Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia
8 listopada 2006
Dzisiaj chciałbym pokazać Państwu, jak skonstruować komorę przepływową, komorę fuzyjną do obrazowania za pomocą mikroskopu pionowego. W tym celu tworzę dwie przestrzenie przy użyciu folii. Wykorzystuję do tego Parafilm, który tnę na małe paski.
W następnym kroku utworzę kanały, które będą stanowić ścianki, a następnie wysuszę je strumieniem powietrza pod kątem. Kładę szkiełko nakrywki na parafilmie i oto gotowy efekt. Następnie podgrzewam całość na bloku grzewczym, aby stopić parafilm i w ten sposób stworzyć uszczelnienie.
Oto szkiełko nakrywowe, a na nim dwie warstwy folii, jak widać tutaj. Następnie na górze znajduje się ponownie szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 by 22 mm. To konkretne szkiełko, które docisnąłem do folii, aby uzyskać szczelne zamknięcie.
Zatem ciecz wpływa tutaj w jednym kierunku, a ja mogę ją odessać za pomocą papieru filtracyjnego w tym kierunku. Pokażę wam za chwilę, jak to zrobić. To, co zazwyczaj robię, to umieszczenie próbki w komorze uwilżeniowej, co jest bardzo proste.
Pobierz dwa rodzaje podwyższonych pasków i umieść pod nimi filtr papierowy. Aby zapobiec zanieczyszczeniom, na komorę przepływową nałóż szkiełko przykrywcze. Sposób wprowadzania roztworu do komory polega na umieszczeniu końcówki pipety przy wlocie do komory i wykonaniu aplikacji.
Teraz inkubuję komorę z zamkniętą pokrywą przez 10 minut. Aby odessać ciecz z drugiej strony, zazwyczaj używam papieru filtracyjnego, który tnę na cienkie paski w ten sposób. Biorę jeden z tych cienkich pasków i jednocześnie podaję roztwór do wlotu, przykładając papier filtracyjny do wylotu, aby odessać wymieniany roztwór.
Zobaczą Państwo ciecz przepływającą przez roztwór. Następnie oczekuję pięciu minut na zamknięcie procesu. Teraz jestem gotowy, aby wprowadzić aktynę; aktynę muszę faktycznie spolimeryzować, co robię wewnątrz komory przepływowej, stosując te same procedury co wcześniej.
Ponieważ w ten sposób, a teraz gdy aktyna uległa polimeryzacji, wypłukuję cały nadmiar niepolimeryzowanej aktyny, używając dużej objętości samego buforu. Mam tutaj około 100 µL, co odpowiada kilku objętościom komory reakcyjnej buforu. Gdy papier filtracyjny stanie się nasycony, muszę zmienić kierunek. Dobrze?
Jestem zatem gotowy do przeprowadzenia obrazowania. Komora perfuzyjna z przytwierdzoną aktyną. Teraz biorę preparat, montuję go pod mikroskopem i ponieważ obrazowanie wykonuję za pomocą obiektywu olejowego, nałożę olej immersyjny na górną powierzchnię szkiełka nakrywkowe, aby ocenić roztwór, białko lub cokolwiek wewnątrz aktyny.
W związku z tym, podczas wykonywania obrazowania poklatkowego, mogę w rzeczywistości wymieniać roztwór po stronie dopływowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł prezentuje konstrukcję komory przepływowej oraz komory fuzji do obrazowania przy użyciu mikroskopu pionowego. Proces ten polega na tworzeniu kanałów z parafily i uszczelnianiu ich za pomocą ciepła.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia
Wstęp
- Komory przepływowe są niezbędne w wielu technikach obrazowania.
- Konstrukcja komory fuzyjnej pozwala na zwiększenie możliwości obrazowania.
- Parafilm jest powszechnie stosowany w warunkach laboratoryjnych do tworzenia uszczelnień.
- Zrozumienie procesu konstrukcji jest kluczowe dla badaczy w tej dziedzinie.
Cel badania
- Dostarczenie instrukcji krok po kroku dotyczącej konstrukcji komory przepływowej.
- Zilustrowanie zastosowania parafilmu w tworzeniu komór obrazujących.
- Zwiększenie dostępności technik obrazowania dla badaczy.
Zastosowane metody
- Wycinanie pasków parafilmu w celu utworzenia kanałów.
- Osuszanie pasków strumieniem powietrza pod kątem.
- Umieszczenie szkiełka nakrywkowego na wierzchu parafilmu.
- Podgrzewanie zespołu na bloku grzewczym w celu utworzenia uszczelnienia.
Główne wyniki
- Pomyślnie skonstruowano funkcjonalną komorę przepływową.
- Proces uszczelniania okazał się skuteczny w tworzeniu stabilnego środowiska do obrazowania.
- Przedstawiona metoda jest powtarzalna i nadaje się do zastosowań laboratoryjnych.
- Badacze mogą wykorzystać tę technikę w różnych zastosowaniach obrazowania.
Wnioski
- Konstrukcja komór przepływowych i fuzyjnych jest prosta.
- Metoda ta może ułatwić zaawansowane badania obrazowe.
- Dostęp do takich technik może poprawić wyniki badań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia powtarzalne przygotowanie kontrolowanych mikrośrodowisk do obrazowania żywych komórek, co wspiera badania mechanistyczne nad dynamiką cytoszkieletu. Poprzez standaryzację montażu komory przepływowej, metoda ta redukuje zmienność w testach opartych na perfuzji, poprawiając spójność danych między zespołami badawczymi. Metoda ta ułatwia ilościową analizę kinetyki rozpadu aktyny, kluczowego procesu w mobilności komórek i transdukcji sygnałów, istotnego dla walidacji celów w onkologii i immunologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią obserwację dynamiki depolimeryzacji aktyny w celu zbadania regulatorów przebudowy cytoszkieletu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną platformę do testowania wpływu związków na obrót aktyny w żywych komórkach.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Wspiera opracowanie odczytów opartych na fluorescencji dla szybkości rozpadu aktyny jako funkcjonalnego punktu końcowego analizy.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wymianę roztworu podczas obrazowania poklatkowego w celu oceny zależności dawka-odpowiedź w warunkach perfuzji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy dynamikę aktyny z fenotypami komórkowymi istotnymi dla przerzutowania, inwazji i tworzenia synapsy immunologicznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przedkliniczną ocenę inhibitorów szlaków sygnałowych z wykorzystaniem mierzalnych biomarkerów obrazowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od przesiewowego badania wiązania z celem molekularnym po walidację funkcjonalną w systemach komórkowych istotnych dla danej choroby.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regulatorów cytoszkieletu poprzez wizualizację przepływu aktyny w czasie rzeczywistym.
- Screening: Zapewnia ilościowe i powtarzalne pomiary rozpadu aktyny w kontrolowanych warunkach perfuzji.
- Analityka: Generuje dane o natężeniu fluorescencji rozdzielone w czasie, co umożliwia modelowanie kinetyki obrotu aktyny.
- Badania translacyjne: Łączy mechanizmy molekularne z fenotypami komórkowymi w przedklinicznych modelach migracji komórek.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Tworzy wielokrotnego użytku platformę perfuzyjną, którą można dostosować do wielu celów cytoszkieletowych i typów komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Mechanistyczna redukcja ryzyka w odniesieniu do celów zaangażowanych w regulację aktyny poprzez bezpośrednie odczyty funkcjonalne.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja przygotowania komory poprawia odtwarzalność testu pomiędzy różnymi ośrodkami i operatorami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wcześniejsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie modulacji celu z funkcjonalnymi efektami w cytoszkielecie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o efekty wpływające na fenotypy ruchliwości i inwazyjności komórek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu żywych komórek oraz w mikrofluidycznej kontroli przepływu.
- Zależy od dostępu do mikroskopów pionowych z kontrolą środowiskową i możliwościami perfuzji.
- Wymaga standaryzacji grubości parafilmu oraz parametrów uszczelniania w celu zapewnienia spójności między komorami.
- Adaptacja do różnych typów komórek może wymagać optymalizacji powłoki powierzchniowej oraz warunków polimeryzacji aktyny.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalny wpływ naprężeń ścinających na komórki podczas przedłużonej perfuzji, co odnotowano w protokole.
