Name: Pomiar zaparć w modelu choroby Parkinsona Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 20 s
Description: Poznaj metodę pomiaru zaparć w modelu choroby Parkinsona u Drosophila melanogaster z ekspresją alfa-synukleiny. Proste i tanie badanie umożliwia ocenę czasu przejścia pokarmu przez przewód pokarmowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Mel Feany z Brigham and Women's Hospital i Harvard Medical School za uprzejmy dar w postaci linii kontrolnej i alfa-synukleiny wyrażającej Drosophila. Zwracamy uwagę na następujące źródła wsparcia grantowego dla dr Olsena: NINDS K08, Amerykańskie Stowarzyszenie Choroby Parkinsona Stypendium George'a C. Cotziasa, Nagroda Departamentu Obrony dla Wczesnego Badacza Choroby Parkinsona.

Muchy użyte w tym teście: kontrola: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; muchy alfa-synukleinowe: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synukleina/+; 1- i 10 dni po ekleksji; samce i samice (sparowane i niesparowane) muchy (patrz Tabela materiałów).
1. Przygotowanie barwionego pokarmu dla much
<ol>
	<li>Wymieszaj barwnik spożywczy w postaci niebieskiej miękkiej pasty żelowej (patrz Tabela materiałów) z wodą destylowaną w stosunku 1:1 (v/v). 
	UWAGA: Używaj komercyjnych barwników spożywczych, które zawierają tylko niewchłanialne barwniki, ponieważ wykazano, że niektóre niebieskie barwniki mają działanie neuroprotekcyjne21.</li>
	<li>Fiolki z pokarmem dla much składającym się ze standardowego agaru z mąki kukurydzianej (patrz Tabela materiałów) należy podgrzewać w kuchence mikrofalowej w odstępach 10-15 sekund, aż pokarm stopi się w płyn lub zawiesinę. Nie dopuścić do wykipienia się jedzenia.</li>
	<li>Dodaj mieszaninę barwników do każdej fiolki z jedzeniem, aby uzyskać jednolite zabarwienie między fiolkami. Mieszaj z mieszanką barwników, aż żywność stanie się jednorodnie niebieska (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Dodać taką ilość mieszanki niebieskiego barwnika, aby kolor żywności był nasycony i nie było różnic w kolorze między fiolkami. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać wkrótce po podgrzaniu w kuchence mikrofalowej, ponieważ żywność szybko krzepnie. Jeśli pokarm zestala się, ponownie podgrzej fiolkę w kuchence mikrofalowej.</li>
	<li>Pozostaw fiolki z farbowaną żywnością do wyschnięcia na powietrzu, aż stężeje. Umieść cienki ręcznik papierowy na otworach fiolki podczas suszenia, aby zapobiec lądowaniu zabłąkanych much w fiolce.</li>
	<li>Gdy żywność ostygnie i stężeje, przenieś muchy, które zostaną użyte do testów, do niebieskiego pokarmu. 
	UWAGA: W przypadku wąskich fiolek (25 mm) zaleca się dodanie 9-14 much do każdej fiolki. W przypadku szerokich fiolek (28,5 mm) zaleca się dodanie 10-20 much do każdej fiolki. Muchy nie są rozdzielane ze względu na płeć lub doświadczenie godowe i obejmują mieszaną populację samców i samic much, z samicami zarówno pokrytymi, jak i niepokrytymi.</li>
	<li>Inkubować fiolki z muchami przez noc w temperaturze 25 °C w inkubatorze.</li>
</ol>
2. Obrazowanie much
UWAGA: Ten krok jest opcjonalny (Rysunek 2).
<ol>
	<li>Następnego ranka (czas 0) znieczul reprezentatywne muchy dwutlenkiem węgla przez 60 s. Umieść muchę tak, aby strona brzuszna była skierowana do góry.</li>
	<li>Za pomocą kamery (patrz Spis materiałów) rób zdjęcia much o każdej godzinie, aby zobrazować ilość niebieskiego pokarmu pozostałego w układzie pokarmowym. 
	UWAGA: Muchy te nie powinny być używane do ilościowej części testu (krok 3), ponieważ znieczulenie może wpłynąć na wyniki.</li>
	<li>Co godzinę znieczulaj i wyobrażaj sobie nowe muchy.</li>
</ol>
3. Wykonywanie testu na zaparcia
<ol>
	<li>Pozostałe (nieznieczulone) muchy przenieść do fiolek ze standardowym pokarmem Drosophila. Ponumerować każdą fiolkę.</li>
	<li>Pozostawić muchy w inkubatorze w temperaturze 25 °C na 60 minut.</li>
	<li>Po 60 minutach przenieś muchy do nowych fiolek ze standardowym pokarmem Drosophila. Rozpocząć rejestrację danych od pierwszego zestawu fiolek.</li>
	<li>Narysuj przerywaną linię wzdłuż fiolki, aby zaznaczyć punkt, od którego rozpocznie się liczenie.</li>
	<li>Ręcznie policz liczbę małych, okrągłych kropek na ściance każdej fiolki. Nie liczyć kropek znajdujących się na zatyczce żywności lub fiolki.</li>
	<li>Zacznij od policzenia liczby niebieskich kropek na ściance każdej fiolki.</li>
	<li>Policz liczbę nieprzezroczystych, bezbarwnych kropek na ściance każdej fiolki. 
	UWAGA: Każda kropka to odchody much, które są kombinacją moczu i kału22. Czasami mucha może przejść po odchodach i pozostawić ślad, w takim przypadku policz tylko oryginalną kropkę, a nie każdy pojedynczy znak na szlaku.</li>
	<li>Zapisać stosunek niebieskich kropek do całkowitej liczby kropek na każdą fiolkę. 
	UWAGA: Całkowita liczba kropek to liczba niebieskich kropek na ściance fiolki dodana do liczby bezbarwnych kropek na ściance tej samej fiolki. Zostanie to wykorzystane do obliczenia procentowej zawartości niebieskiego kału na godzinę.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2-3.8 jeszcze siedem razy, zbierając dane co godzinę w sumie przez 8 godzin.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Wykres procentowej zawartości niebieskiego kału na godzinę dla każdego stanu.</li>
	<li>Porównaj dane między conditions. 
	UWAGA: Istotność statystyczną można określić na 3 sposoby: porównując poszczególne punkty czasowe między warunkami, mierząc nachylenie linii w czasie lub porównując obszar pod krzywą.</li>
</ol>

Constipation Assays in Drosophila Flies

<ol><li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 397 (10291), 2284-2303 (2021).</li>
<li>Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the environment.</a> Front Neurol. 10, 218(2019).</li>
<li>Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+challenge+test+for+early+detection+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease.</a> NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116(2021).</li>
<li>Ueki, A., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+style+risks+of+Parkinson%27s+disease%3A+association+between+decreased+water+intake+and+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation.</a> J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).</li>
<li>Houser, M. C., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis%3A+is+intestinal+inflammation+a+silent+driver+of+Parkinson%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis.</a> NPJ Parkinsons Dis. 3, 3(2017).</li>
<li>Pfeiffer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motor+symptoms+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">Non-motor symptoms in Parkinson's disease.</a> Parkinsonism Relat Disord. 22 (Suppl 1), (2016).</li>
<li>Klann, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut-brain+axis+and+its+relation+to+parkinson%27s+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review.</a> Front Aging Neurosci. 13, 782082(2021).</li>
<li>Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gut dysfunction in Parkinson's disease.</a> World J Gastroenterol. 22 (25), 5742-5752 (2016).</li>
<li>Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+gut%3A+symptoms%2C+nutrition%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).</li>
<li>Chen, S. J., Lin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microenvironmental+changes+as+a+potential+trigger+in+Parkinson%27s+disease+through+the+gut-brain+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis.</a> J Biomed Sci. 29 (1), 54(2022).</li>
<li>Hawrysh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRKN%2Fparkin-mediated+mitophagy+is+induced+by+the+probiotics+Saccharomyces+boulardii+and+Lactococcus+lactis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis.</a> Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).</li>
<li>Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestine-derived+%CE%B1-synuclein+initiates+and+aggravates+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila.</a> Transl Neurodegener. 11 (1), 44(2022).</li>
<li>Rota, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constipation%2C+deficit+in+colon+contractions+and+alpha-synuclein+inclusions+within+the+colon+precede+motor+abnormalities+and+neurodegeneration+in+the+central+nervous+system+in+a+mouse+model+of+alpha-synucleinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy.</a> Transl Neurodegener. 8, 5(2019).</li>
<li>Diwakarla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATH434+reverses+colorectal+dysfunction+in+the+A53T+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).</li>
<li>Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+Induces+mitochondrial+dysfunction+through+spectrin+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton.</a> Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).</li>
<li>Olsen, A. L., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+%CE%B1-synuclein+promotes+neurodegeneration+characterized+by+a+distinct+transcriptional+program+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo.</a> Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).</li>
<li>Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+and+systemic+signals+couple+nutritional+and+reproductive+status+with+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis.</a> Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).</li>
<li>Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interplay+in+Drosophila+melanogaster%3A+chronic+nutritional+deprivation+in+larval+life+affects+adult+fecal+output%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output.</a> J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).</li>
<li>Popovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+dPerk+in+the+intestine+suppresses+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Cell Death Dis. 14 (3), 206(2023).</li>
<li>Poteet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+actions+of+methylene+blue+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives.</a> PLoS One. 7 (10), e48279(2012).</li>
<li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li>
<li>Schlichting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+network+underlying+circadian+entrainment+and+photoperiodic+adjustment+of+sleep+and+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila.</a> J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole jest kilka kroków, które pomogą w pomyślnym zakończeniu testu. Po pierwsze, ważne jest, aby upewnić się, że odstępy czasu między każdą rundą dla każdej fiolki są spójne przez cały czas trwania eksperymentu. Etykietowanie fiolek numerami pomoże uniknąć konieczności długiego opisu genotypu, oszczędzając czas. Ponadto ważne jest, aby metoda liczenia kału22 pozostała spójna przez cały czas trwania eksperymentu. Podczas gdy niebieski kał jest widoczny na korku pokarmu i fiolki, bezbarwny kał nie jest. Dlatego nie należy liczyć niebieskich kropek na zatyczce żywności lub fiolki.
W przypadku testów behawioralnych zawsze istnieje możliwość niespójności wyników z powodu wahań w zachowaniu much lub nieznanych zmiennych wpływających na test. Zalecamy używanie tych samych pożywek Drosophila , tego samego barwnika spożywczego i tej samej marki fiolek do wszystkich eksperymentów. Co ciekawe, w kilku badaniach zaobserwowano, że muchy mają tendencję do rzadsza wypróżniania się wczesnym popołudniem, prawdopodobnie ze względu na rytm dobowy much23. Jednak to zachowanie jest spójne zarówno u much kontrolnych, jak i much wyrażających alfa-synukleinę, więc nie powinno budzić obaw.
Jeśli muchy nie wydalają niebieskiego kału na początku testu, możliwe, że użyty barwnik nie jest wystarczająco pigmentowany. W takim przypadku można odpowiednio zwiększyć stosunek barwnika do wody destylowanej. Możliwe jest również, że gdy w przewodzie pokarmowym muchy pozostała tylko niewielka ilość niebieskiego pokarmu, może być trudno określić, czy kał jest bladoniebieski, czy bezbarwny. Kiedy tak się stanie, umieszczenie białego arkusza papieru za fiolką pomoże określić kolor kropki kału. Nawet jeśli kał jest bardzo jasnoniebieski, najlepiej zapisać go jako niebieski kał, a nie bezbarwny kał.
Jednym z ograniczeń tego testu jest to, że wymaga on ręcznego liczenia plam kałowych. Aby zwiększyć potencjał wysokoprzepustowych badań przesiewowych, protokół ten może zostać zmodyfikowany w przyszłości, aby umożliwić automatyczną ocenę ilościową niebieskich plam kałowych wytwarzanych przez pojedyncze muchy na płytkach wielodołkowych. Innym ograniczeniem jest to, że chociaż model alfa-synukleiny ma potencjał, aby przekształcić się w prodromalny model PD, nie zidentyfikowano jeszcze optymalnego punktu czasowego, w którym zaparcia występują bez neurodegeneracji.
Podsumowując, metoda ta oferuje proste, bezpośrednie podejście do modelowania zaparć, niedostatecznie zbadanego objawu niemotorycznego PD, w modelu PD Drosophila .

Choroba Parkinsona (PD) jest postępującym zaburzeniem neurodegeneracyjnym, charakteryzującym się klinicznie obecnością objawów motorycznych, takich jak bradykinezja, sztywność i drżenie, co skutkuje znaczną zachorowalnością1. Patologicznie PD definiuje się przez utratę neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej i nieprawidłowe fałdowanie alfa-synukleiny, co prowadzi do powstawania ciał Lewy'ego i neurytów Lewy'ego. Patogeneza choroby Parkinsona pozostaje słabo poznana, prawdopodobnie wynika ze złożonej interakcji czynników genetycznych i środowiskowych2,3. Obecnie terapie modyfikujące przebieg choroby są niedostępne, prawdopodobnie częściowo ze względu na zaawansowany stopień patologii obecny w momencie diagnozy. Badania wykazały, że ponad 60% neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej zostało już utraconych w wyniku wystąpienia objawów motorycznych, co podkreśla potrzebę zbadania potencjalnych biomarkerów do wczesnego wykrywania choroby4. Jednym z takich klinicznych biomarkerów są zaparcia, które są powszechne u pacjentów z chorobą Parkinsona5,6 i może poprzedzać wystąpienie objawów motorycznych o lata, a nawet dekady.
Pomimo klinicznej definicji PD opartej na objawach motorycznych, zaparcia są jednym z kilku objawów niemotorycznych, które są trudniejsze do leczenia objawowego i powodują znaczne pogorszenie jakości życia pacjentów7. Zmiany w osi jelitowo-mózgowej, która reprezentuje dwukierunkową komunikację między mózgiem a jelitowym układem nerwowym, są związane z patogenezą PD. Agregaty alfa-synukleiny zostały znalezione w próbkach tkanek z przewodu pokarmowego pacjentów z chorobą Parkinsona8, a modele zwierzęce sugerują, że agregaty alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym rozprzestrzeniają się w sposób podobny do prionów do ośrodkowego układu nerwowego9. Ponadto pacjenci z chorobą Parkinsona wykazują nieprawidłowości w mikrobiomie jelitowym10 i mogą doświadczać nadmiernego stanu zapalnego jelit11. Zaparcia w chorobie Parkinsona były niedostatecznie zbadane, z kilkoma zgłoszonymi modelami zaparć związanych z chorobą Parkinsona u much12,13lub gryzoniach14,15.
Ten test wykorzystuje model PD Drosophila, w którym muchy wyrażają ludzki gen alfa-synukleiny pod kontrolą czynnika pan-neuronalnego, n-synaptobrewiny. Muszki te wykazują wszystkie charakterystyczne cechy PD, w tym agregację alfa-synukleiny, dysfunkcję motoryczną i neurodegenerację związaną z wiekiem, co skutkuje utratą neuronów dopaminergicznych16,17. Poprzednie badania wprowadziły pomiar wydalania kału u muszek w celu oceny dysfunkcji jelit, ilościowe określenie kału much i porównanie ilości wydalin w różnych liniach genetycznych, aby ujawnić funkcjonalne różnice w układzie pokarmowym18,19,20. Tutaj demonstrujemy test zaparć przy użyciu muszek wyrażających ludzką alfa-synukleinę. To proste, ale cenne narzędzie umożliwia badanie ważnego niemotorycznego objawu PD.

<table><tbody><tr><td>1400 g sacharozy</td><td>MP Biomedicals</td><td>904713</td><td></td></tr><tr><td>1800 g dekstrozy</td><td>MP Biomedicals</td><td>901521</td><td></td></tr><tr><td>2884 g drożdży</td><td>MP Biomedicals</td><td>903312</td><td></td></tr><tr><td>428 g agaru</td><td>Fisher Scientific</td><td>10253156</td><td></td></tr><tr><td>4600 ml melasy</td><td>Babcina melasa</td><td>7971942</td><td></td></tr><tr><td>68 L wody</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>680 ml mieszanki tegosept (1200 g tegoseptu w 6 l etanolu)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6864 g mąki kukurydzianej</td><td>Młyn perłowy</td><td>125045</td><td></td></tr><tr><td>800 ml mieszanki kwasów (83 ml kwasu fosforowego w 1 l wody + 836 ml kwasu propionowego w 1 l wody)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellSens Standardowe oprogramowanie</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-Aper</td><td>111ACS200</td><td></td></tr><tr><td>Flugs do szerokich plastikowych fiolek</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-101</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff szerokie fiolki Drosophila, polistyren</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>Wersja 9.5.1</td></tr><tr><td>Aparat fotograficzny Olympus DP23</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZX12 Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25470A</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A258 - 500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Miękka pasta żelowa barwnik spożywczy, Royal blue</td><td>AmeriColor</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Apex</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4</td><td>Wszystkie linie dostarczane przez Dr. Mel Feany</td><td>N/A</td><td>Lines są dostępne bezpośrednio w Dr. Feany&nbsp;</td></tr><tr><td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa synukleina</td><td></td><td>n/A</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td>n/A</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar zaparć w modelu choroby parkinsona drosophila

Measuring Constipation in a Drosophila Model of Parkinson's Disease

Objawy niemotoryczne w chorobie Parkinsona (PD) są powszechne, trudne do leczenia i znacząco pogarszają jakość życia. Jednym z powszechnych objawów niemotorycznych są zaparcia, które mogą poprzedzać diagnozę PD o lata, a nawet dekady. Zaparcia są niedostatecznie zbadane w zwierzęcych modelach PD i brakuje specyficznych terapii. Test ten wykorzystuje model PD Drosophila, w którym ludzka alfa-synukleina ulega ekspresji pod wpływem sterownika panneuronalnego. U muszek wykazujących ekspresję alfa-synukleiny rozwijają się charakterystyczne cechy PD: utrata neuronów dopaminergicznych, upośledzenie motoryczne i inkluzje alfa-synukleiny.
Ten protokół przedstawia metodę badania zaparć u tych muszek. Muchy umieszcza się na pokarmie dla much z dodatkiem o niebieskim kolorze przez noc, a następnie przenosi się do standardowego pokarmu następnego dnia. Następnie są one przenoszone do nowych fiolek ze standardowym pokarmem dla much co godzinę przez 8 godzin. Przed każdym transferem oblicza się procent niebieskich plam kałowych w porównaniu z całkowitymi plamami kałowymi na ściance fiolki. Muszki kontrolne, które nie mają alfa-synukleiny, wydalają cały niebieski barwnik na kilka godzin przed muchami wykazującymi ekspresję alfa-synukleiny. Dodatkowo przepływ niebieskiego pokarmu z jelit można monitorować za pomocą prostej fotografii. Prostota tego testu umożliwia jego zastosowanie w zaawansowanych genetycznych lub chemicznych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji modyfikatorów zaparć u Drosophila.

Ponieważ odwłok Drosophila jest przezroczysty, niebieski pokarm można zaobserwować wewnątrz jelita u żywych, znieczulonych much. Jakościowe różnice w pasażu jelitowym można ocenić, wykonując zdjęcia much w różnych punktach czasowych. U much kontrolnych niebieski pokarm jest szybko wydalany, natomiast u much z alfa-synukleiną niebieski pokarm pozostaje w jelicie przez okres do 8 godzin (Rycina 2).
Muchy wykazujące ekspresję alfa-synukleiny przejawiają związaną z wiekiem neurodegenerację, a wyraźny fenotyp rozwija się do 10 dnia po wyjściu z poczwarki10. W tym punkcie czasowym różnice w czasie pasażu treści przez jelita w porównaniu z muchami kontrolnymi są widoczne poprzez porównywanie poszczególnych punktów czasowych między grupami, pomiar nachylenia linii w czasie lub porównanie pola pod krzywą (Rysunek 3). W wcześniejszym punkcie czasowym, w 1. dniu po wyjściu z poczwarki, nie obserwuje się różnic w pasażu jelitowym między muchami kontrolnymi a muchami z alfa-synukleiną, kiedy dysfunkcja motoryczna i neurodegeneracja nie są jeszcze obecne (Rysunek 4).
<img alt="Proces oddzielania przez wirowanie; probówki, osad i prążki; wyniki analizy laboratoryjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Niebieskie fiolki z pożywką i plamki kałowe. (A) Wszystkie fiolki zawierają niebieską pożywkę. Na tym etapie muchy zostały właśnie wprowadzone do niebieskiego pokarmu i nie widać niebieskiej treści kałowej. (B) Fiolka po przeniesieniu much w1118 na świeżą pożywkę na 1 h, a następnie ich usunięciu. Lewy wstawka jest powiększona na (C), a prawa wstawka jest powiększona na (D). (C) Obszar wykluczony z analizy ze względu na obecność pokarmu dla much. (D) Powiększony widok plamek kałowych, wskazujący plamki niebieskie (czarne strzałki) i niebieskie (żółte strzałki). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie Drosophila melanogaster, ekspresja α-synukleiny, obrazowanie time-lapse, analiza degeneracji komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wizualizacja pasażu pokarmowego zabarwionego pokarmu w czasie. Muchy kontrolne oraz muchy wykazujące ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny w neuronach pozostawiono na noc na pokarmie zabarwionym na niebiesko, a następnego dnia przeniesiono na standardowe podłoże. Muchy przenoszono seryjnie na nowy standardowy pokarm co godzinę. Przedstawiono reprezentatywne obrazy w czasie zero oraz 2, 4, 6 i 8 h po przeniesieniu. Muchy kontrolne i muchy z alfa-synukleiną wykazują podobne fragmenty niebieskiego pokarmu w jelicie w czasie zero. W kolejnych punktach czasowych muchy kontrolne mają mniej niebieskiego pokarmu niż muchy z alfa-synukleiną, a w 8 h cały niebieski pokarm znika u much kontrolnych. Genotypy dla każdej linii much są następujące: kontrolne (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); muchy z alfa-synukleiną (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+). Do obrazowania wykorzystano samice ze względu na łatwiejszą wizualizację odwłoka wynikającą z ich większego rozmiaru. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres i wykres słupkowy porównujący niebieską masę kałową w czasie; grupy α-synukleiny i kontrolne, istotność." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Test zaparć u much w 10. dniu po wykluciu. Muchy kontrolne oraz muchy wykazujące ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny w neuronach pozostawiono na pożywce zabarwionej na niebiesko na noc, a następnego dnia przeniesiono na standardową pożywkę dla much. Muchy przenoszono seryjnie na nowe standardowe podłoża co godzinę. (A) Procent niebieskiej masy kałowej na godzinę. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. N = 6 fiolek na genotyp; każda fiolka zawierała 9-14 much. Wszystkie analizy statystyczne wykonano w programie Graphpad Prism (patrz Tabela materiałów). Istotność statystyczną w każdym punkcie czasowym obliczono za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA. Nachylenie linii oraz różnicę między nachyleniami obliczono za pomocą analizy regresji liniowej. (B>) Obliczono pole pod krzywą dla każdego genotypu. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Genotypy dla każdej linii much są następujące: kontrolne (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); muchy z alfa-synukleiną (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+). Uwzględniono samce i samice w zbliżonej liczbie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres procentowego usuwania niebieskiej treści kałowej w czasie, z porównaniem grupy kontrolnej i α-synukleiny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Test zaparć u much w 1. dniu po wykluciu. Muchy kontrolne oraz muchy wykazujące ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny w neuronach pozostawiono przez noc na pożywce barwionej na niebiesko, a następnego dnia przeniesiono na standardowe podłoże. Muchy przeniesiono seryjnie na nową standardową pożywkę dla much co godzinę. (A) Procent niebieskiej treści kałowej na godzinę. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. N = minimum 5 fiolek na genotyp; każda fiolka zawierała 9-14 much. Wszystkie analizy statystyczne wykonano w programie Graphpad Prism. Istotność statystyczną dla każdego punktu czasowego obliczono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (two-way ANOVA). Nachylenie linii oraz różnica między nachyleniami zostały obliczone przy użyciu analizy regresji liniowej. (B) Obliczono pole pod krzywą dla każdego genotypu. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Genotypy dla każdej linii much są następujące: kontrolne (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); muchy z alfa-synukleiną (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+). Uwzględniono zarówno samce, jak i samice w w przybliżeniu równych liczbach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół przedstawia test do modelowania zaparć w modelu choroby Parkinsona opartym na alfa-synukleinie Drosophila.

Pomiar zaparć w modelu choroby Parkinsona Drosophila

Non-motor symptoms in Parkinson's disease (PD) are common, difficult to treat, and significantly impair quality of life. One prevalent non-motor symptom ...

Choroba Parkinsona jest definiowana przez objawy motoryczne bradykinezji, drżenia i sztywności. Jednak wielu pacjentów z chorobą Parkinsona cierpi na objawy niemotoryczne, które są trudniejsze do leczenia i powodują większe pogorszenie jakości życia. Nie zostały one dobrze przebadane na zwierzęcych modelach choroby, co ogranicza nasze możliwości znalezienia nowych terapii dla nich.Ten protokół jest prosty i niedrogi, ale generuje powtarzalne wyniki. Jest łatwy do nauczenia i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Za pomocą tego prostego testu możemy ocenić zaparcia u muszek z neurodegeneracją.W przyszłości mamy nadzieję opracować model, w którym u muszek rozwijają się zaparcia przed wystąpieniem neurodegeneracji. Pozwoli nam to lepiej zrozumieć patogenezę choroby Parkinsona. Na początek wymieszaj barwnik spożywczy w postaci niebieskiej miękkiej pasty żelowej z wodą destylowaną.Fiolki z żywnością zawierające standardowy pokarm agarowy z mąki kukurydzianej należy podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż żywność stopi się w płyn. Dodaj mieszaninę barwników do każdej fiolki z jedzeniem i dobrze wymieszaj, aż żywność stanie się jednorodnie niebieska. Dodaj pewną ilość mieszanki niebieskiego barwnika, aby nasycić kolor żywności, upewniając się, że nie ma różnic w kolorze między fiolkami.Umieść cienki ręcznik papierowy na otworach fiolki podczas suszenia, aby zapobiec przedostawaniu się zabłąkanych much do fiolki. Gdy pokarm zostanie schłodzony i zestalony, przenieś muchy do niebieskiej fiolki zawierającej żywność. Inkubować fiolki z muchami przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Następnego dnia przenieś muchy do fiolek zawierających standardowy pokarm dla muszki i ponumeruj każdą fiolkę. Wysiaduj muchy w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 60 minut. Po inkubacji przenieś muchy do nowych fiolek ze standardowym pokarmem dla drosophila.Narysuj przerywaną linię wzdłuż fiolki, aby zaznaczyć punkt początkowy liczenia. Ręcznie policz małe, okrągłe, nieprzezroczyste i bezbarwne kropki na ściance każdej fiolki. Zanotować stosunek niebieskich kropek do całkowitej liczby kropek na każdą fiolkę.U much kontrolnych niebieski pokarm jest wydalany stosunkowo szybko. Podczas gdy u much alfa-synukleinowych niebieski pokarm pozostaje w jelitach do ośmiu godzin. W 10 dniu po eklozji, kiedy muszki alfa-synukleinowe wykazują silny fenotyp neurodegeneracyjny, zaobserwowano znaczące różnice w czasie pasażu jelitowego w porównaniu z muszkami kontrolnymi.Nie zaobserwowano jednak różnic w pasażu jelitowym między muszkami kontrolnymi i alfa-synukleinowymi w pierwszym dniu po ekleksji.

measuring-constipation-in-a-drosophila-model-of-parkinson-s-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Testy behawioralne służące do pomiaru funkcji lokomocyjnych, zdolności uczenia się i pamięci u Drosophila.

Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Choroba Parkinsona jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym, które wynika ze zwyrodnienia neuronów dopaminergicznych w ośrodkowym układzie nerwowym, powodując zaburzenia lokomocji. Rotenon modeluje chorobę Parkinsona u Drosophila. W artykule przedstawiono dwa testy, które charakteryzują zarówno spontaniczne, jak i wywołane przez przerażenie niedobory lokomocji spowodowane rotenonem.

Metody charakteryzowania spontanicznej i indukowanej przez odstraszenie lokomocji w modelu choroby Parkinsona wywołanym rotenonem Drosophila

Przedstawiamy zoptymalizowany, niedrogi i wiarygodny test negatywnej geotaksji u Drosophila melanogaster jako model zaburzeń neurodegeneracyjnych. Będąc bardziej wrażliwym na łagodne wady narządu ruchu, test ten pomoże w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych interakcji genetycznych i celów leków.

Analiza ilościowa wad wspinaczkowych w modelu Drosophila zaburzeń neurodegeneracyjnych

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Protokół ten opisuje ilościowy test defekacji u młodych mutantów RAC1/CED-10 Caenorhabditis elegans, oferując prosty model do badania stadij choroby Parkinsona prodromalnej. Przezwycięża ograniczenia innych modeli zwierzęcych i ułatwia testowanie strategii terapeutycznych skierowanych do wczesnej patologii Parkinsona.

Ocena ruchliwości przewodu pokarmowego u mutantów Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 jako narzędzie do badania wczesnej choroby Parkinsona

Ten artykuł opisuje test behawioralny, który wykorzystuje popęd godowy samców u Drosophila melanogaster do badania motywacji. Korzystając z tej metody, naukowcy mogą wykorzystać zaawansowane techniki neurogenetyczne much, aby odkryć mechanizmy genetyczne, molekularne i komórkowe, które leżą u podstaw tej motywacji.

Pomiar i zmiana popędu godowego u samca Drosophila melanogaster

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Ten protokół skupia się na ilościowej analizie złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej (NDAC) u Drosophila, która może być wykorzystana do badań morfogenezy dendrytycznej.

Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila

Celem tego artykułu jest nakreślenie kroków wymaganych do wytworzenia włókienek z monomerycznej alfa-synukleiny, późniejszej kontroli jakości i użycia wstępnie uformowanych włókienek in vivo.

Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Tutaj opisujemy system RatWalker, zbudowany przez przeprojektowanie aparatu MouseWalker, aby dostosować go do zwiększonych rozmiarów i wagi szczurów. System ten wykorzystuje sfrustrowane całkowite odbicie wewnętrzne (FTIR), szybkie przechwytywanie wideo i oprogramowanie do analizy w otwartym dostępie do śledzenia i ilościowego określania parametrów chodu.

Zastosowanie systemu RatWalker do analizy chodu w genetycznym modelu szczurzym choroby Parkinsona

Poznaj metodę pomiaru zaparć w modelu choroby Parkinsona u Drosophila melanogaster z ekspresją alfa-synukleiny. Proste i tanie badanie umożliwia ocenę czasu przejścia pokarmu przez przewód pokarmowy.

Pomiar zaparć w modelu choroby Parkinsona Drosophila

Przeglądaj więcej filmów