Name: Test chemiczny Acetyl-Click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Poznaj test chemiczny acetyl-click do pomiaru aktywności acetylotransferazy histonowej HAT1. Ta skalowalna metoda umożliwia szybkie przesiewanie inhibitorów małocząsteczkowych z zastosowaniem w badaniach nad rakiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy George'owi Zhengowi za dostarczenie H4K12CoA. Dziękujemy członkom Gruber Lab za pomocne dyskusje i opinie. Dziękujemy za wsparcie ze strony NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090, RP210041) oraz V Foundation (V2022-022).

1. Metoda 1: Produkcja i oczyszczanie rekombinowanego kompleksu HAT1/Rbap46
<ol>
	<li> rozmrażanie, regeneracja i namnażanie komórek HEK293f
	<ol>
		<li>Rozmrozić od 1 do 10 milionów komórek ssaczych HEK293f26 w 30 mL pożywki ekspresyjnej freestyle 293 w kolbie o pojemności 100 mL. Inkubować w 8% CO2 w temperaturze 37 °C przy obrotach 60 rpm.</li>
		<li>Następnego dnia policzyć komórki i sprawdzić ich żywotność, a następnie zwiększyć prędkość obrotową do 120 rpm. Przeszczepić do 300 mL hodowli w kolbie o pojemności 1 L, utrzymując gęstość szczepienia na poziomie 500 000 komórek/mL i pasażując komórki przed przekroczeniem gęstości 3 x 106 komórek/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja HEK293f
	<ol>
		<li>Zaszczepić 5 x 105 komórek/mL w 300 mL hodowli w kolbie o pojemności 1 L i hodować przez 24 h. Następnego dnia policzyć komórki, aby upewnić się, że ich liczba mieści się w przedziale od 7,5 x 105 do 1,2 x 106 komórek/mL.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę 300 µg plazmidowego DNA pHEK-FLAG-HAT1 oraz 300 µg plazmidowego DNA pHEK-Rbap46 w 30 mL PBS. Do mieszaniny DNA/PBS dodać 1,2 mL polietylenoiminy (PEI) i wymieszać. Inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej. Dodać mieszaninę DNA/PBS/PEI do 300 mL hodowli i inkubować w 37 °C przez 48 h przy 120 rpm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór komórek
	<ol>
		<li>Policzyć komórki, aby upewnić się, że ich gęstość wynosi od 1,7 x 106 do 2,5 x 106 komórek/mL. Przy tej gęstości dodać forskolin do stężenia końcowego 12,5 µM w celu aktywacji HAT1 i inkubować komórki przez 30 min w 37 °C przy 120 rpm.</li>
		<li>Zwirwić komórki przy 300 x g przez 5 min, przemyć raz 30 mL PBS i zamrozić gwałtownie w ciekłym N2. Przechowywać w -80 °C do czasu oczyszczania białka lub przystąpić bezpośrednio do oczyszczania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie kompleksu HAT1/Rbap46 za pomocą kulek FLAG
	<ol>
		<li>Zlizować komórki i przygotować ekstrakt białkowy.
		<ol>
			<li>Przygotować bufor do lizy, dodając jedną tabletkę koktajlu inhibitorów proteaz (PIC) do 50 mL RSB-500 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 25 mM MgCl2).</li>
			<li>Rozmrozić osad komórkowy z 300 mL hodowli na lodzie i zlizować przy użyciu 40 mL lodowatego buforu do lizy z 0,1% Triton X-100. Poddać sonikacji na lodzie, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 10 min w 4°C. Zebrać cały nadsącz do jednej probówki 50 mL na lodzie; stanowi on ekstrakt białkowy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować kulki FLAG.
		<ol>
			<li>Rozdzielić kulki FLAG do czterech stożkowych probówek 15 mL, dodając 400 µL zawiesiny kulek agarozowych M2-FLAG do każdej probówki zawierającej 5 mL 0,1 M glicyny pH 3,5 i 0,01% Triton X-100. Energicznie wstrząsnąć każdą probówką ręcznie przez 5 s.</li>
			<li>Odwirować krótko przez 30 s przy 1000 x g w 4 °C, odessać nadsącz, przemyć dwukrotnie 5 mL RSB-500 + 0,1% Triton X-100 (Tx-100; bez inhibitora proteaz) i inkubować na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeprowadzić immunoprecypitację FLAG.
		<ol>
			<li>Dodać 10 mL ekstraktu białkowego do każdej stożkowej probówki 15 mL z przemytymi kulkami. Inkubować probówki w 4 °C przy obrotach odwróconych przez co najmniej 90 min lub przez noc.</li>
			<li>Przemyć związane kulki 5x w 10 mL RSB-500 + 0,1% Tx-100. Przy każdym myciu odwrócić probówkę 2-5 razy, aby resuspendować kulki, a następnie wirwić przy 1000 x g przez 1 min w 4 °C. Na koniec przemyć 1x w RSB-100 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl2) + 0,1% Tx-100.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Elucja peptydem FLAG: Eluować kompleks HAT1 w 1,5 mL buforu do elucji (EB) zawierającego 0,5 mg/mL peptydu FLAG. Inkubować w 4 °C przez co najmniej 1 h lub przez noc. Odwirować krótko eluowane kulki przy 1000 x g przez 30 s w 4 °C i zebrać nadsącz, który zawiera oczyszczony kompleks HAT1/Rbap46.</li>
		<li>Skoncentrować białko i usunąć peptyd FLAG.
		<ol>
			<li>Przenieść eluat do probówki z filtrem o odcięciu 10 000 Daltonów i pojemności 20 mL. Uzupełnić objętość do 15 mL buforem EB. Wirować przy 2500 x g przez 15 min w 4 °C, powtarzając czynność dwukrotnie z dodatkowymi 15 mL EB za każdym razem.</li>
			<li>Odzyskać końcowy eluat z probówki z filtrem i sprawdzić stężenie białka za pomocą A260. Przewidywane stężenie to 1 mg całkowitego białka w 6 mL EB (na 300 mL hodowli początkowej). Sprawdzić czystość białka za pomocą SDS-PAGE, barwienia Coomassie i immunoblottingu, a następnie przechowywać aliquoty w -80 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Metoda 2: Krzywa wzorcowa acetyl-click dla HAT1
<ol>
	<li>Przygotowanie krzywej standardowej
	<ol>
		<li>Zsyntetyzować peptyd dodatniej kontroli N-końcowej histonu H4 o sekwencji: SCRG[Pra]GGKGLG[Pra]GGAKRHRKVLRGG[Lys(Biotin)], gdzie [Pra] oznacza propargyloglicynę.</li>
		<li>Resuspendować peptyd Pra do stężenia 0,1 mg/mL w DMSO. Wymieszać peptyd Pra z biotynilowanym peptydem histonu H4 (1-23-GGK-biotin) w celu utworzenia krzywej standardowej (Rycina 2; objętości podano w Tabeli 1). Krzywe standardowe można przygotować bezpośrednio przed wiązaniem na płytce lub, jeśli zostaną przygotowane wcześniej, wymieszać z 20 µL 8 M mocznika i przechowywać w temperaturze -20 °C do etapu 3.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Metoda 3: Analiza acetyl-click HAT1
<ol>
	<li>Przygotowanie reakcji acetylacji z inhibitorami testowymi
	<ol>
		<li>Przygotować reakcje acetylacji w dubletach w probówkach PCR 0,2 mL lub 96-dołkowych płytkach PCR z następujących składników: biotynilowanego peptydu histony H4 (1-23-GGK-biotin) resuspenderowanego w DMSO do stężenia 0,1 mg/mL (34,8 µM), enzymu HAT1 uprzednio rozcieńczonego w EB, buforu 20x (1M Tris pH 8,5, 0,1% NP40), 2 mM DTT oraz 4-pentynoilu-CoA rozpuszczonego w wodzie do stężenia 1 mg/mL (1 mM). Reakcja o objętości 20 µL obejmuje 10 µL enzymu, 1 µL peptydu H4, 1 µL buforu 20x oraz 1 µL DTT, które należy wcześniej wymieszać i rozdzielić do dołków 96-dołkowej płytki PCR na lodzie.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 1 µL DMSO (kontrola negatywna), związku testowego rozpuszczonego w stężeniu 1-10 µM lub H4K12CoA25 (lub odpowiedniego inhibitora jako kontroli pozytywnej). Wymieszać delikatnie pipetując i inkubować przez 10 min na lodzie, aby umożliwić utworzenie kompleksów enzym-inhibitor.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuacja reakcji acetylacji
	<ol>
		<li>Połączyć 2 µL 4-pentynoilu-CoA z 4 µL wody, a następnie dodać do dołków. Delikatnie wymieszać pipetując, wirować z prędkością 300 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej (RT), aby zebrać zawartość, i inkubować w 37 °C przez 1 h w zamkniętych probówkach lub płytkach z folią uszczelniającą.</li>
		<li>Zawartość można poddać bezpośredniej analizie w celu oznaczenia produktów reakcji lub zgasić reakcję, dodając 20 µL 8 M mocznika, i przechowywać w -20 °C do czasu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiązanie peptydu z płytką Neutravidin
	<ol>
		<li>Zawartość reakcji (z mocznikiem lub bez) przenieść na czarne 96-dołkowe płytki pokryte Neutravidyną, uprzednio zablokowane albuminą surowicy bydlęcej (BSA), zawierające 80 µL PBST (PBS + 0,1% Tween-20) na dołek.</li>
		<li>Peptydy krzywej wzorcowej dodać w dubletach do osobnych dołków zawierających 80 µL PBST. Wiązanie peptydów przeprowadzić przy delikatnym wstrząsaniu orbitalnym przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemywanie: Po zakończeniu wiązania odessać ciecz z dołków i przemyć je 200 µL PBST, wykonując 3x 15 cykli przemywania (objętość jednego cyklu 180 µL) przy użyciu myjki do płytek.</li>
	<li>Reakcja chemii klik (click chemistry)
	<ol>
		<li>Przygotować odczynniki do reakcji klik w następujący sposób: ligand THPTA (tris(3-hydroksypropyltriazolometyl)amina) 100 mM w wodzie oraz CuSO4 20 mM w wodzie. THPTA zapobiega hydrolizie katalizowanej przez Cu(II) oraz gasi rodniki i nadtlenki generowane z O2/Cu/askorbinianu.</li>
		<li>Mieszaninę THPTA/Cu dodać do 300 mM askorbinianu sodu w wodzie oraz 2,5 mM azotku biotyny w DMSO. Jedna reakcja klik zawiera 140 µL PBS, 10 µL THPTA, 10 µL CuSO4, 10 µL askorbinianu sodu oraz 20 µL azotku biotyny. Odczynniki do reakcji klik należy zawsze mieszać bezpośrednio przed użyciem, następnie dozować 190 µL do każdego dołka, uszczelnić płytkę i inkubować w 37°C przez 1 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemywanie: Odessać ciecz z dołków i przemyć płytkę 3x PBST (objętość cyklu 180 µL, 15 cykli dla każdego przemycia).</li>
	<li>Wiązanie streptawidyny-peroksydazy chrzanowej: Rozcieńczyć streptawidynę-HRP (0,224 mg/mL) 1:10 w streptawidynie (0,224 mg/mL), a następnie dalej rozcieńczyć 1:1000 w PBST. Dodać mieszaninę streptawidyny-HRP:streptawidyny (100 µL na dołek) i inkubować w RT przez 1 h przy delikatnym wstrząsaniu orbitalnym.</li>
	<li>Przemyć 3x PBST, analogicznie jak w poprzednich krokach.</li>
	<li>Utlenianie Amplex Red
	<ol>
		<li>Przygotować odczynniki detekcyjne Amplex Red w następujący sposób: 4,45 mL buforu NaHPO4 (stężenie końcowe 1x = 50 mM), 50 µL Amplex Red (20 mM rozcieńczone w DMSO), 500 µL rozcieńczonego H2O2.</li>
		<li>Rozcieńczyć H2O2 ze stężenia zapasowego 30% do 3% w buforze NaHPO4 1x, a następnie dodać 22,7 µL 3% H2O2 do 977 µL buforu NaHPO4 1x (jest to H2O2 stosowany w reakcji z Amplex Red). Do każdego dołka dodać 100 µL mieszaniny reakcyjnej Amplex Red, inkubować w RT przez 30 min w ciemności, a następnie zmierzyć fluorescencję (wzbudzenie/emisja 571/585 nm) przy użyciu standardowego czytnika płytek fluorescencyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczenie inhibicji enzymu: Obliczyć procent inhibicji (Rycina 3) zgodnie z następującym wzorem: <img alt="Wzór na wydajność chromatografii \( \frac{D-X}{D-BG} \times 100 \); metoda analizy danych." src="/files/ftp_upload/66054/66054eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">, gdzie D to wartość fluorescencji reakcji kontrolnych traktowanych samym DMSO, X to wartość reakcji traktowanych związkami testowymi, a BG to wartość dołków tła (kontrola peptydu H4, bez dodatku enzymu).</li>
	<li>Krzywa dawek: Wybrać związki testowe, które wykazują inhibicję aktywności enzymu HAT1, do powtórnych analiz z zastosowaniem rozcieńczeń szeregowych związku. Rozcieńczenia związku ustalić empirycznie. Na przykład: zacząć od stężenia zapasowego 2 mM, a następnie wykonać rozcieńczenia szeregowe 1:3 dla ośmiu rozcieńczeń. Następnie rozcieńczyć 1:20 w analizach enzymatycznych, co da najwyższą dawkę 100 µM.
	<ol>
		<li>Wykreślenie krzywej: Użyć regresji najmniejszych kwadratów do dopasowania krzywych inhibicji zależnej od dawki (wykorzystując wartości procentowej inhibicji z kroku 3.10) w oprogramowaniu do analizy danych (GraphPad Prism) i wyznaczyć wartości IC50 dla każdego związku (Rycina 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja acetylacji z acetylo-CoA:
	<ol>
		<li>Użyć tej metody do potwierdzenia aktywności enzymu z naturalnym kofaktorem acetylo-CoA zamiast 4-pentynoilu-CoA. Przeprowadzić analizy acetylacji HAT1 zgodnie z opisem w krokach 3.1-3.2, stosując acetylo-CoA zamiast 4-pentynoilu-CoA.</li>
		<li>Nanieść produkty reakcji na membrany nitrocelulozowe (1-2 µL), pozostawić do wyschnięcia, a następnie wykonać dot-blot z przeciwciałami przeciwko acetylowanej lizynie-12 H4 lub acetylowanej lizynie-5 H4. Ilość sygnału immunoblottu określić densytometrycznie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Development of a Click-Based Assay for Screening HAT1 Enzyme Activity

<ol><li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li>
<li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast%3A+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li>
<li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li>
<li>Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+1%3A+more+than+just+an+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).</li>
<li>Gruber, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li>
<li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47(2019).</li>
<li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967(2021).</li>
<li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li>
<li>Campos, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+program+for+processing+newly+synthesized+histones+H3.1+and+H4%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).</li>
<li>Agudelo Garcia, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+roles+for+histone+acetyltransferase+1+in+replication-coupled+chromatin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly.</a> Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).</li>
<li>Nagarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyl+transferase+1+is+essential+for+mammalian+development%2C+genome+stability%2C+and+the+processing+of+newly+synthesized+histones+H3+and+H4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003518(2013).</li>
<li>Annunziato, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembling+chromatin%3A+the+long+and+winding+road%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Assembling chromatin: the long and winding road.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).</li>
<li>Annunziato, A. T., Seale, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylation+is+required+for+the+maturation+of+newly+replicated+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin.</a> J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).</li>
<li>Dahlin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+interference+and+off-target+liabilities+of+reported+histone+acetyltransferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors.</a> Nat Commun. 8 (1), 1527(2017).</li>
<li>Baell, J. B., Miao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+inhibitors%3A+where+art+thou%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou.</a> Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).</li>
<li>Lasko, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+selective+catalytic+p300%2FCBP+inhibitor+that+targets+lineage-specific+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours.</a> Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).</li>
<li>Baell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+histone+acetyltransferases+KAT6A%2FB+induce+senescence+and+arrest+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth.</a> Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).</li>
<li>Falk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+high-throughput+screening+method+for+MYST+family+acetyltransferases%2C+a+new+class+of+epigenetic+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets.</a> J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).</li>
<li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+biology+approaches+for+investigating+the+functions+of+lysine+acetyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).</li>
<li>Lipchik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide-based+biosensor+assay+to+detect+intracellular+Syk+kinase+activation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition.</a> Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoproteomic+profiling+of+protein+substrates+of+a+major+lysine+acetyltransferase+in+the+native+cellular+context%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context.</a> ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).</li>
<li>Gaddameedi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-click+screening+platform+identifies+small-molecule+inhibitors+of+histone+acetyltransferase+1+%28HAT1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).</li>
<li>Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisubstrate+inhibitors+to+target+histone+acetyltransferase+1+%28HAT1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).</li>
<li>Parker, C. G., Pratt, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+in+proteomic+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Click chemistry in proteomic investigations.</a> Cell. 180 (4), 605-632 (2020).</li>
<li>Islam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bump-and-hole+tactic%3A+Expanding+the+scope+of+chemical+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics.</a> Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).</li>
<li>Radziwon, K., Weeks, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+for+selective+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering for selective proteomics.</a> Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2007+commercial+optical+biosensor+literature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature.</a> J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).</li>
</ol>

Złożyliśmy wnioski patentowe opisujące test HAT1 acetyl-click (PCT/US20/29395). J.J.G. informuje o umowach konsultingowych z Sharma Therapeutics, LLC i Guidepoint oraz o wsparciu badawczym (dla swojej instytucji) ze strony Hummingbird Biosciences.

W ciągu ostatniej dekady chemia kliknięć stała się popularna20, umożliwiając precyzyjne projektowanie oddziałujących ze sobą struktur chemicznych. W tym kontekście, różne bioortogonalne połączenia kowalencyjne21 okazały się obiecującymi opcjami tworzenia kompleksów w ich naturalnym środowisku. Chemia kliknięć wykorzystuje pary grup funkcyjnych, które wykazują szybkie i selektywne reakcje, powszechnie znane jako "reakcje kliknięcia". Reakcje te zachodzą efektywnie w przyjaznych dla środowiska, łagodnych warunkach wodnych. W niniejszej pracy przedstawiono rozwój platformy przeznaczonej do identyfikacji i charakterystyki aktywności acetylotransferazy HAT124. Platforma ta wykorzystuje wysokoprzepustowy test enzymatyczny oparty na peptydach, który jest możliwy dzięki chemii kliknięć.
Jedną z kluczowych zalet tego testu jest to, że opiera się on na ludzkim kompleksie enzymatycznym HAT1/Rbap46 uzyskanym z oczyszczania komórek ludzkich, a nie na źródle bakteryjnym. Co więcej, metoda ta bezpośrednio mierzy aktywność enzymatyczną na substracie peptydowym, eliminując potrzebę sprzężonych reakcji, które mogą być podatne na niespecyficzne hamowanie. Chociaż dostępne są metody oparte na przeciwciałach do oceny aktywności enzymu21, test acetylo-klikowy oferuje wyraźne korzyści, unikając zmienności biologicznej i kosztów związanych z przeciwciałami. Co więcej, z powodzeniem przetestowaliśmy jego wysoką przepustowość na płytkach 96-dołkowych, dzięki czemu możliwe jest przeprowadzanie rozległych badań przesiewowych chemicznych. Podejście oparte na chemii kliknięć można prawdopodobnie zaadaptować do stosowania również z innymi acetylotransferazami. Na przykład rekombinowane acetylotransferazy mogą być inkubowane z innymi peptydami histonowymi, które naśladują swoje naturalne substraty w połączeniu z 4-pentynoylo-CoA w celu indukowania acylacji peptydów. Następnie można szybko dostosować kolejne etapy testu wiązania peptydów, funkcjonalizacji i utleniania czerwieni ampleksu. Należy dołożyć starań, aby zaprojektować odpowiednie kontrole dodatnie i ujemne dla krzywych wzorcowych, aby umożliwić ilościowe oznaczenie.
Należy pamiętać o pewnych ograniczeniach testu. Po pierwsze, chociaż protokół ten został zoptymalizowany pod kątem HAT1, nie wszystkie acetylotransferazy mogą akceptować pentynoylo-CoA jako mimetyk acetylo-CoA. W związku z tym można rozważyć opracowanie dodatkowych cząsteczek donorowych acylu26 lub może być wymagana mutageneza kieszeni katalitycznej, aby umożliwić akceptację kofaktorów kompatybilnych z klikaniem27,28. Po drugie, ponieważ powinowactwo do kofaktorów opartych na kliknięciach może różnić się od naturalnego kofaktora, zaleca się stosowanie wtórnych testów kontrolnych w celu potwierdzenia wyników, na przykład wykrywania opartego na przeciwciałach (patrz krok 3.12). Na koniec należy wykonać dodatkowe potwierdzające testy enzymatyczne, biofizyczne i komórkowe w celu potwierdzenia wyników. Wiązanie małych cząsteczek z kompleksami białkowymi można potwierdzić za pomocą przyrządów mierzących powierzchniowy rezonans plazmonowy, na przykład29.
Istnieje kilka krytycznych kroków, na które należy zwrócić uwagę, aby test przebiegał sprawnie, a odpowiednie wyniki były dokładne. Wykładniczy wzrost komórek 293f powinien być widoczny przed i po transfekcji DNA, aby osiągnąć dobrą ekspresję białka. Należy zastosować plazmidy, które dają wysoką ekspresję białka w przejściowych systemach transfekcji, na przykład stosowany tutaj plazmid pHEK-293. Enzym HAT1 jest aktywowany przez forskolinę w tym protokole, ale podobne wyniki osiągnięto w przypadku orthovanadate, co sugeruje, że modyfikacje potranslacyjne są niezbędne dla aktywności HAT1. Zaobserwowaliśmy, że oczyszczone preparaty enzymatyczne HAT1/Rbap46 są stosunkowo stabilne i mogą przetrwać cykle zamrażania/rozmrażania bez utraty aktywności enzymatycznej. Zalecamy jednak zamrażanie podwielokrotności enzymów w niewielkich ilościach. Zazwyczaj nie używamy enzymów po więcej niż jednym cyklu zamrażania/rozmrażania.
Podczas testu acetylu kliknięć ważne jest, aby zawsze uwzględniać potrójne reakcje kontrolne: reakcje traktowane DMSO służą jako kontrole negatywne, a reakcje traktowane H4K12CoA służą odpowiednio jako kontrole pozytywne dla hamowania enzymu. Wartości fluorescencji reakcji enzymatycznej poddanej działaniu DMSO powinny mieścić się na liniowej krzywej wzorcowej między 25 a 50 % dodatnim peptydem Pra, aby uniknąć nasycenia sygnału. Może to wymagać starannego miareczkowania ilości enzymu HAT1/Rbap46 w reakcjach kontrolnych przed badaniem leków. Na przykład enzym HAT1 / Rbap46 można rozcieńczyć w stosunku 1:1, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:75 i 1:100 w EB, a następnie użyć w reakcjach acetylu w celu określenia ilości enzymu wymaganej do wygenerowania sygnału w zakresie 25%-50% peptydu Pra. Odkryliśmy, że enzym 100 nM jest zazwyczaj wystarczający, ale powinien być określany empirycznie dla każdego nowego preparatu enzymu. Celem mieszania streptawidyny-HRP ze streptawidyną jest zmniejszenie sygnału utleniania ampleksu. Rozcieńczenie streptawidyny można dostosować do sygnału wyjściowego w zależności od potrzeb. Jeśli generowany jest szybki sygnał, może być konieczne odczytanie tabliczki przed upływem 30 minut, aby uniknąć nasycenia sygnału. Podczas wstępnej optymalizacji testu sugerujemy odczyt po 5 minutach, 15 minutach i 30 minutach. Odczyty szeregowe mogą być wykonywane bez wpływu na sygnał. Jeśli test jest dobrze skalibrowany, czerwone sygnały amppleksu generowane między 5 minutami a 30 minutami powinny skalować się liniowo.

Wśród licznych eukariotycznych acetylotransferaz, HAT1 był początkową acetylotransferazą histonową, która miała zostać wyizolowana1,2,3. Późniejsze badania mocno ustaliły jego kluczową rolę w replikacji chromatyny, szczególnie w syntezie nowych nukleosomów podczas fazy S4. Nasze wysiłki badawcze doprowadziły do uznania, że HAT1 jest silnie stymulowany przez leczenie naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF) w komórkach sutkowych5. Co więcej, wyszło na jaw, że HAT1 jest wymagany do szybkiej proliferacji komórek i tworzenia nowotworów in vivo6,7,8,9. Dane wskazują, że HAT1 ma kluczowe znaczenie w koordynowaniu procesów anabolicznych i epigenetycznych w celu podziału komórek, napędzając wzrost guza.
HAT1 di-acetyluje amino-końcowy ogon histonu H4 na lizynach 5 i 12 w kompleksie z białkiem opiekuńczym Rbap46, które wiąże histon i przedstawia aminokoniec HAT1. Tetramery lub disomy histonów10, wraz z HAT1/Rbap46 i innymi chaperonami histonów11, są następnie importowane do jądra. Histony są następnie uwalniane w celu zdeponowania w widełkach replikacyjnych lub innych miejscach w celu wsparcia aktywacji lub represji genów. Funkcja znacznika diacetylacji HAT1 na histonie H4 nie jest w pełni poznana. Prawdopodobnie jest szybko usuwany w ciągu 15-30 minut przez działanie deacetylaz histonowych12,13,14,15 po wprowadzeniu H4 do chromatyny. Tak więc znak di-acetylacji HAT1 nie jest propagowany w chromatynie i może nie pełnić prawdziwej roli epigenetycznej, chociaż postuluje się rolę w rekrutacji enzymów modyfikujących chromatynę do powstającej chromatyny12. Ponadto HAT1 nie acetyluje bezpośrednio chromatyny; Jego aktywność jest ograniczona do rozpuszczalnych histonów.
Rozwój małocząsteczkowych inhibitorów acetylotransferazy histonowej został zahamowany przez niespecyficzne i niskoprzepustowe testy, często skutkujące generowaniem biologicznie reaktywnych związków16,17. Złoty standard testu do pomiaru aktywności acetylotransferazy wymaga użycia 3H-acetylo-coA, który ogranicza przepustowość i wymaga promieniowania. Niemniej jednak ostatnio opisano i potwierdzono specyficzne i bardzo silne małocząsteczkowe inhibitory acetylotransferazy ukierunkowane na CBP/p30018 i KAT6A/B19,20 poprzez zastosowanie 3H-acetylo-CoA. Idąc dalej, opracowywane są ulepszone testy, aby osiągnąć lepszą przepustowość i uniknąć zagrożeń laboratoryjnych.
Ostatnie postępy w monitorowaniu acetylacji21 wykorzystały chemię kliknięć, aby umożliwić monitorowanie reakcji enzymatycznych. Istnieje wiele prekursorów z obsługą kliknięć, które są dostępne za pomocą prostych ścieżek syntezy lub można je kupić, które można włączyć do reakcji enzymatycznych. Reakcje te są zwykle przeprowadzane w układach rekombinowanych, chociaż możliwe są również testy oparte na komórkach22. Zaletą kofaktorów i substratów z obsługą kliknięć jest to, że badania przesiewowe mogą bezpośrednio mierzyć aktywność enzymów bez konieczności stosowania sprzężonych systemów odczytu, które często są zaburzone przez związki przesiewowe i wymagają dodatkowych czynności związanych z obsługą. Pozwala to na leczenie inhibitorami tylko na etapie enzymatycznym, podczas gdy wszystkie dalsze etapy funkcjonalizacji i wykrywania są przeprowadzane po intensywnym myciu w celu usunięcia związków, ograniczając w ten sposób możliwość wystąpienia zakłóceń testu. Te zalety sprawiają, że projektowanie testów z obsługą kliknięcia jest lepsze niż testy sprzężone, które zwykle opierają się na wykrywaniu wolnego koenzymu A.
Jedną z ważnych kwestii jest akceptacja kofaktorów z włączonym kliknięciem do miejsca aktywnego enzymu. Istniejące współfaktory z włączoną obsługą kliknięć mogą nie być w pełni zgodne z aktywną witryną zoptymalizowaną pod kątem natywnego współfaktora. Informacje strukturalne i modelowanie mogą być wykorzystane do projektowania podstawień aminokwasów w celu powiększenia miejsca aktywnego w celu uwzględnienia zmienionych substratów23. Może to umożliwić badania przesiewowe z lepszą kinetyką enzymów i niższymi poziomami substratów i enzymów. Wadą tego podejścia jest to, że zmienione kieszenie katalityczne mogą nie identyfikować inhibitorów, które silnie oddziałują z enzymem natywnym. Ostatecznie konieczne jest połączenie różnych podejść w celu zidentyfikowania i walidacji potencjalnych inhibitorów enzymów.
Tutaj opisujemy metodę opracowaną do oczyszczania i oznaczania aktywności enzymu HAT1 za pomocą kofaktora 4-pentynoylo-CoA24. Ten test (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) wykorzystuje natywną sekwencję enzymu w kompleksie z wymaganym białkiem partnerskim Rbap46, które, jak wykazano, zwiększa aktywność enzymu. Oczyszczanie enzymu z komórek ludzkich pozwala na aktywację enzymu w celuli, co może zachować stymulujące modyfikacje potranslacyjne ważne dla pełnej aktywności enzymu. Projektowanie i optymalizacja rekombinowanych testów enzymatycznych dla wysokoprzepustowych chemicznych badań przesiewowych została z powodzeniem wykorzystana do identyfikacji i scharakteryzowania małocząsteczkowych inhibitorów HAT1.

<table><tbody><tr><td>4P CoA</td><td>Cayman Chemical</td><td>10547</td><td>Kliknij kofaktor chemiczny</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Fisher Sci</td><td>A12222</td><td>Podłoże fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Biotyna-PEG-Azydek</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64996MC</td><td>Kliknij chemia</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 7758-98-7</td><td>Kliknij chemia</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 67-68-5</td><td>Rozcieńczalnik</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Acros Organics</td><td>03-12-3483</td> środek <td>redukujący</td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>VWR</td><td>102987-310</td><td>Ekspresja</td></tr><tr><td>białka Freestyle 293 Expression Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>12338018</td><td>Media</td></tr><tr><td>Ogniwa Freestyle 293-F</td><td>Thermo Fisher</td><td>R790-07</td><td>Ekspresja białka</td></tr><tr><td>H4-peptyd/1-23-GGK-biotyna</td><td>Anaspec</td><td>AS65097</td><td>substrat peptydowy</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 7365-45-9</td><td>EB Bufor</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30% roztwór</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; Z00183-99-0</td><td>inicjator</td></tr><tr><td>Gnojowica przeciwciał M2 FLAG</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A2220</td><td>Oczyszczanie białek</td></tr><tr><td>Filtr Macrosep 10K (Pall Lab)</td><td>VWR</td><td>89131-980</td><td>Oczyszczanie białek</td></tr><tr><td>Płytka neutrawidyny</td><td>Thermo Sci</td><td>15127</td><td>BSA-wstępnie zablokowany</td></tr><tr><td>NP40 (IGEPAL)</td><td>MP Biomedical</td><td>198596</td><td>20x bufor</td></tr><tr><td>plazmid pHEK-293</td><td>Takara Bio</td><td>3390</td><td>Ekspresja białka</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem 10x</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp; Z00082-33-6</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>myjący Peptyd Pra</td><td>Genscript</td><td>Niestandardowa synteza</td><td>biotynylowany</td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 134-03-2</td><td>Kliknij chemia</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 7647-14-5</td><td>EB Bufor</td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>VWR International</td><td>7558-80-7</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>EMD Milipore</td><td>189730</td><td>konkurent</td></tr><tr><td>Streptawidyna-HRP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>Enzym 3999S</td><td></td></tr><tr><td>Ligand THPTA</td><td>Fisher Sci</td><td>1010-500</td><td>Kliknij chemia</td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 77-86-1</td><td>20x zderzak</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 9002-93-1</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>EB Tween-20</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 9005-64-5</td><td>Bufor płuczący</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-13-6</td><td></td></tr></tbody></table>

test chemiczny acetyl-click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, znany również jako acetylotransferaza histonowa 1, odgrywa kluczową rolę w syntezie chromatyny poprzez stabilizację i acetylację powstającego H4 przed złożeniem nukleosomów. Jest niezbędny do wzrostu guza w różnych układach, co czyni go potencjalnym celem leczenia raka. Aby ułatwić identyfikację związków, które mogą hamować aktywność enzymatyczną HAT1, opracowaliśmy test acetylowo-klikowy do szybkich badań przesiewowych. W tym prostym teście stosujemy rekombinowany HAT1 / Rbap46, który jest oczyszczany z aktywowanych komórek ludzkich. Metoda wykorzystuje analog acetylo-CoA 4-pentynoylo-CoA (4P) w podejściu chemii kliknięć. Polega to na enzymatycznym przenoszeniu uchwytu alkinowego przez zależną od HAT1 reakcję acylacji do biotynylowanego N-końcowego peptydu H4. Wychwycony peptyd jest następnie unieruchamiany na płytkach neutrawidyny, a następnie następuje funkcjonalizacja chemiczna za pomocą azydku biotyny. Następnie rekrutacja streptawidyny-peroksydazy jest wykorzystywana do utleniania czerwieni amplex, co daje ilościową produkcję fluorescencyjną. Wprowadzając inhibitory chemiczne podczas reakcji acylacji, możemy określić ilościowo hamowanie enzymatyczne w oparciu o redukcję sygnału fluorescencji. Co ważne, reakcja ta jest skalowalna, co pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe potencjalnych inhibitorów aktywności enzymatycznej HAT1.

Na każdej płytce należy umieścić krzywe wzorcowe w dubletach (16 dołków), aby zapewnić prawidłowe działanie testu. Dane krzywej wzorcowej powinny zostać zestawione w formie tabeli, z zakresem od 100% do 0% zgodnie ze stosunkiem peptydu zawierającego Pra do natywnego peptydu H4 w roztworze (Tabela 1). Sygnał Amplex red będzie najwyższy w dołkach z 100% pra/0% natywnego peptydu H4, a najniższy w dołkach z 0% pra/100% natywnego peptydu H4. Po detekcji fluorescencji i obliczeniu średnich dla dołków, otrzymany wykres wzorców powinien odpowiadać linii prostej (Rysunek 2), choć przy stężeniach Pra powyżej 50% może być obserwowana saturacja sygnału. Nieprawidłowe zmieszanie Pra z peptydami kontrolnymi H4 może skutkować słabym lub brakiem sygnału Amplex red bądź nieliniowymi zmianami sygnału Amplex red w zakresie 0-50% Pra. Prawidłowy sygnał i wyniki krzywej wskazują, że reakcja chemii klik (click chemistry) zaszła pomyślnie, a dane mogą zostać odpowiednio przeanalizowane.
Ważne jest, aby zawsze uwzględniać reakcje kontrolne w trzech powtórzeniach: reakcje traktowane DMSO służą jako kontrole negatywne, a reakcje traktowane H4K12CoA jako kontrole pozytywne dla inhibicji enzymu. Powinny być one obecne na każdej płytce, aby zapewnić wysoką wiarygodność testu i umożliwić obliczenie procentu inhibicji. Dołki kontroli pozytywnej zawierające 1 µM H4K12CoA powinny wykazywać niski sygnał amplex red, podobny do sygnału w dołkach z 0% Pra/100% peptydu H4. Dołki kontroli negatywnej zawierające DMSO powinny wykazywać sygnał zbliżony do fluorescencji w dołkach z 50% Pra/50% peptydu H4. Dołki z badanym związkiem będą wykazywać zróżnicowany sygnał amplex. Należy wyciągnąć średnią z powtórzeń (dubletów lub tripletów), aby uzyskać średnią wartość sygnału wraz z błędem standardowym.
Oblicz inhibicję enzymu za pomocą powyższego wzoru, gdzie D to sygnał fluorescencyjny dla DMSO, X to sygnał eksperymentalny, a BG to sygnał z peptydy H4 bez enzymu lub z dołka 0% na krzywej wzorcowej. Sygnał fluorescencyjny z reakcji z badanym związkiem będzie niższy niż dla DMSO, jeśli badany związek hamuje aktywność enzymu, co skutkuje dodatnimi wartościami procentowymi inhibicji. Przeciwny efekt będzie obserwowany w reakcjach, w których nie wystąpiła inhibicja enzymu. Przykładowe dane dla badanych związków przesiewanych w dwóch stężeniach (1 µM i 10 µM) przedstawiono na Rysunku 3. Za pomocą tego testu można również badać rozcieńczenia seryjne związków, co pozwala na wyznaczenie wartości IC50 związku poprzez nieliniowe dopasowanie krzywej do danych (Rysunek 4).
<img alt="Schemat acylacji peptydu histony H4, reakcji click biotyna-azydkowa, płytki z neutrawidyną oraz testu Amplex Red." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat chemii click dla acetylacji/acylacji przez HAT1. Reakcja click acetylacji HAT1 zachodzi z udziałem oczyszczonego białka HAT1 i Rbap46 w roztworze z biotynilowanym peptydem histony H4, 4-pentynoylo-CoA oraz badanymi związkami. Po zakończeniu reakcji roztwór jest wiązany do płytki powlekanej neutrawidyną, a następnie przeprowadzana jest chemia click z użyciem siarczanu miedzi i biotyny-azydku. Końcowe dodanie streptawidyny-HRP i Amplex Red skutkuje emisją czerwonej fluorescencji. Porównanie intensywności fluorescencji Amplex Red pozwala określić aktywność acetylacji HAT1. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Gaddameedi i wsp.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres krzywej standardowej; fluorescencja vs. miareczkowanie peptydów; R²=0.95; metoda analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład krzywej standardowej. Po obliczeniu średnich wartości krzywej standardowej dla każdej pary, należy nanieść średnie ± SEM w funkcji procentowej zawartości peptydu Pra w kontroli pozytywnej. Otrzymana krzywa powinna przypominać krzywą przedstawioną na rysunku i być dopasowana do linii liniowej. Granica wykrywalności (LOD) dla tego testu wynosi 1,8% ± 0,89%, a granica oznaczalności (LOQ) 5,4% ± 3,1%24. Krzywa standardowa może ulec nasyceniu dla wartości Pra &gt;50%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza inhibicji związków; wykres; związki A-G; stężenia 10 μM, 1 μM; % inhibicji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Testowanie nowych związków w trzech powtórzeniach. Do oceny aktywności inhibicyjnej nowo zsyntetyzowanych związków wykorzystano test acetyl-click. Związki rozcieńczono do stężeń 10 µM oraz 1 µM i przetestowano w trzech powtórzeniach, z zaznaczoną medianą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres krzywej zależności dawka-odpowiedź, % inhibicji w funkcji stężenia leku, analiza statystyczna, wyznaczanie IC50." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Rozcieńczenia szeregowe testowanych związków w teście acetyl click dla HAT1. Związki rozcieńczono w zakresie od 100 µM do 0,01 µM i przetestowano w dwóch powtórzeniach. Wynikowe krzywe dawka-odpowiedź wykazują, że związki A i C hamują aktywność HAT1 w blisko 100% dla kilku rozcieńczeń. Dane wykorzystano następnie do obliczenia IC50 związków, które zostaną użyte w dalszych eksperymentach. Dane przedstawiają średnią ± SEM z dwóch powtórzeń eksperymentu. Wartości R2 dla dopasowań nieliniowych wynoszą odpowiednio 0,84, 0,78 i 0,94 dla związków A, B i C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>% Kontrola pozytywna </td>
			<td>Peptyd kontroli pozytywnej [2,5 reakcji] „pra” rozcieńczony do stężenia 0,1 mg/ml w DMSO (zawierający alkin)</td>
			<td>Peptyd H4 [2,5 reakcji] rozcieńczony do stężenia 0,1 mg/ml w DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 </td>
			<td>2.5 µL </td>
			<td>- </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 </td>
			<td>1.875 µL  </td>
			<td>0.625 µL </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 </td>
			<td>1.25 µL  </td>
			<td>1.25 µL  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 </td>
			<td>0.625 µL  </td>
			<td>1.875 µL  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 </td>
			<td>1 µL  </td>
			<td>9 µL  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 </td>
			<td>1.25 µL  (w stosunku 1:10) </td>
			<td>1.25 µL  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 </td>
			<td>1 µL  (w stosunku 1:10) </td>
			<td>9 µL  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 </td>
			<td>- </td>
			<td>2.5 µL  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>8.5 µL  </td>
			<td>25.5 µL  </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Rozcieńczenie peptydu kontrolnego Pra względem peptydu H4. Stosunki peptydu kontroli pozytywnej „Pra” do peptydu H4 wykorzystywane do stworzenia krzywej wzorcowej. Po początkowym zawieszeniu zapasu Pra w stężeniu 4 mg/mL w DMSO, należy go rozcieńczyć 1:40 w DMSO do stężenia końcowego 0,1 mg/mL. Biotynilowany peptyd H4 musi zostać również rozcieńczony do 0,1 mg/mL (34,8 µM) w DMSO. Następnie każdy peptyd należy ze sobą zmieszać w podanych proporcjach. Każdy wzorzec zostanie naniesiony w duplikacie na płytkę 96-dołkową. Wartości fluorescencji należy uśrednić w celu stworzenia krzywej wzorcowej.

Szybkie i dokładne testy chemiczne do badań przesiewowych pod kątem określonych inhibitorów są ważnym narzędziem w arsenale rozwoju leków. Tutaj przedstawiamy skalowalny test chemiczny acetylu do pomiaru hamowania aktywności acetylacji HAT1.

Test chemiczny Acetyl-Click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Opracowany przez nas test acetyl-click służy jako narzędzie do oceny aktywności acetylotransferazy HAT1, która ma kluczowe znaczenie w izolowaniu histonów H4 przed włączeniem nukleosomów. Naszym celem jest wykorzystanie tej metody do wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych przeciwko enzymowi HAT1. Metoda ta mierzy aktywność enzymatyczną bezpośrednio na substracie peptydowym.Daje to korzyści w porównaniu z innymi testami enzymatycznymi, unikając zmienności biologicznej i kosztów związanych z przeciwciałami. Jest to również wysoka przepustowość i może być dostosowana do stosowania z innymi acetylotransferazami. Niedawno opublikowaliśmy małocząsteczkowy inhibitor HAT1 oparty na tym teście, który ma aktywność w komórkach i zwierzętach.Nadal używamy tego testu do badania przesiewowego dodatkowych bibliotek chemicznych i wykonywania zależności między aktywnością struktury. Rozwijamy metody śledzenia produkcji histonów, fałdowania, opiekuńczości i integracji chromatyny. Uwypukla to potrzebę udoskonalenia narzędzi chemicznych w celu badania mechanizmów biologicznych i stymulowania odkrywania leków.Naszym celem jest wykazanie, że celowanie w produkcję histonów może przynieść korzyści terapeutyczne w przypadku chorób takich jak rak.

an-acetyl-click-chemistry-assay-to-measure-histone-acetyltransferase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Ten protokół opisuje wymagane kroki do przeprowadzenia testów deacetylacji in vitro i in vivo w celu ustalenia roli białek jako specyficznych substratów deacetylacji dla sirtuin i dalszego badania roli odwracalnej acetylacji lizyny jako modyfikacji potranslacyjnej.

Testy deacetylacji w celu rozwikłania wzajemnych zależności między sirtuinami (SIRT2) a specyficznymi substratami białkowymi

Obecna metoda służy do identyfikacji specyficznych dla izoform inhibitorów deacetylaz histonowych (HDAC) w komórkach HeLa za pomocą analizy UHPLC-MS wielu substratów. Jest to metoda wolna od przeciwciał opracowana w celu odzwierciedlenia aktywności HDAC1 i HDAC6 w środowisku żywych komórek, w przeciwieństwie do testów bezkomórkowych z pojedynczymi izoformami.

Jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego, systematycznego przewodnika po skutecznym oczyszczaniu histonów H3 i H4 oraz kwantyfikacji reszt acetylowanych histonów.

Oczyszczanie białek histonów H3 i H4 oraz oznaczanie ilościowe acetylowanych śladów histonów w komórkach i tkance mózgowej

Deacetylazy histonowe klasy 1 (HDAC), takie jak RpdA, zyskały na znaczeniu jako potencjalne cele w leczeniu infekcji grzybiczych. W tym miejscu przedstawiamy protokół specyficznego wzbogacania RpdA znakowanego TAP w połączeniu z testem aktywności HDAC, który umożliwia badanie skuteczności in vitro inhibitorów deacetylazy histonowej.

Jednoetapowe wzbogacanie deacetylazy histonowej znakowanej TAP grzyba nitkowatego Aspergillus nidulans do oznaczania aktywności enzymatycznej

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Inhibitory acetylotransferaz histonowych (HAT, znane również jako acetylotransferazy lizyny), takie jak CBP/p300, są potencjalnymi terapiami w leczeniu raka. Potrzebne są jednak rygorystyczne metody walidacji tych inhibitorów. Trzy metody walidacji in vitro obejmują testy HAT z rekombinowanymi acetylotransferazami, immunoblotting acetylacji histonów w hodowli komórkowej oraz ChIP-qPCR.

Testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej

Badanie acylacji tłuszczów ma ważne implikacje w interakcjach i chorobach białek komórkowych. Przedstawiono tutaj zmodyfikowany protokół mający na celu poprawę wykrywania chemicznego acylowanych białek tłuszczowych, który może być stosowany w różnych typach komórek i łączony z innymi testami, w tym pościgiem impulsowym i spektrometrią mas.

Zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii Click

Tutaj prezentujemy metodę ekspresji acetylowanych białek histonowych za pomocą ekspansji kodu genetycznego i składania odtworzonych nukleosomów in vitro.

Specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Poznaj test chemiczny acetyl-click do pomiaru aktywności acetylotransferazy histonowej HAT1. Ta skalowalna metoda umożliwia szybkie przesiewanie inhibitorów małocząsteczkowych z zastosowaniem w badaniach nad rakiem.

Test chemiczny Acetyl-Click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1

Przeglądaj więcej filmów