Analiza jakościowa i ilościowa produkcji sideroforów z Pseudomonas aeruginosa
15 marca 2024
Ten protokół dostarcza zarówno jakościowych, jak i ilościowych analiz całkowitej liczby sideroforów, pioverdyny i pyocheliny z Pseudomonas aeruginosa.
Siderofory tworzą kompleksy z żelazem i transportują je do komórki w warunkach ograniczających żelazo. Siderofory są silnymi czynnikami wirulencji, które pomagają w ustaleniu ciężkiej infekcji u gospodarza i wiadomo, że odgrywają rolę w regulacji wyczuwania kworum u Pseudomonas aeruginosa. Nasze badania mają na celu ilościowe oszacowanie produkcji sideroforów u Pseudomonas.
Siderofory są cząsteczkami zewnątrzkomórkowymi, więc całkowite siderofory, wraz z pioverdyną i pyocheliną, są oznaczane ilościowo przy użyciu bezkomórkowego supernatantu. Ponieważ pyochelin nie jest wykrywany w małej objętości, ekstrakcję przeprowadza się z dużej objętości bezkomórkowego supernatantu. Ostatnio opracowano LCMS i biosensory do ilościowego oznaczania pyocheliny.
LCMS jest kosztowną konfiguracją dla małych laboratoriów, podczas gdy bioczujniki są zdolne do ilościowego oznaczania tylko pyocheliny. Ten prosty i ilustrowany protokół wykorzystuje minimalną ilość odczynników i oprzyrządowania laboratoryjnego oraz umożliwia oszacowanie siderforów z bezkomórkowego supernatantu przy użyciu krótszego czasu. Na początek weź kultury Pseudomonas aeruginosa hodowane przez 24 godziny, a następnie ustaw ich gęstość optyczną na 600 nanometrów na 0,2 i wykonaj odpowiednie rozcieńczenia za pomocą 0,8% soli fizjologicznej.
Za pomocą sterylnej drucianej pętli rozprowadź smugi na kulturze bakteryjnej na płytce agarowej CAS. Inkubować płytkę agarową CAS w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Przenieś kulturę na 96-dołkową płytkę mikromiareczkową i zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach.
Następnie przenieś kultury do probówek wirówkowych. Odwirować kulturę bakteryjną przy 4 650 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odpipetować 100 mikrolitrów bezkomórkowego supernatantu i dodać go do dołka na 96-dołkowej płytce.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów barwnika CAS do studzienki. Przykryj płytkę folią aluminiową przed inkubacją. Po inkubacji należy wykonać odczyty spektrofotometryczne przy 630 nanometrach i obliczyć całkowitą ilość sideroforów jako procentową jednostkę sideroforu.
Odpipetować 100 mikrolitrów bezkomórkowego supernatantu do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania, a następnie dodać do niej 100 mikrolitrów kwasu tris-solnego. Zmierzyć odczyt spektrofotometryczny roztworu przy 405 nanometrach. W celu ekstrakcji pyochelin, najpierw odpipetuj 100 mililitrów 48-godzinnych kultur Psuedomonas aeruginosa do probówek wirówkowych.
Odwirować kultury w temperaturze 4 650 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj pięć mililitrów jednego molowego kwasu cytrynowego do supernatantu. Dodaj 50 mililitrów octanu etylu do roztworu, aby wyekstrahować pyochelinę.
Przefiltruj fazę organiczną z siarczanem magnezu przez filtr strzykawkowy, a następnie przechowuj fazę organiczną w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Na koniec wykonaj odczyty spektrofotometryczne przy 320 nanometrach. Trzy izolaty kliniczne i szczep referencyjny, PAO1, rozwinęły wyraźną pomarańczową aureolę podczas uprawy na agarze CAS, co wskazuje na produkcję sideroforu.
Zaobserwowano istotne różnice między całkowitą produkcją sideroforów izolatu J3 i PAO1. Analizy spektrofotometryczne ekstraktu z pioverdyny wykazały potwierdzający pik na głębokości 380 nanometrów. Podczas gdy wszystkie izolaty były dodatnie pod względem produkcji pioverdyny, MR1 i J3 wykazały niższą produkcję w stosunku do szczepu referencyjnego.
Obecność pyocheliny została potwierdzona przez pik na poziomie 320 nanometrów. Wszystkie trzy izolaty kliniczne wytwarzały znacznie większe objętości w porównaniu z PAO1.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje produkcję sideroforów u Pseudomonas aeruginosa, koncentrując się w szczególności na ilościowym oznaczeniu całkowitej puli sideroforów, pyoverdyny oraz pyocheliny. Praca przedstawia uproszczony protokół pomiaru tych czynników wirulencji, które są kluczowe dla transportu żelaza i przebiegu infekcji patogennych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Czynniki wirulencji patogenów
- Mechanizmy transportu żelaza
- Metody ilościowego oznaczania metabolitów bakteryjnych
Wstęp
- Siderofory są niezbędne do pozyskiwania żelaza w warunkach jego niedoboru.
- Przyczyniają się one do patogenności Pseudomonas aeruginosa.
- Niniejszy protokół umożliwia łatwiejszą ocenę produkcji sideroforów.
Zastosowane metody
- Analiza spektrofotometryczna całkowitej zawartości sideroforów
- Pseudomonas aeruginosa jako organizm modelowy
- Techniki ekstrakcji piocheliny i pyoverdyny
Główne wyniki
- Zaobserwowano ilościowe różnice w produkcji sideroforów pomiędzy izolatami klinicznymi.
- Badanie potwierdziło, że wszystkie izolaty produkowały pyowerdynę.
- W różnych szczepach wykryto znacznie większe ilości piocheliny w porównaniu ze szczepem referencyjnym PAO1.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia wiarygodną metodę ilościowego oznaczania sideroforów w Pseudomonas aeruginosa.
- Wyniki stanowią podstawę do dalszych badań nad wirulencją bakterii oraz szlakami pozyskiwania żelaza.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa i jakościowa analiza produkcji sideroforów u Pseudomonas aeruginosa umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad szlakami pozyskiwania żelaza, które stanowią kluczowy czynnik wirulencji w modelach chorób zakaźnych. Wiarygodny pomiar pyoverdyny i pyocheliny wspomaga walidację celów oraz funkcjonalną analizę bakteryjnego wychwytu żelaza. Możliwości te dostarczają informacji niezbędnych w fazie wczesnego odkrywania oraz w badaniach translacyjnych nad strategiami antywirulencyjnymi w rurociągach rozwoju leków w biofarmacji.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną pozyskiwania żelaza jako celu terapeutycznego u patogenów bakteryjnych.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez rozróżnienie między szlakami sideroforów o wysokim i niskim powinowactwie.
- Ułatwia analizę porównawczą izolatów klinicznych w celu priorytetyzacji celów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe odczyty produkcji sideroforów z wykorzystaniem analiz spektrofotometrycznych.
- Umożliwia powtarzalną ocenę wpływu związków na biosyntezę pyoverdyny i pyocheliny.
- Wspiera skalowalność analizy i ponowne wykorzystanie platformy do przesiewania kandydatów na leki przeciwvirulencyjne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie ilościowego oznaczania sideroforów in vitro do modeli infekcji bakteryjnych istotnych w kontekście klinicznym.
- Zapewnia ciągłość translacyjną poprzez powiązanie wyników molekularnych z fenotypami wirulencji.
- Wspiera optymalizację rozwoju kandydatów na leki przeciwinfekcyjne celujące w mechanizmy pozyskiwania żelaza, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając wiarygodny pomiar produkcji sideroforów na potrzeby walidacji celów, przesiewania oraz badań translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów pozyskiwania żelaza oraz regulacji czynników wirulencji.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników do oceny związków w odniesieniu do szlaków sideroforowych.
- Analityka: Zapewnia spektrofotometryczne odczyty dla konkretnych długości fal, umożliwiając bezpośrednie porównania między izolatami i warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z przedklinicznymi modelami zakażeń poprzez kwantyfikację kluczowych determinantów wirulencji.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje zestandaryzowany, niskonakładowy protokół, który można dostosować do różnych szczepów bakteryjnych i warunków badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów oraz badaniach mechanistycznych wirulencji bakteryjnej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację przy minimalnych wymaganiach sprzętowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go w programach antywirulencyjnych poprzez zapewnienie wiarygodnych wyników funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów przeciwdziałających infekcjom oraz związków wiodących z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli bakterii i analizy spektrofotometrycznej.
- Niezbędny jest dostęp do podstawowej aparatury laboratoryjnej oraz odczynników do ekstrakcji i oznaczania ilościowego.
- Wymagana jest standaryzacja warunków analizy i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zastosowania dla różnych szczepów P. aeruginosa oraz potencjalnie innych organizmów wytwarzających siderofory.
- Etapy ekstrakcji pioczeliny mogą ograniczać wydajność w porównaniu do bezpośredniego oznaczania ilościowego pyowerdyny.
