Demonstracja samoorganizującej się hodowli arkuszy komórkowych i ręcznego generowania organoidu 3D przypominającego ścięgno/więzadło przy użyciu ludzkich fibroblastów skórnych
June 21st, 2024
Tutaj demonstrujemy trzyetapowy model organoidów (dwuwymiarowa ekspansja [2D], stymulacja 2D, trójwymiarowe dojrzewanie [3D]), oferujący obiecujące narzędzie do podstawowych badań nad ścięgnami i potencjalną metodę inżynierii tkanek ścięgien bez rusztowań.
Pokazujemy poprzednio opublikowany i wdrożony trzyetapowy protokół organoidowy przy użyciu dostępnych na rynku normalnych ludzkich fibroblastów skóry jako źródła komórek. Model 3D organoidu ma kilka zalet w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Ściśle naśladuje skład i organizację komórkową, a także interakcje między komórkami i komórka-macierz tkanek ścięgien.
Sprawdzone podejście 3D do organoidów ścięgien/więzadeł może być wykorzystane jako model do podstawowych i stosowanych badań ścięgien w następujących obszarach: tenogenika in vitro, mechanizm chorobowy, testy leków i inżynieria tkanek ścięgien bez rusztowań. Na początek odwiruj trypsynizowane normalne ludzkie fibroblasty skóry. Usunąć supernatant z probówki wirówkowej.
Dodaj wstępnie podgrzaną, uzupełnioną pożywkę DMEM o niskiej zawartości glukozy do osadu i dobrze wymieszaj, aby ją ponownie zawiesić. Umieść normalne ludzkie fibroblasty skóry w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórek przylegających. Delikatnie kołysz naczyniem w poprzek
.Po 14 dniach stymulacji 2D, gdy komórki zlewają się, odessać pożywkę i użyć skrobaka do komórek, aby delikatnie i szybko oderwać uformowany arkusz komórek od naczynia. W tym samym czasie zwiń arkusz komórki w organoid 3D przypominający pręt. Przenieś normalne ludzkie organoidy fibroblastów skórnych na nieprzylegającą szalkę Petriego o szerokości 10 centymetrów.
Zmierz wydłużenie linijką, a następnie przytrzymaj jedną stronę organoidu pęsetą i delikatnie rozciągnij organoid, aż zostanie wydłużony osiowo o około 10%Za pomocą pęsety ręcznie wciśnij metalowe kołki przez obie krawędzie organoidu do plastikowego naczynia, aby go zamocować. Na koniec, do dojrzewania 3D, dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanej, uzupełnionej pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy przed inkubacją. Ogólna morfologia organoidów 3D w dniach zero i 14 etapu dojrzewania 3D wykazała lśniący biały wygląd.
Z biegiem czasu organoidy kurczyły się i wydawały się gęstsze. Morfologię organoidów oceniano za pomocą barwienia H&E. Pierwszego dnia organoidy wykazywały rozłączne warstwy, składające się głównie z komórek, otoczone niewielką ilością macierzy.
Komórki w warstwach wykazywały jądra o okrągłym kształcie i różnych rozmiarach. W 14 dniu zaobserwowano zauważalny wzrost sygnału eozyny, co wskazywało na osadzanie się matrycy i stopione warstwy. Co więcej, organoidy wykazały obecność obszarów zawierających wyrównane komórki.
Większość jąder miała podobne rozmiary i czasami była wydłużona.
Przegląd
To badanie przedstawia trójstopniowy model organoidów do badań nad ścięgnami, wykorzystując normalne ludzkie fibroblasty skóry. Model oferuje bezszkieletowe podejście do inżynierii tkanki ścięgna i ściśle naśladuje cechy tkanki ścięgna.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkanki
- Medycyna regeneracyjna
- Modele organoidów
Tło
- Modele organoidów zapewniają platformę do badania złożonych tkanek.
- Normalne ludzkie fibroblasty skóry służą jako żywotne źródło komórek.
- 3D modele organoidów poprawiają rozumienie interakcji tkanek.
- Metody bezszkieletowe są korzystne dla inżynierii tkanki.
Cel badania
- Opracowanie trójstopniowego modelu organoidów do badań nad ścięgnami.
- Zbadanie zastosowań w testowaniu leków i mechanizmach chorobowych.
- Dostarczenie bezszkieletowej metody do inżynierii tkanki ścięgna.
Zastosowanie metod
- Wykorzystanie normalnych ludzkich fibroblastów skóry.
- Zastosowanie trójstopniowego protokołu organoidów.
- Centrifugowanie trypsynizowanych fibroblastów.
- Ocenę składu komórkowego i organizacji.
Główne wyniki
- 3D model organoidów ściśle naśladuje tkankę ścięgna.
- Wykazał zalety dla zastosowań w medycynie regeneracyjnej.
- Ułatwiał in vitro badania nad mechanizmami tenogenicznymi.
- Dostarczył platformę dla bezszkieletowej inżynierii tkanki ścięgna.
Wnioski
- Ustalony model organoidów jest obiecującym narzędziem do badań nad ścięgnami.
- Oferuje znaczący potencjał dla zastosowań w inżynierii tkanki.
- To podejście może poprawić rozumienie biologii i patologii ścięgien.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized 3D tendon/ligament organoid models address a critical gap in musculoskeletal drug discovery by enabling physiologically relevant, scaffold-free systems for early-stage target validation and mechanistic de-risking. This approach supports predictive confidence in disease modeling and compound evaluation, directly impacting translational research and tissue engineering portfolios. The model's reproducibility and adaptability position it as a reusable platform for both basic and applied R&D in tendon biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tenogenic differentiation and tendon-specific pathway mechanisms in a controlled 3D environment.
- Supports biological de-risking by recapitulating native cell-to-cell and cell-to-matrix interactions.
- Facilitates functional target validation for tendon and ligament repair strategies.
Screening & Assay Development
- Provides a robust, ECM-rich organoid system for quantitative assessment of drug effects on tendon-like tissue.
- Improves assay reproducibility and standardization through a defined three-step protocol.
- Enables preparation of validated biological models for downstream screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Offers a disease-relevant system for modeling tendon injury and repair processes in vitro.
- Supports translational biomarker discovery and preclinical evaluation of regenerative therapies.
- Bridges discovery and preclinical validation by maintaining tissue architecture and mechanical properties relevant to human tendon biology.
Pipeline & Workflow Integration
This 3D organoid protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early hypothesis testing, lead identification, and translational research in tendon biology.
- Discovery Biology: Advances hypothesis-driven studies of tenogenic differentiation and ECM organization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound and biomaterial evaluation.
- Analytics: Enables measurement of morphological, cellular, and matrix changes under defined conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical needs for scaffold-free, physiologically relevant tendon models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, adaptable platform for ongoing R&D and cross-program applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tendon research.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in tissue engineering pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tendon repair and regeneration programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and tissue engineering protocols.
- Needs access to standard cell culture instrumentation and histological analysis tools.
- Demands cross-team standardization for reproducible organoid generation and assessment.
- Allows adaptation to alternative cell sources for broader model applicability.
- May require further optimization for dynamic mechanical stimulation or specific translational endpoints.
