Name: Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych próbek płynów ustrojowych przy użyciu rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F. Technika umożliwia ciągły przepływ i automatyzację.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim darczyńcom, którzy wzięli udział w tym badaniu, pracownikom Łotewskiej Bazy Danych Genomu za dostarczenie próbek. Instytut Fizyki Ciała Stałego Uniwersytetu Łotewskiego jako Centrum Doskonałości otrzymał dofinansowanie z Programu Ramowego Unii Europejskiej Horyzont 2020 H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 na podstawie umowy o grant nr 739508, projekt CAMART2. Prace te były wspierane przez Łotewską Radę Nauki w ramach projektu nr 1. lzp-2019/1-0142 oraz nr projektu: lzp-2022/1-0373.

Microfluidic Device for Continuous Extracellular Vesicle Isolation from Human Urine

<ol><li>Colombo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Tricarico, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biogenesis+of+shed+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Biology and biogenesis of shed microvesicles.</a> Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+drug+delivery+system+for+cancer+treatment%3A+Current+strategies+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances.</a> Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).</li>
<li>Royo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+separation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+Results+of+a+Worldwide+Survey+Performed+by+the+ISEV+Rigor+and+Standardization+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee.</a> Cells. 9 (9), 1955(2020).</li>
<li>Sidhom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+exosomal+isolation+methods%3A+Is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Reshi, Q. U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles+%28EVs%29+using+benchtop+size+exclusion+chromatography+%28SEC%29+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns.</a> Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Priedols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcated+asymmetric+field+flow+fractionation+of+nanoparticles+in+PDMS-free+microfluidic+devices+for+applications+in+label-free+extracellular+vesicle+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation.</a> Polymers. 15 (4), 789(2023).</li>
<li>Zhang, H., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric-flow+field-flow+fractionation+technology+for+exomere+and+small+extracellular+vesicle+separation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).</li>
<li>Talebjedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+microfluidics+for+extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Potential+use+for+standardized+embryo+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment.</a> Front Vet Sci. 7, 620809(2020).</li>
<li>van Meer, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+absorption+by+PDMS+in+the+context+of+drug+response+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays.</a> Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Bussooa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+oxygen+levels+within+thermoplastic+Organ-on-Chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%3A+X%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices.</a> Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).</li>
<li>Tang, L., Lee, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+route+for+irreversible+bonding+of+plastic-PDMS+hybrid+microdevices+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature.</a> Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).</li>
<li>Borda, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformable+neural+interface+based+on+off-stoichiometry+thiol-ene-epoxy+thermosets%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets.</a> Biomaterials. 293, 121979(2023).</li>
<li>Sandström, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+injection+molding+and+direct+covalent+bonding+of+OSTE%2B+polymer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).</li>
<li>Sticker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+based+polymers+as+versatile+materials+for+microfluidic+devices+for+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).</li>
<li>Bajo-Santos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolation+from+large+volume+samples+using+a+polydimethylsiloxane-free+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).</li>
<li>Claridge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+extracellular+vesicle+therapeutics%3A+Challenges%2C+considerations%2C+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).</li>
<li>Rezaie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+exosomes+application+in+clinical+trials%3A+Perspective%2C+questions%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges.</a> Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).</li>
<li>Aragón, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urinary+tract+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol+Focus%22%5BJournal%5D)">The urinary tract microbiome in health and disease.</a> Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).</li>
</ol>

A.A., G.M. i R.R. są założycielami, członkami zarządu i udziałowcami Cellbox Labs, LLC

Zaprezentowane urządzenie mikroprzepływowe stanowi obiecującą metodę izolacji i ekstrakcji pojazdów elektrycznych z płynów biologicznych, rozwiązując niektóre z krytycznych ograniczeń istniejących metod opartych na złotych standardach, takich jak UC i SEC12. UC i SEC są znane z tego, że są pracochłonne, czasochłonne i charakteryzują się niską wydajnością, co czyni je mniej odpowiednimi do zastosowań o wysokiej przepustowości, w których potrzebne są duże ilości pojazdów elektrycznych21,22. W przeciwieństwie do tego, opisywane urządzenie mikroprzepływowe może w sposób ciągły przetwarzać znaczną objętość do 20 ml płynu biologicznego przy minimalnym udziale użytkownika, co czyni je potencjalnym przełomem w warunkach przemysłowych lub klinicznych. Jedną z kluczowych zalet tego urządzenia mikroprzepływowego jest jego zdolność do standaryzacji izolacji pojazdów elektrycznych i poprawy odtwarzalności w porównaniu z tradycyjnymi metodami, które wymagają ręcznych kroków. Zmniejszając zmienność produkcji urządzeń izolujących pojazdy elektryczne poprzez masową produkcję, wydajność urządzenia może być lepiej kontrolowana i spójna, co ma kluczowe znaczenie dla zastosowań takich jak terapia i diagnostyka oparta na pojazdach elektrycznych. Co więcej, kompatybilność urządzenia z produkcją wielkoseryjną poprzez wtryskiwanie reakcyjne odpowiednich podłoży jeszcze bardziej zwiększa jego potencjał skalowalności i szerszego zastosowania.
Aby zapewnić powtarzalność i stałą wydajność, niezbędny jest obszerny i dobrze zdefiniowany protokół, zarówno do produkcji chipa, jak i do jego wykorzystania w eksperymentach. Chip został zaprojektowany z myślą o industrializacji. Jednak podczas wytwarzania urządzenia w środowisku laboratoryjnym należy zwrócić uwagę na unikanie tworzenia się pęcherzyków, zapewnienie precyzyjnego i solidnego wiązania oraz przeprowadzenie dokładnych testów przy wyższych prędkościach przepływu niż oczekiwane w rzeczywistych eksperymentach. Ten środek ostrożności jest szczególnie ważny w przypadku urządzeń COC-OSTE, ponieważ mogą one być podatne na wycieki z powodu nieudanego łączenia, zwłaszcza przy wyższych natężeniach przepływu. Dodatkowo, ponieważ OSTE jest materiałem światłoczułym, produkcja urządzenia powinna odbywać się w żółtym świetle, aby uniknąć niepotrzebnej ekspozycji na promieniowanie UV. Ponieważ technologia ta jest wciąż w początkowej fazie, naukowcy powinni eksperymentować z różnymi prędkościami przepływu, aby określić optymalne ustawienie dla ich konkretnego zastosowania, ponieważ ustandaryzowane protokoły dla tej nowatorskiej metody nie zostały jeszcze ustalone, a lepkość cieczy może wyraźnie wpłynąć na skuteczność izolacji EV w oparciu o nasze wyniki. Postępując zgodnie z tymi wytycznymi i stawiając czoła wyzwaniom standaryzacji, potencjał tego mikroprzepływowego urządzenia do izolacji pojazdów elektrycznych może być w pełni wykorzystany w różnych obszarach badawczych i zastosowaniach.
Metoda izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego pozwala na daleko idące modyfikacje i rozwiązywanie problemów w celu optymalizacji wydajności. Aby poprawić separację cząstek, naukowcy mogą badać dłuższe kanały, różne porowatości i gęstości porów błony oraz zmienione wymiary. Jeśli na wylocie małych cząstek znajduje się dużo dużych cząstek, korzystne może być przetestowanie wyższej prędkości wlotowej bufora, natomiast jeśli na wylocie dużych cząstek znajduje się wiele małych cząstek, zaleca się eksperymentowanie z dłuższym kanałem lub membraną z większymi porami. Zajęcie się absorpcją cząstek może obejmować dostosowanie prędkości przepływu, modyfikacje powierzchni i składu OSTE lub zmianę czasu ekspozycji na promieniowanie UV. W przypadku urządzeń, w których występuje niestabilność i nieszczelność, zmniejszenie prędkości przepływu i zapewnienie prawidłowego klejenia są kluczowymi krokami. Aby zminimalizować uszkodzenia pojazdów elektrycznych, naukowcy mogą zmniejszyć prędkość przepływu, dokładniej umyć PBS po sterylizacji urządzenia i rozważyć użycie mniejszych porów membranowych lub alternatywnych technik i materiałów do projektowania form. Dzięki tym zmianom urządzenie mikroprzepływowe może zostać precyzyjnie dostrojone, uwalniając jego potencjał do różnorodnych zastosowań w badaniach nad pojazdami elektrycznymi i pokrewnych dziedzinach. Dodatkowo, aby zoptymalizować wydajność urządzenia, można włączyć charakterystykę próbki przed procesem, w tym pomiary gęstości i lepkości, w celu dostosowania parametrów przepływu. Ponadto należy położyć szczególny nacisk na charakter próbki, biorąc pod uwagę stwierdzoną niesterylność płynów biologicznych23. W związku z tym należy należycie rozważyć sterylizację próbek przed ich podaniem w zastosowaniach klinicznych.
Pomimo tych wyzwań urządzenie mikroprzepływowe ma ogromny potencjał w różnych obszarach badawczych. Jego zdolność do ciągłego izolowania pojazdów elektrycznych od dużych ilości wysoce niejednorodnych próbek otwiera drzwi do automatyzacji, ułatwiając aplikacje o wysokiej przepustowości i umożliwiając bardziej dogłębną analizę pojazdów elektrycznych z różnych źródeł. Zintegrowanie tego modułu mikroprzepływowego z różnymi urządzeniami, takimi jak wkłady bioreaktorów z pustymi włóknami lub cytometry przepływowe o wysokiej rozdzielczości, może sprawić, że zastosowania pojazdów elektrycznych staną się bardziej przyjazne dla przemysłu i napędzać innowacje w dziedzinach takich jak dostarczanie leków, diagnostyka i kosmetyki4. Ogólnie rzecz biorąc, to urządzenie mikroprzepływowe stanowi znaczący krok naprzód w dziedzinie badań nad pojazdami elektrycznymi, oferując wydajną i ustandaryzowaną metodę izolacji pojazdów elektrycznych z obiecującymi zastosowaniami w szerokim zakresie badań i warunków przemysłowych.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to cząstki błonowe pochodzenia komórkowego, składające się z dwóch głównych typów: egzosomy (30-200 nm) i mikropęcherzyki (200-1000 nm)1. Egzosomy powstają poprzez wewnętrzne pączkowanie błony endosomalnej w ciele wielopęcherzykowym (MVB), uwalniając pęcherzyki śródświetlne (ILV) do przestrzeni zewnątrzkomórkowej po fuzji z błoną plazmatyczną1. W przeciwieństwie do tego, mikropęcherzyki są generowane przez pączkowanie na zewnątrz i rozszczepienie błony komórkowej2. EV odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej poprzez transport białek, kwasów nukleinowych, lipidów i metabolitów, odzwierciedlając stan fizjologiczny komórki, w tym wzrost, angiogenezę, przerzuty, proliferację i oporność na terapię3. W rezultacie okazały się obiecującymi biomarkerami i celami terapeutycznymi dla chorób, w tym raka, podkreślając ich potencjał w diagnostyce i systemach dostarczania leków4.
Aby w pełni wykorzystać EVs w diagnostyce chorób i terapii, niezbędna jest skuteczna izolacja od różnych płynów biologicznych5. Typowe metody obejmują ultrawirowanie (UC), wirowanie w gradionym gradiorze, chromatografię wykluczania wielkości (SEC), filtrację i immunoizolację6. UC jest szeroko stosowaną techniką, ale może dawać cząstki o podobnej gęstości, które nie są EV i mogą generować agregaty EVs7. SEC zyskał popularność ze względu na swoją zdolność do dostarczania próbek o wyższej czystości poprzez wykluczanie cząstek na podstawie rozmiaru, a nie gęstości8. Jednak staranny dobór odpowiedniej wielkości porów dla kolumny SEC i optymalizacja warunków chromatograficznych są niezbędne, aby zminimalizować koizolację niepożądanych cząstek, takich jak chylomikrony i lipoproteiny o niskiej gęstości8. Pomimo swojej skuteczności, obie metody są czasochłonne i trudne do zautomatyzowania, szczególnie w przypadku próbek o większej objętości, takich jak pożywki komórkowe lub mocz, co ogranicza ich skalowalność do zastosowań przemysłowych9.
W ostatnich latach, frakcjonowanie pola asymetrycznego przepływu pola (A4F) rozwinęło się jako potężna technika separacji mikro- i nanometrowych cząstek na podstawie wielkości i wyporu10. Zasada działania A4F opiera się na kanale mikroprzepływowym wyposażonym w porowatą membranę u podstawy, generującą siłę wywieraną w kierunku membrany zwaną przepływem krzyżowym10. W połączeniu z ruchem Browna i przepływem Poiseuille'a nieodłącznie związanymi z systemem, przepływ krzyżowy ułatwia efektywną separację cząstek dzięki zmiennemu położeniu cząstek w dynamice przepływu11. Pomimo korzyści, metoda ta jest ograniczona do objętości próbek w zakresie mikrolitrów12 i wymaga dodatkowego kroku ogniskowania, wydłużając czas trwania procesu10.
W ciągu ostatniej dekady, mikrofluidyka zyskała na znaczeniu jako narzędzie do szybkiej, efektywnej i klinicznie niezawodnej separacji EV13. Jednak większość metod mikroprzepływowych przeznaczonych do separacji EV jest zoptymalizowana dla próbek EV o małej objętości i wysokim stężeniu lub zależy od złożonych procedur separacji14. Ponadto, w dziedzinie mikrofluidyki, polidimetylosiloksan (PDMS) jest uznawany za złoty standard ze względu na swoją przezroczystość optyczną, biokompatybilność i łatwość użycia15. Niemniej jednak, jego znana skłonność do wchłaniania małych cząsteczek lipofilowych, w tym EV, może być problematyczna dla jego zastosowania w polu EV13.
Cykliczny kopolimer olefin (COC) jest często używanym materiałem w mikrofluidyce ze względu na biokompatybilność, małą absorpcję cząsteczek i wysoką odporność chemiczną15. Jednak produkcja urządzeń COC często wiąże się ze złożonymi procesami lub specjalistycznym sprzętem16. Alternatywnie, pozastechiometryczny tiol-en (OSTE) jest obiecującą alternatywą dla PDMS ze względu na zmniejszoną absorpcję małych cząsteczek, doskonałą stabilność chemiczną, łatwość wytwarzania i skalowalny proces wytwarzania17,18. Jednak ze względu na skomplikowane połączenia z rurkami, urządzenia mogą być podatne na przeciekanie19.
Celem tego badania było zaprojektowanie i wyprodukowanie urządzenia mikroprzepływowego łączącego OSTE i COC oraz rozwidloną zasadę A4F do separacji EV od próbek o dużej objętości, takich jak mocz lub media komórkowe.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mikro; m karboksylan FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F8803</td><td>Stężenie magazynowe: 3,6 x 1013 kulek/ml (w zależności od LOT)</td></tr><tr><td>0,5 ml probówki do mikrowirówek</td><td>Starstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Strzykawka stożkowa Luer jednorazowego użytku bez igły</td><td>RAYS</td><td>TUB1ML</td><td></td></tr><tr><td>1.0 &micro; m polistyren FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F13083</td><td>Stężenie magazynowe: 1 x 1010 kulek/ml (w zależności od LOT)</td></tr><tr><td>10 ml Pipety serologiczne</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL (100k) Filtry odśrodkowe Amicon Ultra</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Białkowe rurki</td><td>LoBind Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>strzykawki 20 ml</td><td>BD PlastikPak</td><td></td><td></td>10569215</tr><tr><td>250 &mikro; m ID rurki polieteroeteroetero-ketonowe</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-1581</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa MWCO odśrodkowe jednostki filtrujące</td><td>Merck Millipore,</td> <td>UFC200324</td><td></td></tr><tr><td>5 ml strzykawka medyczna bez igły</td><td>Anhui Hongyu Wuzhou Medical</td><td>159646</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurki stożkowe</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti ultrawirówka o stałym kącie</td> nachylenia <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>800 &mikro; m ID rurki z politetrafluoroetylenu</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KTU-15</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka, f-bottom, med. wiązanie</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655001</td><td>płytka ELISA</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x), bez surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>SigmaAldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas platforma</td> <td>szkiełek mikroskopowychMikroprzepływowy sklep z chipami</td><td>10000002</td><td></td></tr><tr><td>platforma szkiełek mikroskopowych COC Topas 2 x 16 Mini Luer&nbsp;</td><td>Chipshop mikroprzepływowy</td><td>10000387</td><td></td></tr><tr><td>Regulator ciśnienia Elveflow OB1</td><td>Grupa Elvesys Złącza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luer</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>&nbsp; CS-10000095</td><td></td></tr><tr><td>Nakładka do masek Suss MA/BA6</td><td>SUSS MicroTec Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer Thinky ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator nanocząstek NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny Nikon Eclipse LV150N</td><td>Nikon Metrology NV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSTE 322 Crystal Clear</td><td>Mercene Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS TABLETS.Ca/Mg darmowy. Bioodczynniki Fishera. 100 g</td><td>Membrana Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>PC (średnica porów 50 nm, gęstość 11,8%)</td><td>it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego, sterylne</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher GIGAbatch 360 M</td><td>PVA TePla America, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEVoriginal/35 nm kolumna</td><td>Izon</td><td>SP5</td><td>SEC</td></tr> <tr><td>kolumnaQSIL 216 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>PP & S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resin Tough Black</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40 Ti wirnik ultrawirówkowy</td><td>wahadłowy Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>DK Infusetek</td><td>ISPLab002</td><td></td></tr><tr><td>T175 kolba zawiesinowa</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.502</td><td></td></tr><tr><td>Białko TIM4-Fc</td><td>Adipogen LifeSciences</td><td>AG-40B-0180B-3010</td><td></td></tr><tr><td>TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna)</td><td>SigmaAldrich</td><td>T0440-100ML</td><td>Podłoże peroksydazy chrzanowej</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>SigmaAldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Optima L100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa jednostka czyszcząca P 60 H</td><td>Elma Schmidbauer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny spektrofotometr</td> <td>do mikropłytekInstrumenty Bio-Tek</td><td>71777-1</td><td></td></tr><tr><td>Kubek do zbierania moczu, 150 ml, sterylny</td><td>APTACA</td><td>2120_SG</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Whatman Anotop 25</td><td>SigmaAldrich</td><td>68092002</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>system dynamicznego rozpraszania światła (DLS)&nbsp;</td></tr><tr><td>Zortrax Inkspire</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego a4f

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) mają ogromny potencjał do różnych zastosowań biomedycznych, w tym diagnostyki, dostarczania leków i medycyny regeneracyjnej. Niemniej jednak obecne metodologie izolowania pojazdów elektrycznych stanowią poważne wyzwania, takie jak złożoność, czasochłonność i zapotrzebowanie na nieporęczny sprzęt, co utrudnia ich kliniczne zastosowanie. Aby rozwiązać te problemy, naszym celem było opracowanie innowacyjnego systemu mikroprzepływowego opartego na cyklicznym tiolowo-senowym tiolowo-senowym kopolimerze olefin poza stechiometrią (COC-OSTE) do wydajnej izolacji EV od próbek o dużej objętości w sposób ciągły. Wykorzystując separację opartą na wielkości i wyporności, technologia zastosowana w tym badaniu osiągnęła znacznie węższy rozkład wielkości w porównaniu z istniejącymi podejściami z próbek moczu i pożywek komórkowych, umożliwiając ukierunkowanie na określone frakcje wielkości EV w przyszłych zastosowaniach. Nasza innowacyjna konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego COC-OSTE, wykorzystująca technologię frakcjonowania w polu przepływu bifurkowanego asymetrycznego, oferuje proste i ciągłe podejście do izolacji EV dla próbek o dużej objętości. Co więcej, potencjał masowej produkcji tego urządzenia mikroprzepływowego zapewnia skalowalność i spójność, co umożliwia integrację izolacji EV z rutynową diagnostyką kliniczną i procesami przemysłowymi, w których niezbędna jest wysoka spójność i przepustowość.

Wytworzyliśmy urządzenie mikroprzepływowe, wykorzystując wydrukowaną w technologii 3D podwójną formę negatywową (Rysunek 1) za pomocą miękkiej litografii (Rysunek 2A), w celu wysokoprzepływowej separacji EV w oparciu o zasadę rozwidlonego A4F (Rysunek 2B,C). Układ wymaga pompy oraz stacji przepływowej, co przedstawiono na Rysunku 3, w celu zautomatyzowanej izolacji EV. W pierwszej kolejności, aby ocenić koncepcję działania urządzeń, przygotowano mieszaninę kulek polistyrenowych o średnicach 100 nm i 1000 nm, reprezentujących odpowiednio pęcherzyki oraz drobne szczątki komórkowe10. Eksperymenty przeprowadzono przy różnych prędkościach przepływu mieszaniny kulek, zarówno z przepływem rozwidlonym, jak i bez niego, aby zbadać wpływ prędkości liniowej na wydajność separacji. we wszystkich eksperymentach odzysk małych kulek pozostał stały i przekroczył 90%10, co wykazuje potencjał urządzenia do odzyskiwania EV.
Następnie oceniono i porównano potencjał urządzenia COC-OSTE w izolowaniu EV z dużych objętości (&gt;1 mL) złożonych płynów biologicznych przy minimalnym wstępnym przetwarzaniu. W związku z tym mocz od 10 zdrowych dawców (Rysunek 4) oraz pożywki komórkowe z dwóch różnych linii komórek prostaty (Rysunek 5) posłużyły jako materiał do jednoczesnej izolacji EV zgodnie z trzema różnymi procedurami: ultrawirowaniem (UC), chromatografią wykluczania sterycznego (SEC) oraz mikrofluidycznym urządzeniem OSTE-COC opartym na technice A4F. Po izolacji oceniono całkowitą liczbę cząstek oraz ich rozkład wielkości, wykorzystując analizę śledzenia nanocząstek (NTA). Średnio urządzenie OSTE-COC wykazało lepszą całkowitą odzyskowość cząstek z płynów biologicznych w porównaniu z UC, jednak istotność statystyczną osiągnięto jedynie po zsumowaniu liczby cząstek z obu portów (Rysunek 4A). Aby porównać wydajność urządzenia z innymi systemami, należy wziąć pod uwagę łączny wynik z wylotów L i R. Jak pokazano na Rysunku 4, wydajność łączna wylotów L i R w odzyskiwaniu EV przewyższa UC i SEC. Osobno port L został zaprojektowany do wychwytywania frakcji małych EV, podczas gdy port R został zaprojektowany do zbierania większej frakcji EV wraz z innymi cząsteczkami o podobnej wielkości. Co ciekawe, odzyskowość przy użyciu portu R urządzenia OSTE-COC była nieco wyższa niż w przypadku samego SEC i UC (Rysunek 4A). Ekspresja CD63 wykazała podobny wzorzec (Rysunek 4C). Wynik ten wskazuje, że urządzenie OSTE-COC było skuteczniejsze w całkowitym odzyskiwaniu EV. Podobny rozkład wielkości stwierdzono dla różnych metod, z wyjątkiem UC, która wykazuje rozkład w stronę większych cząstek (Rysunek 4B).
Podobne wyniki zaobserwowano w hodowlach w pożywkach komórkowych. W obu scenariuszach całkowity odzysk cząstek z obu portów urządzenia wykazał lepszą wydajność w porównaniu z metodami SEC lub UC (jak przedstawiono na Rysunku 5A,B). Warto zauważyć, że pęcherzyki EV pochodzące z komórek PC3 wykazały wyraźny rozkład wielkości, z większą homogenicznością w rozkładzie L-PORT w porównaniu z innymi grupami eksperymentalnymi (Rysunek 5C,D). Ponadto analiza ekspresji CD63 potwierdziła wyższe wskaźniki odzysku EV osiągnięte przy użyciu urządzenia COC-OSTE (jak zilustrowano na Rysunku 5E,F). Podsumowanie porównujące charakterystykę izolacji różnych metod badanych w niniejszej pracy znajduje się w Tabeli 1.
<img alt="Schemat urządzenia mikrofluidycznego, zawiera wymiary projektu, stosowanego do kontroli płynów i eksperymentów lab-on-chip." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wymiary i widok izometryczny wydrukowanej w 3D podwójnej formy negatywowej o kształcie serpentyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wytwarzanie urządzenia mikrofluidycznego; proces PDMS, OSTE/COC; schemat komory separacyjnej; szczątki komórkowe, EV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Mikrofluidyczne urządzenie COC-OSTE. (A) Schemat głównych etapów wytwarzania urządzenia OSTE-COC. (B) Zasada działania urządzenia. (C) Zdjęcie gotowego urządzenia. Pasek skali: 15 mm. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Priedols et al.10 oraz Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="System chromatograficzny z autoinjektorem; ustawienie eksperymentu w laboratorium chemii analitycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Konfiguracja eksperymentalna urządzenia. Po lewej stronie znajduje się pompa strzykawkowa, w środku urządzenie OSTE-COC, a po prawej stacja odzysku. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Priedols et al.10 oraz Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cząstek z wykresami słupkowymi i pudełkowymi przedstawiającymi rozkład, rozmiar i poziomy ekspresji CD63." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Rozkład rozmiarów EV w moczu oraz odzysk cząstek od 10 dawców przy użyciu ultrawirowania (UC), chromatografii wykluczania rozmiarów (SEC) i urządzenia COC-OSTE. (A) Ilość cząstek odzyskanych każdą metodą izolacji, określona za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Dane przedstawiono jako średnia +/- odchylenie standardowe. Istotność statystyczną oznaczono symbolem * (p&lt;0.05). (B) Wykresy pudełkowe przedstawiają średni rozkład rozmiarów cząstek we wszystkich próbkach moczu ocenionych metodą NTA, gdzie wąsy wskazują wartości minimalne i maksymalne. Wartości p uzyskano z porównań do metody UC, gdzie **** oznacza wysoką istotność statystyczną (p&lt;0.0001). (C) Dla każdej metody izolacji obliczono medianę i zakres średniej ilości CD63 we wszystkich próbkach, ocenianej za pomocą podwójnego enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego typu sandwich (dsELISA). L-port: port lewy; R-port: port prawy. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy analizy cząstek; całkowita ilość, rozmiar i ekspresja CD63; porównanie PC3 i LNCaP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Charakterystyka EV izolowanych z komórek PC3 i LNCaP za pomocą różnych metod. (A) Ilość cząstek odzyskanych z pożywki PC3 przy użyciu analizy śledzenia nanocząstek (NTA), przedstawiona jako średnia +/- odchylenie standardowe. (B) Ilość cząstek odzyskanych z pożywki komórek LNCaP przy użyciu NTA, przedstawiona jako średnia +/- odchylenie standardowe. (C) Mediana rozkładu wielkości cząstek EV z hodowli PC3 wraz z zakresem, wyznaczona metodą NTA. (D) Mediana rozkładu wielkości EV izolowanych z hodowli LNCaP wraz z zakresem. (E) Mediana i zakres ekspresji CD63 dla każdej metody izolacji w przypadku EV pochodzących z linii komórkowej PC3, z zastosowaniem podwójnego testu ELISA (dsELISA). (F) Mediana i zakres ekspresji CD63 w EV pochodzących z LNCaP wyznaczone metodą dsELISA dla każdej metody izolacji. UC: ultrawirowanie; SEC: chromatografia wykluczania rozmiarów; L-port: port lewy; R-port: port prawy. Rysunek został zmodyfikowany za zgodą Bajo-Santos i wsp.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>UC</td>
			<td>SEC (Chromatografia żelowa / Chromatografia wykluczania molekularnego)</td>
			<td>COC-OSTE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas przetwarzania/próbka</td>
			<td>++/+++</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przepustowość</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koszt/próbka</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czystość</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatyzacja</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wydajność EV</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selekcja pod względem wielkości</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Porównanie charakterystyk izolacji EV za pomocą trzech metod: UC, SEC oraz urządzenia COC-OSTE. UC: ultrawirowanie; SEC: chromatografia wykluczania cząsteczkowego. COC-OSTE: cykliczny kopolimer olefinowy – reakcja thiol-ene poza stechiometrią. +: niska; ++: średnia; +++: wysoka. * Zależne od urządzenia.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

Dostrzegamy potencjał pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, ale także dostrzegamy trudność w ich izolacji, zwłaszcza od dużej próbki biopłynów, takich jak pożywka bioreaktorowa. W tym badaniu sprawdziliśmy, czy możemy użyć asymetrycznego frakcjonowania pola przepływu do wyizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Obecnie niemożliwe jest wyizolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bezpośrednio z płynów biologicznych w ciągłym przepływie w celu integracji z bioreaktorami.Zamiast tego biopłyny muszą być najpierw zebrane i przetworzone, co zwiększa żywotność i pracę. Nasze urządzenie, przeznaczone do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biopłynów o dużej objętości, umożliwia integrację z bioreaktorami w celu zapewnienia ciągłego przepływu i automatyzacji. Odkryliśmy, że lepkość cieczy może wpływać na izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu asymetrycznego frakcjonowania w polu.Badamy, czy dostosowanie przepływów biopłynów i do lepkości może poprawić izolację. Aby rozpocząć, umieść utleniony szkiełko COC na formie PDMS dla górnego kanału urządzenia. Umieść zespół w przyrządzie do formowania na miejscu.Następnie dokręć przyrząd kluczem dynamometrycznym ustawionym na 0,3 niutonometra. Podłącz rurkę PTFE do wlotu formy. Napełnij urządzenie ciśnieniem 1 000 milibarów, utrzymywanym przez pompę elektryczną piso umieszczoną w układzie ciśnieniowym.Umieść przyrząd ze szklanym szkiełkiem do góry w wyrównywaczu maski i wystawiaj go na działanie 850 milidżuli dozowanych z filtrem ND33. Teraz doprowadź strukturalny OSTE do kontaktu z membraną o słabej gęstości 11,8%, upewniając się, że kanały są całkowicie pokryte membraną. Umieść czyste szklane szkiełko na membranie.Zastosuj nacisk 1,6 kilopaskali od góry, aby zapewnić równomierne wiązanie. Następnie umieść membranę montażową stroną do góry na płycie grzejnej w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie wyrównaj warstwę OSTE struktury z zespołem górnego kanału.Upewnij się, że górna i dolna warstwa są wyrównane, a dolna warstwa OSTE styka się z membraną. Użyj mikroskopu, aby wizualnie ocenić urządzenie pod kątem wszelkich wad. Po zakończeniu napełnij dwie pięciomililitrowe strzykawki dwoma mililitrami nadtlenku wodoru.Umieścić strzykawki na pompie strzykawkowej. Następnie podłącz rurkę PTFE o długości 14 centymetrów do strzykawek z igłami strzykawkowymi. Podłącz rurkę do wlotów urządzenia za pomocą łączników przynęty.Podłącz rurkę PEEK o długości 20 centymetrów do wylotów urządzenia. Następnie podłącz drugi koniec rurki PEEK do pojemnika na odpady. Na ekranie przyrządu naciśnij ustawienia, a następnie wybierz zestaw systemowy, a następnie strzykawkę.Następnie kliknij przycisk Wstecz i wybierz parametry, aby wprowadzić prędkość przepływu 500 mikrolitrów na minutę. Zebrać przepływ do pojemnika na odpady. Następnie napełnij dwie nowe pięciomililitrowe strzykawki dwoma mililitrami etanolu.Zastąp zużyte strzykawki strzykawkami wypełnionymi etanolem, a następnie uruchom pompę. Podobnie, napełnij strzykawki pięcioma mililitrami PBS z filtrem 20-nanometrowym. Podłącz je do pompy i przepłucz urządzenie czterema mililitrami roztworu PBS.Odłącz rurkę od urządzenia. Otwory wlotowe i wylotowe należy zamknąć korkami do przynęt. Następnego dnia przepłucz urządzenie wypełnione PBS czterema mililitrami przefiltrowanego PBS.Zbierz ostatni mililitr przepływu z obu wylotów do dwumililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania białka. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza jako ślepą próbę na cząstki wprowadzane przez urządzenie. Wymienić strzykawki wypełnione PBS na strzykawki wypełnione powietrzem.Następnie przepłucz urządzenie czterema mililitrami powietrza, aż cała ciecz opuści urządzenie i rurkę. Aby przetestować próbki moczu, najpierw zbierz 100 mililitrów porannego moczu od każdego dawcy w sterylnych pojemnikach. Oddziel każdą próbkę do dwóch 50-mililitrowych probówek.Odwirować probówki o stężeniu 2 000 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zbierz supernatant. Odwirować sklarowany nad osadem o stężeniu 10 000 G przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia wszelkich cząstek stałych.Zebrać supernatant do nowych probówek. Napełnij 20-mililitrową strzykawkę przygotowaną próbką moczu. Następnie podłącz go do wlotu próbki urządzenia.Następnie napełnij kolejną 20-mililitrową strzykawkę 20 mililitrami przefiltrowanego PBS poddanego działaniu DEPC i podłącz ją do wlotu bufora urządzenia. Oddzielnie przenieś przepływ do 100 000 probówek o masie cząsteczkowej i odwiruj probówki, aby zagęścić 100 mikrolitrów każda. Następnie przenieś koncentraty do mikroprobówek wirówkowych o pojemności 0,5 mililitra.Wiruj koncentraty przez 30 sekund, a następnie wiruj przez 10 sekund w wirówce. Przenieść 25 mikrolitrów każdej próbki do nowych oznakowanych probówek. Zamroź je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.Urządzenie OSTE COC wykazało lepszy całkowity odzysk cząstek z biopłynów w porównaniu z ultrawirowaniem. Odzysk przy użyciu portu R urządzenia COC OSTE był nieco wyższy niż w przypadku samej chromatografii wykluczającej rozmiar i ultrawirowania. Stwierdzono równoważny rozkład wielkości między różnymi metodologiami, z wyjątkiem ultrawirowania, które wykazało większy rozkład wielkości cząstek.Całkowity odzysk cząstek z obu portów urządzenia wykazał się doskonałą wydajnością.

single-step-isolation-extracellular-vesicles-from-large-volume

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Źródło: Watson, D. C., et al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości z porowatymi kulkami żywicy do izolowania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu kultury bakteryjnej. Większe EV eluują się wcześnie, omijając pory żywicy, podczas gdy mniejsze białka dostają się do porów i wymywają później.

Izolacja bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość 

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), małych błoniastych cząsteczek uwalnianych z komórek, z zaledwie 10 μl próbek surowicy. Takie podejście pozwala obejść potrzebę ultrawirowania, wymaga tylko kilku minut czasu na oznaczenie i umożliwia izolację EV od próbek o ograniczonej objętości.

Papierowe urządzenia do izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Tutaj opisujemy dwa protokoły izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, wirowanie ultrafiltracji i ultrawirowanie z wirowaniem gradientu gęstości, aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z próbek płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego myszy. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mysiego płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą obu metod są określane ilościowo i charakteryzowane.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji

Tutaj prezentujemy łatwy do zastosowania protokół do oceny stabilności przechowywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, grupy naturalnie występujących nanocząsteczek wytwarzanych przez komórki. Pęcherzyki są obciążone glukuronidazą jako enzymem modelowym i przechowywane w różnych warunkach. Po przechowywaniu oceniane są ich parametry fizykochemiczne oraz aktywność kapsułkowanego enzymu.

Ocena stabilności spichrzeniowej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych próbek płynów ustrojowych przy użyciu rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F. Technika umożliwia ciągły przepływ i automatyzację.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F (Wideo) | JoVE Journal

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Przeglądaj więcej filmów