Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia
November 8th, 2006
Okej, więc to co chciałbym dzisiaj zrobić, to pokazać wam, jak skonstruować komorę przepływową, komorę fuzyjną do obrazowania na pionowym mikroskopie. Następnie tworzę dwie przestrzenie za pomocą filmu. Więc to, co robię, to biorę folię para, tnę ją na małe paski.
Następnie zamierzam to w zasadzie uformować kanały dla ścian i suszę je przechylonym powietrzem. Kładę szkiełko nakrywkowe na górze para, a oto gotowe. Następnie podgrzewam go na bloku grzewczym, aby stopić parametr i w zasadzie stworzyć uszczelkę.
To jest szkło nakrywkowe tutaj, a na wierzchu szkła nakrywkowego znajdują się dwie warstwy kaprysu, jak widzicie tutaj. A na dodatek, znowu, jest to szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na dwa kilometry. Ten właśnie tutaj, który przycisnąłem do parametru, aby spaść pieczęć.
Okej, więc płyn wchodzi tutaj w jednym kierunku i mogę go odessać bibułą filtracyjną tutaj w tym kierunku. Za chwilę pokażę Ci, jak to zrobić. Więc to, co lubię robić, to umieszczać go w wilgotnej komorze, co jest bardzo proste.
Weź dwa rodzaje podwyższonych pasków i umieść pod spodem filtr papieru. I żeby było głośno, tak jak ja, założyłem pokrywę, szkiełko nakrywkowe na komorę przepływu. Teraz sposób, w jaki wprowadzasz rozwiązanie do komory, polega na tym, że po prostu kładziesz końcówkę pipety przy wejściu do komory i po prostu dzielisz.
Teraz inkubuję komorę z zamkniętą pokrywą przez 10 minut. To, co zwykle robię, aby odessać płyn z drugiej strony, to użyć go, wziąć bibułę filtracyjną i pokroić ją w cienkie paski, takie jak ten. I biorę jeden z tych cienkich pasków i jednocześnie nakładam roztwór do wejścia, kładąc bibułę filtracyjną na wyjściu, aby zassać wymianę, roztwór.
Więc zobaczysz, jak płyn przepływa przez roztwór. A potem czekam pięć minut na środkowe zamknięcie. Teraz jestem gotów zrobić, to faktycznie umieścić aktynę i aktynę, właściwie muszę polimeryzować, polimeryzuję w komorze przepływowej i to są te same procedury wcześniej.
Więc ponieważ w ten sposób, a potem teraz, gdy działanie jest spolimeryzowane, wypłukuję cały nadmiar niespolimeryzowanego działania za pomocą dużej objętości samego buforu. Więc tutaj mam około stu mikrolitrów i jest to bufor o pojemności kilku objętości komory reakcyjnej. Po prostu, wiesz, kiedy bibuła filtracyjna staje się nasycona, muszę zmienić kierunek. Porządku?
Jestem więc gotowy do zrobienia obrazowania z tym. A więc komora perfuzyjna z dołączoną do niej aktyną. Teraz biorę szkiełko, montuję je pod mikroskopem, a ponieważ obrazuję za pomocą obiektywu olejowego, zamierzam nałożyć trochę olejku immersyjnego na górną powierzchnię okładki, dotyk trawy, taki jak ocena roztworu lub białka lub czegokolwiek na działanie w środku.
Więc to, co robię, to mogę wymieniać się stroną rozwiązania podczas wykonywania zdjęć poklatkowych. Jako takie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł demonstruje konstrukcję komory przepływowej i komory fuzyjnej do obrazowania na pionowym mikroskopie. Proces polega na tworzeniu kanałów za pomocą parafilmu i uszczelnianiu ich za pomocą ciepła.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
Tło
- Komory przepływowe są niezbędne dla różnych technik obrazowania.
- Konstrukcja komory fuzyjnej pozwala na ulepszone możliwości obrazowania.
- Parafilm jest powszechnie stosowany w warunkach laboratoryjnych do tworzenia uszczelnień.
- Zrozumienie procesu konstrukcji jest kluczowe dla badaczy w tej dziedzinie.
Cel badania
- Dostarczyć krok po kroku przewodnik do konstruowania komory przepływowej.
- Zobrazować użycie parafilmu w tworzeniu komór obrazu.
- Zwiększyć dostępność technik obrazowania dla badaczy.
Stosowane metody
- Cięcie parafilmu na paski w celu utworzenia kanałów.
- Wysuszanie pasków za pomocą nachylonego strumienia powietrza.
- Umieszczenie pokrywki szklanej na parafilmie.
- Nagrzewanie zespołu na bloku grzejnym w celu utworzenia uszczelnienia.
Główne wyniki
- Funkcjonalna komora przepływowa została pomyślnie zbudowana.
- Proces uszczelniania był skuteczny w stworzeniu stabilnego środowiska do obrazowania.
- Przedstawiona metoda jest powtarzalna do użytku laboratoryjnego.
- Badacze mogą wykorzystać tę technikę do różnych zastosowań obrazowania.
Wnioski
- Konstrukcja komór przepływowych i fuzyjnych jest prosta.
- Ta metoda może ułatwić zaawansowane badania obrazowania.
- Dostępność do takich technik może poprawić wyniki badań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
