Wykrywanie wielogenowego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w raku żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych

Nasz zespół badawczy skupia się na elementach, które decydują o wrażliwości i odporności na 5-fluorouracyl, kluczowy środek chemioterapeutyczny w raku żołądka, kładąc nacisk na wnioski genetyczne. Naszym celem jest odkrycie, w jaki sposób różnice genetyczne wpływają na reakcje na leki i ocena możliwości dostosowania leczenia do indywidualnych profili genetycznych. Protokół ten jest dostosowany do wykrywania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów u pacjentów z rakiem żołądka, wyjaśniając korelację między mutacjami genetycznymi a ich wrażliwością na chemioterapię fluorouracylem.

To przełomowe odkrycie umożliwia przewidywanie reakcji pacjentów na fluorouracyl, ułatwiając dostosowanie strategii leczenia. Protokół ten wyróżnia się wysoką czułością dla różnych typów próbek, w tym krwi, zmniejszając inwazyjność w przypadku wielu próbek. Wykorzystanie sekwencjonowania półprzewodników upraszcza operacje, a co za tym idzie czas, dzięki bezpośredniemu wykrywaniu zmian jonów przez przepuszczanie fluorouracyli.

Na początek weź kwasy nukleinowe wyekstrahowane z próbek tkanek raka żołądka zatopionych w parafinie. Umieść na lodzie elementy wykonanego na zamówienie zestawu do wykrywania wielogenowego raka żołądka na lodzie. Po dokładnym wymieszaniu składników odwiruj je przez 10 sekund, a następnie sekwencyjnie dodaj odczynniki do 0,2 mililitrowej probówki PCR i mieszaj przez pięć sekund przez wirowanie.

Umieść każdą probówkę reakcyjną na termocyklerze i uruchom program amplifikacji dla próbek DNA i produktów cDNA. Rozmrozić enzym trawienia startera na lodzie. Dodaj dwa mikrolitry enzymu trawienia startera do każdej probówki reakcyjnej.

Po wirowaniu i odwirowaniu probówek umieść je na termocyklerze i uruchom program mineralizacji. Rozmrozić adapter łączący odczynniki na lodzie. Oznacz 1,5 mililitra probówkę mikrowirówki jako mieszaninę adaptera X i dodaj wymagane składniki.

Pobrać strawiony produkt podkładowy z termocyklera. Dodać odczynniki do ligacji do probówki, wirować przez pięć sekund i wirować z niską prędkością przez 10 sekund przy 2 500 G. Następnie umieść probówkę na termocyklerze i uruchom program amplifikacji dla próbek DNA i produktów cDNA. Na początek usuń kulki magnetyczne oczyszczające DNA z lodówki o temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza.

Po wymieszaniu odwirować kulki przez 10 sekund przy 2,500 G. Przenieś podwiązany produkt reakcji adaptera do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej o niskiej absorpcji. Dodaj 45 mikrolitrów oczyszczonych kulek magnetycznych DNA do każdej probówki.

Po wirowaniu składników odwirować probówkę przez 10 sekund. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na trzy minuty. Ostrożnie wyrzucić supernatant bez pipetowania kulek.

Teraz przenieś 300 mikrolitrów 75% świeżo przygotowanego etanolu do każdej probówki mikrowirówkowej. Delikatnie obróć rurki cztery razy o 180 stopni. Gdy roztwór się klaruje, należy natychmiast wyrzucić supernatant, unikając pipetowania kulek.

Następnie krótko odwiruj probówki po wyjęciu probówek ze stojaka na magnesy. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i odpipetuj pozostały płyn. Otwórz nakrętki 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych i pozostaw kulki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Po rozmrożeniu i wirtowaniu odczynników związanych z PCR, odwirować odczynniki przez 10 sekund. Wyjmij 1,5-mililitrową probówkę mikrowirówkową ze stojaka magnetycznego i dodaj odczynniki PCR. Krótko odwiruj rurkę wirową, aby uniknąć kropli cieczy na ściance i pokrywie probówki.

Następnie przenieś produkt PCR do nowej probówki PCR. Inkubuj na termocyklerze i uruchom program amplifikacji próbek DNA i cDNA po odwirowaniu inkubacyjnym do probówki PCR na 10 sekund i przenieś produkt do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej o niskiej absorpcji. Dodaj 25 mikrolitrów oczyszczonych kulek magnetycznych DNA do każdej probówki i dobrze wymieszaj przez wirowanie.

Odwirować probówkę z niską prędkością i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym na trzy minuty, aż roztwór się klaruje. Przenieść supernatant do nowych probówek do mikrowirówek, unikając pipetowania kulek.

Przenieś 300 mikrolitrów 75% świeżo przygotowanego etanolu do probówek i umyj kulki dwa razy za pomocą stojaka magnetycznego, jak pokazano wcześniej. Po krótkim odwirowaniu probówek umieść je na ruszcie i odpipetuj pozostały płyn. Otwórz nakrętki tubek o pojemności 1,5 mililitra i susz kulki w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Odpipetować 50 mikrolitrów eluentu do probówek. Wykonaj krótkie wirowanie po wirowaniu probówek. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na trzy minuty, aż roztwór stanie się klarowny.

Ostrożnie przenieś płyn do nowej probówki i oznacz ją nazwą biblioteki.