Name: Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj protokół nanoszenia jednowarstwowego grafenu na siatki krioelektronowej mikroskopii, który poprawia lokalizację cząsteczek i ich orientację. Metoda umożliwia wytwarzanie siatek w laboratorium, obniżając koszty i zwiększając dostępność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Próbki zostały przygotowane i zobrazowane w CryoEM Facility w MIT.nano na mikroskopach pozyskanych dzięki Fundacji Arnolda i Mabel Beckmanów. Urządzenia do obrazowania kąta zwilżania zostały wydrukowane w MIT Metropolis Maker Space. Dziękujemy laboratoriom Nieng Yan i Yimo Han oraz pracownikom MIT.nano za ich wsparcie podczas wdrażania tej metody. W szczególności dziękujemy dr Guanhui Gao i dr Sarah Sterling za ich wnikliwe dyskusje i opinie. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 i granty NSF-CAREER 2046778. Badania w laboratorium Davisa są wspierane przez Fundację Alfreda P. Sloana, Fundusz Jamesa H. Ferry'ego, MIT J-Clinic i Rodzinę Whiteheadów.

1.&#160;Przygotowanie grafenu CVD
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do trawienia grafenu zgodnie z opisem poniżej.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 4,6 g nadsiarczanu amonu (APS) w 20 mL wody klasy molekularnej w zlewce o pojemności 50 mL, aby uzyskać roztwór 1 M, a następnie przykryć folią aluminiową. Pozostawić APS do całkowitego rozpuszczenia, przechodząc do kroku 1.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować fragment grafenu CVD do powlekania polimetakrylanem metylu (MMA). Ostrożnie wyciąć kwadratowy fragment grafenu CVD. Przenieść kwadrat na szkiełko nakrywkowe (50 mm x 24 mm) w czystej szalce Petriego i pozostawić go przykrytego podczas transportu do powlekarki wirówkowej. 
	&#8203;UWAGA: Kwadrat o wymiarach 18 mm x 18 mm powinien pozwolić na uzyskanie 25-36 siatek powlekanych grafenem.</li>
</ol>
2. Pokrywanie grafenu CVD warstwą MMA
<ol>
	<li>Ustaw parametry spin coatera na 60 s szybkiego wirowania przy 2 500 rpm. Ostrożnie umieść grafen CVD na odpowiednio dobranym uchwycie. 
	&#8203;UWAGA: Idealnie grafen CVD powinien wystawać 1-2 mm poza krawędź wybranego uchwytu, aby zapobiec zassaniu MMA do układu próżniowego.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Take/Absorb, aby uruchomić pompę próżniową i przymocować grafen CVD do uchwytu. Nanieś MMA na środek kwadratu z grafenu CVD, zamknij pokrywę i natychmiast naciśnij przycisk Start/Stop. Dla kwadratu grafenu CVD o wymiarach 18 mm x 18 mm wystarczająca jest ilość 40 µL MMA.</li>
	<li>Po zatrzymaniu wirowania wyłącz pompę próżniową i ostrożnie pobierz pęsetą pokryty MMA grafen CVD. Odwróć grafen CVD tak, aby strona pokryta MMA była skierowana w dół, i połóż go z powrotem na szklanej lamellce.</li>
</ol>
3. Trawienie plazmowe tylnej strony grafenu
<ol>
	<li>Przenieść graffen CVD na szkiełku podstawnym do urządzenia do wyładowań żarowych i poddać działaniu wyładowania żarowego przez 30 s przy natężeniu 25 mA, używając pęsety z płaskimi końcami.</li>
	<li>Przenieść graffen CVD na szkiełku podstawnym z powrotem do szalki Petriego i przykryć go podczas transportu do miejsca trawienia miedzi. Powłoka MMA zabezpieczy górną warstwę grafenu przed trawieniem plazmowym.</li>
</ol>
4. Wycinanie kwadratów grafenu CVD powleczonego MMA o rozmiarach siatki
<ol>
	<li>Użyj dwóch par pęset do podtrzymania kwadratu grafenu CVD. Zwróć uwagę na orientację kwadratu grafenu CVD; podczas trzymania pęsetami strona z MMA musi być skierowana do góry (KRYTYCZNE).</li>
	<li>Wytnij grafen CVD w kwadraty o wymiarach około 3 mm x 3 mm. W tym kroku użyj &#160;dwóch zestawów pęset z blokadą (tzw. reverse-action forceps)&#160;, aby trzymać kwadrat grafenu CVD stroną prawą do góry i unieruchomić go w pozycji, a także aby przytrzymać krawędź kwadratu 3 mm x 3 mm po odcięciu go od reszty materiału.</li>
</ol>
5. Rozpuszczanie podłoża miedzianego z grafenu CVD pokrytego PMMA
<ol>
	<li>Każdy kwadrat o wymiarach 3 mm x 3 mm należy ostrożnie umieścić na powierzchni roztworu APS. Przed zwolnieniem każdego kwadratu należy upewnić się, że styka się on z powierzchnią roztworu APS. Zlewnik należy przechylić tak, aby każdy kwadrat mógł zostać umieszczony w roztworze pod niewielkim kątem; zapobiega to zatonięciu kwadratu.</li>
	<li>Zlewnik należy przykryć folią aluminiową i inkubować przez noc w temperaturze 25 °C.</li>
</ol>
6. Usuwanie błon MMA/grafenowych z podłoży APS
<ol>
	<li>Należy użyć szklanego szkiełka podstawowego o wymiarach 12 mm x 50 mm i wyłowić kwadraty z MMA/grafenu z roztworu APS, delikatnie zanurzając szkiełko pionowo w APS, a następnie przesuwając je bocznie tak, aby dotknęło pływającego kwadratu z MMA/grafenu.</li>
	<li>Należy ostrożnie wyjąć szkiełko, upewniając się, że kwadrat całkowicie przylega do jego boku podczas wyciągania.</li>
	<li>Przenieść kwadraty z MMA/grafenu do czystego zlewki o pojemności 50 mL wypełnionej wodą klasy molekularnej na 20 min. Delikatnie zanurzyć szkiełko z przytwierdzonym kwadratem z MMA/grafenu pionowo w wodzie, upewniając się, że kwadrat oddziela się od szkiełka w momencie kontaktu z powierzchnią wody. Powtórzyć czynność dla wszystkich kwadratów z MMA/grafenu.</li>
</ol>
7. Mocowanie grafenu do siatek
<ol>
	<li>Używając pincety o działaniu negatywnym, ostrożnie zanurz siatkę pionowo w wodzie stroną węglową w stronę pływającego kwadratu MMA/grafenu. Po zetknięciu z kwadratem ostrożnie wyjmij siatkę, upewniając się, że kwadrat całkowicie przylega do węglowej strony siatki po jej wyjęciu. Aby zapobiec uszkodzeniu pól siatki, zminimalizuj ruchy boczne siatki podczas zanurzenia w wodzie (KRYTYCZNE).</li>
	<li>Umieść siatki stroną z MMA/grafenem do góry na czystym szkiełku nakrywkowym i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 1 do 2 min. Przenieś szkiełko nakrywkowe z siatkami powleczonymi grafenem/MMA na płytkę grzejną ustawioną na 130 °C, używając pincety z płaskimi końcówkami.</li>
	<li>Przykryj górną częścią szklanej szalki Petriego i inkubuj przez 20 min. Zdejmij z podgrzewacza i studź do temperatury pokojowej przez 1 do 2 min. 
	&#8203;OSTRZEŻENIE: Zachowaj ostrożność, ponieważ górna część szalki Petriego będzie bardzo gorąca.</li>
</ol>
8. Rozpuszczanie MMA w acetonie
<ol>
	<li>Przenieś całą lamellkę do szalki Petriego wypełnionej 15 mL acetonu. Inkubuj przez 30 min.</li>
	<li>Za pomocą czystej szklanej pipety serologicznej przenieś aceton, w którym inkubowano siatki, do pojemnika na odpady. Ostrożnie dodaj 15 mL świeżego acetonu do szalki Petriego, używając czystej szklanej pipety serologicznej. Inkubuj przez 30 min.</li>
	<li>Powtórz te etapy płukania, aby łącznie przeprowadzić 3 płukania acetonem.</li>
</ol>
9. Usuwanie pozostałości acetonu za pomocą izopropanolu
<ol>
	<li>Po trzykrotnym płukaniu acetonem usunąć aceton i zastąpić go 15 mL izopropanolu, używając czystej szklanej pipety serologicznej. Inkubować przez 20 min.</li>
	<li>Powtórzyć czynność 3 razy, aby łącznie przeprowadzić 4 płukania izopropanolem. Ostrożnie wyjąć siatki z izopropanolu i wysuszyć je na powietrzu na czystym szkiełku nakrywkowym za pomocą pęsety. 
	UWAGA: Pozostałości izopropanolu mogą utrudniać zwolnienie siatek z pęsety. Problem ten można rozwiązać, doprowadzając do kontaktu siatki z czystym szkiełkiem nakrywkowym przed puszczeniem siatki z pęsety.</li>
	<li>Odparować resztki substancji organicznych, przenosząc szkiełko nakrywkowe z pokrytymi grafenem siatkami na płytkę grzejną ustawioną na 100 °C na 10 min. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać w próżni do momentu użycia.</li>
</ol>
10. Opracowanie siatek pokrytych grafenem za pomocą promieniowania UV/ozonu
<ol>
	<li>Używając pęsety z odwróconym chwytem, delikatnie umieść siatki w czystym obszarze naświetlania w czyszczarce UV/ozonowej, stroną pokrytą grafenem do góry.</li>
	<li>Zasuń osłonę obszaru naświetlania i włącz urządzenie. Ustaw pokrętło czasu na wyznaczony czas obróbki, aby rozpocząć traktowanie siatek UV/ozonem.. 
	UWAGA: Czas obróbki jest parametrem regulowanym, a zbyt długa ekspozycja może uszkodzić siatkę. Han et al.30 zalecają 10 min obróbki UV/ozonowej; ustaliliśmy, że czas 10 min jest również wystarczający. Patrz krok 12 w celu uzyskania wskazówek dotyczących dostrajania czasu tej obróbki.</li>
	<li>Przejdź bezpośrednio do mrożenia próbki cryoEM na potraktowanych siatkach, postępując zgodnie z etapami mrożenia opisanymi przez Koh et al.37. 
	UWAGA: Węglowodory atmosferyczne mogą gromadzić się na powierzchni siatki po obróbce UV/ozonowej i zwiększać hydrofobowość powierzchni grafenowej38,39. Aby tego uniknąć, mroź siatki potraktowane UV/ozonem niezwłocznie. Wskazane może być traktowanie siatek UV/ozonem w partiach, na przykład obróbka sześciu siatek i natychmiastowe ich mrożenie, a następnie obróbka drugiej partii siatek i mrożenie tej drugiej partii.</li>
</ol>
11. Rejestracja obrazu dyfrakcyjnego
<ol>
	<li>Upewnij się, że mikroskop jest odpowiednio nastrojony, ustalono równoległe oświetlenie, a końcowy defokus ustawiono na -0.2 µm.</li>
	<li>W pełni wsuń ekran fluorescencyjny oraz przesłonę wiązki (beam stop). Przejdź do trybu dyfrakcyjnego, aby wyraźnie zwizualizować punkty dyfrakcyjne.</li>
	<li>Nabyj obraz za pomocą kamery CCD i oceń go przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. 
	UWAGA: Najłatwiejszymi do zaobserwowania i zidentyfikowania punktami dyfrakcyjnymi generowanymi przez monowarstwę grafenu są 6 punktów odpowiadających częstotliwości przestrzennej 2.13 Å. Użyj narzędzia pomiarowego, aby oszacować odległość od centrum dyfrakcyjnej wiązki do jednego z tych punktów w jednostkach odwrotnych. W szczególności 2.13 Å <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66023/66023eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 0.47 Å-1.</li>
</ol>
12. Ocena hydrofilowości siatki
<ol>
	<li>Przygotować zestaw do obrazowania. Przygotować statyw na telefon, blat do obrazowania, telefon z aparatem, szkiełko podstawowe oraz folię parafinową. Zdjęcia przedstawione w niniejszej publikacji uzyskano przy użyciu statywu na telefon oraz blatu do obrazowania wydrukowanych w technologii 3D z dostarczonych plików .stl, co pozwoliło na łatwiejszą reprodukcję i kwantyfikację pomiarów kąta zwilżania (Supplementary Figure 1A).</li>
	<li>Położyć szkiełko podstawowe na płaskiej powierzchni, następnie wyciąć kwadrat z folii parafinowej o wymiarach 1 cm na 1 cm i umieścić go na szkiełku podstawowym. Umieścić telefon na statywie, ustawiając go tak, aby aparat znajdował się w jednej płaszczyźnie ze szkiełkiem podstawowym. Przymocować telefon w tej pozycji za pomocą gumek recepturek (Supplementary Figure 1B). Wykonać zdjęcie próbne, aby zweryfikować, czy aparat jest wyrównany z powierzchnią obrazowania.</li>
	<li>Bezpośrednio po obróbce siatek pokrytych grafenem w atmosferze UV/ozon, umieścić jedną siatkę na kwadracie folii parafinowej na szkiełku podstawowym. Upewnić się, że strona z grafenem jest skierowana do góry. Za pomocą pipety nanieść kroplę wody o objętości 2 µL na środek powierzchni siatki i natychmiast wykonać zdjęcie. 
	UWAGA: Powtórzyć ten krok po: i) wybranych odstępach czasu obróbki UV/ozon, aby określić wystarczający czas trwania procesu; lub ii) wybranych odstępach czasu po obróbce UV/ozon, aby zmierzyć, jak długo po obróbce powierzchnia siatki zachowuje swój charakter hydrofilowy.</li>
	<li>Obliczyć kąty zwilżania na podstawie zdjęć, importując je do programu ImageJ43 i korzystając z wtyczki do pomiaru kąta zwilżania.</li>
</ol>
13. Analiza pojedynczych cząsteczek zbioru danych kompleksu dCas9
UWAGA: Cały proces przetwarzania obrazów opisany w niniejszym protokole został przeprowadzony przy użyciu oprogramowania cryoSPARC w wersji 4.2.1.
<ol>
	<li>Przeprowadź wstępne przetwarzanie filmów za pomocą zadań Patch Motion Correction oraz Patch CTF Estimation. Wykonaj wybieranie cząstek (particle picking) przy użyciu zadania Blob picker, stosując sferyczny blob o średnicy od 115 Å do 135 Å.</li>
	<li>Wyodrębnij cząstki za pomocą zadania Extract from micrographs, stosując znormalizowany współczynnik korelacji (NCC) oraz progi mocy, aby uzyskać około 200-300 cząstek na jedną mikrografię. Należy pamiętać, że odpowiednie progi i wynikowa liczba cząstek mogą się różnić, dlatego użytkownicy powinni ocenić jakość wyboru na serii mikrografii w celu zidentyfikowania optymalnych warunków.</li>
	<li>Wykonaj wieloklasowe rekonstrukcje początkowe za pomocą zadania Ab-initio reconstruction, określając trzy klasy. Dwie z trzech klas prawdopodobnie będą zawierać cząstki inne niż Cas9, w tym zanieczyszczenia powierzchniowe. Wybierz klasę przypominającą dCas9 do dalszego przetwarzania. 
	UWAGA: Można zastosować dodatkowe rundy wieloklasowej rekonstrukcji Ab-initio lub rafinacji heterogenicznej (Heterogeneous refinement), aby dodatkowo udoskonalić zestaw cząstek.</li>
	<li>Przeprowadź rafinację 3D za pomocą zadania Non-uniform Refinement, wybierając parametry domyślne. Oszacuj rozdzielczość rekonstrukcji za pomocą zadań Validation (FSC) oraz ThreeDFSC, wykorzystując mapy i maskę z końcowej rafinacji 3D.</li>
</ol>

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

<ol><li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cheaper%3A+Recent+advances+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).</li>
<li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+New+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Leginon: New features and applications.</a> Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li>
<li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cisTEM%2C+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383(2018).</li>
<li>Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+single+particle+refinement+in+EMAN2.1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High resolution single particle refinement in EMAN2.1.</a> Methods. 100, 25-34 (2016).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM-How+did+it+get+here+and+where+will+it+go%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go.</a> Science. 361 (6405), 876-880 (2018).</li>
<li>Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+structural+ensembles+from+single+particle+cryo-EM+data+using+cryoDRGN%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN.</a> Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).</li>
<li>Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoDRGN%3A+reconstruction+of+heterogeneous+cryo-EM+structures+using+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks.</a> Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).</li>
<li>Chen, M., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning-based+mixed-dimensional+Gaussian+mixture+model+for+characterizing+variability+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM.</a> Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).</li>
<li>Punjani, A., Fleet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+variability+analysis%3A+Resolving+continuous+flexibility+and+discrete+heterogeneity+from+single+particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM.</a> J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).</li>
<li>Dashti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieving+functional+pathways+of+biomolecules+from+single-particle+snapshots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots.</a> Nat Commun. 11 (1), 4734(2020).</li>
<li>Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KsgA+facilitates+ribosomal+small+subunit+maturation+by+proofreading+a+key+structural+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion.</a> Nat Struct Mol Biol. , (2023).</li>
<li>Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+aqueous+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Frozen aqueous suspensions.</a> Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).</li>
<li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM--the+first+thirty+years%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM--the first thirty years.</a> J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).</li>
<li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+influence+the+formation+and+stability+of+thin%2C+cryo-EM+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens.</a> Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-Em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-Em grids.</a> Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747(2019).</li>
<li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li>
<li>Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+effects+of+particle+adsorption+to+the+air%2Fwater+interface+in+single-particle+cryo-electron+microscopy%3A+Bacterial+RNA+polymerase+and+CHAPSO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol+X%22%5BJournal%5D)">Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO.</a> J Struct Biol X. 1, 100005(2019).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).</li>
<li>Neselu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+effects+of+ice+thickness+on+resolution+in+single+particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol+X%22%5BJournal%5D)">Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM.</a> J Struct Biol X. 7, 100085(2023).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+Substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Graphene: Substrate preparation and introduction.</a> J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Geim, A. K., Novoselov, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+graphene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">The rise of graphene.</a> Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Sci Rep. 13 (1), 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nat Commun. 13 (1), 6718(2022).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+functionalized+monolayer+graphene+for+high-resolution+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy.</a> J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).</li>
<li>Benjamin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+capture+of+histidine-tagged+proteins+from+cell+lysates+using+TEM+grids+modified+with+NTA-graphene+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide.</a> Sci Rep. 6, 32500(2016).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+and+robust+covalently+linked+graphene+oxide+affinity+grids+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).</li>
<li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Collection+of+High-Resolution+cryo-EM+Datasets+Using+200+KV+Transmission+Electron+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope.</a> J Vis Exp. (181), (2022).</li>
<li>Schweizer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+cleaning+of+graphene+using+in+situ+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy.</a> Nat Commun. 11 (1), 1743(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+airborne+contaminants+on+the+wettability+of+supported+graphene+and+graphite%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite.</a> Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+reveal+coordinated+domain+motions+that+govern+DNA+cleavage+by+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9.</a> Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).</li>
<li>Croll, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISOLDE%3A+a+physically+realistic+environment+for+model+building+into+low-resolution+electron-density+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+angle+measurement+of+free-standing+square-millimeter+single-layer+graphene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene.</a> Nat Commun. 9 (1), 4185(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Przygotowanie próbek CryoEM wiąże się z wieloma wyzwaniami technicznymi, przy czym większość procesów roboczych wymaga od badaczy ręcznego manipulowania delikatnymi siatkami z najwyższą ostrożnością, aby uniknąć ich uszkodzenia. Ponadto podatność każdej próbki na witryfikację jest nieprzewidywalna; Cząstki często oddziałują z powierzchnią międzyfazową powietrze-woda lub ze stałą folią nośną pokrywającą siatki, co może prowadzić do tego, że cząstki przyjmują preferowaną orientację lub nie dostają się do otworów obrazowych...

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa pojedynczej cząstki (cryoEM) stała się powszechnie stosowaną metodą wizualizacji makrocząsteczek biologicznych1. Napędzany postępami w bezpośredniej detekcji elektronów2,3,4, akwizycja danych5 i algorytmy przetwarzania obrazu6,7,8,9,10, cryoEM jest teraz w stanie wytwarzać struktury 3D o rozdzielczości zbliżonej do atomowej szybko rosnącej liczby makrocząsteczek11. Co więcej, wykorzystując jednocząsteczkowy charakter tego podejścia, użytkownicy mogą określić wiele struktur na podstawie jednej próbki12,13,14,15, podkreślając obietnicę wykorzystania wygenerowanych danych do zrozumienia heterogenicznych zespołów strukturalnych16,17. Pomimo tego postępu nadal występują wąskie gardła w przygotowywaniu siatek do próbek kriogenicznych.

Do charakterystyki strukturalnej za pomocą cryoEM, próbki biologiczne powinny być dobrze zdyspergowane w roztworze wodnym, a następnie muszą zostać błyskawicznie zamrożone w procesie zwanym witryfikacją18,19. Celem jest wychwycenie cząstek w jednolicie cienkiej warstwie zeszklonego lodu zawieszonej w regularnie rozmieszczonych otworach, które zwykle są wycinane w warstwie amorficznego węgla. Ta wzorzysta amorficzna folia węglowa jest podtrzymywana przez siatkę TEM z siatką z miedzianych lub złotych prętów nośnych. W standardowych przepływach pracy siatki są przekształcane w hydrofilowe metody za pomocą obróbki plazmowej jarzeniowej przed nałożeniem próbki. Nadmiar cieczy osusza się bibułą filtracyjną, dzięki czemu roztwór białka tworzy cienką warstwę cieczy w poprzek otworów, którą można łatwo zeszklone podczas zamrażania wgłębnego. Typowe wyzwania obejmują lokalizację cząstek na granicy faz powietrze-woda (AWI) i późniejszą denaturację20,21,22 lub przyjęcie preferowanych orientacji23,24,25, przyleganie cząstek do folii węglowej, a nie migrowanie do otworów, oraz grupowanie i agregacja cząstek w holes26. Kolejnym problemem jest niejednolita grubość lodu; Gruby lód może powodować wyższy poziom szumu tła na mikrofotografiach ze względu na zwiększone rozpraszanie elektronów, podczas gdy ekstremalnie cienki lód może wykluczać większe cząstki27.
Aby sprostać tym wyzwaniom, do powlekania powierzchni siatki użyto różnych cienkich folii podporowych, pozwalając cząsteczkom spoczywać na tych podporach i, idealnie, unikając interakcji z interfejsem powietrze-woda. Podpory grafenowe okazały się bardzo obiecujące, częściowo ze względu na ich wysoką wytrzymałość mechaniczną w połączeniu z minimalnym przekrojem rozpraszania, co zmniejsza sygnał tła dodawany przez warstwę nośną28. Oprócz minimalnego wpływu na szum tła, grafen wykazuje również niezwykłą przewodność elektryczną i cieplną29. Wykazano, że siatki pokryte grafenem i tlenkiem grafenu zapewniają wyższą gęstość cząstek, bardziej równomierny rozkład cząstek30 i zredukowaną lokalizację do klasy AWI<sup="xref">22. Ponadto grafen zapewnia powierzchnię nośną, którą można dalej modyfikować w celu: 1) dostrojenia właściwości fizykochemicznych powierzchni siatki poprzez funkcjonalizację31,32,33; lub 2) para czynników łączących, które ułatwiają oczyszczanie powinowactwa białek będących przedmiotem zainteresowania34,35,36.
W tym artykule zmodyfikowaliśmy istniejącą procedurę powlekania siatek cryoEM pojedynczą jednolitą warstwą grafenu30. Modyfikacje mają na celu zminimalizowanie obsługi sieci w całym protokole, w celu zwiększenia wydajności i odtwarzalności. Dodatkowo omawiamy nasze podejście do oceny skuteczności różnych zabiegów UV/ozonu w renderowaniu siatek hydrofilowych przed zanurzeniem. Ten etap przygotowania próbki cryoEM przy użyciu siatek pokrytych grafenem ma kluczowe znaczenie i stwierdziliśmy, że nasza prosta metoda ilościowego określania względnej hydrofilowości powstałych siatek jest przydatna. Korzystając z tego protokołu, demonstrujemy użyteczność stosowania siatek pokrytych grafenem do określania struktury poprzez generowanie rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości katalitycznie nieaktywnego S. pyogenes Cas9 w kompleksie z przewodnikiem RNA i docelowym DNA.

<table><tbody><tr><td>Zlewka 250 ml (3x)</td><td>Fisher</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 50 ml (2x)</td><td>Corning</td><td>1000-50</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher</td><td>15-078-292</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Fisher</td><td>(I17874</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 50 mm x 24 mm</td><td></td><td>Mattek PCS-1.5-5024</td><td></td></tr><tr><td>CVD grafen</td><td>Graphene Supermarket</td><td>CVD-Cu-2x2</td><td></td></tr><tr><td>easiGlow wyładowczy</td><td>Ted-Pella</td><td>91000S</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>1.11727</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta z płaską końcówką&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>50-239-60</td><td></td></tr><tr><td>Nóż do szkła</td><td>Grainger</td><td>21UE26</td><td></td></tr><tr><td>Szklana płytka Petriego i pokrywa&nbsp;</td><td>VWR</td><td>75845-544</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta serologiczna</td><td>Fisher</td><td>13-676-34D</td><td></td></tr><tr><td>Walizka do przechowywania siatki</td><td>EMS</td><td>71146-02</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Fisher</td><td>07-770-108</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki laboratoryjne&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-806-2</td><td></td></tr><tr><td>Metakrylan metylu EL-6&nbsp;</td><td>Kayaku</td><td>MMA M310006 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy molekularnej</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta o negatywnym działaniu (2x)</td><td>Pipeta Fisher</td><td>50-242-78</td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>Pipeta Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Rainin</td><td>17008652&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>30389291</td><td></td></tr><tr><td>Siatki Quantifoil z dziurawym węglem&nbsp;</td><td>Powlekarka EMS</td><td>Q2100CR1</td><td></td></tr><tr><td>Spin&nbsp;</td><td>SetCas</td><td>KW-4A</td><td>z uchwytem SCA-19-23</td></tr><tr><td>Termometr Straightedge</td><td>ULINE</td><td>H-6560</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>3LRD1</td><td></td></tr><tr><td>Środek czyszczący UV/Ozone&nbsp;</td><td>BioForce</td><td>SKU: PC440</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X11</td><td></td></tr><tr><td>Papier Whatman</td><td>VWR</td><td>28297-216</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

W kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM), oczyszczone makrocząsteczki są nakładane na siatkę z dziurawą folią węglową; cząsteczki są następnie osuszane w celu usunięcia nadmiaru płynu i szybko zamrażane w warstwie lodu szklistego o grubości około 20-100 nm, zawieszonej w otworach foliowych o szerokości około 1 μm. Otrzymaną próbkę obrazuje się za pomocą kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej, a po przetworzeniu obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania można określić struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej. Pomimo powszechnego zastosowania cryoEM, przygotowanie próbek pozostaje poważnym wąskim gardłem w przepływach pracy cryoEM, a użytkownicy często napotykają wyzwania związane ze słabym zachowaniem próbek w zawieszonym lodzie szklistym. Ostatnio opracowano metody modyfikacji siatek krioEM za pomocą pojedynczej ciągłej warstwy grafenu, która działa jak powierzchnia nośna, która często zwiększa gęstość cząstek w obrazowanym obszarze i może zmniejszać interakcje między cząstkami a granicą faz powietrze-woda. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły dotyczące stosowania grafenu w siatkach krioelektromagnetycznych oraz szybkiej oceny względnej hydrofilowości powstałych siatek. Dodatkowo opisujemy metodę opartą na elektromagnetycznym w celu potwierdzenia obecności grafenu poprzez wizualizację jego charakterystycznego wzoru dyfrakcyjnego. Na koniec demonstrujemy użyteczność tych nośników grafenowych, szybko rekonstruując mapę gęstości kompleksu Cas9 o rozdzielczości 2,7 A przy użyciu czystej próbki o stosunkowo niskim stężeniu.

Pomyślne wykonanie siatek do krio-EM powlekanych grafenem przy użyciu sprzętu (Rycina 1) i protokołu (Rycina 2) opisanych w niniejszym opracowaniu pozwoli na uzyskanie monowarstwy grafenu pokrywającej otwory w folii, co można potwierdzić na podstawie charakterystycznego obrazu dyfrakcyjnego. Aby zwiększyć adsorpcję białek na powierzchni grafenu, można zastosować traktowanie UV/ozonem, co uczyni powierzchnię hydrofilową poprzez wprowadzenie grup funkcyjnych zawie...

Zastosowanie warstw nośnych do siatek kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) może zwiększyć gęstość cząstek, ograniczyć interakcje z interfejsem powietrze-woda, zredukować ruch wywołany wiązką i poprawić rozkład orientacji cząstek. W artykule opisano solidny protokół powlekania siatek krioEM monowarstwą grafenu w celu lepszego przygotowania próbek kriogenicznych.

Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Częstym wyzwaniem w przygotowaniu próbek do mikroskopii krioelektronowej jest lokalizacja cząstek na granicy faz powietrze-woda, co powoduje, że cząstki przyjmują preferowane orientacje i ulegają denaturacji. Zamiast tego lepiej jest, aby cząstki spoczywały na powierzchni siatki, co promują żebrowane nośniki folii, takie jak grafen. Kolejnym wyzwaniem jest wymóg stosunkowo wysokich stężeń próbek, któremu można również zaradzić za pomocą grafenu.Siatki powlekane grafenem zapewniają wiele korzyści w określaniu struktury krio-EM, ale historycznie były trudne do powtarzalnego wytwarzania we własnym zakresie, a także zbyt kosztowne w zakupie komercyjnym. Protokół ten pozwala na solidne osadzanie jednowarstwowego grafenu, obniżając w ten sposób barierę dla użytkowników wykorzystujących te siatki w swoich badaniach. Grafen jest wyjątkowy ze względu na swoje właściwości materiałowe.Jest to monowarstwa węgla, dzięki czemu emituje minimalny szum tła. Inne nośniki siatki kriogenicznej, takie jak cienka warstwa amorficznego węgla lub płatki tlenku grafenu, nie mogą być stosowane jako pojedyncza monowarstwa i dostarczają więcej sygnału tła. Teraz, gdy ustaliliśmy solidny protokół stosowania grafenu w siatkach krio-EM, chcielibyśmy kontynuować funkcjonalizację siatek pokrytych grafenem z uchwytami powinowactwa do wychwytywania w sieci bezpośrednio z lizatów komórkowych.Może to złagodzić kolejne wąskie gardło w przygotowywaniu próbek krio-EM. Zacznij od przygotowania roztworu do wytrawiania grafenu w 50-mililitrowej zlewce. W tym celu dodaj 4,6 grama nadsiarczanu amonu lub APS do 20 mililitrów wody molekularnej w zlewce, przykryj folią aluminiową i pozwól APS całkowicie się rozpuścić.Aby przygotować przekrój grafenu CVD do powlekania MMA, należy ostrożnie przyciąć kwadratowy przekrój grafenu, przenieść wycinek na szkiełko nakrywkowe na czystej szalce Petriego i przykryć szalkę w celu przetransportowania jej do powlekarki. Następnie ustaw powlekarkę wirową na 60-sekundowy szybki wir z prędkością 2 500 obrotów na minutę. Ostrożnie przenieś sekcję grafenu CVD do uchwytu o odpowiedniej wielkości.Naciśnij przycisk pobierania lub absorpcji, aby włączyć pompę próżniową i przymocować grafen do uchwytu. Następnie nałóż MMA na środek kwadratu grafenowego CVD. Zamknij pokrywę, pociągnij odkurzacz i natychmiast naciśnij przycisk start lub stop.Po odłączeniu pompy próżniowej po zatrzymaniu wirowania, za pomocą pęsety ostrożnie wyjmij grafen CVD pokryty MMA. Odwróć grafen tak, aby powlekana strona była skierowana w dół, i umieść go z powrotem na szklanym szkiełku nakrywkowym. Następnie, za pomocą pęsety z płaską końcówką, przenieś grafen CVD z szkiełka nakrywkowego do wyładowarki jarzeniowej i wyładowuj jarzenie przez 30 sekund przy natężeniu 25 miliamperów.Umieść grafen z szkiełka nakrywkowego z powrotem na szalce Petriego. Na koniec przykryj go w celu przetransportowania do obszaru wytrawiania miedzi. Zacznij od pocięcia metakrylanu metylu lub kwadratów grafenu pokrytych MMA na kawałki wielkości siatki.Aby to zrobić, użyj dwóch zestawów kleszczy o odwróconym działaniu, aby podeprzeć kwadrat grafenowy CVD, jednocześnie upewniając się, że strona MMA jest skierowana do góry podczas mocowania go do kleszczy. Aby pociąć grafen na małe kwadraty, użyj dwóch zestawów kleszczy o odwróconym działaniu, aby przytrzymać grafen prawą stroną do góry, zakotwiczając go w odpowiedniej pozycji, a także przytrzymać krawędź małego kwadratu po odcięciu go od reszty dużego kwadratu. Przechyl zlewkę zawierającą nadsiarczan amonu lub APS, aby umieścić w niej kwadraty pod płytkim kątem, nie topiąc.Następnie wybierz kwadrat i spraw, aby zetknął się z powierzchnią roztworu APS przed jego uwolnieniem. Po przykryciu zlewki folią aluminiową inkubować ją przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie, aby usunąć folie grafenowe MMA z roztworu APS, najpierw zanurz szklane szkiełko nakrywkowe pionowo w roztworze, a następnie przesuń je na boki tak, aby dotykało pływającego kwadratu.Następnie ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że folia całkowicie przylega do boku szkiełka nakrywkowego po zdjęciu. Zanurz szkiełko nakrywkowe pionowo w wodzie molekularnej w 50-mililitrowej zlewce, aby usunąć dołączoną folię do wody. W podobny sposób przenieś wszystkie folie do zlewki.Pozostaw folie w zlewce przez 20 minut, zanim będą gotowe do przyklejenia do siatek krioelektromagnetycznych. Aby przymocować grafen CVD pokryty metakrylanem metylu lub MMA do siatek, należy użyć wcześniej przygotowanych kwadratów grafenowych powlekanych o rozmiarze siatki, przechowywanych w zlewce zawierającej wodę molekularną. Używając pęsety o negatywnym działaniu, delikatnie zanurz siatkę pionowo w wodzie, stroną z włókna węglowego skierowaną w pływający kwadrat grafenowy MMA.Po zetknięciu się z kwadratem ostrożnie wyjmij siatkę z wody, upewniając się, że kwadrat całkowicie przylega do węglowej strony siatki. Umieść kratki na czystym szkiełku nakrywkowym stroną z grafenu MMA skierowaną do góry i pozostaw kratki do wyschnięcia na powietrzu przez jedną do dwóch minut. Za pomocą pęsety z płaską końcówką przenieś szkiełko nakrywkowe z kratkami na gorącą płytę ustawioną na 130 stopni Celsjusza.Inkubuj kratki po przykryciu ich wierzchem szklanej szalki Petriego przez 20 minut. Następnie, w celu przemycia MMA acetonem, przenieś całe szkiełko nakrywkowe na szalkę Petriego wypełnioną 15 mililitrami acetonu i inkubuj przez 30 minut. Następnie za pomocą pipety serologicznej z czystego szkła przenieś aceton do pojemnika na odpady.Za pomocą kolejnej pipety serologicznej z czystego szkła dodaj 15 mililitrów świeżego acetonu do szalki Petriego i inkubuj przez 30 minut. Po trzech praniach acetonem usuń aceton. I za pomocą czystej szklanej pipety serologicznej zastąp ją 15 mililitrami izopropanolu.Następnie za pomocą pęsety ostrożnie wyjmij siatki z izopropanolu, aby wysuszyć je na powietrzu na czystym szkiełku nakrywkowym. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe z kratkami pokrytymi grafenem na płycie grzejnej ustawionej na 100 stopni Celsjusza na 10 minut, aby odparować resztki substancji organicznych. Używając pęsety o odwrotnym działaniu, delikatnie umieść kratki w czystym obszarze oświetlenia środka do czyszczenia ozonem UV, stroną pokrytą grafenem skierowaną do góry.Zamknij obszar oświetlenia i włącz maszynę. Ustaw pokrętło czasu na wyznaczony czas zabiegu, aby rozpocząć oczyszczanie siatek ozonem UV. Na koniec przystąp do zanurzenia próbki z mikroskopii krioelektronowej na traktowanych siatkach.

application-monolayer-graphene-to-cryo-electron-microscopy-grids-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj opisujemy protokół stosowania pojedynczej monowarstwy grafenu na siatkach mikroskopii elektronowej i jak przygotować je do użycia w określaniu struktury krioEM.

Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Kinaza IκB 1/α (IKK1/α CHUK) to kinaza białkowa Ser/Thr, która bierze udział w niezliczonych aktywnościach komórkowych, głównie poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych NF-κB. W tym miejscu opisujemy główne etapy niezbędne do produkcji i określenia struktury krystalicznej tego białka.

Przewodnik po produkcji, krystalizacji i określaniu struktury ludzkiego IKK1/α

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół korzystania z urządzenia do szybkiego tworzenia siatki, zarówno do szybkiego tworzenia siatki, jak i do szybkiego mieszania i zamrażania w celu przeprowadzania eksperymentów z rozdzielczością czasową.

Szybkie przygotowanie siatki do czasowo-rozdzielczej mikroskopii krioelektronowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Optymalne stężenie sacharozy zostało określone do ekstrakcji glikogenu wątrobowego za pomocą wirowania w gradicynie gęstości sacharozy. Korzystne okazało się dodanie 10-minutowego etapu wrzenia w celu zahamowania enzymów rozkładających glikogen.

Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

Poznaj protokół nanoszenia jednowarstwowego grafenu na siatki krioelektronowej mikroskopii, który poprawia lokalizację cząsteczek i ich orientację. Metoda umożliwia wytwarzanie siatek w laboratorium, obniżając koszty i zwiększając dostępność.

Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów