Name: Wykorzystanie testu rozszczepienia pod tarczami i znakowania (CUT and Tag) w badaniach mioblastów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Poznaj technikę CUT&Tag do badania modyfikacji epigenetycznych H3K4me1 w mioblastach myszy. Ta metoda umożliwia analizę chromatyny w rzadkich populacjach komórek macierzystych mięśni szkieletowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Strategiczny Priorytetowy Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk (XDA16020400 do PH); Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (32170804 do PH).

Profiling Genomic Histone Marks in Mouse Myoblasts Using CUT&#38;Tag

<ol><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+generating+high-resolution+maps+of+genome-wide+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding.</a> eLife. 4, e09225(2015).</li>
<li>Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+micrococcal+nuclease+and+exonuclease+III+digestion+reveals+precise+positions+of+the+nucleosome+core%2Flinker+junctions%3A+implications+for+high-resolution+nucleosome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping.</a> J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).</li>
<li>Policastro, R. A., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+methods+for+genome-wide+profiling+of+protein+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites.</a> Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).</li>
<li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, e21856(2017).</li>
<li>Mezger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+accessibility+profiling+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution.</a> Nat Commun. 9, 3647(2018).</li>
<li>Zheng, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nat Commun. 8, 14049(2017).</li>
<li>Nakka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JMJD3+activated+hyaluronan+synthesis+drives+muscle+regeneration+in+an+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment.</a> Science. 377 (6606), 666-669 (2022).</li>
<li>Fu, X., Wang, H., Hu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+activation+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Stem cell activation in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).</li>
<li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skelet Muscle. 6, 35(2016).</li>
<li>Giordani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+single-cell+cartography+reveals+novel+skeletal+muscle-resident+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations.</a> Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+inflammation-related+cytokines+promotes+long-term+muscle+stem+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion.</a> Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+transcription+factor+profiling+in+rare+stem+cell+populations+using+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&Tag.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100751(2021).</li>
<li>Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD%3A+a+regulatory+gene+of+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, discussion 3-6 (1990).</li>
<li>Wardle, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+control%3A+transcriptional+regulation+of+mammalian+Myod%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod.</a> J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).</li>
<li>Local, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+H3K4me1-associated+proteins+at+mammalian+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers.</a> Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Faralli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UTX+demethylase+activity+is+required+for+satellite+cell-mediated+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).</li>
<li>Yang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+transcriptional+activation+of+MyoD+mediated+by+replication-independent+histone+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag.</a> Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Określona liczba komórek wymagana w określonej reakcji CUT&Tag całkowicie zależy od wzbogacenia znaków/wariantów histonów lub białek wiążących chromatynę, które mają być badane. Zwykle w przypadku bardzo wzbogaconych znaczników histonowych, takich jak H3K4me1, H3K4me3 i H3K27ac itp., 25 000-50 000 mioblastów jest wystarczające dla jednej reakcji CUT&Tag. Jednak niektóre rzadkie białka wiążące chromatynę mogą wymagać nawet 250 000 komórek. Liczba komórek używana w testach CUT&Tag jest krytyczna, która, jeśli nie jest dobrze obsługiwana, zwykle powoduje niepowodzenie testu. Użycie nadmiernej liczby komórek w reakcji CUT&Tag jest szkodliwe, zwłaszcza w przypadku badania bardzo wzbogaconych znaczników histonowych. Rozpoczęcie od zbyt wielu komórek oznacza niewystarczającą ilość przeciwciał przydzielonych do każdej komórki. CUT&Tag działa nie tylko w przypadku bardzo małej liczby komórek, ale może być stosowany na poziomiepojedynczej komórki 1.
Przede wszystkim zastosowanie wiarygodnego i zwalidowanego przeciwciała o wysokim powinowactwie i swoistości jest zawsze kluczem do udanego testu CUT&Tag. Podobnie jak testy ChIP, immunoprecypitacji (IP) i IF, CUT&Tag wymaga również rodzaju przeciwciał, które mogą rozpoznać naturalnie sfałdowane antygeny1. W przeciwieństwie do tego, przeciwciała, które rozpoznają tylko zrelaksowane peptydy w Western blot, powinny być bezwzględnie unikane w CUT&Tag.
Jeśli optymalizacja liczby komórek lub użycie zwalidowanego immunofluorescencyjnie lub dobrze cytowanego przeciwciała nadal nie może rozwiązać problemu słabego sygnału w teście CUT&Tag, sprawdź, czy białko będące przedmiotem zainteresowania jest białkiem związanym z chromatyną, które słabo wiąże się lub nawet nie wiąże się bezpośrednio z DNA. W takim przypadku, jak wspomniano wcześniej, przełącz się na używanie CUT&RUN zamiast CUT&Tag. Alternatywnie, lekka fiksacja, taka jak 5 minut w 0,5% paraformaldehydzie (a następnie 10 minut hartowanie w 0,1 M glicynie), może być metodą wartą przetestowania. Ponieważ jednak nigdy nie praktykowaliśmy utrwalania w żadnych testach CUT&Tag, ani nawet nie natknęliśmy się na konieczność utrwalania komórek przed wykonaniem CUT&Tag, nie możemy udzielić dalszych uwag na temat sieciowania.
Rozumiemy, że niektóre wersje protokołów CUT&Tag mogą twierdzić, że zarówno RT (2 godziny), jak i 4 °C (przez noc) dla etapu inkubacji przeciwciał pierwotnych mogą przynieść przyzwoite wyniki21. Zalecamy jednak stosowanie 4 °C (przez noc), a nie RT przez 2 godziny. Z drugiej strony nie zaleca się również przedłużania czasu inkubacji dłużej niż jedną noc.
Jeśli chodzi o czułość, kontrolę tła i stopień złożoności dla badaczy, CUT&Tag jest lepszy od testów ChIP. Jeśli trzeba mieć pewne wady dla CUT&Tag w porównaniu z ChIP, to jedyną z nich jest to, że protokoły CUT&Tag nie zawierają wewnętrznej metody normalizacji, takiej jak użycie "Input" w teście ChIP1. W związku z tym, porównując wysokości pików między próbkami za pomocą CUT&Tag, badacze muszą na początek wyrównać liczbę komórek między próbkami. Niezwykle ważne jest również uwzględnienie replik technicznych.
Protokół ten przedstawia pełne szczegóły wykonywania CUT&Tag w mysich mioblastach, dostarczając udanego przykładu H3K4me1 CUT&Tag w tym typie komórek. Opisana tutaj metoda może być bezpośrednio zastosowana do świeżo wyizolowanych MuSC bez żadnych modyfikacji. Co więcej, eksperymenty CUT&Tag dotyczące znaczników histonowych, wariantów histonów lub czynników transkrypcyjnych w innych typach komórek mogą być również przeprowadzane zgodnie z tym protokołem. W przypadku miotub lub włókien mięśniowych jądra można najpierw wyizolować, a następnie przeprowadzić CUT&Tag na jądrach mięśniowych. W ten sposób można traktować jądra w taki sam sposób, w jaki traktuje się komórki w tym protokole CUT&Tag. Miorurki i włókna mięśniowe są komórkami wielojądrowymi i nie testowaliśmy, czy miorurki lub włókna mięśniowe mogą być bezpośrednio związane z kulkami Concanavalin-A, chociaż może to być wykonalne.

Test CUT&Tag został wynaleziony, aby zrekompensować niektóre jawne wady ChIPs1. Dwie główne wady ChIP to: 1) stronniczość wynikająca z fragmentacji chromatyny oraz 2) niekompetencja do pracy z niską liczbą komórek. Testy X-ChIP opierają się na sonikacji lub trawieniu MNazy w celu uzyskania fragmentów chromatyny, podczas gdy N-ChIP najczęściej wykorzystuje trawienie MNazy w celu uzyskania nukleosomów. Sonikacja wykazuje skłonność do zrelaksowanych lokalizacji chromatyny, takich jak regiony promotorowe2, i najwyraźniej trawienie MNazy działa również wydajniej na rozluźnione włókna chromatyny. Co więcej, niektórzy stwierdzili, że trawienie MNazy wykazuje również stronniczość zależną od sekwencji DNA3. W związku z tym, na etapie przygotowania danych wejściowych testów ChIP, niemożliwe jest uzyskanie fragmentów chromatyny ze wszystkich rodzajów lokalizacji genomowych w sposób idealnie losowy. Co więcej, testy ChIP zwykle generują wyższe sygnały tła w porównaniu do CUT&Tag i wymagają ponad 10 razy więcej odczytów niż CUT&Tag, aby zaakcentować, gdzie znajdują się szczyty1,4,5. To wyjaśnia, dlaczego eksperymenty ChIP muszą zaczynać się od znacznie większej liczby komórek niż CUT&Tag. Nie stanowi to problemu podczas badania linii komórkowych, ponieważ mogą one być powtarzalnie pasażowane, aby osiągnąć bardzo wysoką liczbę komórek. Jednak test ChIP zdecydowanie nie jest silnym narzędziem epigenetycznym do badania rzadkich lub cennych populacji komórek pierwotnych, chociaż komórki pierwotne mają oczywiście bardziej praktyczne i medyczne implikacje.
Podczas gdy długa i skomplikowana procedura ChIP zniechęca niektórych badaczy do nauki lub korzystania z tej techniki, ludzie czują się bardziej komfortowo z łatwiejszymi testami, takimi jak immunocytochemia (ICC) lub immunofluorescencja (IF). Test CUT&Tag zasadniczo przypomina proces eksperymentów ICC i IF, ale odbywa się tylko w probówce. CUT&Tag nie potrzebuje na początku rozdrobnionej chromatyny, a zamiast tego genom musi być nienaruszony, aby związać przeciwciała1. W pierwszym dniu eksperymentu ChIP badacze zwykle spędzają do 4 godzin na przygotowaniu pofragmentowanych chromatyn z jąder za pomocą sonikacji lub trawienia MNazy, zanim krótkie fragmenty chromatyny będą mogły zostać zmieszane z kulkami przeciwciała4,5. W przeciwieństwie do tego, pierwszy dzień pracy procedury CUT&Tag polega po prostu na unieruchomieniu komórek za pomocą kulek Concanavalin-A, a następnie dodaniu przeciwciała pierwotnego do kulek komórkowych. Wymaga to tylko ~40 min1.
Warto wspomnieć, że Cięcie pod Cele i Uwalnianie za pomocą Nukleazy (CUT&RUN) jest ważną alternatywą dla CUT&Tag. CUT&RUN powstał w oparciu o podobny mechanizm działania jak CUT&Tag. W CUT&Tag przeciwciała kierują transpozazę pA/G-Tn5 do wszystkich miejsc, w których enzym wycina fragment chromatyny, a w międzyczasie znakuje go adapterami tworzącymi bibliotekę, podczas gdy w CUT&RUN rolę pA/G-Tn5 pełni pA/G-MNaza, która wykonuje tylko część tnącą zadania6. W związku z tym, w porównaniu do CUT&Tag, CUT&RUN wymaga dodatkowego etapu, którym jest przyklejenie adapterów bibliotecznych do fragmentaryzowanych fragmentów DNA pA/G-MNase7,8. Ze względu na duże podobieństwa między CUT&Tag i CUT&RUN, badacze zaznajomieni z CUT&Tag z łatwością przystosują się do biegłego wykonywania CUT&RUN. Należy jednak zauważyć, że istnieją pewne drobne różnice między CUT&Tag a CUT&RUN. Protokoły CUT&RUN zwykle wykorzystują fizyczne stężenie soli (~150 mM) na etapach mycia, podczas gdy w CUT&Tag bufor myjący 300-Dig ma wysoką zawartość soli. Dlatego CUT&Tag jest dobry w kontrolowaniu tła podczas profilowania znaczników/wariantów histonów lub czynników transkrypcyjnych, ponieważ białka te bezpośrednio i silnie wiążą DNA1. CUT&Tag może napotkać problemy podczas profilowania czynników związanych z chromatyną, które nie wiążą bezpośrednio DNA i wykazują słabe powinowactwo do chromatyny. Etapy mycia o wysokiej zawartości soli w CUT&Tag mogą usunąć czynniki związane z chromatyną i nie powodować żadnych sygnałów w końcowym wyjściu. Chociaż istnieją udane przypadki, w których CUT&Tag może być używany do profilowania niektórych białek niebędących czynnikami histone/nietranskrypcyjnymi9, nadal zalecamy CUT&RUN zamiast CUT&Tag w celu profilowania słabo związanych białek związanych z chromatyną.
Po osiągnięciu przez ssaki wieku dorosłego, ich tkanki mięśni szkieletowych nadal zawierają komórki macierzyste mięśni. Podczas urazu mięśni te komórki macierzyste mogą być aktywowane i ulegać ekspansji i różnicowaniu liczby komórek w celu regeneracji uszkodzonych włókien mięśniowych10. Te komórki macierzyste są znane jako komórki macierzyste mięśni / satelitarne (MuSC). Po wyizolowaniu MuSC od zwierząt lub aktywacji przez uszkodzenie mięśni, zaczynają się namnażać i stają się mioblastami.
Aby uzyskać MuSCs z trawienia mięśni szkieletowych myszy, często używane są markery powierzchniowe MuSC, takie jak Vcam1 (Cd106), Cd34 i α7-integryna (Itga7) pojedynczo lub w kombinacjach do wzbogacania MuSC podczas sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)11. Wykazano, że Cd31-/Cd45-/Sca1-/Vcam1+ jest prawdopodobnie najlepszą kombinacją markerów, aby uzyskać >95% czystych MuSCs12. FACS może wyizolować czyste MuSC zaraz po strawieniu świeżych mięśni. Jeśli jednak projekt eksperymentalny nie wymaga czystych MuSC bezpośrednio w momencie ich izolacji, wstępne posiewy są bardziej opłacalne niż FACS w celu uzyskania >90% czystych mioblastów (potomstwo MuSC).
MuSCs świeżo wyizolowane od myszy nie namnażają się efektywnie w pożywce F10 Hama uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS). Aby lepiej zwiększyć liczbę komórek MuSC i uzyskać wystarczającą ilość mioblastów, zamiast FBS należy stosować bydlęcą surowicę wzrostu (BGS). Jeśli jednak BGS nie jest dostępny, pełne podłoże F10 Hama (zawierające około 20% FBS) można zmieszać z równą objętością pożywki warunkowej komórek T, aby radykalnie przyspieszyć ekspansję mioblastów13. W związku z tym protokół ten będzie również opisywał przygotowanie pożywek MuSC kondycjonowanych pożywkami z komórek T.
Najważniejsze, ten protokół dostarcza kompletnego przykładu przeprowadzania testów H3K4me1 CUT&Tag na mysich mioblastach wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy. Należy pamiętać, że protokół ten dotyczy również innych typów komórek oraz znaczników histonów i wariantów histonów, a czytelnicy muszą jedynie zoptymalizować liczbę komórek lub ilości przeciwciał dla swoich przypadków w oparciu o wzbogacenie określonych znaczników histonów lub wariantów, które badają.
Aby można było użyć w CUT&Tag lub CUT&RUN, Tn5 lub MNaza musi być połączona z białkiem A lub białkiem G, aby wytworzyć pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNazę lub pG-MNazę. Wygląda na to, że zarówno białko A, jak i białko G mogą być łączone z tymi enzymami w tym samym czasie, aby wytworzyć pA/G-Tn5 lub pA/G-MNazę. Białko A i białko G wykazują zróżnicowane powinowactwo do IgG różnych gatunków. Dlatego całkowite połączenie białka A i białka G z enzymem może przezwyciężyć ten problem i sprawić, że enzym będzie kompatybilny z przeciwciałami wielu gatunków.

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5275</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Concanavalin-A</td><td>Bangs</td><td>Laboratories BP531</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Przeciwciało Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me1&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>Szynka F10 media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11550043</td><td></td></tr><tr><td>Hiperaktywny uniwersalny CUT& Zestaw do oznaczania tagów dla Illumina&nbsp;</td><td>Vazyme</td><td>TD903</td><td>Ten zestaw został przez nas przetestowany pod kątem prawidłowego działania</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny na probówki EP 1,5 ml</td><td>Qualityard</td><td>QYM06</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny na paski probówek 8-PCR</td><td>Anosun Magnetic</td><td>CLJ16/21-021</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0541L</td><td>Do tworzenia bibliotek Reakcja PCR</td></tr><tr><td>pA-Tn5</td><td>Vazyme</td><td>S603-01</td><td>Przed użyciem należy go zamontować za pomocą adapterów</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Beyotime</td><td>ST535-100mg</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne (świnka morska anty-królicza IgG)</td><td>Przeciwciała-online</td><td>ABIN101961</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>TruePrep Index Kit V2 dla Illumina&nbsp;</td><td>Vazyme</td><td>TD202</td><td>Ten zestaw zawiera podkłady Illumina N7XX i N5XX&nbsp;</td></tr><tr><td>Czyste koraliki VAHTS DNA&nbsp;</td><td>Vazyme</td><td>N411</td><td>Może zastąpić koraliki Ampure XP. Może oczyszczać CUT& Biblioteki znaczników i wybieranie fragmentów DNA według rozmiaru</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie testu rozszczepienia pod tarczami i znakowania (cut&tag) w badaniach mioblastów myszy

Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myoblast Research

Ten dokument o protokole ma na celu dostarczenie nowym badaczom pełnych szczegółów korzystania z Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) do profilowania lokalizacji genomowych czynników wiążących chromatynę, znaczników histonów i wariantów histonów. Protokoły CUT&Tag bardzo dobrze sprawdzają się w przypadku mysich mioblastów i świeżo wyizolowanych komórek macierzystych mięśni (MuSC). Można je łatwo zastosować do wielu innych typów komórek, o ile komórki mogą być unieruchomione przez kulki Concanavalin-A. W porównaniu z CUT&Tag, testy immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) są czasochłonnymi eksperymentami. Testy ChIP wymagają wstępnej obróbki chromatyny, zanim materiał chromatyczny będzie mógł być użyty do immunoprecypitacji. W sieciowaniu ChIP (X-ChIP) wstępna obróbka chromatyny obejmuje sieciowanie i sonikację w celu fragmentacji chromatyny. W przypadku natywnego ChIP (N-ChIP) rozdrobnione chromatyny są zwykle osiągane przez trawienie nukleazy mikrokokowej (MNazy). Zarówno sonikacja, jak i trawienie MNazy wprowadzają pewne odchylenia do eksperymentów ChIP. Testy CUT&Tag mogą być zakończone w mniejszej liczbie kroków i wymagają znacznie mniejszej liczby komórek w porównaniu z ChIP, ale dostarczają bardziej bezstronnych informacji na temat czynników transkrypcyjnych lub znaczników histonowych w różnych lokalizacjach genomu. CUT&Tag może pracować z zaledwie 5 000 komórek. Ze względu na wyższą czułość i niższy sygnał tła niż w przypadku ChIP, naukowcy mogą spodziewać się uzyskania wiarygodnych danych szczytowych z zaledwie kilku milionów odczytów po sekwencjonowaniu.

Przed związaniem komórek z koralikami z konkawaliną A należy sprawdzić zawiesinę komórkową pod mikroskopem. Analogicznie, po inkubacji komórek z koralikami z konkawaliną A należy umieścić probówki z próbkami na statywie magnetycznym, a następnie ponownie zaobserwować nadsącz za pomocą mikroskopu. Służy to ocenie wydajności wychwytu komórek przez koraliki z konkawaliną A. Bufor płukący zawierający 7 x 105 komórek/mL powinien wyglądać pod mikroskopem tak, jak na Rysunku 1A. Z kolei Rysunek 1B przedstawia nadsącz po związaniu z koralikami z konkawaliną A, gdzie koraliki usunęły wszystkie komórki. Nie ma sensu przechodzić do kolejnych etapów procedury CUT&amp;Tag, jeśli koraliki z konkawaliną A nie wychwyciły komórek w sposób wydajny. Bufor płukący nie powinien zawierać surowicy ani EDTA/EGTA, ponieważ mogą one znosić wiązanie błony komórkowej z koralikami z konkawaliną A. Albumina surowicy bydlęcej natomiast nie zakłóca wiązania konkawaliny A z komórkami.
Po przygotowaniu bibliotek CUT&amp;Tag metodą PCR, małą alikwot biblioteki (3-4 µL) można poddać elektroforezie na żelu agarozowym o stężeniu 1,2-1,5%, aby sprawdzić jakość biblioteki. Rycina 2 przedstawia przykład pomyślnie przygotowanych bibliotek CUT&amp;Tag dla H3K4me1. W przypadku CUT&amp;Tag dla modyfikacji histonów lub wariantów histonów większość wyciętych jednostek to zazwyczaj mononukleosomy, choć możliwe jest również wspólne wycięcie dwóch nukleosomów. Jednoczesne wycięcie i oznakowanie trzech nukleosomów byłoby bardzo rzadkie. W związku z tym w elektroforezie bibliotek CUT&amp;Tag dla modyfikacji histonów powinna być obserwowana drabinka nukleosomów zawierająca mononukleosomy, dinukleosomy i bardzo niewielką liczbę trinukleosomów. Nukleosomy zawierają 147 bp DNA, jednak po dodaniu adapterów sekwencyjnych przez transpozazę Tn5 oraz podczas PCR biblioteki, całkowita wielkość mononukleosomu CUT&amp;Tag powinna wynosić około 300 bp, co pokazano na Rycini 2.
Przed poniesieniem kosztów związanych z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem bibliotek CUT&amp;Tag, kolejną metodą kontroli jakości jest przeprowadzenie qPCR z wykorzystaniem starterów specyficznych dla danego locus. Jest to równoważne z wykonaniem ChIP-qPCR. Co więcej, startery specyficzne dla locus w qPCR dla CUT&amp;Tag są projektowane w oparciu o te same zasady, co startery dla ChIP-qPCR. Rysunek 3 przedstawia amplifikację qPCR w różnych lokalizacjach w locus genu Myod1. Myod1 koduje główny czynnik transkrypcyjny, MyoD, który determinuje linię mięśni szkieletowych podczas miogenezy15. Jak pokazano na Rysunku 3, H3K4me1 jest silnie wzbogacony w głównym enhancerze (CER) oraz dystalnym regionie regulacyjnym (DRR) locus Myod1. CER i DRR są bardzo dobrze udokumentowanymi regionami enhancerowymi dla Myod116. Jest to zgodne z dobrze udokumentowanym fenotypem, według którego H3K4me1 specyficznie znakuje enhancery zaktywowane (commissioned enhancers)17. Ponadto Rysunek 3 pokazuje, że poziom H3K4me1 jest bardzo niski w proksymalnym regionie regulacyjnym (PRR), ponieważ nukleosomy w regionie proksymalnym aktywnych promotorów są zazwyczaj modyfikowane za pomocą H3K4me318 zamiast H3K4me1. Wszystkie pary starterów dla ocenianych loci zostały wcześniej opublikowane19,20, a ich sekwencje znajdują się w Tabeli 4. Zazwyczaj, po przeprowadzeniu kontroli jakości poprzez elektroforezę DNA biblioteki oraz qPCR w specyficznych loci, badacze mogą z pewnością przystąpić do sekwencjonowania.
<img alt="Obraz mikroskopowy zmienności gęstości komórek, wynik eksperymentu, pasek skali 200 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66066/66066fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Mioblasty zawieszone w buforze do płukania. Obrazy mikroskopowe wykonane (A) przed i (B) po wiązaniu z koralikami Concanavalin-A. Panel B pokazuje, że w zawiesinie po inkubacji z koralikami Concanavalin-A nie pozostały prawie żadne komórki, co wskazuje na efektywne wychwycenie komórek przez koraliki. Małe cząstki w panelu B to prawdopodobnie nadmiarowe koraliki Concanavalin-A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66066/66066fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Żel elektroforetyczny bibliotek CUT&amp;Tag H3K4me1, widoczne oznakowane nukleosomy dla trzech powtórzeń prób." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66066/66066fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Elektroforeza bibliotek CUT&amp;Tag. Przeprowadzono trzy niezależne analizy CUT&amp;Tag dla H3K4me1, a każdą z nich przekształcono w bibliotekę sekwencjonowania przy użyciu starterów Illumina i reakcji PCR. W każdym badaniu CUT&amp;Tag H3K4me1 wykorzystano 70 000 mysich mioblastów. Biblioteki zawierają głównie oznakowane mononukleosomy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66066/66066fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza CUT&amp;Tag dla H3K4me1 w mioblastach myszy; wykres słupkowy z pikami enhancerów i lokalizacjami genomicznymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66066/66066fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Amplifikacja qPCR w różnych lokalizacjach w locus genu Myod1. qPCR wykazuje, że w mioblastach myszy marka H3K4me1 jest silnie wzbogacona w regionach enhancerów genu Myod1, co jest zgodne z opublikowanymi wnioskami. CER i DRR to opublikowane enhancery Myod1, które znajdują się powyżej promotora Myod1. Należy zauważyć, że w PRR nie występuje akumulacja H3K4me1, co jest również spójne z faktem, że aktywne promotory są głównie znakowane H3K4me3. Wzbogacenia obliczono poprzez normalizację do wzbogacenia H3K4me1 w „pustyni genowej” (gene desert) próbki „Repeat 1”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66066/66066fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa</td>
			<td>Sekwencje (5’-3’):</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-Rev</td>
			<td>phos-CTGTCTCTTATACACATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-A</td>
			<td>TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-B</td>
			<td>GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencje oligonukleotydów do przygotowania Adaptora-A i Adaptora-B do zamontowania na transpozazie pA/G-Tn5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Frakcja</td>
			<td >Objętość</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oczyszczone genomowe DNA po reakcji CUT&amp;Tag</td>
			<td >21 µL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Starter N5XX (10 µM)</td>
			<td >2 µL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Starter N7XX (10 µM)</td>
			<td >2 µL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix</td>
			<td >25 µL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Łącznie 50 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Konfiguracja PCR dla przygotowania biblioteki CUT&amp;Tag z użyciem starterów indeksujących Illumina. W przypadku korzystania z komercyjnego zestawu CUT&amp;Tag, który zawiera odczynniki do PCR biblioteki, takie jak mieszanina polimerazy DNA, należy postępować zgodnie z instrukcją dołączoną do danego zestawu w celu przeprowadzenia PCR biblioteki.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Krok</td >
			<td >Temperatura</td >
			<td >Czas</td >
			<td >Liczba cykli</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1</td >
			<td >72 oC</td >
			<td >3 min</td >
			<td >1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td >
			<td >95 oC</td >
			<td >3 min</td >
			<td >1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3</td >
			<td >98 oC</td >
			<td >10 s</td >
			<td rowspan="2">od 9 do 14</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >4</td >
			<td >60 oC</td >
			<td >5 s, następnie powrót do kroku 3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >5</td >
			<td >72 oC</td >
			<td >1 min</td >
			<td >1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >6</td >
			<td >4 oC</td >
			<td >utrzymanie</td >
			<td >n/d</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3: Program PCR dla przygotowania biblioteki CUT&amp;Tag z wykorzystaniem starterów indeksujących Illumina.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Lokalizacja</td>
			<td >Sekwencje starterów (5’-3’)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">CER</td>
			<td >For: GGG CAT TTA TGG GTC TTC CT</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rev: CTC ATG CCT GGT GTT TAG GG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">-15,000</td>
			<td >For: TGC CCA GAG CCT AGA ATC AT</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rev: TCA TGC ATC CTT GCT GGA TA</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">-7,000</td>
			<td >For: GGC ATG GGA GGT TTA TAG CA </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rev: ATG CCA CTA TGC AAT CCA CA</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">DRR</td>
			<td >For: TCA GGA CCA GGA CCA TGT CT</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rev: CTG GAC CTG TGG CCT CTT AC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">PRR</td>
			<td >For: GAG TAG ACA CTG GAG AGG CTT GG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rev: GAA AGC AGT CGT GTC CTG GG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">CDS1</td>
			<td >For: CAT CTG ACA CTG GAG TCG CTT TG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rev: CAA GCA ACA CTC CTT GTC ATC AC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">CDS2</td>
			<td >For: GTG AGC CTT GCA CAC CTA AGC C</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rev: GTT GCA CTA CAC AGC ATG CCT G</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">Enhancer IgH</td>
			<td >For: ACC CTG GGA AGA CCA TAC TTA ATC T</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rev: CCA TCC ACA CTC GTG CCT TA</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">Pustynia genowa</td>
			<td >For: TCC TCC CCA TCT GTG TCA TC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rev: GGA TCC ATC ACC ATC AAT AAC C</td>
		</tr >
	</tbody >
</table >
Tabela 4: Startery specyficzne dla locus do badania wzbogacenia H3K4me1 w różnych miejscach genu Myod1.

Badacze nowi w dziedzinie epigenetyki uznają CUT&Tag za znacznie łatwiejszą alternatywę dla testów ChIP. Projekt CUT&Tag przyniósł ogromne korzyści badaniom epigenetycznym na rzadkich i pierwotnych populacjach komórek, uzyskując wysokiej jakości dane z bardzo niewielu komórek. Protokół ten opisuje wykonywanie testów H3K4me1 CUT&Tag na mysich mioblastach wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy.

Wykorzystanie testu rozszczepienia pod tarczami i znakowania (CUT&Tag) w badaniach mioblastów myszy

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile ...

Badania naszej grupy koncentrują się na tym, w jaki sposób struktura genomu i transkrypcja w komórkach macierzystych dorosłych mięśni szkieletowych są regulowane i utrzymywane, szczególnie podczas zmian faz komórkowych, takich jak zaangażowanie komórek macierzystych, różnicowanie i starzenie się. Dorosłe komórki macierzyste mięśni szkieletowych, zawierające zaledwie 1% komórek jednojądrowych w tkance mięśniowej, stanowią wyzwanie dla badań cech chromatyny przy użyciu Hi-C, ChIP i ATAC-seq ze względu na ich niedobór w zawiesinach pojedynczych komórek uzyskanych z trawienia mięśni. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest kluczowym narzędziem do profilowania cech genomu.Prostsza, bardziej wydajna technika kontaktowa opracowana przez dr Stevena Henikoffa często przewyższa ChIP, zwłaszcza w badaniu epigenetyki w rzadkich populacjach komórek. Jego łatwość użycia zwiększa jego dostępność dla badaczy, w tym ekspertów niebędących ekspertami w dziedzinie epigenetyki. Na początek dodaj 30 mikrolitrów kulek Concanavalin A do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.Odpipetować 300 mikrolitrów buforu wiążącego do kulek. Odwróć rurkę kilka razy, aby dobrze wymieszać. Następnie umieść rurkę na stojaku magnetycznym.Po sklarowaniu roztworu odpipetować supernatant. Odpipetować 300 mikrolitrów buforu wiążącego do probówki po wyjęciu jej ze stojaka. Odwróć ponownie, aby wymieszać zawartość probówki.Rozprowadzić zawartość probówki równomiernie w trzech probówkach z paskiem probówki 8 PCR. Następnie umieść pasek probówki na stojaku magnetycznym, aż roztwór się wyjaśni. Po usunięciu supernatantu należy odpipetować 10 mikrolitrów buforu wiążącego do probówek i wymieszać.Przygotowane koraliki ułożyć na lodzie do czasu dalszych eksperymentów. Następnie trypsynizuj hodowane mioblasty myszy z płytek. Po odwirowaniu komórek użyj próżni, aby usunąć zastąpić próżnią.Następnie ponownie zawiesić osad w PBS. Odwirować komórki po wykonaniu zliczania komórek w zawiesinie. Następnie ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu do płukania, aby wygenerować gęstość komórek 700 000 komórek na mililitr.Odpipetować 100 mikrolitrów tej zawiesiny komórek do każdej probówki paska probówki do PCR i dobrze wymieszać. Następnie umieść pasek rurki na huśtawce na 10 minut w temperaturze pokojowej, aby kulki konkanawaliny A mogły uchwycić komórki. Zawartość probówek należy ponownie sklarować na stojaku magnetycznym przed odpipetowaniem supernatantu.Na koniec obserwuj supernatant pod mikroskopem, aby ocenić skuteczność wiązania kulki konkanawaliny A z komórkami. Na początek należy odpipetować trzy mikrolitry przeciwciała H3K4me1 do probówki zawierającej 150 mikrolitrów buforu przeciwciała. Odpipetować rozcieńczone przeciwciało do każdej probówki z ośmioma probówkami do PCR, zawierającymi mysie mioblasty sekwestrowane do kulek konkanawaliny A.Odwróć probówki kilka razy, aby dobrze wymieszać zawartość, a następnie umieść probówki na noc na huśtawce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia, po sklarowaniu próbek na stojaku magnetycznym, odpipetować supernatant. Dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej probówki z próbką po odessaniu supernatantu.Wymieszać probówki z próbkami przez odwrócenie i inkubować na huśtawce przez godzinę w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant z oczyszczonej próbki, a następnie odpipetować 200 mikrolitrów buforu do płukania Dig do każdej probówki. Umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym i odpipetuj supernatant.Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu 300-Dig, zawierającego pA / G-Tn5a do każdej probówki. Po zakończeniu inkubacji umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym. Następnie odpipetować oczyszczony supernatant.Teraz dodaj 200 mikrolitrów buforu 300-Dig do każdej probówki. Umieścić probówki z próbkami na wytrząsarce na trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po ostatnim płukaniu dokładnie odpipetować supernatant z każdej magnetycznie sklarowanej probówki.Następnie dodaj 50 mikrolitrów bufora do znakowania. Na koniec inkubuj probówki w maszynie do PCR w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę bez korzystania z funkcji podgrzewania pokrywki instrumentu. Na początek dodaj 150 mikrolitrów buforu do oznaczania do probówek zawierających oznakowane próbki mysich mioblastów.Odpipetować EDTA, SDS i proteinazę K do każdej probówki. Zwiruj zawartość probówek, aby dobrze się wymieszały, a następnie inkubuj probówki w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dwie godziny w maszynie do PCR. Następnie odpipetować każdą próbkę do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych zawierających 200 mikrolitrów mieszaniny chloroformu fenolu.Zmieszaj zawartość probówek, aby je wymieszać. Po zakończeniu wirowania przenieś górną warstwę do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do nowych probówek przed ponownym wirowaniem i odwirowaniem.Zassaj górną warstwę do nowej rurki. Teraz dodaj 550 mikrolitrów 100% etanolu do każdej probówki i dobrze wymieszaj, odwracając. Następnie umieść probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na jedną godzinę, aby wywołać wytrącanie DNA.Odwirować roztwór z maksymalną prędkością przez 15 minut, aby uzyskać osad DNA. Po wylaniu supinatu przemyj granulat 75% etanolem przed ponownym odwirowaniem przez pięć minut. Następnie ponownie zawiesić osad w 21 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody.Skonfiguruj PCR, który ma być używany do przygotowania biblioteki. Do każdej próbki należy użyć innego podkładu N7 XX Illumina i uniwersalnego podkładu N5 XX. Wprowadź numer cyklu PCR do urządzenia, aby uruchomić PCR.Po amplifikacji, elektroforeza trzy mikrolitry bibliotek na aeros żelach. Biblioteki cięć i znaczników zawierały głównie znakowane mononukleosomy o długości około 300 par zasad. QPCR wykazał, że znacznik H3K4me1 był wysoce wzbogacony w regionach wzmacniających gen Myod1.

using-cleavage-under-targets-tagmentation-cut-tag-assay-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film opisuje preparację, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznej analizy etykietowania TUNEL.

Wykrywanie i analiza uszkodzeń DNA w mięśniach szkieletowych myszy in situ metodą TUNEL

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Ten protokół wykorzystuje elektroporację do wprowadzania i ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek we włóknach mięśniowych myszy. Po rekonwalescencji po elektroporacji włókna są izolowane. Poszczególne włókna są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji struktury mięśni.

Elektroporacja DNA, izolacja i obrazowanie włókien mięśniowych

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Szczepienie pod celami i tagmentacją (CUT&amp;Tag) to skuteczna strategia profilowania epigenomicznego chromatyny. Protokół ten przedstawia udoskonaloną strategię CUT&amp;Tag do profilowania modyfikacji histonów w roślinach.

Profilowanie modyfikacji H3K4me3 w roślinach przy użyciu rozszczepienia w ramach celów i tagowania

Gdy transformujący czynnik wzrostu ß białka prekursorowe rodziny są ektopowo wyrażane w zarodkach Xenopus laevis, ulegają one dimeryzacji, rozszczepianiu i są wydzielane do blastocoele, który zaczyna się w późnym stadium blastuli do wczesnego stadium gastruli. Opisano metodę zasysania produktów rozszczepienia z jamy blastocoele do analizy immunoblot.

Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis

Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół do izolacji komórek satelitarnych mięśni kończyn myszy aktywowanym fluorescencyjnie (FACS), przystosowany do badania regulacji transkrypcji we włóknach mięśniowych poprzez rozszczepienie pod tarczami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&amp;RUN).

Wydajny protokół do analizy CUT&RUN mysich komórek satelitarnych izolowanych od FACS

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj technikę CUT&Tag do badania modyfikacji epigenetycznych H3K4me1 w mioblastach myszy. Ta metoda umożliwia analizę chromatyny w rzadkich populacjach komórek macierzystych mięśni szkieletowych.

Wykorzystanie testu rozszczepienia pod tarczami i znakowania (CUT&Tag) w badaniach mioblastów myszy

Przeglądaj więcej filmów