Name: Ocena cytotoksyczności metabolitów typowych pestycydów triazolowych w roślinach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę oceny cytotoksyczności metabolitów pestycydów triazolowych w roślinach wykorzystującą kulturę kalusa roślinnego i linię komórek ludzkich. To podejście łączy modele roślinne z ludzkimi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (21976160) oraz Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006).

1. Różnicowanie kalusa marchwi
UWAGA: Szczegółowy protokół różnicowania kalusa marchwi został opisany w poprzednim badaniu12. Oto krótki opis.
<ol>
	<li>Sterylizuj powierzchnię nasion wernalizowanej 75% etanolem przez 20 minut, a następnie 20% H2O2 przez 20 minut. Umyj je wodą destylowaną co najmniej 3 razy.</li>
	<li>Wysiewaj nasiona na bezhormonalnym pożywce żelowej (1% w/v) Murashige i Skoog (MS) (pH = 5,8, autoklawizowane w temperaturze 121 °C) i inkubuj je w ciągu 16 godzin fotoperiodu (350 μmol/m2s) w temperaturze 26 °C przez 15 dni, aby uformować siewki.</li>
	<li>Zebrać eksplantaty, krojąc hipokotyl i liścienie siewek na małe kawałki (0,5 cm) i inkubować eksplantaty w pożywce MS zawierającej auksymon 1 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego i fitokininę 0,5 mg/l 6-benzyloaminopuryny w temperaturze 26 °C w ciemności przez 3-4 tygodnie w celu wywołania kalusa.</li>
	<li>Zbierz kalus (o średnicy około 1 cm, zwarty) za pomocą skalpeli i kleszczy.</li>
</ol>
2. Leczenie kalusa marchwi pestycydami
<ol>
	<li>Rozpuścić po 10 mg flusilazolu, dinikonazolu, tebukonazolu i propikonazolu w 100 ml sterylnego podłoża MS o końcowym stężeniu 100 mg/l (pH 5,6-7,0). 
	UWAGA: Stężenie badanych pestycydów zostało wybrane jako maksymalne stężenie 50% hamujące wzrost komórek (IC50) do komórki Caco-2.</li>
	<li>Zmieszać 3 g kalusa marchwi (z kroku 1.4) z 10 ml przygotowanych roztworów pestycydów (z kroku 2.1) w szklanych kolbach w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Zmieszać 3 g kalusa marchwi (z kroku 1.4) z 10 ml aseptycznego podłoża MS w szklanych kolbach w sterylnych warunkach. 
	UWAGA: Wszystkie szklane kolby zostały poddane sterylizacji w autoklawie.</li>
	<li>Inkubować kalus marchwi (od etapów 2.2 i 2.3) przy 130 obr./min i w temperaturze 26 °C w ciemności przez 72 godz. 
	Ustaw wszystkie zabiegi w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Zebrać kalus marchwi z pożywki przez filtrację za pomocą filtrów z włókna szklanego (0,45 μm) po inkubacji trwającej 72 godziny. Przemyć kalus ultraczystą wodą 3x.</li>
	<li>Liofilizować kalus za pomocą liofilizatora w temperaturze -55 °C, a następnie homogenizować je za pomocą wysokowydajnego młynka do tkanek przy 70 Hz przez 3 minuty.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja chemiczna kalusa marchwi
<ol>
	<li>Zmieszać 0,2 g zmielonego proszku liofilizowanego kalusa z 3 ml acetonitrylu w probówce wirówkowej (10 ml).</li>
	<li>Wirować probówkę wirówkową przez 8 minut, a następnie podsłuchiwać ją sonikować przez 5 minut (150 W, 40 kHz).</li>
	<li>Zebrać supernatanty przez pipetowanie po odwirowaniu w temperaturze 8 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Powtórz procedury ekstrakcji 3 razy i połącz ekstrakty w czystej probówce wirówkowej (10 ml).</li>
	<li>Skoncentrować zebrane ekstrakty do sucha za pomocą koncentratora przedmuchiwania azotem w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Ponownie rozpuścić pozostałości ekstraktów (z etapu 3.5) w 1 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 0,3% dimetylosulfotlenku (DMSO). 
	UWAGA: Pozostałości w kroku 3.6 uzyskano z ekstraktów kalusa poddanego działaniu pestycydów (z kroku 2.2).</li>
	<li>Ponownie rozpuść pozostałości ekstraktów (z kroku 3.5) w 1 ml DMEM z 0,3% DMSO i rozpuść 1 mg flusilazolu, dinikonazolu, tebukonazolu i propikonazolu odpowiednio w 4 różnych probówkach. 
	UWAGA: Pozostałości w kroku 3.7 uzyskano z ekstraktów ślepego kalusa (z etapu 2.3). 
	UWAGA: DMEM przygotowano z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyków (penicyliny i streptomycyny).</li>
</ol>
4. Reanimacja komórki Caco-2
UWAGA: Wszystkie odczynniki i materiały używane w testach komórek Caco-2 były sterylizowane w autoklawie przez 20 minut i sterylizowane w świetle ultrafioletowym przez 2 godziny.
<ol>
	<li>Wyjąć probówkę do kriokonserwacji (przechowującą zamrożone komórki) ze zbiornika z ciekłym azotem i szybko przenieść ją do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Ciągle wstrząsać nią, aby rozmrozić zamrożony roztwór. 
	UWAGA: Podczas potrząsania należy unikać przepływania wody przez pokrywę rurki do kriokonserwacji.</li>
	<li>Zdezynfekuj powierzchnię probówki do krioprezerwacji 75% alkoholem po rozmrożeniu zamrożonego roztworu. Szybko przenieś roztwór komórkowy do sterylnej probówki wirówkowej za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Usunąć supernatanty z probówki do kriokonserwacji po odwirowaniu w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Dodać 1 ml DMEM i zawiesić komórki, delikatnie stukając i potrząsając.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek (z kroku 4.3) do szklanej kolby za pomocą pipetowania. Dodać 5 ml DMEM do szklanej kolby i delikatnie potrząsnąć szklaną kolbą, aby równomiernie rozprowadzić komórki.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Kroki 4.2-4.4 zostały wykonane na super czystej ławce.</li>
</ol>
5. Przejście komórki Caco-2
<ol>
	<li>Wyjąć szklaną kolbę z inkubatora i wyrzucić pożywkę hodowlaną, gdy gęstość komórek osiągnie ponad 80%. Umyj komórki PBS 3x.</li>
	<li>Dodaj 1 ml roztworu trypsyny-EDTA i równomiernie go rozprowadz, aby zapewnić pełny kontakt z komórkami.</li>
	<li>Usuń roztwór trawienny, gdy komórki skurczą się od przylegającego kształtu do małego okrągłego punktu i nie zawisną pod obserwacją pod mikroskopem (100-krotne powiększenie). Delikatnie postukać w ściankę kolby, aby spowodować usunięcie komórek.</li>
	<li>Dodać 2 ml DMEM, powtórzyć płukanie ścianki kolby 10 razy, delikatnie postukać w ściankę kolby i przenieść 1 ml zawiesiny komórek do innej szklanej kolby.</li>
	<li>Dodać 5 ml DMEM do szklanych kolb. Delikatnie postukaj w ściankę kolby, aby równomiernie rozprowadzić komórki.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Pożywkę hodowlaną należy zastępować świeżym DMEM co 24 godziny, aż gęstość komórek osiągnie ponad 80%.</li>
	<li>Powtarzaj procedury pasażu komórkowego, aż do momentu, gdy zostanie pobrana wystarczająca liczba komórek (około 2 x 106) do następujących testów ekspozycji. 
	UWAGA: Kroki 5.1-5.5 zostały wykonane na super czystej ławce. Liczbę komórek określono za pomocą hemocytometru19.</li>
</ol>
6. Ekspozycja komórki Caco-2
<ol>
	<li>Wyjąć szklane kolby (z kroku 5.7) z inkubatora i powtórzyć kroki 5.1-5.4 w celu zebrania komórek.</li>
	<li>Delikatnie postukać w ściankę kolby, aby równomiernie rozprowadzić komórki i przenieść zawiesiny komórek do probówki wirówkowej (15 ml).</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórkową (od kroku 6.2) DMEM w połączeniu z cytometrią, aby osiągnąć gęstość komórek około 1 x 105 komórek/ml. Delikatnie postukaj w ściankę kolby, aby równomiernie rozprowadzić komórki.</li>
	<li>Dodać 100 μl PBS do zewnętrznych dołków płytki 96-dołkowej, aby zapobiec parowaniu pożywki hodowlanej z powodu efektu krawędzi. 
	UWAGA: Ciągle stukaj w ściankę probówki wirówkowej, aby utrzymać jednolitą zawiesinę komórek.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawiesiny komórek (z kroku 6.3) do lewych studzienek płytki 96-dołkowej i pozostawić na 10 minut.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
	<li>Po 48 godzinach inkubacji wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i wyrzucić pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Ustawić grupę metabolitów pestycydów, dodając 100 μl roztworów (z kroku 3.6) do każdej studzienki. 
	UWAGA: W każdym dołku w kroku 6.8 znajdowały się metabolity pestycydów wygenerowane od rodziców o dawce 0,1 mg.</li>
	<li>Ustaw grupę rodzicielską pestycydów, dodając 100 μl roztworów (z kroku 3.7) do każdej studzienki w celu porównania. 
	UWAGA: W każdym dołku w kroku 6.9 znajdowało się 0,1 mg pestycydów rodziców.</li>
	<li>Ustaw ślepą kontrolę, dodając 100 μl DMEM z 0,3% DMSO w każdym dołku. Użyj sześciu dołków dla każdej grupy (kroki 6.8-6.9).</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny 
	UWAGA: Kroki 6.1-6.5 i 6.7-6.10 zostały wykonane na super czystej ławce.</li>
</ol>
7. Ocena żywotności komórek
<ol>
	<li>Wyjąć 96-dołkową płytkę (z 6.11) z inkubatora i odrzucić pożywkę hodowlaną po ekspozycji trwającej 24 godziny. Przemyć komórki PBS 2x.</li>
	<li>Dodaj 100 μl DMEM do każdego dołka, a następnie dodaj 10 μl odczynników CCK-8. Delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 godziny.</li>
	<li>Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora po 4 godzinach inkubacji i zmierzyć absorbancję optyczną (OD) przy 450 nm za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego.</li>
	<li>Oblicz żywotność komórki za pomocą następującego równania: 
	żywotność komórek (%) = (grupa eksperymentalna OD - ODDMEM) / (kontrola OD - ODDMEM)×100%. 
	UWAGA: Kroki 7.1-7.2 zostały wykonane na super czystej ławce.</li>
</ol>

Estimating the Integral Metabolite Cytotoxicity of Triazole Pesticides in Plants

<ol><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+halogenated+organic+compounds+%28HOCs%29+into+peanut+and+corn+during+the+whole+life+cycle+grown+in+an+agricultural+field%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Uptake of halogenated organic compounds (HOCs) into peanut and corn during the whole life cycle grown in an agricultural field.</a> Environ Pollut. 263, 114400(2020).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+metals+in+e-waste+lead+to+serious+health+risk+through+consumption+of+rice+growing+near+an+abandoned+e-waste+recycling+site%3A+Comparisons+with+PBDEs+and+AHFRs%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Trace metals in e-waste lead to serious health risk through consumption of rice growing near an abandoned e-waste recycling site: Comparisons with PBDEs and AHFRs.</a> Environ Pollut. 247, 46-54 (2019).</li>
<li>Liu, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrabromobisphenol-A%2FS+and+nine+novel+analogs+in+biological+samples+from+the+Chinese+Bohai+Sea%3A+Implications+for+trophic+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Tetrabromobisphenol-A/S and nine novel analogs in biological samples from the Chinese Bohai Sea: Implications for trophic transfer.</a> Environ Sci Technol. 50 (8), 4203-4211 (2016).</li>
<li>Awasthi, A. K., Zeng, X., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+pollution+of+electronic+waste+recycling+in+India%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Environmental pollution of electronic waste recycling in India: A critical review.</a> Environ Pollut. 211, 259-270 (2016).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+accumulation+and+transformation+of+brominated+and+organophosphate+flame+retardants%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Plant accumulation and transformation of brominated and organophosphate flame retardants: A review.</a> Environ Pollut. 288, 117742(2021).</li>
<li>Sandermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+plant+metabolism+of+xenobiotics%3A+the+%27green+liver%27+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenetics%22%5BJournal%5D)">Higher plant metabolism of xenobiotics: the 'green liver' concept.</a> Pharmacogenetics. 4, 225-241 (1994).</li>
<li>Zhang, J. J., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+detoxification+of+pesticides+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Metabolism and detoxification of pesticides in plants.</a> Sci Total Environ. 790, 148034(2021).</li>
<li>Debenest, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecotoxicity+of+a+brominated+flame+retardant+%28tetrabromobisphenol+A%29+and+its+derivatives+to+aquatic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Phys+C%22%5BJournal%5D)">Ecotoxicity of a brominated flame retardant (tetrabromobisphenol A) and its derivatives to aquatic organisms.</a> Comp Biochem Phys C. 152 (4), 407-412 (2010).</li>
<li>McCormick, J. M., Van Es, T., Cooper, K. R., White, L. A., Haggblom, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbially+mediated+O-methylation+of+bisphenol+A+results+in+metabolites+with+increased+toxicity+to+the+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Microbially mediated O-methylation of bisphenol A results in metabolites with increased toxicity to the developing zebrafish (Danio rerio) embryo.</a> Environ Sci Technol. 45 (15), 6567-6574 (2011).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+metabolic+pathways+of+2%2C4%2C6-tribromophenol+in+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants.</a> Environ Sci Technol. 53 (13), 7473-7482 (2019).</li>
<li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+of+tetrabromobisphenol+A+in+pumpkin%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin.</a> Environ Sci Technol. 53 (15), 8805-8812 (2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+metabolism+of+2%2C4-Dibromophenol+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Elucidating the metabolism of 2,4-Dibromophenol in plants.</a> J Vis Exp. (192), e65089(2023).</li>
<li>Zucco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inter-laboratory+study+to+evaluate+the+effects+of+medium+composition+on+the+differentiation+and+barrier+function+of+Caco-2+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Atla-Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">An Inter-laboratory study to evaluate the effects of medium composition on the differentiation and barrier function of Caco-2 cell lines.</a> Atla-Altern Lab Anim. 33, 603-618 (2005).</li>
<li>Eisenbrand, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+in+vitro+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Methods of in vitro toxicology.</a> Food Chem Toxicol. 40, 193-236 (2002).</li>
<li>Sambuy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caco-2+cell+line+as+a+model+of+the+intestinal+barrier%3A+influence+of+cell+and+culture-related+factors+on+Caco-2+cell+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics.</a> Cell Biol Toxicol. 21, 1-26 (2005).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+translocation%2C+and+subcellular+distribution+of+three+triazole+pesticides+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+Res%22%5BJournal%5D)">Uptake, translocation, and subcellular distribution of three triazole pesticides in rice.</a> Environ Sci Pollut Res. 29 (17), 25581-25590 (2022).</li>
<li>Satapute, P., Kamble, M. V., Adhikari, S. S., Jogaiah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+triazole+pesticides+on+tillage+soil+microbial+populations+and+metabolic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Influence of triazole pesticides on tillage soil microbial populations and metabolic changes.</a> Sci Total Environ. 651, 2334-2344 (2019).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+but+unrecognized+risk+of+acceptable+daily+intake+dose+triazole+pesticides+exposure-bile+acid+disturbance+induced+pharmacokinetic+changes+of+oral+medication%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">A possible but unrecognized risk of acceptable daily intake dose triazole pesticides exposure-bile acid disturbance induced pharmacokinetic changes of oral medication.</a> Chemosphere. 322, 138209(2023).</li>
<li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+viability+analysis+using+trypan+blue%3A+manual+and+automated+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten został opracowany w celu oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów pestycydów triazolowych w roślinach poprzez połączenie kalusa roślinnego i modeli komórek ludzkich. Krytycznymi etapami dla tego proponowanego protokołu są hodowla kalusa roślinnego i komórki Caco-2. Najtrudniejsza część i względne porady dotyczące hodowli kalusa roślinnego zostały przedstawione w naszym poprzednim badaniu12. W tym miejscu należy zauważyć, że utrzymanie komórek jest najtrudniejszą częścią hodowli k...

Rośliny uprawne rosnące na polach uprawnych mogą być narażone na różne zanieczyszczenia organiczne pochodzące z działalności antropogenicznej1,2. Zanieczyszczenia mogą być wchłaniane przez rośliny, powodując dalsze zagrożenia dla ekosystemu i zdrowia ludzkiego poprzez łańcuchy pokarmowe3,4. Ksenobiotyki w roślinach prawdopodobnie przechodzą szereg biotransformacji, takich jak metabolizmy fazy I i II5, generując szereg metabolitów. Zgodnie z koncepcją zielonej wątroby w roślinach, metabolizm roślin może zmniejszyć toksyczność ksenobiotyków6,7. Wykazano jednak, że toksyczność niektórych metabolitów może być wyższa niż ich rodziców. Na przykład udowodniono, że debromowany produkt tetrabromobisfenolu A (TBBPA) i produkt O-metylowany bisfenolu A (BPA) są znacznie bardziej toksyczne niż ich rodzice8,9, a debromacja i O-metylacja obejmują główne szlaki metabolizmu fazy I w roślinach. W związku z tym ocena toksyczności oparta wyłącznie na rodzicach zanieczyszczeń w roślinach nie jest dokładna, podczas gdy należy wziąć pod uwagę odpowiadające im metabolity.
Metabolity ksenobiotyków w roślinach są niezwykle złożone10,11, co utrudnia ich kompleksową identyfikację i rozdzielenie. Ponadto można uzyskać tylko kilka wzorców zidentyfikowanych metabolitów. W związku z tym dane toksykologiczne dotyczące wszystkich metabolitów nie są dostępne, co utrudnia kompleksową ocenę toksyczności. W ramach tego badania zaproponowano strategię oceny integralnej toksyczności metabolitów zanieczyszczeń w roślinach poprzez traktowanie ich jako całości podczas badań toksykologicznych, dostarczając nowych danych do precyzyjnej oceny toksyczności zanieczyszczeń w roślinach. Nasze poprzednie badania wykazały, że kultura kalusa roślinnego otwiera prostą i skuteczną drogę do uzyskania metabolitów ksenobiotyków w roślinach12. W związku z tym w tym badaniu wykorzystano kulturę kalusa roślinnego w celu wytworzenia metabolitów zanieczyszczeń w roślinach, a następnie ekstrakcji chemicznej i testów toksykologicznych z wykorzystaniem ludzkiej linii komórkowej. Przewód pokarmowy jest jednym z bezpośrednich narządów docelowych ksenobiotyków narażonych na kontakt ze zwierzętami i ludźmi. Linia komórkowa Caco-2 okazała się najlepszym modelem do badania zachowań jelitowych i toksyczności ksenobiotyków in vitro13,14,15. W związku z tym w tym badaniu wybrano model komórkowy Caco-2.
Pestycydy triazolowe, klasa fungicydów o szerokim spektrum działania, były szeroko stosowane w produkcji rolnej16. Ich zanieczyszczenie pozostałościami na polach uprawnych przyciąga coraz większą uwagę17,18. W tym przypadku jako typowe zanieczyszczenia wybrano cztery powszechnie stosowane pestycydy triazolowe, w tym flusilazol, diniconazol, tebukonazol i propikonazol. Marchew została wybrana w tym badaniu jako roślina reprezentatywna dla świeżych, gotowych do spożycia warzyw. Kalus marchwi był początkowo narażony na działanie badanych pestycydów w stężeniu 100 mg/L. Po ekspozycji trwającej 72 godziny metabolity wyekstrahowano w celu oceny cytotoksyczności przy użyciu linii komórkowej Caco-2. Metodę tę można łatwo rozszerzyć w celu oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów innych rodzajów zanieczyszczeń w roślinach.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy</td><td>WAKO</td><td>1 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>20% H2O2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>10011218-500ML</td><td></td></tr><tr><td>6-benzyloaminopuryna</td><td>WAKO</td><td>0,5 mg / L</td><td></td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>1269101-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator sztucznego klimatu</td><td>Ningbo DongNan Lab Equipment Co., Ltd</td><td>RDN-1000A-4</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawy</td><td>STIK</td><td>MJ-Series</td><td></td></tr><tr><td>Caco-2 Ogniwa</td><td>Nuoyang Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki CCK8</td><td>Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng, Chiny</td><td>G021-1-3</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Labtrip</td><td>HWJ-3-160</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Dinikonazol, 98,7%</td><td>J& K Scientific</td><td>83657-24-3</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle's Dulbecco</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>11965-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Shanghai Precision Instrument Co., Ltd</td><td>FA1004B</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Cellmax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr fluorescencyjny</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Flusilazol, 98,5%</td><td>J& K Naukowy</td><td>85509-19-9&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wysokowydajna szlifierka do tkanek</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q system Millipore</td><td></td><td>MS1922801-4L</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog medium</td><td>HOPEBIO</td><td>HB8469-7</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator nadmuchu azotu</td><td>AOSHENG</td><td>MD200-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1022-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna Płyn</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1400-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Propiconazol, 100%</td><td>J& K Naukowy</td><td>60207-90-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Badania plus</td><td>Eppendorf</td><td>10-1000 &mu; L</td><td></td></tr><tr><td>Nasiona marchwi Little Finger (Daucus carota var. sativus)</td> <td>Shouguang Seed Industry Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubatory z potrząsaniem</td><td>Shanghai bluepard instruments Co., Ltd.</td><td>THZ-98AB</td><td></td></tr><tr><td>Tebukonazol, 100%</td> <td>J& K Scientific</td><td>107534-96-3</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>T1300-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonograf</td><td>ZKI</td><td>UC-6</td><td></td></tr> super <tr><td>czysta ławka sterylizowana promieniami UV</td> Instrument <td>AIRTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd</td><td>BV-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena cytotoksyczności metabolitów typowych pestycydów triazolowych w roślinach

Assessing Cytotoxicity of Metabolites of Typical Triazole Pesticides in Plants

Różne zanieczyszczenia organiczne zostały uwolnione do środowiska z powodu działalności antropogenicznej. Zanieczyszczenia te mogą być wchłaniane przez rośliny uprawne, powodując potencjalne zagrożenia dla ekosystemu i zdrowia ludzi w całym łańcuchu żywnościowym. Biotransformacja zanieczyszczeń w roślinach prowadzi do powstania szeregu metabolitów, które mogą być bardziej toksyczne niż ich związki macierzyste, co oznacza, że metabolity te powinny być brane pod uwagę podczas oceny toksyczności. Metabolity zanieczyszczeń w roślinach są jednak niezwykle złożone, co utrudnia kompleksowe uzyskanie informacji toksykologicznych na temat wszystkich metabolitów. W badaniu tym zaproponowano strategię oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów zanieczyszczeń w roślinach poprzez traktowanie ich jako całości podczas badań toksykologicznych. Pestycydy triazolowe, klasa fungicydów o szerokim spektrum działania, są szeroko stosowane w produkcji rolnej. Coraz większą uwagę przyciąga zanieczyszczenie pozostałościami na terenach uprawnych. W związku z tym jako badane zanieczyszczenia wybrano cztery pestycydy triazolowe, w tym flusilazol, diniconazol, tebukonazol i propikonazol. Metabolity zostały wytworzone w wyniku traktowania kalusa marchwi testowanymi pestycydami triazolowymi. Po zabiegu trwającym 72 godziny wyekstrahowano metabolity pestycydów z kalusa marchwi, a następnie przeprowadzono testy toksykologiczne z wykorzystaniem linii komórkowej Caco-2. Wyniki wykazały, że metabolity badanych pestycydów w kalusie marchwi nie hamowały istotnie żywotności komórek Caco-2 (P0,05), nie wykazując cytotoksyczności metabolitów pestycydów. Zaproponowana metoda otwiera nową drogę do oceny cytotoksyczności metabolitów zanieczyszczeń w roślinach, co ma dostarczyć cennych danych do precyzyjnej oceny toksyczności.

Rysunek 1 przedstawia schemat proponowanej metody generowania, ekstrakcji i oceny cytotoksyczności metabolitów pestycydów w kalusie marchwi. Na Rysunku 2 przedstawiono krzywe kinetyki poboru i metabolizmu badanych pestycydów, z których wynika, że stężenia pestycydów w pośrodkach hodowlanych spadały wykładniczo, podczas gdy ich stężenia w kalusie marchwi zaczęły wzrastać, osiągając szczyt po 4 lub 8 h, po czym nastąpił stopniowy spadek. Wyniki te sugerują, że pes...

Protokół opisuje nową metodę oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów triazolowych pestycydów w roślinach.

Ocena cytotoksyczności metabolitów typowych pestycydów triazolowych w roślinach

Various organic pollutants have been released into the environment because of anthropogenic activities. These pollutants can be taken up by crop plants, ...

Nasz protokół opisuje nową metodę oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów triazolowych pestycydów w roślinach. Kultura kalusa roślinnego jest wykorzystywana do wytwarzania metabolitów białek w roślinach, a następnie przeprowadza się testy toksykologiczne z wykorzystaniem ludzkiej linii komórkowej w celu oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów. Metabolity ksenobiotyków w roślinach są niezwykle złożone i można uzyskać tylko kilka stanowisk metabolitów.W związku z tym dług toksykologiczny metabolitów jest ograniczony, co zagraża kompleksowej ocenie toksyczności. W protokole tym zaproponowano strategię oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów pestycydów triazolowych w roślinach. W tym protokole nośniki roślinne i modele komórek ludzkich są łączone w celu uzyskania integralnej oceny cytotoksyczności metabolitów pestycydów triazolowych w roślinach.Pozwala to uniknąć skomplikowanych etapów i separacji metabolitów, zapewniając w ten sposób nowy dług do precyzyjnej, wiarygodnej oceny. Zacznij od potraktowania zebranego kalusa marchwi różnymi pestycydami triazolowymi w sterylnych warunkach. W tym celu w oddzielnych szklanych kolbach wykonuje się trzy gramy kalusa marchwi z 10 mililitrami każdego roztworu pestycydu przygotowanego na pożywce MS.Wymieszaj również trzy gramy kalusa marchwi z 10 mililitrami aseptycznego podłoża MS w innej szklanej kolbie. Przygotowane próbki kalusa marchwi inkubować przy 130 obr./min i 26 stopniach Celsjusza w ciemności przez 72 godziny. Ustaw wszystkie zabiegi w trzech egzemplarzach.Po inkubacji, za pomocą filtrów z włókna szklanego o grubości 0,5 mikrona, zbierz kalus marchwi z pożywki przez filtrację. Umyj modzel ultraczystą wodą trzy razy. Na koniec liofilizuj kalus za pomocą liofilizatora w temperaturze minus 55 stopni Celsjusza, a następnie homogenizuj je za pomocą wysokowydajnego młynka do tkanek o częstotliwości 70 Hz przez trzy minuty.Stężenia wszystkich pestycydów w pożywkach hodowlanych gwałtownie spadły. Podczas gdy te w modzelach marchwi zaczęły się zwiększać, osiągając szczyt po czterech lub ośmiu godzinach, po czym nastąpił stopniowy spadek. Wyniki te sugerowały, że pestycydy były szybko wchłaniane i przekształcane przez kalus marchwi.Czasowe odzyskiwanie pestycydów w systemie hodowli kalusa wykazało, że po 72-godzinnej inkubacji pozostało tylko 8,3 do 11% pestycydów, co wskazuje, że większość pestycydów została przekształcona w metabolity. Na początek wymieszaj 0,2 grama zmielonego proszku z każdej liofilizowanej, poddanej pestycydom próbki kalusa marchwi z trzema mililitrami acetonitrylu w 10-mililitrowej probówce wirówkowej. Wirować probówkę wirówkową przez osiem minut, a następnie poddawać ją sonikacji przez pięć minut z mocą 150 watów i 40 kiloherców.Następnie odwirować probówkę o stężeniu 8 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut przed pobraniem supernatantu przez pipetowanie. Za pomocą koncentratora przedmuchiwania azotem w temperaturze 40 stopni Celsjusza skoncentruj zebrane ekstrakty do sucha. Ponownie rozpuść pozostałości ekstraktu w jednym mililitrze DMEM zawierającym 0,3% DMSO, aby uzyskać roztwór ekspozycji na metabolit pestycydu.W podobny sposób należy ponownie rozpuścić pozostałości ekstraktu otrzymanego z ślepych próbek kalusa w jednym mililitrze DMEM zawierającym 0,3% DMSO. Następnie rozpuścić jeden miligram każdego użytego pestycydu w różnych probówkach zawierających roztwór pozostałości ślepej próbki, aby uzyskać macierzyste roztwory ekspozycji na pestycydy. Przystąp do pasażu komórek po ich hodowli, aż osiągną gęstość komórek powyżej 80%Po odrzuceniu pożywki hodowlanej umyj komórki trzykrotnie PBS.Następnie dodaj jeden mililitr roztworu trypsyny-EDTA do kolby i równomiernie rozprowadź go, aby uzyskać pełny kontakt z komórkami. Gdy komórki zmienią się z przylegającego kształtu na małe okrągłe punkty, jak obserwuje się pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu, usuń roztwór trawienny. Delikatnie postukaj w ściankę kolby, aby odłączyć komórki.Dodaj dwa mililitry DMEM i powtórz płukanie ścianki kolby 10 razy. Delikatnie postukać w ściankę kolby i przenieść jeden mililitr zawiesiny komórek do innej szklanej kolby. Dodaj pięć mililitrów DMEM do każdej szklanej kolby.Delikatnie postukaj w ściankę kolby, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aż gęstość komórek przekroczy 80%Kontynuuj wykonywanie testu ekspozycji, gdy zostanie zebrana wystarczająca liczba komórek do tego samego. Delikatnie postukaj w ściankę kolby zawierającej komórki, aby rozprowadzić je równomiernie i przenieś zawiesiny komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Rozcieńczyć zawiesinę komórek DMEM w połączeniu z cytometrią, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek. Delikatnie postukaj w ściankę kolby, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów PBS do zewnętrznych dołków płytki 96-dołkowej, aby zapobiec parowaniu pożywki hodowlanej z powodu efektu krawędzi.Dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do lewych dołków płytki i pozostawić na 10 minut. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Po wyjęciu płytki 96-dołkowej z inkubatora należy wyrzucić pożywkę hodowlaną.Aby ustalić grupę metabolitów pestycydów, dodaj 100 mikrolitrów różnych przygotowanych roztworów narażenia na pozostałości pestycydów do każdej wyznaczonej studzienki, a następnie dodaj 100 mikrolitrów różnych przygotowanych roztworów narażenia na pestycydy rodzicielskie do każdej wyznaczonej studzienki w celu porównania, aby ustalić grupę rodzicielską pestycydów. W celu ustawienia ślepej próby kontrolnej dodaj 100 mikrolitrów DMEM zawierającego 0,3% DMSO do każdej wyznaczonej studzienki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.Na początek należy pobrać 96-dołkową płytkę zawierającą komórki z inkubatora po 24-godzinnej ekspozycji na roztwory ekstraktów metabolitów. Usunąć pożywkę hodowlaną i przeprowadzić podwójne płukanie komórek za pomocą PBS. Wprowadź 100 mikrolitrów DMEM do każdej studzienki, a następnie dodaj 10 mikrolitrów odczynników CCK8.Zapewnij równomierne rozłożenie komórek, delikatnie potrząsając płytką. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez cztery godziny. Na koniec przeprowadź pomiar gęstości optycznej przy 450 nanometrach za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego.Nie stwierdzono istotnej różnicy między żywotnością komórek metabolitu pestycydu a grupą kontrolną, co wskazuje na brak cytotoksyczności metabolitów pestycydów. Żywotność komórek w grupie rodzicielskiej pestycydów była znacznie niższa w porównaniu z kontrolą, co wskazuje na oczywistą cytotoksyczność.

assessing-cytotoxicity-metabolites-typical-triazole-pesticides

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten manuskrypt opisuje, jak tempo metabolizmu herbicydów może być skutecznie określone ilościowo za pomocą wyciętych liści z chwastów dwuliściennych, zmniejszając w ten sposób zmienność i usuwając wszelkie możliwe zakłócające efekty pobierania lub translokacji herbicydów, zwykle obserwowane w testach na całej roślinie.

Pomiar tempa metabolizmu herbicydów w chwastach dwuskrzydłowych za pomocą testu wyciętych liści

Protokoły są opisane do oceny toksyczności chemii dla niedojrzałych i dorosłych komarów do rozwoju jako nowe klasy larwobójców, adultycydów i endektocydów. Protokoły umożliwiają wysokoprzepustowe testowanie wielu substancji chemicznych przy dawce jednopunktowej, a następnie ocenę za pomocą testu dawka-odpowiedź w celu określenia toksyczności w kontakcie lub po spożyciu.

Protokoły badania toksyczności nowych środków owadobójczych dla komarów

Ta praca przedstawia protokół tworzenia kultury zawiesiny komórkowej pochodzącej z liści herbaty (Camellia sinensis L.), która może być wykorzystana do badania metabolizmu zewnętrznych związków, które mogą być pobierane przez całą roślinę, takich jak insektycydy.

Badanie metabolizmu sześciu ogólnoustrojowych insektycydów w nowo powstałej kulturze zawiesiny komórkowej pochodzącej z herbaty (Camellia Sinensis L.) Liście

Często konieczne jest oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności zestawu związków na hodowanych komórkach. W tym miejscu opisujemy strategię niezawodnego badania przesiewowego pod kątem toksycznych związków w formacie 96-dołkowym.

Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości

Protokół opisuje szybki, wysokoprzepustowy, niezawodny, niedrogi i bezstronny test do skutecznego określania żywotności komórek. Ten test jest szczególnie przydatny, gdy mitochondria komórek zostały uszkodzone, co zakłóca działanie innych testów. Test wykorzystuje automatyczne zliczanie komórek wybarwionych dwoma barwnikami jądrowymi – Hoechst 33342 i jodkiem propidyny.

Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu

Tutaj opisujemy test biologiczny z użyciem bromku 3-(4′,5′-dimetylotiazol-2′-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) do testowania wcześniej zsyntetyzowanych oksymów spirocyklicznych.

Funkcjonalizowana spirocykliczna synteza heterocykliczna i test cytotoksyczności

Ten protokół przedstawia powszechnie stosowane testy cytotoksyczności (testy Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red i MTT) dostosowane do oceny cytotoksyczności w liniach komórkowych zarodka danio pręgowanego (ZEM2S) i wątroby (ZFL) na 96-dołkowych płytkach.

Testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego

Obecny protokół opisuje prostą i skuteczną metodę identyfikacji metabolitów 2,4-dibromofenolu w roślinach.

Wyjaśnienie metabolizmu 2,4-dibromofenolu w roślinach

Związki tiofenesulfonamidu są silnymi i specyficznymi inhibitorami regulatorów Vibrio quorum sensing LuxR/HapR, które blokują ich aktywność in vivo, zapobiegając w ten sposób transkrypcji genów zjadliwości, ruchliwości i biofilmów. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób związki te są syntetyzowane, modelowane in silico i oznaczane in vivo pod kątem aktywności przeciwko LuxR / HapR.

Synteza i test inhibitorów Vibrio Quorum Sensing

Protokół ten zapewnia systematyczne ramy do oceny, w jaki sposób fitochemikalia mogą wzmacniać bakteriobójcze efekty tradycyjnych biocydów, wykorzystując modelowanie aktywności bakteriobójczej oraz testy interakcji kombinatorycznych, które mają na celu identyfikację synergicznych mieszanin poprawiających kontrolę mikroorganizmów i ograniczających ogólne zużycie biocydów.

In vitro Ocena wzmacniających efektów cząsteczek pochodzenia roślinnego na konwencjonalne biocydy

Poznaj metodę oceny cytotoksyczności metabolitów pestycydów triazolowych w roślinach wykorzystującą kulturę kalusa roślinnego i linię komórek ludzkich. To podejście łączy modele roślinne z ludzkimi.

Ocena cytotoksyczności metabolitów typowych pestycydów triazolowych w roślinach

Przeglądaj więcej filmów