Wykorzystanie testu rozszczepienia pod tarczami i znakowania (CUT&Tag) w badaniach mioblastów myszy
1 marca 2024
Badacze nowi w dziedzinie epigenetyki uznają CUT&Tag za znacznie łatwiejszą alternatywę dla testów ChIP. Projekt CUT&Tag przyniósł ogromne korzyści badaniom epigenetycznym na rzadkich i pierwotnych populacjach komórek, uzyskując wysokiej jakości dane z bardzo niewielu komórek. Protokół ten opisuje wykonywanie testów H3K4me1 CUT&Tag na mysich mioblastach wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy.
Badania naszej grupy koncentrują się na tym, w jaki sposób struktura genomu i transkrypcja w komórkach macierzystych dorosłych mięśni szkieletowych są regulowane i utrzymywane, szczególnie podczas zmian faz komórkowych, takich jak zaangażowanie komórek macierzystych, różnicowanie i starzenie się. Dorosłe komórki macierzyste mięśni szkieletowych, zawierające zaledwie 1% komórek jednojądrowych w tkance mięśniowej, stanowią wyzwanie dla badań cech chromatyny przy użyciu Hi-C, ChIP i ATAC-seq ze względu na ich niedobór w zawiesinach pojedynczych komórek uzyskanych z trawienia mięśni. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest kluczowym narzędziem do profilowania cech genomu.
Prostsza, bardziej wydajna technika kontaktowa opracowana przez dr Stevena Henikoffa często przewyższa ChIP, zwłaszcza w badaniu epigenetyki w rzadkich populacjach komórek. Jego łatwość użycia zwiększa jego dostępność dla badaczy, w tym ekspertów niebędących ekspertami w dziedzinie epigenetyki. Na początek dodaj 30 mikrolitrów kulek Concanavalin A do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.
Odpipetować 300 mikrolitrów buforu wiążącego do kulek. Odwróć rurkę kilka razy, aby dobrze wymieszać. Następnie umieść rurkę na stojaku magnetycznym.
Po sklarowaniu roztworu odpipetować supernatant. Odpipetować 300 mikrolitrów buforu wiążącego do probówki po wyjęciu jej ze stojaka. Odwróć ponownie, aby wymieszać zawartość probówki.
Rozprowadzić zawartość probówki równomiernie w trzech probówkach z paskiem probówki 8 PCR. Następnie umieść pasek probówki na stojaku magnetycznym, aż roztwór się wyjaśni. Po usunięciu supernatantu należy odpipetować 10 mikrolitrów buforu wiążącego do probówek i wymieszać.
Przygotowane koraliki ułożyć na lodzie do czasu dalszych eksperymentów. Następnie trypsynizuj hodowane mioblasty myszy z płytek. Po odwirowaniu komórek użyj próżni, aby usunąć zastąpić próżnią.
Następnie ponownie zawiesić osad w PBS. Odwirować komórki po wykonaniu zliczania komórek w zawiesinie. Następnie ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu do płukania, aby wygenerować gęstość komórek 700 000 komórek na mililitr.
Odpipetować 100 mikrolitrów tej zawiesiny komórek do każdej probówki paska probówki do PCR i dobrze wymieszać. Następnie umieść pasek rurki na huśtawce na 10 minut w temperaturze pokojowej, aby kulki konkanawaliny A mogły uchwycić komórki. Zawartość probówek należy ponownie sklarować na stojaku magnetycznym przed odpipetowaniem supernatantu.
Na koniec obserwuj supernatant pod mikroskopem, aby ocenić skuteczność wiązania kulki konkanawaliny A z komórkami. Na początek należy odpipetować trzy mikrolitry przeciwciała H3K4me1 do probówki zawierającej 150 mikrolitrów buforu przeciwciała. Odpipetować rozcieńczone przeciwciało do każdej probówki z ośmioma probówkami do PCR, zawierającymi mysie mioblasty sekwestrowane do kulek konkanawaliny A.
Odwróć probówki kilka razy, aby dobrze wymieszać zawartość, a następnie umieść probówki na noc na huśtawce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia, po sklarowaniu próbek na stojaku magnetycznym, odpipetować supernatant. Dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej probówki z próbką po odessaniu supernatantu.
Wymieszać probówki z próbkami przez odwrócenie i inkubować na huśtawce przez godzinę w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant z oczyszczonej próbki, a następnie odpipetować 200 mikrolitrów buforu do płukania Dig do każdej probówki. Umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym i odpipetuj supernatant.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu 300-Dig, zawierającego pA / G-Tn5a do każdej probówki. Po zakończeniu inkubacji umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym. Następnie odpipetować oczyszczony supernatant.
Teraz dodaj 200 mikrolitrów buforu 300-Dig do każdej probówki. Umieścić probówki z próbkami na wytrząsarce na trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po ostatnim płukaniu dokładnie odpipetować supernatant z każdej magnetycznie sklarowanej probówki.
Następnie dodaj 50 mikrolitrów bufora do znakowania. Na koniec inkubuj probówki w maszynie do PCR w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę bez korzystania z funkcji podgrzewania pokrywki instrumentu. Na początek dodaj 150 mikrolitrów buforu do oznaczania do probówek zawierających oznakowane próbki mysich mioblastów.
Odpipetować EDTA, SDS i proteinazę K do każdej probówki. Zwiruj zawartość probówek, aby dobrze się wymieszały, a następnie inkubuj probówki w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dwie godziny w maszynie do PCR. Następnie odpipetować każdą próbkę do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych zawierających 200 mikrolitrów mieszaniny chloroformu fenolu.
Zmieszaj zawartość probówek, aby je wymieszać. Po zakończeniu wirowania przenieś górną warstwę do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do nowych probówek przed ponownym wirowaniem i odwirowaniem.
Zassaj górną warstwę do nowej rurki. Teraz dodaj 550 mikrolitrów 100% etanolu do każdej probówki i dobrze wymieszaj, odwracając. Następnie umieść probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na jedną godzinę, aby wywołać wytrącanie DNA.
Odwirować roztwór z maksymalną prędkością przez 15 minut, aby uzyskać osad DNA. Po wylaniu supinatu przemyj granulat 75% etanolem przed ponownym odwirowaniem przez pięć minut. Następnie ponownie zawiesić osad w 21 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody.
Skonfiguruj PCR, który ma być używany do przygotowania biblioteki. Do każdej próbki należy użyć innego podkładu N7 XX Illumina i uniwersalnego podkładu N5 XX. Wprowadź numer cyklu PCR do urządzenia, aby uruchomić PCR.
Po amplifikacji, elektroforeza trzy mikrolitry bibliotek na aeros żelach. Biblioteki cięć i znaczników zawierały głównie znakowane mononukleosomy o długości około 300 par zasad. QPCR wykazał, że znacznik H3K4me1 był wysoce wzbogacony w regionach wzmacniających gen Myod1.
Przegląd
W niniejszym artykule omówiono zalety techniki CUT&Tag w porównaniu do tradycyjnych analiz ChIP w badaniach epigenetyki rzadkich populacji komórek, a konkretnie w dorosłych komórkach macierzystych mięśni szkieletowych. Protokół koncentruje się na przeprowadzaniu analiz H3K4me1 CUT&Tag na myoblastach mysich wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Epigenetyka
- Biologia komórki
- Badania nad komórkami macierzystymi mięśni
Wprowadzenie
- Szkieletowe komórki macierzyste mięśni dorosłych występują rzadko i stanowią zaledwie 1% mononuklearnych komórek w tkance mięśniowej.
- Tradycyjne metody, takie jak ChIP i ATAC-seq, napotykają trudności ze względu na niską dostępność tych komórek.
- CUT&Tag jest prostszą i bardziej wydajną techniką profilowania cech chromatyny.
- Metoda ta zwiększa dostępność dla badaczy, w tym dla osób nieekspertów w dziedzinie epigenetyki.
Cel badania
- Wykazanie skuteczności metody CUT&Tag w badaniu modyfikacji epigenetycznych w rzadkich populacjach komórek.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu przeprowadzania analiz CUT&Tag dla H3K4me1.
- Ułatwienie prowadzenia badań z zakresu epigenetyki szerszemu gronu naukowców.
Zastosowane metody
- Izolacja mioblastów mysich z mięśni kończyn tylnych.
- Przygotowanie kulek z konkanawaliną A do analizy CUT&Tag.
- Zastosowanie protokołu CUT&Tag w celu analizy modyfikacji H3K4me1.
- Gromadzenie danych i analiza cech epigenetycznych.
Główne wyniki
- Metoda CUT&Tag dostarcza wysokiej jakości dane z bardzo niewielkiej liczby komórek.
- Technika ta pozwala na skuteczne profilowanie modyfikacji epigenetycznych w komórkach macierzystych mięśni.
- Wyniki wykazują przewagi metody CUT&Tag nad tradycyjnymi metodami.
- Otrzymane wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia regulacji genomu w komórkach macierzystych mięśni.
Wnioski
- CUT&Tag jest cennym narzędziem dla badaczy zajmujących się epigenetyką w rzadkich populacjach komórek.
- Protokół ten zwiększa możliwość generowania istotnych danych z ograniczonej liczby próbek.
- Niniejsze badanie wspiera szersze zastosowanie metody CUT&Tag w różnych dziedzinach badań biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Profilowanie cech chromatyny w rzadkich populacjach komórek stanowi krytyczne wyzwanie w fazie wczesnego odkrywania i walidacji celów, szczególnie w badaniach nad komórkami macierzystymi mięśni. Metoda CUT&Tag umożliwia wysokoczułe mapowanie czynników wiążących chromatynę oraz modyfikacji histonowych przy użyciu minimalnej liczby komórek, co zwiększa pewność predykcyjną w identyfikacji celów epigenetycznych. Możliwość ta usprawnia selekcję projektów w portfolio i minimalizuje ryzyko związane z wczesnymi hipotezami mechanistycznymi w biologii mięśni i komórek macierzystych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkryć i walidacja celu
- Umożliwia analizę stanu chromatyny i regulacji transkrypcyjnej w rzadkich populacjach komórek.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez mapowanie znaczników histonowych i czynników chromatynowych w konkretnych loci genomicznych.
- Zwiększa pewność prognostyczną dla celów epigenetycznych poprzez redukcję błędu próbkowania i szumu tła.
- Ułatwia selekcję projektów z portfolio dzięki dostarczaniu wiarygodnych danych z ograniczonej ilości materiału biologicznego.
Przesiewy i opracowywanie analiz
- Przygotowuje zwalidowane systemy profilowania chromatyny do późniejszych etapów procesów przesiewania związków.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki modyfikacji histonów i wiązania czynników chromatynowych.
- Umożliwia standaryzację i skalowalność testu dzięki niskim wymaganiom co do liczby komórek.
- Wspiera wiarygodną ocenę modulatorów epigenetycznych w kampaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki profilowania chromatyny z modelami komórek macierzystych mięśni istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć po przedkliniczną walidację mechanizmów epigenetycznych.
- Minimalizuje ryzyko decyzji dotyczących dalszego rozwoju badań poprzez dostarczanie obiektywnych danych o wysokiej rozdzielczości dotyczących chromatyny.
- Wspiera dostosowanie biomarkerów do badań nad regeneracją i różnicowaniem mięśni.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza CUT&Tag integruje się z continuum odkryć – od wczesnej walidacji celu po badania przedkliniczne, szczególnie w sytuacjach, gdy niedobór komórek ogranicza stosowanie tradycyjnych metod opartych na ChIP.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków sygnałowych w rzadkich populacjach komórek macierzystych mięśni.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne profilowanie chromatyny do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Generuje ilościowe dane z sekwencjonowania o niskim poziomie tła, umożliwiając rzetelne porównywanie warunków.
- Badania translacyjne: Łączy mapowanie stanu chromatyny z modelami mięśni istotnymi dla chorób oraz strategiami wyznaczania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, szeroko stosowalną platformę do profilowania chromatyny w różnych typach komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów epigenetycznych.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy dzięki mniejszej liczbie kroków, niższemu zapotrzebowaniu na komórki oraz wyższej czułości w porównaniu do ChIP.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczanie wiarygodnych danych z rzadkich próbek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów epigenetycznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w dziedzinie biologii chromatyny oraz analizy sekwencjonowania nowej generacji.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury służącej do obsługi kulek magnetycznych, PCR oraz sekwencjonowania.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych typów komórek, o ile wykonalna jest immobilizacja za pomocą kulek z Konkanawaliny A.
- Ograniczeniem jest konieczność zastosowania przeciwciał wysokiej jakości oraz starannego obchodzenia się z próbkami w celu zminimalizowania błędów systematycznych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:15
Sequestration of Mouse Myoblasts onto Activated Concanavalin‐A Beads
3:08
Incubation of Mouse Myoblast‐Sequestered Concanavalin‐A Beads with Antibodies for CUT&Tag Assay
4:59
Genomic Purification and Library Preparation of Tagmented Mouse Myoblast DNA for Epigenetic Profiling
