Name: Wykrywanie wielogenowego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w raku żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Poznaj metodę wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w raku żołądka przy użyciu sekwencjonowania półprzewodnikowego. Ta technika umożliwia personalizację terapii fluorouracylem na podstawie profilu genetycznego pacjenta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez Badanie Mechanizmu i Roli szlaku ERK2/Snai1/AGPS/PUFA-PL w oporności komórek raka żołądka na ferroptozę wywołaną apatynibem (Numer pozycji: 82172814), wspierane przez National Nature Science Foundation of China; Badanie roli i mechanizmu czynnika transkrypcyjnego 1 palca cynkowego w modulowaniu oporności komórek raka żołądka na ferroptozę indukowaną przez apatynib za pośrednictwem wielonienasyconego szlaku fosfolipidowego eteru (numer pozycji: 2022A1515010267), wspierany przez Komitet Prowincji Guangdong ds. Finansowania Badań Podstawowych i Stosowanych; oraz Badania i zastosowanie odczynnika do diagnostyki wrażliwości na chemoterapię 5-FU w raku żołądka (numer pozycji: 201903010072), Projekty Naukowe i Technologiczne w Kantonie.

Wszystkie protokoły oraz próbki tkanek raka żołądka (krok 1), pobrane podczas endoskopii górnego odcinka przewodu pokarmowego lub zabiegu chirurgicznego i wykorzystane w niniejszym badaniu, zostały przejrzane i zatwierdzone przez komisję etyki medycznej w dniu 24 lipca 2023 r. (NFEC-2023-298). Ponadto protokół ten został opracowany wyłącznie w celu zilustrowania detekcji wielu genów w raku żołądka, bez przeprowadzania porównań kohortowych, w związku z czym nie określa on żadnych specyficznych kryteriów włączenia lub wykluczenia pacjentów. Pacjenci/uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu.
1. Przygotowanie bloków zatopionych w parafinie z raka żołądka
<ol>
	<li>Skonfiguruj system do zatapiania tkanek, składający się z rezerwuaru i dozownika parafiny oraz płyt grzewczych i chłodzących, zgodnie z określonymi wytycznymi eksploatacyjnymi.</li>
	<li>Wyjmij przygotowaną do zatopienia tkankę z dehydratora i umieść ją w szczelinie magazynowej centrum zatapiania.</li>
	<li>Dobierz odpowiednie formy do zatapiania w zależności od wielkości tkanki, wlej wystarczającą ilość roztopionej parafiny, aby przykryć tkankę, a następnie umieść formę na płycie grzewczej.</li>
	<li>Wyjmij tkankę z kaset i ułóż błonę śluzową żołądka prostopadle do podstawy formy do zatapiania, aby zapewnić, że płaszczyzna przekroju przechodzi przez wszystkie warstwy tkanki. Ustabilizuj położenie tkanki w formie.</li>
	<li>Umieść kasetę na górze formy, a następnie dolej parafinię, aby całkowicie wypełnić formę.</li>
	<li>Umieść formę z zatopioną tkanką na płycie chłodzącej, a po zestaleniu parafiny oddziel bloki z tkanem od form.</li>
</ol>
2. Izolacja kwasów nukleinowych z próbek
<ol>
	<li>Użyj zestawów do ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych, aby wyizolować kwasy nukleinowe z próbek tkanek zatopionych w parafinie.</li>
	<li>Użyj kwantyfikatora kwasów nukleinowych do oznaczenia ilości wyekstrahowanego kwasu nukleinowego. Zaleca się, aby stężenie kwasu nukleinowego wynosiło powyżej 2 ng/µL. 
	UWAGA: Materiały wykorzystane na tym etapie znajdują się w Tabeli materiałów.</li>
</ol>
3. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania
<ol>
	<li>Przygotowanie przed eksperymentem
	<ol>
		<li>Włączyć lampę UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza i sterylizować przez 30 min. Następnie wyłączyć lampę UV i włączyć wentylator, aby wietrzyć komorę przez 10 min.</li>
		<li>Wyjąć kwasy nukleinowe z lodówki o temperaturze -20 ± 5 °C, sprawdzić i zapisać identyfikator próbki, kod kreskowy kwasu nukleinowego oraz numer etykiety przypisanej do próbki. Po weryfikacji umieścić próbkę w statywie do probówek wiriówek w celu rozpuszczenia w temperaturze pokojowej (RT), a następnie wirCować przez 10 s przy stałej prędkości 2 50 x g w celu przygotowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja PCR fragmentu docelowego
	<ol>
		<li>Wyjąć roztwór do reakcji przechwytywania fragmentów, starter amplifikacyjny dla raka żołądka oraz starter amplifikacji fuzyjnej z dedykowanego zestawu do wspólnego wykrywania wielu genów raka żołądka i umieścić je na lodzie do rozpuszczenia. Po rozpuszczeniu wstrząsnąć i wymieszać, odwirować przez 10 s oraz przygotować wodę wolną od nukleaz. Szczegółowe informacje o starterach przedstawiono w Tabeli 1. 
		UWAGA: Zestaw nie jest jeszcze dostępny w sprzedaży komercyjnej, w celu uzyskania dalszych szczegółów należy skontaktować się z autorami.</li>
		<li>Przygotować probówkę do reakcji PCR o pojemności 0,2 mL, kolejno dodać do niej odczynniki zgodnie z Tabelą uzupełniającą 1, wymieszać na wirówce typu vortex przez 5 s i odwirować natychmiast przez 10 s przy stałej prędkości 2 50 x g, tak aby na ściankach i zakrętce probówki nie pozostały wyraźne krople. Próbki RNA należy poddać odwrotnej transkrypcji do cDNA, a następnie wykorzystać do późniejszej konstrukcji biblioteki. Produkty cDNA należy dodawać do probówek kolejno zgodnie z Tabelą uzupełniającą 2.</li>
		<li>Umieścić każdą probówkę z reakcją w termocyklerze. W przypadku próbek DNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 2. W przypadku produktów cDNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie sekwencji startera
	<ol>
		<li>Wyjąć enzym do trawienia starterów i umieścić go na lodzie do rozpuszczenia. Po amplifikacji wyjąć wyżej wymienione probówki z reakcją, dodać do każdej probówki 2 µL enzymu do trawienia starterów, zapewniając uzyskanie objętości całkowitej 2 µL.</li>
		<li>Wymieszać roztwór reakcyjny w probówce PCR na wirówce typu vortex i odwirować natychmiast przez 10 s przy stałej prędkości 2 50 x g.</li>
		<li>Umieścić każdą probówkę z reakcją w termocyklerze i uruchomić program zgodnie ze szczegółami w Tabeli 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ligacja adaptera
	<ol>
		<li>Umieścić odczynniki do łączenia adapterów na lodzie w celu rozpuszczenia. Przygotować probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, a następnie wymieszać poszczególne składniki zgodnie z Tabelą 5 i oznaczyć ją jako mieszaninę adapterów X. 
		UWAGA: Odczynniki do łączenia adapterów obejmują adaptery P1 oraz specyficzne adaptery X, numerowane od 1 do 48. Są one zaprojektowane w celu unikalnego znakowania różnych próbek. Podczas dodawania specyficznego adaptera należy otwierać tylko jedną probówkę na raz, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej specyficznych adapterów. Rozcieńczona mieszanina specyficznych adapterów może być przechowywana w temperaturze -20 ± 5 °C. W procesach sekwencjonowania próbki nie są przetwarzane pojedynczo; zamiast tego wiele próbek, z których każda jest znakowana specyficznym adapterem, jest łączonych w jedną wspólną bibliotekę do sekwencjonowania. Metoda ta umożliwia późniejsze rozróżnienie próbek na podstawie sekwencji ich specyficznych adapterów.</li>
		<li>Wyjąć z termocyklera produkt trawienia starterów (2 µL). Kolejno dodać do probówki odczynniki zgodnie z Tabelą 6, wymieszać na wirówce typu vortex przez 5 s. Odwirować przy niskiej prędkości przez 10 s przy stałej wartości 2 50 x g, tak aby na ściankach i zakrętce probówki nie pozostały wyraźne krople.</li>
		<li>Umieścić probówkę z reakcją w termocyklerze. W przypadku próbek DNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 7. W przypadku produktów cDNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie produktu ligacji i amplifikacja
	<ol>
		<li>Wyjąć wcześniej magnetyczne kulki do oczyszczania DNA z lodówki o temperaturze 2-8 °C, wymieszać je równomiernie na wirówce typu vortex i odwirować natychmiast przez 10 s przy stałej prędkości 2 50 x g. Inkubować kulki magnetyczne w temperaturze RT przez 30 min.</li>
		<li>Przygotować probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL o niskiej adsorpcji i przenieść do odpowiedniej probówki produkt reakcji ligacji.</li>
		<li>Dodać do każdej probówki 45 µL magnetycznych kulek do oczyszczania DNA, dobrze wymieszać na wirówce typu vortex, odwirować natychmiast przez 10 s i inkubować w temperaturze RT przez 5 min.</li>
		<li>Umieścić probówkę na statywie magnetycznym na 3 min. Odpipować i usunąć nadsącz, unikając pobrania kulek.</li>
		<li>Przenieść 30 µL świeżo przygotowanego 75% etanolu do probówki do mikrocentryfugi i delikatnie obrócić probówki 4 razy o 180°. Po przejaśnieniu się roztworu szybko usunąć nadsącz. Unikać pobrania kulek. Powtórzyć procedurę płukania jeszcze raz.</li>
		<li>Zdjąć probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL ze statywu magnetycznego i krótko odwirować (10 s przy stałej prędkości 2 50 x g). Umieścić probówki z powrotem na statywie magnetycznym i wypipować pozostały płyn. Upewnić się, że na ściankach probówek nie pozostał płyn.</li>
		<li>Otworzyć zakrętki każdej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i suszyć kulki w temperaturze RT przez 5 min. Kontrolować stopień wysuszenia kulek. Po wyschnięciu kulek magnetycznych sprawdzić, czy na powierzchni nie ma plam z wody. W razie potrzeby odpowiednio wydłużyć czas suszenia, jeśli kulki są zbyt wilgotne. Natychmiast zamknąć zakrętki, jeśli na kulkach pojawią się pęknięcia, i przejść do następnego kroku w celu amplifikacji i oczyszczania biblioteki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja i oczyszczanie biblioteki
	<ol>
		<li>Wcześniej umieścić odczynniki do PCR na lodzie w celu rozpuszczenia, wymieszać na wirówce typu vortex i odwirować przez 10 s. Zdjąć probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL ze statywu magnetycznego, dodać do probówki odczynniki PCR zgodnie z Tabelą 9, zamknąć zakrętkę i wymieszać na wirówce typu vortex przez 5 s. Odwirować krótko (10 s), aby na ściankach i zakrętce probówki nie było wyraźnych kropli cieczy.</li>
		<li>Przenieść powyższy produkt do nowej probówki PCR. Inkubować próbkę w termocyklerze. W przypadku próbek DNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 10. W przypadku produktów cDNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 1.</li>
		<li>Przygotować nową probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL o niskiej adsorpcji. Odwirować probówkę PCR przez 10 s po inkubacji. Przenieść produkt z probówki PCR do probówki EP.</li>
		<li>Dodać do każdej probówki 25 µL magnetycznych kulek do oczyszczania DNA. Dobrze wymieszać na wirówce typu vortex, odwirować przy niskiej prędkości i inkubować w temperaturze RT przez 5 min.</li>
		<li>Umieścić probówki na statywie magnetycznym na 3 min i poczekać, aż roztwór stanie się przejrzysty. Przenieść nadsącz do nowych probówek do mikrocentryfugi. Unikać pobrania kulek.</li>
		<li>Dodać do każdej probówki 60 µL magnetycznych kulek do oczyszczania DNA. Dobrze wymieszać na wirówce typu vortex, odwirować przy niskiej prędkości i inkubować w temperaturze RT przez 5 min.</li>
		<li>Umieścić probówki na statywie magnetycznym na 3 min i poczekać, aż roztwór stanie się przejrzysty. Usunąć nadsącz. Unikać pobrania kulek.</li>
		<li>Przenieść 30 µL świeżo przygotowanego 75% etanolu do probówek i delikatnie obrócić probówki 4 razy o 180°. Po przejaśnieniu się roztworu szybko wypipować i usunąć nadsącz. Unikać pobrania kulek. Powtórzyć procedurę płukania raz.</li>
		<li>Zdjąć probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL ze statywu magnetycznego i krótko odwirować (10 s). Włożyć probówki z powrotem do statywu magnetycznego i wypipować pozostały płyn. Upewnić się, że na ściankach probówek nie pozostał płyn.</li>
		<li>Otworzyć zakrętki probówek o pojemności 1,5 mL i suszyć kulki w temperaturze RT przez 5 min. Kontrolować stopień wysuszenia kulek. Po wyschnięciu kulek magnetycznych na powierzchni nie powinny być widoczne plamy z wody. W razie potrzeby odpowiednio wydłużyć czas suszenia, jeśli kulki są zbyt wilgotne. Natychmiast zamknąć zakrętkę, jeśli na kulkach pojawią się pęknięcia.</li>
		<li>Wpipować 50 µL eluentu do probówek, wymieszać dobrze na wirówce typu vortex. Odwirować krótko (5 s przy stałej prędkości 2 500 x g) i pozostawić probówki w temperaturze RT na 5 min.</li>
		<li>Umieścić probówki na statywie magnetycznym na 3 min i poczekać, aż roztwór stanie się przejrzysty. Ostrożnie przenieść ciecz do nowej probówki i oznaczyć nazwę biblioteki.</li>
		<li>Przechowywać bibliotekę tymczasowo w lodówce w temperaturze 2-8 °C do czasu wykonania oznaczenia ilościowego lub przechowywać bibliotekę w lodówce w temperaturze -20 ± 5 °C w celu długoterminowego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ilościowe oznaczenie skonstruowanej biblioteki
<ol>
	<li>Użyj urządzenia do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych, aby określić ilość biblioteki. Jeśli stężenie biblioteki wynosi ≥ 0,2 ng/&#181;Ljest ona odpowiednia. W przeciwnym razie należy ponownie przygotować bibliotekę.</li>
	<li>Wymieszać równe objętości DNA (lub RNA) i oznaczyć stężenie roztworu. Na podstawie wyniku ilościowego rozcieńczyć zmieszany roztwór do stężenia 10 pmol/L, korzystając z poniższego wzoru. 
	<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66058/66058eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
	UWAGA: Alternatywną metodą jest rozcieńczenie biblioteki do stężenia 10 pmol/L zgodnie z formułą, a następnie przeprowadzenie ilościowego pomiaru za pomocą fluorescencyjnego ilościowego PCR. Biblioteki DNA (lub RNA) należy zmieszać w równych ilościach, opierając się na wynikach ilościowych otrzymanych z urządzenia do PCR.</li>
	<li>Wymieszać bibliotekę DNA o stężeniu 10 pmol/L oraz bibliotekę RNA w stosunku 4:1. Uzyskaną mieszaninę bibliotek DNA i RNA wykorzystać do sekwencjonowania komputerowego.</li>
</ol>
5. Sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Przeprowadź sekwencjonowanie zgodnie z instrukcją uniwersalnego zestawu do reakcji sekwencjonowania24,25 (metoda sekwencjonowania półprzewodnikowego).</li>
</ol>
6. Kontrola jakości próbek
<ol>
	<li>Pozytywna kontrola jakości DNA w raku żołądka: Należy pobrać pozytywną kontrolę DNA w raku żołądka i przeprowadzić test zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Kontrola jest dostarczana w zestawie. Wynik wskazuje na wykrycie mutantów genów MTHFR, DHFR, MTR, GGH oraz SLC19A1.</li>
	<li>Negatywna kontrola jakości DNA w raku żołądka: Należy pobrać negatywną kontrolę DNA w raku żołądka i przeprowadzić test zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Kontrola jest dostarczana w zestawie. Wynik wskazuje na wykrycie typów dzikich genów MTHFR, DHFR, MTR, GGH oraz SLC19A1. 
	UWAGA: Należy upewnić się, że kryteria zostały spełnione w obu przypadkach; w przeciwnym razie wymagane jest ponowne przeprowadzenie detekcji.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Uruchom odpowiednie wtyczki (Variant Caller, Coverage Analysis oraz oprogramowanie Ion Reporter) w oprogramowaniu Torrent Suite, aby uzyskać wyniki analizy próbek. Oceń wyniki detekcji w próbkach na podstawie wyników analizy z wtyczek.</li>
</ol>

SNP-Guided 5-FU Therapy in Gastric Cancer Using Ion Torrent Sequencing

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2020%3A+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Wagner, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+for+advanced+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+Syst+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy for advanced gastric cancer.</a> Cochrane Database Syst Rev. 8, (2017).</li>
<li>Shah, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+and+targeted+therapy+for+advanced+gastroesophageal+cancer%3A+Asco+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy and targeted therapy for advanced gastroesophageal cancer: Asco guideline.</a> J Clin Oncol. 41 (7), 1470-1491 (2023).</li>
<li>Loganayagam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetic+variants+in+the+dpyd%2C+tyms%2C+cda+and+mthfr+genes+are+clinically+significant+predictors+of+fluoropyrimidine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetic variants in the dpyd, tyms, cda and mthfr genes are clinically significant predictors of fluoropyrimidine toxicity.</a> Br J Cancer. 108 (12), 2505-2515 (2013).</li>
<li>Giacchetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+iii+multicenter+randomized+trial+of+oxaliplatin+added+to+chronomodulated+fluorouracil-leucovorin+as+first-line+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase iii multicenter randomized trial of oxaliplatin added to chronomodulated fluorouracil-leucovorin as first-line treatment of metastatic colorectal cancer.</a> J Clin Oncol. 18 (1), 136-147 (2000).</li>
<li>Hoff, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+oral+capecitabine+versus+intravenous+fluorouracil+plus+leucovorin+as+first-line+treatment+in+605+patients+with+metastatic+colorectal+cancer%3A+Results+of+a+randomized+phase+iii+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Comparison of oral capecitabine versus intravenous fluorouracil plus leucovorin as first-line treatment in 605 patients with metastatic colorectal cancer: Results of a randomized phase iii study.</a> J Clin Oncol. 19 (8), 2282-2292 (2001).</li>
<li>Meulendijks, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+dpyd+variants+c.1679t%3Eg%2C+c.1236g%3Ea%2Fhapb3%2C+and+c.1601g%3Ea+as+predictors+of+severe+fluoropyrimidine-associated+toxicity%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+individual+patient+data%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of dpyd variants c.1679t>g, c.1236g>a/hapb3, and c.1601g>a as predictors of severe fluoropyrimidine-associated toxicity: A systematic review and meta-analysis of individual patient data.</a> Lancet Oncol. 16 (16), 1639-1650 (2015).</li>
<li>Sadighi, S., Mohagheghi, M. A., Montazeri, A., Sadighi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+of+life+in+patients+with+advanced+gastric+cancer%3A+A+randomized+trial+comparing+docetaxel%2C+cisplatin%2C+5-fu+%28tcf%29+with+epirubicin%2C+cisplatin%2C+5-fu+%28ecf%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Quality of life in patients with advanced gastric cancer: A randomized trial comparing docetaxel, cisplatin, 5-fu (tcf) with epirubicin, cisplatin, 5-fu (ecf).</a> BMC Cancer. 6, 274(2006).</li>
<li>Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+polymorphism+discovery+resource+for+research+on+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation.</a> Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).</li>
<li>Ladner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dutpase+and+uracil-DNA+repair+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of dutpase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy.</a> Curr Protein Pept Sci. 2 (4), 361-370 (2001).</li>
<li>Capitain, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+fluorouracil+outcome+parameters+on+tolerance+and+efficacy+in+patients+with+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">The influence of fluorouracil outcome parameters on tolerance and efficacy in patients with advanced colorectal cancer.</a> Pharmacogenomics J. 8 (4), 256-267 (2008).</li>
<li>Askari, B. S., Krajinovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dihydrofolate+reductase+gene+variations+in+susceptibility+to+disease+and+treatment+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dihydrofolate reductase gene variations in susceptibility to disease and treatment outcomes.</a> Curr Genomics. 11 (8), 578-583 (2010).</li>
<li>Ceppi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+variants+in+dhfr+gene+and+response+to+treatment+in+children+with+childhood+b+all%3A+Revisited+in+aieop-bfm+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">DNA variants in dhfr gene and response to treatment in children with childhood b all: Revisited in aieop-bfm protocol.</a> Pharmacogenomics. 19 (2), 105-112 (2018).</li>
<li>Sharp, L., Little, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphisms+in+genes+involved+in+folate+metabolism+and+colorectal+neoplasia%3A+A+huge+review%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Polymorphisms in genes involved in folate metabolism and colorectal neoplasia: A huge review.</a> Am J Epidemiol. 159 (5), 423-443 (2004).</li>
<li>Yousef, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+of+polymorphisms+in+folate-metabolizing+genes+with+response+to+adjuvant+chemotherapy+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The association of polymorphisms in folate-metabolizing genes with response to adjuvant chemotherapy of colorectal cancer.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 82 (2), 237-243 (2018).</li>
<li>Schneider, E., Ryan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-glutamyl+hydrolase+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Gamma-glutamyl hydrolase and drug resistance.</a> Clin Chim Acta. 374 (1-2), 25-32 (2006).</li>
<li>Moran, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+folylpoly-gamma-glutamate+synthetase+in+therapeutics+with+tetrahydrofolate+antimetabolites%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Roles of folylpoly-gamma-glutamate synthetase in therapeutics with tetrahydrofolate antimetabolites: An overview.</a> Semin Oncol. 26 (2), 24-32 (1999).</li>
<li>Maezawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+gamma-glutamyl+hydrolase+and+low+folylpolyglutamate+synthetase+expression+as+prognostic+biomarkers+in+patients+with+locally+advanced+gastric+cancer+who+were+administrated+postoperative+adjuvant+chemotherapy+with+s-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">High gamma-glutamyl hydrolase and low folylpolyglutamate synthetase expression as prognostic biomarkers in patients with locally advanced gastric cancer who were administrated postoperative adjuvant chemotherapy with s-1.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 146 (1), 75-86 (2020).</li>
<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+substrate+specific+functional+polymorphism+of+human+gamma-glutamyl+hydrolase+alters+catalytic+activity+and+methotrexate+polyglutamate+accumulation+in+acute+lymphoblastic+leukaemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenetics%22%5BJournal%5D)">A substrate specific functional polymorphism of human gamma-glutamyl hydrolase alters catalytic activity and methotrexate polyglutamate accumulation in acute lymphoblastic leukaemia cells.</a> Pharmacogenetics. 14 (8), 557-567 (2004).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+cyclic+dinucleotides+and+folates+by+human+slc19a1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of cyclic dinucleotides and folates by human slc19a1.</a> Nature. 612 (7938), 170-176 (2022).</li>
<li>Ulrich, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphisms+in+folate-metabolizing+enzymes+and+response+to+5-fluorouracil+among+patients+with+stage+ii+or+iii+rectal+cancer+%28int-0144%3B+swog+9304%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Polymorphisms in folate-metabolizing enzymes and response to 5-fluorouracil among patients with stage ii or iii rectal cancer (int-0144; swog 9304).</a> Cancer. 120 (21), 3329-3337 (2014).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+biomarkers+of+therapeutic+responses+in+han+chinese+pemetrexed-based+treated+advanced+nsclc+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel biomarkers of therapeutic responses in han chinese pemetrexed-based treated advanced nsclc patients.</a> Front Pharmacol. 10, 944(2019).</li>
<li>Corrigan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetics+of+pemetrexed+combination+therapy+in+lung+cancer%3A+Pathway+analysis+reveals+novel+toxicity+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetics of pemetrexed combination therapy in lung cancer: Pathway analysis reveals novel toxicity associations.</a> Pharmacogenomics J. 14 (5), 411-417 (2014).</li>
<li>Ion 520 & ion 530 ext kit - chef user guide. Thermofisherscientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0015805_Ion520_530ExTKit_UG.pdf">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0015805_Ion520_530ExTKit_UG.pdf</a> (2023).</li>
<li>Ion genestudio s5 instrument user guide. Thermofisherscientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017528_Ion_GeneStudio_S5_Instrument_UG.pdf">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017528_Ion_GeneStudio_S5_Instrument_UG.pdf</a> (2023).</li>
<li>Parkin, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-laboratory+comparison+of+next-generation+to+sanger-based+sequencing+for+hiv-1+drug+resistance+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Multi-laboratory comparison of next-generation to sanger-based sequencing for hiv-1 drug resistance genotyping.</a> Viruses. 12 (7), 694(2020).</li>
<li>Ziller, M. J., Hansen, K. D., Meissner, A., Aryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coverage+recommendations+for+methylation+analysis+by+whole-genome+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Coverage recommendations for methylation analysis by whole-genome bisulfite sequencing.</a> Nat Methods. 12 (3), 230-232 (2015).</li>
<li>Lordick, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmet+needs+and+challenges+in+gastric+cancer%3A+The+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">Unmet needs and challenges in gastric cancer: The way forward.</a> Cancer Treat Rev. 40 (6), 692-700 (2014).</li>
<li>Kumar, K. R., Cowley, M. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+emerging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and emerging technologies.</a> Semin Thromb Hemost. 45 (7), 661-673 (2019).</li>
<li>Chinese Centres for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ministry+of+Health+of+the+People%27s+Republic+of+China.+WS+233-2002%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Centres+for+Disease+Control+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Ministry of Health of the People's Republic of China. WS 233-2002.</a> Chinese Centres for Disease Control and Prevention. , 1-64 (2002).</li>
<li>China Environmental Protection Industry. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+waste+management+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22China+Environmental+Protection+Industry%22%5BJournal%5D)">Medical waste management regulations.</a> China Environmental Protection Industry. (1), 6-10 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Eksperci kliniczni jednogłośnie zgadzają się, że pacjenci, nawet z tym samym typem i stadium raka żołądka, mogą mieć znacznie różne reakcje na identyczne podejście do leczenia. Lata badań ujawniły naukowcom, że indywidualne różnice przypisuje się głównie naturze raka żołądka jako niejednorodnej, polimorficznej i różnorodnie zróżnicowanej populacji komórkowej, co prowadzi do znacznych indywidualnych różnic w odpowiedziach na leczenie28. W związku z tym pobieranie próbek raka żołądka za pomocą endoskopii lub chirurgii górnego odcinka przewodu pokarmowego oraz próbek krwi, w połączeniu z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem do analizy genetycznej, umożliwia spersonalizowane leczenie raka żołądka. Strategia ta ma na celu zwiększenie skuteczności leczenia klinicznego i zmniejszenie ryzyka wystąpienia ciężkich toksycznych działań niepożądanych. Postęp w technologii sekwencjonowania półprzewodników jonowych sprawił, że spersonalizowane leczenie stało się praktyczną rzeczywistością29.
Oto kilka ograniczeń tej metody testowej. Zastosowany tutaj zestaw służy przede wszystkim do diagnostyki in vitro , a więc ogranicza się do wykrywania mutacji rs1801131 i rs1801133 genu MTHFR , rs1650697 i rs442767 genu DHFR , rs1805087 genu MTR , rs11545078 genu GGH oraz rs1051298 genu SLC19A1. Nie można wykryć mutacji w innych sekcjach. Ze względu na znaczną niejednorodność tkanki nowotworowej, różne lokalizacje pobierania próbek mogą wpływać na wyniki wykrywania. W przypadku próbek tkanek zatopionych w parafinie przechowywanych przez dłuższy czas, DNA i RNA mogą ulec degradacji w pewnym stopniu, wpływając na wyniki testu. Nieuzasadnione pobieranie, transport i przetwarzanie próbek, a także niewłaściwa eksploatacja eksperymentu i środowisko eksperymentalne mogą prowadzić do wyników fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich. Wynik wykrywania nie może być gwarantowany, jeśli stężenie kwasu nukleinowego jest niższe niż 2 ng/μl. Wyniki testów zestawu służą wyłącznie do celów klinicznych. Wybór spersonalizowanego leczenia dla pacjentów należy rozważyć w połączeniu z ich objawami/przedmiotami, wywiadem medycznym, innymi badaniami laboratoryjnymi i reakcjami na leczenie. Negatywne wyniki nie mogą całkowicie wykluczyć istnienia mutacji genu docelowego. Negatywne wyniki mogą być również spowodowane zbyt małą liczbą komórek nowotworowych w próbce, nadmierną degradacją kwasu nukleinowego lub stężeniem genu docelowego w układzie reakcji amplifikacji poniżej granicy wykrywalności.
Niektóre wskaźniki wydajności zastosowanego zestawu są zgodne z opisem. Czułość analityczna: W przypadku próbek DNA minimalna wykrywalna ilość całkowitego kwasu nukleinowego w tym zestawie wynosi 10 ng i można wykryć 5% szybkość mutacji. W przypadku próbek RNA minimalna wykrywalna ilość całkowitego kwasu nukleinowego w tym zestawie wynosi 10 ng. Dodatni i ujemny wskaźnik koincydencji: Dodatni i ujemny wskaźnik koincydencji sięga 100%. Granica wykrywalności (LOD): Można użyć łącznie 14 referencji LOD, ponumerowanych od L1 do L14. L1-L11 to referencje LOD genów MTHFR, DHFR, MTR, GGH i SLC19A1 , a ich wyniki wykrywania powinny być takie, że typy mutacji odpowiednich miejsc genów są dodatnie, a wskaźniki koincydencji wynoszą 100%. Powtarzalność: Można zastosować łącznie pięć powtarzalnych materiałów referencyjnych o numerach R1-R5. R1 jest silnie dodatnim powtarzalnym materiałem referencyjnym (mutacja rs67376798 genu DPYD ). R2, który zawiera tę mutację w mniejszej liczbie, jest słabo dodatnim powtarzalnym materiałem referencyjnym (mutacja rs67376798 genu DPYD ), R3 jest ujemnym powtarzalnym materiałem referencyjnym (6 miejsc genów DPYD, MTHFR i ABCB1 jest wykrywanych jako typ dziki). Każda próbka referencyjna musi zostać przebadana 10 razy, upewniając się, że wyniki tych powtarzających się ocen odpowiadają ich wcześniej określonym klasyfikacjom. Objętość danych: Efektywna objętość danych próbek DNA i RNA powinna być kontrolowana powyżej 0,05 M. Głębokość sekwencjonowania próbek DNA powinna być kontrolowana powyżej 500, a zmapowane odczyty próbek RNA powinny być kontrolowane powyżej 20000. Test zakłóceń: Na ten zestaw nie mają wpływu endogenne substancje zakłócające (trójglicerydy i albumina) oraz egzogenne substancje zakłócające (formalina i odwodniony alkohol).
Podczas eksperymentu należy przestrzegać pewnych środków ostrożności. Zastosowany tutaj zestaw może być używany wyłącznie do badań in vitro. Prosimy o uważne przeczytanie niniejszej instrukcji przed eksperymentem i korzystanie z niej w okresie ważności. Elementy zestawu w różnych partiach nie mogą być używane zamiennie. Zaleca się używanie jednorazowych materiałów eksploatacyjnych do tego zestawu, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Podczas użytkowania tego zestawu zaleca się stosowanie głowicy ssącej z wkładem filtrującym. W celu uniknięcia wszelkich potencjalnych zagrożeń biologicznych w próbce, badaną próbkę należy uznać za substancje zakaźne w celu uniknięcia kontaktu ze skórą i błoną śluzową. Zaleca się obchodzenie się z próbkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego, która może zapobiec wydostawaniu się aerozoli. Probówki i przyssawki używane w operacji należy wysterylizować przed wyrzuceniem. Eksploatacja i utylizacja próbek powinny spełniać wymagania odpowiednich przepisów ustawowych i wykonawczych: Ogólnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa biologicznego mikrobiologicznych laboratoriów biomedycznych oraz Przepisów Ministerstwa Zdrowia w sprawie gospodarki odpadami medycznymi30,31. Personel doświadczalny musi przejść profesjonalne szkolenie, działać ściśle według instrukcji i ściśle oddzielić obszary zgodnie z procesem doświadczalnym. Na każdym etapie czynności doświadczalnej stosuje się specjalne przyrządy i wyposażenie, a przedmioty na każdym etapie każdego obszaru nie mogą być używane zamiennie. Personel doświadczalny musi ściśle oddzielić obszary zgodnie z procesem doświadczalnym. Na każdym etapie czynności doświadczalnej stosuje się specjalne przyrządy i sprzęt. W razie potrzeby podejmij środki ochronne, takie jak rękawice, odzież robocza itp. Utylizacja odpadów powinna być zgodna z odpowiednimi przepisami krajowymi.
Chociaż ten artykuł koncentruje się na siedmiu SNP w obrębie pięciu genów związanych z rakiem żołądka, sekwencjonowanie w praktycznych zastosowaniach nie ogranicza się tylko do tych pięciu genów. Niniejsza praca definitywnie ustala istotną korelację między siedmioma SNP a wrażliwością na chemioterapię 5-FU w raku żołądka.

<a href="https://app.jove.com/t/6602">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/66058</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66058">Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform

Rak żołądka jest dużym obciążeniem w dziedzinie globalnego zdrowia publicznego. Według Global Cancer Statistics 2020, opublikowanego przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem (IARC), rak żołądka jest piątym najczęściej diagnozowanym nowotworem i czwartą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem. Na całym świecie częstość występowania wskaźnika standaryzowanego według wieku w Azji Wschodniej jest najwyższa zarówno u mężczyzn, jak i kobiet1. Występowanie raka żołądka jest podstępne, co oznacza, że pacjenci często we wczesnym stadium nie mają żadnych oczywistych i specyficznych objawów. Spośród wszystkich pacjentów z rakiem żołądka, w krajach, w których nie przeprowadza się rutynowych badań przesiewowych, 80%-90% pacjentów jest albo diagnozowanych w zaawansowanym stadium, gdy guz nie może być operowany, albo dochodzi do nawrotów w ciągu 5 lat po operacji2.
W przypadku zaawansowanego lub przerzutowego raka żołądka, głównym sposobem leczenia jest chemioterapia, która może poprawić przeżywalność i jakość życia pacjentów. W początkowej terapii pacjentów z przerzutowym rakiem żołądka głównym wyborem dla schematu chemioterapii pierwszego rzutu jest schemat platynowo-fluoropirymidynowy3. Fluoropirymidyna obejmuje głównie 5-fluorouracyl (5-FU) i doustne pochodne fluoropirymidyny, takie jak kapecytabina i tegafur. Głównym celem 5-FU są enzymy związane z metabolizmem kwasu foliowego, które hamują syntezę DNA i spowalniają wzrost tkanki nowotworowej. Działania niepożądane leków ograniczają ich użyteczność, a do najczęstszych działań niepożądanych należą biegunka, zapalenie błony śluzowej, supresja szpiku kostnego i zespół ręka-stopa. Doniesiono, że odpowiedź terapeutyczna i działania niepożądane leku są ściśle związane z czynnikami w szlaku metabolicznym kwasu foliowego. Warto zauważyć, że homozygotyczna mutacja rs1801131 została zidentyfikowana jako wskaźnik zespołu ręka-stopa (p = 4,1 x 10-6, OR = 9,99, 95% CI: 3,84-27,8)<klasa sup = "xref">4. Chociaż fluoropirymidyny są szeroko stosowane w chemioterapii przeciwnowotworowej, ich chemooporność jest częstym stanem awaryjnym, powodującym niepowodzenie terapeutyczne w leczeniu raka żołądka. Na przykład ogólny wskaźnik odpowiedzi wynosi tylko 10%-15% wśród pacjentów z zaawansowanym rakiem jelita grubego leczonych tylko 5-FU5. Ponadto fluoropirymidyny mają toksyczność, której nie można zignorować. Reakcje toksyczności wywołane przez 5-FU obejmują głównie biegunkę, zespół ręka-stopa, zapalenie jamy ustnej, neutropenię, małopłytkowość, neurotoksyczność, a nawet śmierć6. Ciężka toksyczność związana z leczeniem występuje u 10%-30% pacjentów leczonych fluoropirymidynami, a śmiertelna toksyczność występuje u 0,5%-1% tych pacjentów7.
Badanie jakości życia pacjentów z zaawansowanym rakiem żołądka wykazało, że wskaźnik odpowiedzi był mniejszy niż 50% u tych, którzy otrzymali chemioterapię opartą na 5-FU8. Dlatego zrozumienie czynników związanych z czułością chemioterapii opartej na 5-FU jest szczególnie ważne dla precyzyjnego leczenia, aby zmaksymalizować wskaźnik odpowiedzi i skuteczność przy jednoczesnej minimalizacji toksyczności. Biorąc pod uwagę, że 5-FU jest ściśle związany z metabolizmem kwasu foliowego, warianty genetyczne enzymów w szlaku metabolicznym kwasu foliowego mogą być jednym z czynników. Około 90% zmienności sekwencji ludzkiej przypisuje się mutacjom pojedynczej zasady w DNA, znanym jako polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP)9. Kiedy SNP zmieniają właściwości enzymatyczne metabolizmu kwasu foliowego, może to prowadzić do indywidualnych różnic w skuteczności, toksyczności i chemooporności na fluorouracyl u pacjentów z rakiem żołądka.
Reduktaza metylenotetrahydrofolianu (MTHFR) jest głównie używana do przekształcania 5,10-metylenotetrahydrofolianu (5,10-MTHF) w 5-metylotetrahydrofolian. 5-FdUMP, metabolit 5-FU, tworzy nieaktywny trójskładnikowy z 5,10-MTHF i syntazą tymidylanową (TS), hamując aktywność TS i prowadząc do niedoboru dTMP10. Akumulacja 5,10-MTHF może nasilać efekt hamowania 5-FU na TS, co jest skorelowane z aktywnością MTHFR. MTHFR rs1801131 i rs1801133 są najczęstszymi polimorfizmami, które są związane z niższą aktywnością enzymu (spadek o 75% dla rs1801133 i 30% dla rs181131) i akumulacją 5,10-MTHF11.
Reduktaza dihydrofolianu (DHFR) jest kluczowym enzymem w metabolizmie folianów i syntezie DNA. DHFR redukuje dihydrofolian za pomocą NADPH do tetrahydrofolianu (THF), który jest używany do przenoszenia jednostki jednowęglowej. SNP DHFR mogą wpływać na jego ekspresję, zmieniać aktywność i obfitość THF, a także dodatkowo wpływać na metabolizm folianów i wrażliwość 5-FU. Mutacja punktowa DHFR rs1650697 występuje w głównym promotorze genu DHFR, co zwiększa ekspresję DHFR 12. Badanie wykazało, że rs442767 jest związany ze skutecznością i toksycznością przeciwzapalnych leków przeciwnowotworowych, takich jak pemetreksed i metotreksat. Jeśli chodzi o SNP rs442767, genotyp GT oznacza dziedziczenie allelu G i allelu T w tym samym locus na chromosomach homologicznych od każdego z rodziców. Podobnie genotypy GG i TT oznaczają dziedziczenie odpowiednio dwóch alleli G lub dwóch alleli T. W porównaniu z genotypem GT+TT, GG wiąże się ze zmniejszonym czasem przeżycia wolnego od zdarzeń i zwiększonym ryzykiem13. Sugeruje to, że rs442767 może prowadzić do pewnego potencjalnego wpływu na 5-FU.
Syntaza metioniny (MTR) katalizuje remetylację homocysteiny do metioniny, która odgrywa ważną rolę w metabolizmie folianów. MTR rs1805087 jest najczęstszym polimorfizmem genu MTR. MTR rs1805087 zastępuje kwas asparaginowy glicyną w potencjalnie funkcjonalnym miejscu białka, co może zmniejszać aktywność MTR. Osoby z allelem G miały podwyższony poziom folianów w osoczu i obniżony poziom homocysteiny w osoczu14. Wręcz przeciwnie, badanie wykazało, że rs1805087 nie ma statystycznie istotnego związku ze skutecznością 5-FU. Ale to badanie koncentrowało się na raku jelita grubego, a wielkość próby była niewielka. Związek między rs1805087 a skutecznością 5-FU u pacjentów z rakiem żołądka pozostaje do zbadania15.
Hydrolaza gamma-glutamylowa (GGH) to enzym lizosomalny, który reguluje wewnątrzkomórkowe stężenie folianów. Kwas pteroiloglutaminowy jest synonimem kwasu foliowego, który składa się z pteryny, kwasu p-aminometylobenzoesowego i kwasu glutaminowego. W organizmach występują dwie formy kwasu foliowego, folian monoglutaminianu i folian poliglutaminianu. Poliglutaminian THF jest enzymatycznie przekształcany w monoglutaminowy folian przez GGH, kolejno uwalniając monoglutaminian (mono-Glu) lub di-glutaminian (di-Glu)16. Badanie dotyczące ekspresji GGH u pacjentów z miejscowo zaawansowanym rakiem żołądka wykazało, że wysoka ekspresja GGH może zmniejszyć 5,10-MTHF i TS, co oznacza, że do osiągnięcia efektu hamującego TS u tych pacjentów potrzebna jest tylko niewielka dawka 5-FU17. GG jest biomarkerem prognostycznym u pacjentów z miejscowo zaawansowanym rakiem żołądka leczonych pooperacyjną chemioterapią uzupełniającą z S-1, prolekiem 5-FU, i odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy wewnątrzkomórkowej kwasu foliowego18. GGH rs11545078 jest wariantem missense i zmienia Thr-127 na Ile-127. Badanie skupiające się na specyficzności substratowej GGH sugeruje, że rs11545078, w porównaniu z typem dzikim, skutkuje wyższym Km i niższą wydajnością katalityczną dla metotreksatu, a struktura jest podobna do kwasu foliowego19. Wspólne zbadanie związku między rs11545078 a wynikami klinicznymi 5-FU jest obiecującą strategią zrozumienia oporności na leki.
Nośnik substancji rozpuszczonej 19 członek 1 (SLC19A1), zwany również transporterem zredukowanego kwasu foliowego, jest typowym ułatwiającym białkiem transbłonowym, które importuje zredukowane foliany, których komórki ssaków nie są w stanie syntetyzować de novo, co jest rozpoznawane w celu oszacowania odpowiedzi guza na 5-FU20. Jednak przeprowadzono tylko kilka badań dotyczących związku między polimorfizmem 5-FU a polimorfizmem SLC19A121. U pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca otrzymujących pemetreksed, który jest analogiem kwasu foliowego, rs1051298 w genie SLC19A1 przyczynił się do zwiększenia ryzyka wystąpienia wszystkich działań niepożądanych i zmniejszenia całkowitego przeżycia22,23. SLC19A1 rs1051298, wariant regionu 3' bez translacji dotyczący metabolizmu kwasu foliowego, może pomóc wyjaśnić niektóre indywidualne różnice dotyczące terapii 5-FU. Celem jest ocena związku między rs1051298 a opornością na 5-FU u pacjentów z rakiem żołądka.
Zestaw oparty na sekwencjonowaniu półprzewodników, służy do jakościowego wykrywania genów in vitro (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), który może wykryć 7 wybranych SNP w 5 genach, mutacje rs1801131 i rs1801133 genu MTHFR, mutacje rs1650697 i rs442767 genu DHFR, mutacje rs1805087 genu MTR, rs11545078 mutacje genu GGH i rs1051298 genu SLC19A1 gen w próbkach tkanki nowotworowej pacjentów z rakiem żołądka. Po pierwsze, próbkę kwasu nukleinowego wyekstrahowano, a fragment docelowy został specjalnie amplifikowany przez PCR. Uniwersalny adapter do sekwencjonowania został dodany na obu końcach fragmentu DNA, aby skonstruować bibliotekę, która może być używana do sekwencjonowania. Następnie przeprowadzono amplifikację biblioteki sekwencjonowania metodą PCR w celu utworzenia matrycy sekwencjonowania. Matryca dodatnia została wzbogacona, aby spełnić wymagania sekwencjonowania. Korzystanie z systemu sekwencjonowania półprzewodników, poprzez zamocowanie nici DNA w maleńkim otworze chipa półprzewodnikowego. Polimeraza DNA przyjmuje jednoniciowy DNA jako matrycę i syntetyzuje komplementarną nić DNA zgodnie z zasadą komplementarnego parowania zasad. Za każdym razem, gdy zasada jest wydłużana w łańcuchu DNA, uwalniany jest proton, powodując lokalne zmiany pH. Czujnik jonowy wykrywa zmiany pH i przekształca sygnały chemiczne na sygnały cyfrowe, dzięki czemu zasady mogą być interpretowane w czasie rzeczywistym, a na koniec można uzyskać sekwencję zasad każdego segmentu DNA. Wykorzystano analizę bioinformatyczną w celu dopasowania tych sekwencji do mapy referencyjnej ludzkiego genomu. Kiedy geny związane z rakiem żołądka mutują, odpowiadające im sekwencje zasad DNA ulegną zmianie, aby uzyskać informacje o mutacjach powiązanych genów.
Wynik może wyświetlać status mutacji genów i stanowić punkt odniesienia dla klinicystów do wyboru odpowiednich typów i dawek leków chemioterapeutycznych oraz przewidywania oporności na leki u pacjentów z rakiem żołądka. Wyniki badań służą jednak wyłącznie jako odniesienie kliniczne i nie są zalecane jako jedyna podstawa do zindywidualizowanego leczenia pacjentów. Klinicyści powinni dokonać kompleksowej oceny w oparciu o stan pacjenta, wskazania do stosowania leków, reakcje na leczenie i inne wskaźniki badań laboratoryjnych.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówek DNA LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówek</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikacyjny starter raka żołądka</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Startery są syntetyzowane przez Thermo Fshier zgodnie z sekwencją w Tabela 1.</td></tr><tr><td>Deparafinowanie</td><td>Qiagen</td><td>19093</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczanie DNA Koraliki magnetyczne</td><td>Bechkman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Odczynnik chemiczny Guangzhou Fabryka Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>http://www.chemicalreagent.com/</td></tr> <tr><td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>4480441</td><td></td></tr><tr><td>Życie wodne wolne od nukleaz</td><td> Technologie</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-02D-C</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-02D-C</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet&nbsp;</td><td>Wysokiej jakości produkty</td><td></td> naukowe <td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td></tr><tr><td>Mini kolumny RNA PureLink</td><td>Thermo Fisher</td><td>A29839</td><td></td></tr><tr><td>RecoverAll Kompletny zestaw do izolacji kwasów nukleinowych</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka stołowa</td><td>SCILOGES</td><td>S1010E</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td> Life <td>Technologies</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikro analizator kwasów nukleinowych</td><td>BEIJING ORIENTAL SCIENCE & ROZWÓJ TECHNOLOGII SP. Z O.O.</td><td>BD-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie wielogenowego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w raku żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych

Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform

Rak żołądka jest powszechnym nowotworem niejednorodnym. Większość pacjentów ma zaawansowanego raka żołądka w momencie diagnozy i często wymaga chemioterapii. Chociaż 5-fluorouracyl (5-FU) jest szeroko stosowany w leczeniu, jego czułość terapeutyczna i tolerancja na lek nadal muszą zostać określone, co podkreśla znaczenie zindywidualizowanego podawania. Farmakogenetyka może pomóc w klinicznym wdrożeniu zindywidualizowanego leczenia. Polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP), jako marker genetyczny, przyczyniają się do doboru odpowiednich schematów i dawek chemioterapii. Niektóre SNP są związane z metabolizmem kwasu foliowego, celem terapeutycznym 5-FU. Reduktaza metylenotetrahydrofolianu (MTHFR) rs1801131 i rs1801133, reduktaza dihydrofolianowa (DHFR) rs1650697 i rs442767, syntaza metioniny (MTR) rs1805087, hydrolaza gamma-glutamylowa (GGH) rs11545078 i nośnik substancji rozpuszczonej 19 członek 1 (SLC19A1) rs1051298 były badane w różnych rodzajach nowotworów i przeciwnowotworowych lekach przeciwfolianowych, które mają potencjalne znaczenie prognostyczne i przewodnie dla zastosowanie 5-FU. Technologia sekwencjonowania półprzewodników nowej generacji może szybko wykrywać SNP związane z rakiem żołądka. Za każdym razem, gdy zasada jest wydłużana w łańcuchu DNA, uwalniany jest H+, powodując lokalne zmiany pH. Czujnik jonowy wykrywa zmiany pH i przekształca sygnały chemiczne w sygnały cyfrowe, uzyskując sekwencjonowanie przez syntezę. Technika ta charakteryzuje się niskim zapotrzebowaniem na próbkę, prostą obsługą, niskimi kosztami i dużą szybkością sekwencjonowania, co jest korzystne dla prowadzenia zindywidualizowanej chemioterapii przez SNP.

Ten protokół proponuje całościowe procedury laboratoryjne wymagane do wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w próbkach raka żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych. Szczegółowo opisano również sekwencje docelowe, adaptery ligaturujące, wzmacnianie i oczyszczanie biblioteki oraz kryteria kontroli jakości.

Wykrywanie wielogenowego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w raku żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych

Gastric cancer is a common heterogeneous tumor. Most patients have advanced gastric cancer at the time of diagnosis and often need chemotherapy. Although ...

Nasz zespół badawczy skupia się na elementach, które decydują o wrażliwości i odporności na 5-fluorouracyl, kluczowy środek chemioterapeutyczny w raku żołądka, kładąc nacisk na wnioski genetyczne. Naszym celem jest odkrycie, w jaki sposób różnice genetyczne wpływają na reakcje na leki i ocena możliwości dostosowania leczenia do indywidualnych profili genetycznych. Protokół ten jest dostosowany do wykrywania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów u pacjentów z rakiem żołądka, wyjaśniając korelację między mutacjami genetycznymi a ich wrażliwością na chemioterapię fluorouracylem.To przełomowe odkrycie umożliwia przewidywanie reakcji pacjentów na fluorouracyl, ułatwiając dostosowanie strategii leczenia. Protokół ten wyróżnia się wysoką czułością dla różnych typów próbek, w tym krwi, zmniejszając inwazyjność w przypadku wielu próbek. Wykorzystanie sekwencjonowania półprzewodników upraszcza operacje, a co za tym idzie czas, dzięki bezpośredniemu wykrywaniu zmian jonów przez przepuszczanie fluorouracyli.Na początek weź kwasy nukleinowe wyekstrahowane z próbek tkanek raka żołądka zatopionych w parafinie. Umieść na lodzie elementy wykonanego na zamówienie zestawu do wykrywania wielogenowego raka żołądka na lodzie. Po dokładnym wymieszaniu składników odwiruj je przez 10 sekund, a następnie sekwencyjnie dodaj odczynniki do 0,2 mililitrowej probówki PCR i mieszaj przez pięć sekund przez wirowanie.Umieść każdą probówkę reakcyjną na termocyklerze i uruchom program amplifikacji dla próbek DNA i produktów cDNA. Rozmrozić enzym trawienia startera na lodzie. Dodaj dwa mikrolitry enzymu trawienia startera do każdej probówki reakcyjnej.Po wirowaniu i odwirowaniu probówek umieść je na termocyklerze i uruchom program mineralizacji. Rozmrozić adapter łączący odczynniki na lodzie. Oznacz 1,5 mililitra probówkę mikrowirówki jako mieszaninę adaptera X i dodaj wymagane składniki.Pobrać strawiony produkt podkładowy z termocyklera. Dodać odczynniki do ligacji do probówki, wirować przez pięć sekund i wirować z niską prędkością przez 10 sekund przy 2 500 G. Następnie umieść probówkę na termocyklerze i uruchom program amplifikacji dla próbek DNA i produktów cDNA. Na początek usuń kulki magnetyczne oczyszczające DNA z lodówki o temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza.Po wymieszaniu odwirować kulki przez 10 sekund przy 2,500 G. Przenieś podwiązany produkt reakcji adaptera do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej o niskiej absorpcji. Dodaj 45 mikrolitrów oczyszczonych kulek magnetycznych DNA do każdej probówki.Po wirowaniu składników odwirować probówkę przez 10 sekund. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na trzy minuty. Ostrożnie wyrzucić supernatant bez pipetowania kulek.Teraz przenieś 300 mikrolitrów 75% świeżo przygotowanego etanolu do każdej probówki mikrowirówkowej. Delikatnie obróć rurki cztery razy o 180 stopni. Gdy roztwór się klaruje, należy natychmiast wyrzucić supernatant, unikając pipetowania kulek.Następnie krótko odwiruj probówki po wyjęciu probówek ze stojaka na magnesy. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i odpipetuj pozostały płyn. Otwórz nakrętki 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych i pozostaw kulki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Po rozmrożeniu i wirtowaniu odczynników związanych z PCR, odwirować odczynniki przez 10 sekund. Wyjmij 1,5-mililitrową probówkę mikrowirówkową ze stojaka magnetycznego i dodaj odczynniki PCR. Krótko odwiruj rurkę wirową, aby uniknąć kropli cieczy na ściance i pokrywie probówki.Następnie przenieś produkt PCR do nowej probówki PCR. Inkubuj na termocyklerze i uruchom program amplifikacji próbek DNA i cDNA po odwirowaniu inkubacyjnym do probówki PCR na 10 sekund i przenieś produkt do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej o niskiej absorpcji. Dodaj 25 mikrolitrów oczyszczonych kulek magnetycznych DNA do każdej probówki i dobrze wymieszaj przez wirowanie.Odwirować probówkę z niską prędkością i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym na trzy minuty, aż roztwór się klaruje. Przenieść supernatant do nowych probówek do mikrowirówek, unikając pipetowania kulek.Przenieś 300 mikrolitrów 75% świeżo przygotowanego etanolu do probówek i umyj kulki dwa razy za pomocą stojaka magnetycznego, jak pokazano wcześniej. Po krótkim odwirowaniu probówek umieść je na ruszcie i odpipetuj pozostały płyn. Otwórz nakrętki tubek o pojemności 1,5 mililitra i susz kulki w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Odpipetować 50 mikrolitrów eluentu do probówek. Wykonaj krótkie wirowanie po wirowaniu probówek. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na trzy minuty, aż roztwór stanie się klarowny.Ostrożnie przenieś płyn do nowej probówki i oznacz ją nazwą biblioteki.

multi-gene-single-nucleotide-polymorphism-detection-gastric-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

Identyfikacja wariantów genetycznych przyczyniających się do złożonych chorób ludzkich pozwala nam zidentyfikować nowe mechanizmy. W tym miejscu demonstrujemy podejście do genotypowania multipleksowego genów kandydujących lub analizy szlaków genowych, które maksymalizuje pokrycie przy niskich kosztach i jest podatne na badania kohortowe.

Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas

Tutaj wprowadzamy metodę sekwencjonowania półprzewodników do preimplantacyjnych testów genetycznych na aneuploidię (PGT-A) z zaletami krótkiego czasu realizacji, niskich kosztów i wysokiej przepustowości.

Sekwencjonowanie półprzewodników do preimplantacyjnych badań genetycznych w kierunku aneuploidii

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Tutaj opisujemy procedurę analizy całego genomu metylacji DNA w nowotworach przewodu pokarmowego. Procedura ta ma znaczenie dla badań, które badają związki między wzorcami metylacji genów a czynnikami przyczyniającymi się do kancerogenezy w nowotworach przewodu pokarmowego.

Analiza całego genomu metylacji DNA w raku przewodu pokarmowego

Protokół przedstawia ogólne procedury laboratoryjne wymagane w preimplantacyjnych testach genetycznych na aneuploidię na platformie sekwencjonowania nowej generacji opartej na półprzewodnikach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe etapy amplifikacji całego genomu, selekcji fragmentów DNA, budowy biblioteki, przygotowania szablonów i przepływu roboczego sekwencjonowania z reprezentatywnymi wynikami.

Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii na półprzewodnikowej platformie sekwencjonowania nowej generacji

Wzrost liczby biomarkerów molekularnych do testowania w leczeniu leczenia niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NS-NSCLC) skłonił do opracowania szybkich i niezawodnych metod wykrywania molekularnego. Opisujemy przebieg pracy do oceny zmian genomowych u pacjentów z NS-NSCLC przy użyciu podejścia ultraszybkiego sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

Ultraszybkie sekwencjonowanie nowej generacji oparte na amplikonie w niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym raku płuca

Poznaj metodę wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w raku żołądka przy użyciu sekwencjonowania półprzewodnikowego. Ta technika umożliwia personalizację terapii fluorouracylem na podstawie profilu genetycznego pacjenta.

Wykrywanie wielogenowego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w raku żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie wielogenowego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w raku żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych

Przeglądaj więcej filmów