory fuzyjne jasność fluorescencji wzrasta. Ostatecznie, podczas AE następuje utrata sygnału z powodu dyfuzji i utraty se...

Opisany tutaj model myszy AcroSensE i metody obrazowania żywych komórek dostarczają nowego podejścia do badania dynamiki wapnia w subkomórkowym przedziale akrosomu plemnika i jak regulują one etapy pośrednie prowadzące do fuzji błony i egzocytozy akrosomów.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i egzocytozy w żywych plemnikach myszy

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process ...

Celem naszych badań jest lepsze zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących pracę plemników, w tym procesów takich jak kapacytacja i zapłodnienie. W szczególności badamy, w jaki sposób lipidy błonowe aktywują sygnalizację wapniową i dostępność akrosomów. Protokół ten wypełnia lukę w naszym zrozumieniu zależności między pojemnością, aktywacją plemników, sygnalizacją wapniową i egzocytozą akrosomów.Do zalet tego protokołu należy obrazowanie plemników w warunkach fizjologicznych, a także jego zdolność do jednoczesnego monitorowania zarówno sygnalizacji wapniowej, jak i egzocystozy akrosomów bez konieczności wykonywania skomplikowanych procedur wstępnego ładowania lub stania. Zacznij od pobrania plemników z najądrza wyizolowanego z transgenicznego modelu myszy wykazującej ekspresję AcroSensE. Wykonaj pobranie nasienia w 3,5-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 0,5 mililitra pożywki MW, umożliwiając 15-minutową procedurę pływania w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie usuń tkankę najądrza z naczynia do zbierania wody. Przenieść pożywkę zawierającą plemniki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego odwirować zawiesinę o sile 100 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Za pomocą plastikowej pipety zbierz supernatant MW zawierający plemniki, odrzucając wszelkie osadki dużych resztek tkanek i przenieś je do probówki z okrągłym dnem.Dostosuj objętość supernatantu do jednego mililitra, dodając 500 mikrolitrów pożywki MW, wstępnie podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Odwirować tę mieszaninę przy 400 G przez osiem minut w temperaturze pokojowej w probówce okrągłodennej. Następnie ostrożnie usuń supernatant, pozostawiając luźno granulowane plemniki.Używając pipety do przenoszenia o dużym otworze, ponownie zawiesić plemniki, delikatnie stukając ręcznie w rurkę, co jest znane jako przesuwanie palcem. Gdy plemniki zostaną równomiernie zawieszone, przenieś je do nowej rurki z okrągłym dnem. Aby rozpocząć, pociągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej dwóch milimetrów i średnicy wewnętrznej 1,56 milimetra, postępując zgodnie z odpowiednimi ustawieniami.Przed wypełnieniem kapilary przed każdym eksperymentem użyj cienkiej pęsety, aby otworzyć końcówkę kapilary. Do obciążenia kapilary należy użyć roztworu stymulującego o stężeniu od trzech do pięciu razy większym niż normalne stężenie wymaganego stymulantu. Za pomocą cienkiej plastikowej pipety transferowej powoli wstrzyknąć roztwór stymulujący do kapilary, aż wypełni się trzy czwarte jej długości.Wyeliminuj wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą powstać podczas procesu napełniania, delikatnie przesuwając kapilarę. Następnie zamontuj wypełnioną kapilę na mikromanipulatorze. Skonfiguruj ustawienia systemu dostarczania pojedynczych komórek, aby zapewnić dziesięciosekundowy impuls przy 5 PSI.Podłącz kapilę borokrzemianową zamontowaną na mikromanipulatorze do uchwytu na pipety systemu dostarczania pojedynczych komórek. Zastosuj krótkie zaciągnięcie trwające dwie sekundy pod ciśnieniem 20 PSI, obserwując końcówkę kapilarną, aby potwierdzić, że roztwór jest dozowany przez koniec końcówki. Zestaw jest teraz gotowy do użycia z mikroskopią do obrazowania w czasie rzeczywistym pojedynczego plemnika myszy.Zacznij od pokrycia 35-milimetrowych nakrywek nakrywkowych poli-D-lizyną lub PDL. Aby to zrobić, dozuj 0,5 mikrolitra kropli PDL na środek naczynia z przykrywką. Za pomocą pipety z podziałką o pojemności 10 mikrolitrów rozsmaruj kroplę PDL na szkiełku nakrywkowym.Pozostaw powlekane naczynie do wyschnięcia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. W celu zobrazowania świeżo pobranych plemników z mysiego modelu wykazującego ekspresję AcroSensE, należy dodać 80 mikrolitrów wstępnie przygotowanej zawiesiny nasienia do środka naczynia z szkiełkiem nakrywkowym pokrytym PDL. Następnie powoli dodaj do naczynia trzy mililitry uzupełnionej zmodyfikowanej pożywki bazowej Whittena, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza.Przystąp do wykonywania obrazowania za pomocą kombinacji mikroskopu z zestawem do dostarczania stymulantu z pojedynczych komórek. Najpierw zamontuj naczynie zawierające plemniki na mikroskopie. Następnie za pomocą mikromanipulatora umieść końcówkę kapilary systemu dostarczania stymulantu około 100 mikronów z boku i pięć do 10 mikronów powyżej płaszczyzny interesującej nas komórki.Umieść kapilarnę w odległości 100 mikronów od główki plemnika. Następnie rozpocznij sekwencję obrazowania pod mikroskopem. Obrazuj plemniki z dużą liczbą klatek na sekundę, najlepiej większą niż 10 klatek na sekundę.10 sekund po rozpoczęciu akwizycji obrazu aktywuj system dostarczania pojedynczej komórki, aby dostarczyć dziesięciosekundowe zaciągnięcie się stymulantem. Kontynuuj przechwytywanie obrazów komórek przez 10 do 15 minut. W podobny sposób wyobraz sobie wiele komórek z jednego naczynia zgodnie z lokalizacjami pokazanymi na ekranie.

real-time-imaging-acrosomal-calcium-dynamics-exocytosis-live-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Oceniono sygnały [Ca2+]i wywołane bodźcem w pojedynczych ludzkich plemnikach. Ruchome komórki obciążono fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na Ca2+ (metodą estru AM) i unieruchomiono w komorze przepływowej. Obrazowanie komórek przeprowadzono za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, a stymulację wykonano poprzez medium perfuzyjne. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub obszarów) przeanalizowano offline przy użyciu programu Excel.

Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w ludzkich plemnikach

Źródło: Bancroft, E. A., et al. Kwantyfikacja spontanicznych strumieni ca2+{ i ich dalsze efekty w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy. J. Vis. Exp. (2020) {{TAG_ 46}}Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy. Wykorzystując wektor wirusowy do ekspresji wskaźnika wapnia, neurony są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym w celu śledzenia zmian intensywności fluorescencji podczas spontanicznej i...

Wizualizacja napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2+ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca2+] w plemnikach ludzkich.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Poznaj obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki wapnia i egzocytozy akrosomu w żywych plemnikach myszy. Ta metoda pozwala badać sygnalizację wapniową i aktywację plemników w warunkach fizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i egzocytozy w żywych plemnikach myszy

Przeglądaj więcej filmów