Name: Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Poznaj konstrukcję komory przepływowej do mikroskopii z poklatkowego obrazowania aktyny. Metoda wykorzystuje parafilm i blok grzewczy do tworzenia szczelnych kanałów na mikroskopie pionowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> Zbuduj komorę przepływu, jak pokazano w filmie. Upewnij się, że uszczelka parafilmie jest napięty i używać umyć nakrywkowe. </li><li> Inkubować aktyny-wiążąca w komorze na 5-10 &quot;. </li><li> Blok nieswoiste wiązania na szkiełka ze szkła białka. </li><li> Polimeryzacji aktyny w komorze przez przepływające w G-aktyny w polimeryzacji bufora. </li><li> Rozmycie unpolymerized aktyny przez płynący w nadmiar buforu. </li></ol>

monitoring actin demontaż z poklatkowy mikroskopia

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia

Dzisiaj chciałbym pokazać Państwu, jak skonstruować komorę przepływową, komorę fuzyjną do obrazowania za pomocą mikroskopu pionowego. W tym celu tworzę dwie przestrzenie przy użyciu folii. Wykorzystuję do tego Parafilm, który tnę na małe paski.W następnym kroku utworzę kanały, które będą stanowić ścianki, a następnie wysuszę je strumieniem powietrza pod kątem. Kładę szkiełko nakrywki na parafilmie i oto gotowy efekt. Następnie podgrzewam całość na bloku grzewczym, aby stopić parafilm i w ten sposób stworzyć uszczelnienie.Oto szkiełko nakrywowe, a na nim dwie warstwy folii, jak widać tutaj. Następnie na górze znajduje się ponownie szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 by 22 mm. To konkretne szkiełko, które docisnąłem do folii, aby uzyskać szczelne zamknięcie.Zatem ciecz wpływa tutaj w jednym kierunku, a ja mogę ją odessać za pomocą papieru filtracyjnego w tym kierunku. Pokażę wam za chwilę, jak to zrobić. To, co zazwyczaj robię, to umieszczenie próbki w komorze uwilżeniowej, co jest bardzo proste.Pobierz dwa rodzaje podwyższonych pasków i umieść pod nimi filtr papierowy. Aby zapobiec zanieczyszczeniom, na komorę przepływową nałóż szkiełko przykrywcze. Sposób wprowadzania roztworu do komory polega na umieszczeniu końcówki pipety przy wlocie do komory i wykonaniu aplikacji.Teraz inkubuję komorę z zamkniętą pokrywą przez 10 minut. Aby odessać ciecz z drugiej strony, zazwyczaj używam papieru filtracyjnego, który tnę na cienkie paski w ten sposób. Biorę jeden z tych cienkich pasków i jednocześnie podaję roztwór do wlotu, przykładając papier filtracyjny do wylotu, aby odessać wymieniany roztwór.Zobaczą Państwo ciecz przepływającą przez roztwór. Następnie oczekuję pięciu minut na zamknięcie procesu. Teraz jestem gotowy, aby wprowadzić aktynę; aktynę muszę faktycznie spolimeryzować, co robię wewnątrz komory przepływowej, stosując te same procedury co wcześniej.Ponieważ w ten sposób, a teraz gdy aktyna uległa polimeryzacji, wypłukuję cały nadmiar niepolimeryzowanej aktyny, używając dużej objętości samego buforu. Mam tutaj około 100 µL, co odpowiada kilku objętościom komory reakcyjnej buforu. Gdy papier filtracyjny stanie się nasycony, muszę zmienić kierunek. Dobrze?Jestem zatem gotowy do przeprowadzenia obrazowania. Komora perfuzyjna z przytwierdzoną aktyną. Teraz biorę preparat, montuję go pod mikroskopem i ponieważ obrazowanie wykonuję za pomocą obiektywu olejowego, nałożę olej immersyjny na górną powierzchnię szkiełka nakrywkowe, aby ocenić roztwór, białko lub cokolwiek wewnątrz aktyny.W związku z tym, podczas wykonywania obrazowania poklatkowego, mogę w rzeczywistości wymieniać roztwór po stronie dopływowej.

monitoring-actin-disassembly-with-time-lapse-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.

Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

W tej pracy zastosowano podejście do rekonstytucji in vitro do badania poroselastyczności żeli z aktomiozyną w kontrolowanych warunkach. Określa się ilościowo dynamikę żelu aktomiozyny i wbudowanego rozpuszczalnika, za pomocą której wykazano porosprężystość sieci. Omawiamy również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.

Mechanika (poro-)elastycznych kurczliwych sieci aktomyozyny jako modelowy układ cytoszkieletu komórkowego

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

Poznaj konstrukcję komory przepływowej do mikroskopii z poklatkowego obrazowania aktyny. Metoda wykorzystuje parafilm i blok grzewczy do tworzenia szczelnych kanałów na mikroskopie pionowej.

Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia

Przeglądaj więcej filmów