Name: Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Poznaj konstrukcję komory przepływowej do mikroskopii z poklatkowego obrazowania aktyny. Metoda wykorzystuje parafilm i blok grzewczy do tworzenia szczelnych kanałów na mikroskopie pionowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li> Zbuduj komorę przepływu, jak pokazano w filmie. Upewnij się, że uszczelka parafilmie jest napięty i używać umyć nakrywkowe. </li><li> Inkubować aktyny-wiążąca w komorze na 5-10 &quot;. </li><li> Blok nieswoiste wiązania na szkiełka ze szkła białka. </li><li> Polimeryzacji aktyny w komorze przez przepływające w G-aktyny w polimeryzacji bufora. </li><li> Rozmycie unpolymerized aktyny przez płynący w nadmiar buforu. </li></ol>

monitoring actin demontaż z poklatkowy mikroskopia

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia

Dzisiaj chciałbym pokazać Państwu, jak skonstruować komorę przepływową, komorę fuzyjną do obrazowania za pomocą mikroskopu pionowego. W tym celu tworzę dwie przestrzenie przy użyciu folii. Wykorzystuję do tego Parafilm, który tnę na małe paski.W następnym kroku utworzę kanały, które będą stanowić ścianki, a następnie wysuszę je strumieniem powietrza pod kątem. Kładę szkiełko nakrywki na parafilmie i oto gotowy efekt. Następnie podgrzewam całość na bloku grzewczym, aby stopić parafilm i w ten sposób stworzyć uszczelnienie.Oto szkiełko nakrywowe, a na nim dwie warstwy folii, jak widać tutaj. Następnie na górze znajduje się ponownie szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 by 22 mm. To konkretne szkiełko, które docisnąłem do folii, aby uzyskać szczelne zamknięcie.Zatem ciecz wpływa tutaj w jednym kierunku, a ja mogę ją odessać za pomocą papieru filtracyjnego w tym kierunku. Pokażę wam za chwilę, jak to zrobić. To, co zazwyczaj robię, to umieszczenie próbki w komorze uwilżeniowej, co jest bardzo proste.Pobierz dwa rodzaje podwyższonych pasków i umieść pod nimi filtr papierowy. Aby zapobiec zanieczyszczeniom, na komorę przepływową nałóż szkiełko przykrywcze. Sposób wprowadzania roztworu do ko

monitoring-actin-disassembly-with-time-lapse-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.

Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

W tej pracy zastosowano podejście do rekonstytucji in vitro do badania poroselastyczności żeli z aktomiozyną w kontrolowanych warunkach. Określa się ilościowo dynamikę żelu aktomiozyny i wbudowanego rozpuszczalnika, za pomocą której wykazano porosprężystość sieci. Omawiamy również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.

Mechanika (poro-)elastycznych kurczliwych sieci aktomyozyny jako modelowy układ cytoszkieletu komórkowego

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

Niniejszy protokół opisuje regulowalny test ruchomości koralików z ogonami z aktyny w celu ilościowego zbadania, w jaki sposób aktywność motorów miozynowych wpływa na montaż rozgałęzionej aktyny oraz architekturę sieci na interfejsie przypominającym błonę.

Rekonstytucja rozgałęzionego montażu aktyny pośredniczonego przez miozynę I w kroplkowym teście ruchliwości ogonów kometowych aktyny

Poznaj konstrukcję komory przepływowej do mikroskopii z poklatkowego obrazowania aktyny. Metoda wykorzystuje parafilm i blok grzewczy do tworzenia szczelnych kanałów na mikroskopie pionowej.

Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia

Przeglądaj więcej filmów