Demonstracja samoorganizującej się hodowli arkuszy komórkowych i ręcznego generowania organoidu 3D przypominającego ścięgno/więzadło przy użyciu ludzkich fibroblastów skórnych
21 czerwca 2024
Tutaj demonstrujemy trzyetapowy model organoidów (dwuwymiarowa ekspansja [2D], stymulacja 2D, trójwymiarowe dojrzewanie [3D]), oferujący obiecujące narzędzie do podstawowych badań nad ścięgnami i potencjalną metodę inżynierii tkanek ścięgien bez rusztowań.
Pokazujemy poprzednio opublikowany i wdrożony trzyetapowy protokół organoidowy przy użyciu dostępnych na rynku normalnych ludzkich fibroblastów skóry jako źródła komórek. Model 3D organoidu ma kilka zalet w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Ściśle naśladuje skład i organizację komórkową, a także interakcje między komórkami i komórka-macierz tkanek ścięgien.
Sprawdzone podejście 3D do organoidów ścięgien/więzadeł może być wykorzystane jako model do podstawowych i stosowanych badań ścięgien w następujących obszarach: tenogenika in vitro, mechanizm chorobowy, testy leków i inżynieria tkanek ścięgien bez rusztowań. Na początek odwiruj trypsynizowane normalne ludzkie fibroblasty skóry. Usunąć supernatant z probówki wirówkowej.
Dodaj wstępnie podgrzaną, uzupełnioną pożywkę DMEM o niskiej zawartości glukozy do osadu i dobrze wymieszaj, aby ją ponownie zawiesić. Umieść normalne ludzkie fibroblasty skóry w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórek przylegających. Delikatnie kołysz naczyniem w poprzek
.Po 14 dniach stymulacji 2D, gdy komórki zlewają się, odessać pożywkę i użyć skrobaka do komórek, aby delikatnie i szybko oderwać uformowany arkusz komórek od naczynia. W tym samym czasie zwiń arkusz komórki w organoid 3D przypominający pręt. Przenieś normalne ludzkie organoidy fibroblastów skórnych na nieprzylegającą szalkę Petriego o szerokości 10 centymetrów.
Zmierz wydłużenie linijką, a następnie przytrzymaj jedną stronę organoidu pęsetą i delikatnie rozciągnij organoid, aż zostanie wydłużony osiowo o około 10%Za pomocą pęsety ręcznie wciśnij metalowe kołki przez obie krawędzie organoidu do plastikowego naczynia, aby go zamocować. Na koniec, do dojrzewania 3D, dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanej, uzupełnionej pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy przed inkubacją. Ogólna morfologia organoidów 3D w dniach zero i 14 etapu dojrzewania 3D wykazała lśniący biały wygląd.
Z biegiem czasu organoidy kurczyły się i wydawały się gęstsze. Morfologię organoidów oceniano za pomocą barwienia H&E. Pierwszego dnia organoidy wykazywały rozłączne warstwy, składające się głównie z komórek, otoczone niewielką ilością macierzy.
Komórki w warstwach wykazywały jądra o okrągłym kształcie i różnych rozmiarach. W 14 dniu zaobserwowano zauważalny wzrost sygnału eozyny, co wskazywało na osadzanie się matrycy i stopione warstwy. Co więcej, organoidy wykazały obecność obszarów zawierających wyrównane komórki.
Większość jąder miała podobne rozmiary i czasami była wydłużona.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia trójetapowy model organoidowy do badań nad ścięgnem, wykorzystujący prawidłowe ludzkie fibroblasty skóry. Model ten oferuje podejście bez użycia rusztowania w inżynierii tkanki ścięgna i ściśle naśladuje charakterystykę tkanki ścięgnistej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Medycyna regeneracyjna
- Modele organoidów
Wprowadzenie
- Modele organoidalne stanowią platformę do badania złożonych tkanek.
- Normalne ludzkie fibroblasty skórne służą jako odpowiednie źródło komórek.
- Trójwymiarowe modele organoidalne poprawiają zrozumienie interakcji tkankowych.
- Metody bezrusztowaniowe są korzystne w inżynierii tkankowej.
Cel badania
- Opracowanie trzystopniowego modelu organoidów do badań nad ścięgnami.
- Zbadanie możliwości zastosowania w testowaniu leków i analizie mechanizmów chorobowych.
- Przedstawienie metody bez użycia rusztowania (scaffold-free) w inżynierii tkankowej ścięgien.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie prawidłowych ludzkich fibroblastów skóry właściwej.
- Wdrożenie trzyetapowego protokołu tworzenia organoidów.
- Wirowanie trypsynizowanych fibroblastów.
- Ocena składu i organizacji komórkowej.
Główne wyniki
- Trójwymiarowy model organoidowy ściśle naśladuje tkankę ścięgnistą.
- Wykazano korzyści w zastosowaniach w medycynie regeneracyjnej.
- Ułatwiono prowadzenie badań in vitro nad mechanizmami tenogennymi.
- Zapewniono platformę do inżynierii tkanki ścięgnistej bez użycia rusztowań.
Wnioski
- Opracowany model organoidowy jest obiecującym narzędziem w badaniach nad ścięgnami.
- Oferuje on znaczący potencjał w zastosowaniach w inżynierii tkankowej.
- Podejście to może pogłębić zrozumienie biologii i patologii ścięgien.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Znormalizowane trójwymiarowe modele organoidów ścięgien i więzadeł wypełniają krytyczną lukę w procesie odkrywania leków na schorzenia układu mięśniowo-szkieletowego, umożliwiając tworzenie fizjologicznie istotnych systemów bez rusztowań do wczesnej walidacji celów terapeutycznych i ograniczania ryzyka mechanistycznego. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w modelowaniu chorób i ocenie związków chemicznych, co bezpośrednio wpływa na badania translacyjne oraz portfele inżynierii tkankowej. Powtarzalność i adaptacyjność modelu pozycjonują go jako wielorazową platformę zarówno dla podstawowych, jak i stosowanych badań i rozwoju w biologii ścięgien.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie różnicowania tenogennego oraz mechanizmów szlaków specyficznych dla ścięgien w kontrolowanym środowisku 3D.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez odtworzenie naturalnych oddziaływań komórka-komórka i komórka-macierz.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla strategii naprawy ścięgien i więzadeł.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia stabilny, bogaty w ECM system organoidowy do ilościowej oceny wpływu leków na tkankę przypominającą ścięgna.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację analizy dzięki zdefiniowanemu, trzyetapowemu protokołowi.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych modeli biologicznych do dalszych badań przesiewowych i studiów nad mechanizmami działania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Oferuje system istotny z punktu widzenia patologii do modelowania procesów uszkodzenia i naprawy ścięgien in vitro.
- Wspiera translacyjne odkrywanie biomarkerów oraz przedkliniczną ocenę terapii regeneracyjnych.
- Łączy etap odkryć z przedkliniczną walidacją poprzez zachowanie architektury tkanki i właściwości mechanicznych istotnych dla biologii ludzkich ścięgien.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół tworzenia organoidów 3D wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, wspierając wczesne testowanie hipotez, identyfikację związków wiodących oraz badania translacyjne w biologii ścięgien.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania oparte na hipotezach w zakresie różnicowania tenogenicznego i organizacji ECM.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków i biomateriałów.
- Analityka: Umożliwia pomiar zmian morfologicznych, komórkowych i macierzy w określonych warunkach.
- Badania translacyjne: Odpowiada na potrzeby przedkliniczne w zakresie bezrusztowianowych, fizjologicznie istotnych modeli ścięgien.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zstandaryzowaną, adaptowalną platformę dla bieżących działań B+R oraz zastosowań międzyprogramowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad ścięgnami.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji, powtarzalności i skalowalności w zespołach badawczo-rozwojowych.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań oraz zwiększa efektywność kapitałową w procesach inżynierii tkankowej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów naprawy i regeneracji ścięgien.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w protokołach 3D hodowli komórkowych i inżynierii tkankowej.
- Wymaga dostępu do standardowej aparatury do hodowli komórkowych oraz narzędzi do analizy histologicznej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności generowania i oceny organoidów.
- Pozwala na adaptację alternatywnych źródeł komórek w celu szerszego zastosowania modelu.
- Może wymagać dalszej optymalizacji pod kątem dynamicznej stymulacji mechanicznej lub specyficznych punktów końcowych w badaniach translacyjnych.
