Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości
November 10th, 2023
Zastosowanie warstw nośnych do siatek kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) może zwiększyć gęstość cząstek, ograniczyć interakcje z interfejsem powietrze-woda, zredukować ruch wywołany wiązką i poprawić rozkład orientacji cząstek. W artykule opisano solidny protokół powlekania siatek krioEM monowarstwą grafenu w celu lepszego przygotowania próbek kriogenicznych.
Częstym wyzwaniem w przygotowaniu próbek do mikroskopii krioelektronowej jest lokalizacja cząstek na granicy faz powietrze-woda, co powoduje, że cząstki przyjmują preferowane orientacje i ulegają denaturacji. Zamiast tego lepiej jest, aby cząstki spoczywały na powierzchni siatki, co promują żebrowane nośniki folii, takie jak grafen. Kolejnym wyzwaniem jest wymóg stosunkowo wysokich stężeń próbek, któremu można również zaradzić za pomocą grafenu.
Siatki powlekane grafenem zapewniają wiele korzyści w określaniu struktury krio-EM, ale historycznie były trudne do powtarzalnego wytwarzania we własnym zakresie, a także zbyt kosztowne w zakupie komercyjnym. Protokół ten pozwala na solidne osadzanie jednowarstwowego grafenu, obniżając w ten sposób barierę dla użytkowników wykorzystujących te siatki w swoich badaniach. Grafen jest wyjątkowy ze względu na swoje właściwości materiałowe.
Jest to monowarstwa węgla, dzięki czemu emituje minimalny szum tła. Inne nośniki siatki kriogenicznej, takie jak cienka warstwa amorficznego węgla lub płatki tlenku grafenu, nie mogą być stosowane jako pojedyncza monowarstwa i dostarczają więcej sygnału tła. Teraz, gdy ustaliliśmy solidny protokół stosowania grafenu w siatkach krio-EM, chcielibyśmy kontynuować funkcjonalizację siatek pokrytych grafenem z uchwytami powinowactwa do wychwytywania w sieci bezpośrednio z lizatów komórkowych.
Może to złagodzić kolejne wąskie gardło w przygotowywaniu próbek krio-EM. Zacznij od przygotowania roztworu do wytrawiania grafenu w 50-mililitrowej zlewce. W tym celu dodaj 4,6 grama nadsiarczanu amonu lub APS do 20 mililitrów wody molekularnej w zlewce, przykryj folią aluminiową i pozwól APS całkowicie się rozpuścić.
Aby przygotować przekrój grafenu CVD do powlekania MMA, należy ostrożnie przyciąć kwadratowy przekrój grafenu, przenieść wycinek na szkiełko nakrywkowe na czystej szalce Petriego i przykryć szalkę w celu przetransportowania jej do powlekarki. Następnie ustaw powlekarkę wirową na 60-sekundowy szybki wir z prędkością 2 500 obrotów na minutę. Ostrożnie przenieś sekcję grafenu CVD do uchwytu o odpowiedniej wielkości.
Naciśnij przycisk pobierania lub absorpcji, aby włączyć pompę próżniową i przymocować grafen do uchwytu. Następnie nałóż MMA na środek kwadratu grafenowego CVD. Zamknij pokrywę, pociągnij odkurzacz i natychmiast naciśnij przycisk start lub stop.
Po odłączeniu pompy próżniowej po zatrzymaniu wirowania, za pomocą pęsety ostrożnie wyjmij grafen CVD pokryty MMA. Odwróć grafen tak, aby powlekana strona była skierowana w dół, i umieść go z powrotem na szklanym szkiełku nakrywkowym. Następnie, za pomocą pęsety z płaską końcówką, przenieś grafen CVD z szkiełka nakrywkowego do wyładowarki jarzeniowej i wyładowuj jarzenie przez 30 sekund przy natężeniu 25 miliamperów.
Umieść grafen z szkiełka nakrywkowego z powrotem na szalce Petriego. Na koniec przykryj go w celu przetransportowania do obszaru wytrawiania miedzi. Zacznij od pocięcia metakrylanu metylu lub kwadratów grafenu pokrytych MMA na kawałki wielkości siatki.
Aby to zrobić, użyj dwóch zestawów kleszczy o odwróconym działaniu, aby podeprzeć kwadrat grafenowy CVD, jednocześnie upewniając się, że strona MMA jest skierowana do góry podczas mocowania go do kleszczy. Aby pociąć grafen na małe kwadraty, użyj dwóch zestawów kleszczy o odwróconym działaniu, aby przytrzymać grafen prawą stroną do góry, zakotwiczając go w odpowiedniej pozycji, a także przytrzymać krawędź małego kwadratu po odcięciu go od reszty dużego kwadratu. Przechyl zlewkę zawierającą nadsiarczan amonu lub APS, aby umieścić w niej kwadraty pod płytkim kątem, nie topiąc.
Następnie wybierz kwadrat i spraw, aby zetknął się z powierzchnią roztworu APS przed jego uwolnieniem. Po przykryciu zlewki folią aluminiową inkubować ją przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie, aby usunąć folie grafenowe MMA z roztworu APS, najpierw zanurz szklane szkiełko nakrywkowe pionowo w roztworze, a następnie przesuń je na boki tak, aby dotykało pływającego kwadratu.
Następnie ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że folia całkowicie przylega do boku szkiełka nakrywkowego po zdjęciu. Zanurz szkiełko nakrywkowe pionowo w wodzie molekularnej w 50-mililitrowej zlewce, aby usunąć dołączoną folię do wody. W podobny sposób przenieś wszystkie folie do zlewki.
Pozostaw folie w zlewce przez 20 minut, zanim będą gotowe do przyklejenia do siatek krioelektromagnetycznych. Aby przymocować grafen CVD pokryty metakrylanem metylu lub MMA do siatek, należy użyć wcześniej przygotowanych kwadratów grafenowych powlekanych o rozmiarze siatki, przechowywanych w zlewce zawierającej wodę molekularną. Używając pęsety o negatywnym działaniu, delikatnie zanurz siatkę pionowo w wodzie, stroną z włókna węglowego skierowaną w pływający kwadrat grafenowy MMA.
Po zetknięciu się z kwadratem ostrożnie wyjmij siatkę z wody, upewniając się, że kwadrat całkowicie przylega do węglowej strony siatki. Umieść kratki na czystym szkiełku nakrywkowym stroną z grafenu MMA skierowaną do góry i pozostaw kratki do wyschnięcia na powietrzu przez jedną do dwóch minut. Za pomocą pęsety z płaską końcówką przenieś szkiełko nakrywkowe z kratkami na gorącą płytę ustawioną na 130 stopni Celsjusza.
Inkubuj kratki po przykryciu ich wierzchem szklanej szalki Petriego przez 20 minut. Następnie, w celu przemycia MMA acetonem, przenieś całe szkiełko nakrywkowe na szalkę Petriego wypełnioną 15 mililitrami acetonu i inkubuj przez 30 minut. Następnie za pomocą pipety serologicznej z czystego szkła przenieś aceton do pojemnika na odpady.
Za pomocą kolejnej pipety serologicznej z czystego szkła dodaj 15 mililitrów świeżego acetonu do szalki Petriego i inkubuj przez 30 minut. Po trzech praniach acetonem usuń aceton. I za pomocą czystej szklanej pipety serologicznej zastąp ją 15 mililitrami izopropanolu.
Następnie za pomocą pęsety ostrożnie wyjmij siatki z izopropanolu, aby wysuszyć je na powietrzu na czystym szkiełku nakrywkowym. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe z kratkami pokrytymi grafenem na płycie grzejnej ustawionej na 100 stopni Celsjusza na 10 minut, aby odparować resztki substancji organicznych. Używając pęsety o odwrotnym działaniu, delikatnie umieść kratki w czystym obszarze oświetlenia środka do czyszczenia ozonem UV, stroną pokrytą grafenem skierowaną do góry.
Zamknij obszar oświetlenia i włącz maszynę. Ustaw pokrętło czasu na wyznaczony czas zabiegu, aby rozpocząć oczyszczanie siatek ozonem UV. Na koniec przystąp do zanurzenia próbki z mikroskopii krioelektronowej na traktowanych siatkach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół powlekania siatek kryogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) warstwą pojedynczą grafenu. Zastosowanie grafenu zwiększa gęstość cząstek, minimalizuje interakcje z interfejsem powietrze-woda i poprawia rozkład orientacji cząstek.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Kryogeniczna mikroskopia elektronowa
- Nauki materiałowe
- Techniki przygotowywania próbek
Tło
- Lokalizacja cząstek na interfejsie powietrze-woda jest częstym wyzwaniem w kryo-EM.
- Preferowane orientacje mogą prowadzić do denaturacji cząstek.
- Podłoża z grafenu pomagają cząstkom spoczywać na powierzchni siatki.
- Historycznie, siatki powlekane grafenem były trudne i kosztowne do wytworzenia.
Cel badania
- Dostarczenie rzetelnego protokołu depozycji pojedynczej warstwy grafenu na siatkach cryoEM.
- Obniżenie barier dla badaczy w wykorzystywaniu siatek powlekanych grafenem.
- Zwiększenie zalet oznaczania struktury kryo-EM.
Stosowane metody
- Opracowanie protokołu powlekania grafenem.
- Ocena gęstości i orientacji cząstek.
- Porównanie siatek powlekanych grafenem z tradycyjnymi siatkami.
- Ocena powtarzalności w produkcji siatek.
Główne wyniki
- Siatki powlekane grafenem znacząco poprawiają lokalizację cząstek.
- Zwiększona gęstość cząstek pozwala na lepsze oznaczanie struktur.
- Rzetelny protokół ułatwia produkcję siatek z grafenem w laboratorium.
- Niższe koszty i poprawiona dostępność dla badaczy.
Wnioski
- Zastosowanie grafenu w siatkach kryo-EM rozwiązuje kluczowe wyzwania w przygotowywaniu próbek.
- Ten protokół umożliwia szerzej zastosowanie siatek powlekanych grafenem w badaniach.
- Unikalne właściwości grafenu zwiększają możliwości kryo-EM.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Sample preparation bottlenecks in cryo-electron microscopy (cryoEM) limit the throughput and reliability of high-resolution structure determination in early discovery and structural biology pipelines. The application of monolayer graphene to cryoEM grids addresses critical challenges of particle localization, orientation bias, and sample concentration requirements, directly impacting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. Robust, reproducible graphene grid protocols enable broader enterprise adoption, supporting risk-adjusted portfolio advancement and efficient resource allocation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity structural interrogation of macromolecular targets at near-atomic resolution.
- Reduces sample denaturation and orientation bias, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates confident target validation by improving particle density and imaging consistency.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible grid supports for downstream cryoEM workflows.
- Improves assay reliability by minimizing background noise and enhancing quantitative imaging outputs.
- Supports scalable screening of structurally diverse complexes at lower sample concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Enables structural studies of disease-relevant complexes, supporting translational biomarker alignment.
- Provides continuity from discovery-stage structure elucidation to preclinical validation of molecular mechanisms.
- Reduces risk of late-stage biological failure by ensuring structural data quality.
Pipeline & Workflow Integration
Monolayer graphene grid preparation integrates into the cryoEM workflow from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven structure determination and mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports robust null hypothesis testing by enabling accurate structural comparisons across conditions.
- Screening: Delivers reproducible, low-background grids for quantitative imaging and assay standardization.
- Analytics: Provides high-quality diffraction patterns and density maps for statistical analysis and decision-making.
- Translational Research: Maintains structural data continuity for disease-relevant targets and complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reproducible grid preparation capability for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, enhances reproducibility, and lowers sample input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing sample preparation bottlenecks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in graphene handling and cryoEM grid preparation.
- Needs access to spin coaters, glow discharge units, and UV ozone cleaners.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or sample types.
- Practical limitations include handling fragility and ensuring monolayer integrity during transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
