Name: Generowanie linii komórkowej U937 z nokautem RIP1 przy użyciu systemu CRISPR-Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj technologię CRISPR-Cas9 do tworzenia linii komórkowej U937 z nokautem genu RIPK1. Metoda ta pozwala badać sygnalizację komórkową i pokazuje wyzwania w edycji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały sfinansowane przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi (NHLBI) Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH), grant numer NIH 2R15-HL135675-02 dla T.J.L.

Schematyczne przedstawienie procedury przedstawiono na rysunku 1. Przewodnik RNA (gRNA) i sekwencja docelowa podano w tabeli 1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Zbieranie ukierunkowanego na RIP1 wektora ekspresji lentiwirusowej CRISPR gRNA zawierającego endonukleazę Cas9 i oporność na puromycynę z Escherichia coli
<ol>
	<li>Kwadrantowa smuga E. coli zawierająca wektor lentiwirusowy gRNAna płytkach agarowych LB uzupełnionych 100 μg / ml ampicyliny.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37°C przez 1-2 dni, aż poszczególne kolonie będą widoczne w najbardziej rozcieńczonym miejscu na płytce.</li>
	<li>Wybierz pojedynczą kolonię ze sterylną pętlą i indywidualnie dodaj każdą kolonię do 5 ml bulionu LB uzupełnionego 100 μg / ml ampicyliny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Upewnij się, że po dodaniu pojedynczej kolonii dokładnie pipetujesz w górę i w dół, aby zapewnić homogenizację.</li>
	<li>Odpowietrzyć i zakleić taśmą nakrętkę stożkowej probówki o pojemności 50 ml i inkubować w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37°C i 225 obr./min przez 8 godzin.</li>
	<li>Podczas 8-godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C dodać 40 ml bulionu LB uzupełnionego 100 μg/ml ampicyliny do każdej z czterech oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Po 8 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C pobrać 40 μl wyhodowanego E. kultury coli i dodać ją do wszystkich czterech stożkowych probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odpowietrzyć i zakleić taśmą nakrętki stożkowych probówek o pojemności 50 ml i inkubować je w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37°C i 225 obr./min przez 12-16 godzin.</li>
	<li>Po tej inkubacji w temperaturze 37°C odwirować wszystkie probówki o stężeniu 3220 x g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 20 minut, aby zagnieździć wyhodowane bakterie E. coli .</li>
	<li>Zdekantować supernatanty do zlewki na odpady, a następnie połączyć wszystkie cztery granulki w 10 ml bulionu LB uzupełnionego 100 μg/ml ampicyliny.</li>
	<li>Ponownie zakręć połączone granulki z maksymalną prędkością w wahadłowym wirniku kubełkowym przez 20 minut, aby uzyskać pojedynczy pellet.</li>
	<li>Wyrzucić jak najwięcej supernatantów do zlewki na odpady i postępować zgodnie z jedną z następujących opcji: (1) Zamrozić mokry granulat w temperaturze -80° przez okres do 1 miesiąca. (2) Kontynuuj oczyszczanie plazmidu wektora lentiwirusowego. UWAGA: W przypadku wybrania opcji 1 protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek HEK293T oczyszczonym wektorem ekspresyjnym lentiwirusa CRISPR gRNA ukierunkowanym na RIP1
<ol>
	<li>Wysiewaj HEK293T komórki przez noc w stężeniu 3 × 106 do 5 × 106 komórek na 10 cm płytkę zawierającą DMEM z 4,5 g/l D-glukozy, L-glutaminą, 110 mg/l pirogronianem sodu i 10 % inaktywowanym termicznie FBS.</li>
	<li>Następnego dnia upewnij się, że płytki mają około 70%-90% zbieżności, a następnie postępuj zgodnie z protokołem.</li>
	<li>Ustaw transfekcję komórek ze stosunkiem plazmidów 1:1:1:1 (eksperymentalny plazmid CRISPR: pLP1: pLP2: pLP/VSVG) przy użyciu odczynnika do transfekcji w stosunku 3:1 (3 części odczynnika: 1 część plazmidowego DNA), wraz ze zredukowaną pożywką surowicy. UWAGA: Część proporcji pLP1: pLP2: pLP/VSVG to mieszanka opakowaniowa lentiwirusów.<ol>
		<li>Zrównoważyć odczynnik do transfekcji, zredukowaną pożywkę surowicy, plazmidowe DNA CRISPR i mieszankę opakowań lentiwirusowych do temperatury pokojowej przed przygotowaniem transfekcji.</li>
		<li>Wymieszać ze sobą 75 μl odczynnika do transfekcji, 2500 μl zredukowanej pożywki surowicy i 25 μg całkowitego DNA (obliczenia na podstawie analizy spektrofotometru dla plazmidowego DNA CRISPR i stosunku 1:1:1:1 z mieszanką opakowaniową lentiwirusa).</li>
		<li>Pozostaw tę mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut. Ostrożnie odpipetować całą objętość tej mieszaniny do zlewającej się płytki HEK293T komórkowej bezpośrednio do podłoża (nie ma potrzeby zmiany pożywki).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie zamieszaj płytkę, aby zapewnić odpowiednią homogenizację mieszanki transfekcyjnej i podłoża płytkowego. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
</ol>
3. Transdukcja lotiwirusowa komórek U937 lub komórek docelowych
<ol>
	<li>Po zakończeniu 48-godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C przenieść pożywkę z płytki HEK293T ogniwa producenta do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować objętość o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby rozpalić pozostałe HEK293T komórek. Usunąć cały supernatant zawierający wirusa, uważając, aby nie naruszyć granulowanych komórek HEK293T, i przechowywać go w oddzielnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Następnie należy odkazić i wyrzucić probówkę zawierającą granulki do odpowiedniego pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. UWAGA: Supernatanty lentiwirusa na bazie HIV mogą być przechowywane w temperaturze -80°C; Wiąże się to jednak z ryzykiem utraty stabilności wirusa nawet o 55% po pierwszym cyklu zamrażania/rozmrażania19.</li>
	<li>Odliczyć i otrzymać osad składający się z 2 × 106 komórek U937 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie odpowiedniej objętości przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zdekantować supernatant, pozostawiając osad komórek w probówce.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy U937 z całym supernatantem zawierającym wirusa, a następnie odwirować probówkę o sile 290 x g przez 60 minut.</li>
	<li>Po odwirowaniu należy użyć pipety, aby ponownie zawiesić osad z supernatantem zawierającym wirusa znajdującym się już w probówce.</li>
	<li>Umieść rurkę na rotatorze typu end-over-end (lub podobnym urządzeniu obrotowym) na 60 minut.<ol>
		<li>Po tej inkubacji odwirować probówki o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą mieszaniny pożywki w stosunku 1:1 zarówno supernatantów zawierających wirusa, jak i kompletnych pożywek RPMI-1640 uzupełnionych 10% inaktywowanym termicznie FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść mieszaninę komórek na 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej i inkubować w temperaturze 37°C przez 48 godzin.</li>
	<li>Po tej inkubacji odwirować komórki U937 przy 400 x g przez 10 minut i usunąć supernatant.<ol>
		<li>Ponownie zawiesić osad z kompletną pożywką RPMI-1640 uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FBS i 5 μg/ml puromycyny i przenieść komórki do kolby T25.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C nietknięte przez 2-3 tygodnie, upewniając się, że co 1-2 dni sprawdzasz je pod kątem oznak wzrostu komórek. UWAGA: Gdy komórki staną się zlewające się i będą miały zdrowy czas obrotu po początkowym pasażu, można je przetestować pod kątem skuteczności zakończonego protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Testowanie skuteczności zrealizowanego protokołu w tworzeniu komórek z mutacją RIP1 CRISPR z wykorzystaniem analizy Western blot
<ol>
	<li>Generuj komórkowe lizaty białkowe monocytów typu dzikiego (WT) U937, komórek CRISPR bez kierowania (NTC) i zmutowanych komórek RIP1 CRISPR 11,12,13.</li>
	<li>Uruchom te lizaty na żelu SDS-PAGE i przystąp do analizy Western blot14.<ol>
		<li>Najpierw znormalizuj próbki do białka porządkowego.</li>
		<li>Po normalizacji przeanalizuj próbki pod kątem poziomów ekspresji białka RIP1, aby odpowiednio określić sukces tworzenia zmutowanej linii komórkowej RIP1 CRISPR14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po konformacji w analizie western blot komórki można wykorzystać do celów eksperymentalnych.</li>
</ol>

<ol><li>Gostimskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%E2%80%93Cas9%3A+A+History+of+its+discovery+and+ethical+considerations+of+its+use+in+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+%28Mosc.%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR–Cas9: A History of its discovery and ethical considerations of its use in genome editing.</a> Biochem (Mosc.). 87 (8), 777-788 (2022).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual+RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Redman, M., King, A., Watson, C., King, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dis+Child+Educ+Pract+Ed%22%5BJournal%5D)">What is CRISPR/Cas9.</a> Arch Dis Child Educ Pract Ed. 101 (4), 213-215 (2016).</li>
<li>Ebrahimi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+CRISPR+PX-LmGP63+vector+effect+on+pathogenicity+of+Leishmania+major+as+a+primary+step+to+control+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of CRISPR PX-LmGP63 vector effect on pathogenicity of Leishmania major as a primary step to control leishmaniasis.</a> Microb Pathog. 161 (Pt A), 105281(2021).</li>
<li>Ebrahimi, S., Alipour, H., Azizi, K., Kalantari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+px-lmgp63+using+crispr-cas9+as+primary+goal+for+gp63+gene+knockout+in+Leishmania+major+and+leishmanization%5BTitle%5D)+AND+%22Jundishapur+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of px-lmgp63 using crispr-cas9 as primary goal for gp63 gene knockout in Leishmania major and leishmanization.</a> Jundishapur J Microbiol. 14 (1), 112965(2021).</li>
<li>Lim, J. M., Kim, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+and+clinical+applications+of+CRISPR-based+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med+J%22%5BJournal%5D)">Basic principles and clinical applications of CRISPR-based genome editing.</a> Yonsei Med J. 63 (2), 105-113 (2022).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+delivery+to+hard-to-transfect+cells+via+membrane+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation.</a> Sci Adv. 1 (7), 1500454(2015).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+for+the+study+of+hematopoietic+cells+in+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models.</a> J Vis Exp. (152), e59977(2019).</li>
<li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 796991(2021).</li>
<li>Mccaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Dis. , 1-14 (2018).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+prime+the+hyperglycemic+shift+from+apoptosis+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS prime the hyperglycemic shift from apoptosis to necroptosis.</a> Cell Death Dis. 6 (1), (2020).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+trafficking+of+MLKL%2C+Bak%2FBax%2C+and+Drp1+Is+mediated+by+RIP1+and+ROS+which+leads+to+decreased+mitochondrial+membrane+integrity+during+the+hyperglycemic+shift+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial trafficking of MLKL, Bak/Bax, and Drp1 Is mediated by RIP1 and ROS which leads to decreased mitochondrial membrane integrity during the hyperglycemic shift to necroptosis.</a> Int J Mol Sci. 24 (10), 8609(2023).</li>
<li>LaRocca, T. J., Sosunov, S. A., Shakerley, N. L., Ten, V. S., Ratner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemic+conditions+prime+cells+for+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemic conditions prime cells for RIP1-dependent necroptosis.</a> J Biol Chem. 291 (26), 13753-13761 (2016).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+and+its+role+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cytosolic+ATM%2FNEMO%2FRIP1+complex+recruits+TAK1+To+mediate+the+NF-%CE%BAB+and+p38+Mitogen-Activated+Protein+Kinase+%28MAPK%29%2FMAPK-activated+protein+2+responses+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A Cytosolic ATM/NEMO/RIP1 complex recruits TAK1 To mediate the NF-κB and p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/MAPK-activated protein 2 responses to DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 31 (14), 2774-2786 (2011).</li>
<li>Eng, V. V., Wemyss, M. A., Pearson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+RIP+kinases+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of RIP kinases in host-pathogen interactions.</a> Semin Cell Dev Biol. 109, 125-143 (2021).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+in+the+inflammatory+response+and+sepsis%3A+Recent+advances%2C+drug+discovery+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">RIPK1 in the inflammatory response and sepsis: Recent advances, drug discovery and beyond.</a> Front Immunol. 14, 1114103(2023).</li>
<li>Kowolik, C. M., Yee, J. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+human+hepatocytes+with+lentiviral+vectors+pseudotyped+by+Sendai+virus+F+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein.</a> Mol Ther. 5 (6), 762-769 (2002).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Keller, A. A., Maeß, M. B., Schnoor, M., Scheiding, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Transfecting Macrophages.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1784, 187-195 (2018).</li>
<li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THP-1+and+U937+cells.+The+impact+of+food+bioactives+on+health%3A+In+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22models%22%5BJournal%5D)">THP-1 and U937 cells. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo.</a> models. 159 (147), (2015).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 4 (4), 495-505 (2009).</li>
<li>Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+lentiviral+transduction+of+mouse+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (3), 441-450 (2008).</li>
<li>Swainson, L., Mongellaz, C., Adjali, O., Vicente, R., Taylor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of immune cells.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 415, 301-320 (2008).</li>
</ol>

Protokół ten ma na celu dostarczenie szczegółowych instrukcji i analizy potencjalnych pułapek w wydajności i niezawodności transfekcji i transdukcji lentiwirusa w celu stworzenia linii komórkowej U937 z nokautem RIP1. Chociaż ta metoda transfekcji i transdukcji jest pracochłonna i czasochłonna, ogólnie uważa się, że jest to skuteczny sposób na włączenie wybranego endonukleazy gRNA i Cas9 do trudnych do transfekcji linii komórkowych 8,9,20<sup ...

Zastosowanie technologii edycji genów CRISPR/Cas9 szybko się rozwija od czasu jej odkrycia 1,2,3. Zdolność do wbijania lub nokautowania genów w liniach komórkowych lub bakteriach jest nieoceniona dla postępu badań i zrozumienia mechanizmów wewnątrzkomórkowych 1,2,3,4,5,6. System CRISPR-Cas9 ulepsza poprzednie metody edycji genów, takie jak nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji (TALEN), upraszczając inżynierię specyficzności genów. Procedura ta obejmuje dwa podstawowe składniki: przewodnik RNA (gRNA) używany do lokalizacji zamierzonego celu genu oraz Cas9, który jest endonukleazą, która modyfikuje zamierzoną lokalizację genomu za pomocą dwuniciowego pęknięcia DNA 3,4. gRNA będzie działać jako przewodnik dla endonukleazy Cas9 w celu zlokalizowania i zainicjowania dwuniciowego pęknięcia w zamierzonej sekwencji genetycznej poprzez parowanie zasad Watsona-Cricka. Pełny proces edycji genomu przez system CRISPR/Cas9 obejmuje maszynerię komórkową naprawiającą te dwuniciowe pęknięcia w DNA poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub rekombinację homologiczną 3,7. Bardziej prawdopodobne jest, że NHEJ wystąpi, skutecznie tworząc mutację w genomie, która powoduje utratę ekspresji docelowego genu 3,4.
Źródła komercyjne były w stanie stworzyć biblioteki celów gRNA, które mogą być wyrażane poprzez wzrost i izolację bakterii, co znacznie poprawia ich łatwość użycia. Jednak głównym ograniczeniem systemu CRISPR/Cas9 jest trudność w dostarczaniu kompleksu gRNA i Cas9 do docelowych linii komórkowych. Ograniczenia te pojawiają się w liniach komórkowych zawiesinowych, ponieważ są one ogólnie określane jako trudne do transfekcji8. Typowe metody transfekcji nie są na ogół skuteczne w dostarczaniu systemu CRISPR/Cas9 do komórek zawiesinowych, dlatego metody dostarczania wirusa, takie jak transfekcja i transdukcja lentiwirusowa, są lepiej odpowiednie dla tego typu linii komórkowej 8,9.
Ten rodzaj transfekcji wymaga wektora lentiwirusowego, który koduje endonukleazę gRNA i Cas9 wraz z dodanymi plazmidami upakowania lentiwirusa, które są transfekowane do linii komórkowej zdolnej do wytwarzania cząstek lentiwirusowych. Typowo wybieraną linią komórkową do tego procesu są komórki HEK293T, ponieważ są one łatwiejsze do transfekcji i bardzo wydajnie pracują w składaniu gRNA i Cas9 9,10. Cząstki te są następnie uwalniane jako lentiwirusy do supernatantu, który może być wykorzystany do transdukcji gRNA i Cas9 do zamierzonej zawiesinowej linii komórkowej, takiej jak ludzkie monocyty U937. W związku z tym opisana tutaj procedura ma następujące zmiany w porównaniu z ustalonymi metodami: (1) Alternatywna metoda transfekcji dla trudnych do transfekcji linii komórkowych; (2) Nie ma potrzeby koncentrowania plazmidowego DNA CRISPR ani używania ultrawirówki; oraz (3) Eliminuje potrzebę klonowania pojedynczych komórek.
Bezpośrednim celem tego artykułu było wyeliminowanie genu RIP1 w ludzkich monocytach U937. Kanoniczna forma nekroptozy szlaku śmierci komórki o wysokim stanie zapalnym jest kontrolowana przez RIP1, który służy jako kluczowy cel w badaniach nad śmiercią komórki. 11,12,13,14 Gdy RIP1 staje się aktywny poprzez autofosforylację, następnie rekrutuje i powoduje bezpośrednią fosforylację i aktywację kinazy serynowo-białkowej 3 (RIPK3 / RIP3) oddziałującej z receptorem i pseudokinazy podobnej do domeny (MLKL) w celu utworzenia nekrosomu. Po tym utworzeniu nekrosom może swobodnie poruszać się po komórce, aby wchodzić w interakcje z organellami, takimi jak mitochondria12,13. W mitochondriach RIP1 nasila pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego z metabolizmem komórkowym, bezpośrednio wpływając na produkcję mitochondrialnych ROS, co z kolei sprzyja dalszej autofosforylacji RIP1, tworzeniu nekrosomów i dalszemu wykonywaniu nekroptozy 11,12,13,14.
Podczas gdy obecna grupa badawcza skupia się na roli RIP1 w śmierci komórki, inne powody do badania RIP1 obejmują jego rolę w stanach zapalnych i infekcjach. Po aktywacji przez receptory śmierci, takie jak receptory TNF, RIP1 promuje aktywację szlaku sygnałowego NF-κB, który wyzwala transkrypcję cytokin prozapalnych, chemokin i innych cząsteczek niezbędnych do rekrutacji komórek odpornościowych i wzmocnienia odpowiedzi zapalnej15. Oprócz aktywacji NF-κB, RIPK1 może również angażować szlaki sygnałowe MAPK, dodatkowo nasilając stan zapalny15,16. Jeśli chodzi o jego rolę w odpowiedziach na zakażenie, RIP1 działa jako kluczowy mediator odpowiedzi zapalnej gospodarza, szczególnie w odpowiedzi na wzorce molekularne związane z patogenem (PAMP) rozpoznawane przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR), takie jak receptory Toll-podobne (TLR)17. Co więcej, podczas sepsy RIP1 jest aktywowany przez sygnalizację przez receptory śmierci, takie jak receptor TNF, co prowadzi do inicjacji kaskad prozapalnych. RIPK1 pośredniczy w aktywacji szlaków NF-κB i MAPK, promując produkcję cytokin prozapalnych, takich jak TNF-α, IL-1β i IL-6, które są kluczowymi czynnikami wywołującymi ogólnoustrojową odpowiedź zapalną charakterystyczną dla sepsy18.

<table><tbody><tr><td>Skorygowany DMEM Średni</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicyliny</td><td>Sigma</td><td>A1593 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>trichlorowodorek bisBenzimide Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał B2261</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny RPMI-1640 Średni</td><td>Sigma</td><td>Czynnik R6504</td><td></td></tr><tr><td>Szczep CRISPR NTC gRNA E.coli</td><td>transOMIC (transOMICZNY)</td><td>TELA1011</td><td></td></tr><tr><td>Szczep CRISPR RIP1 gRNA E.coli</td><td>transOMIC (transOMICZNY)</td><td>TEVH-1162203</td><td></td></tr><tr><td>End-over-end Rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny EVOS FL</td><td>Technologie życiowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw GenElute Plasmid Maxiprep</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał PLX15</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG, koniugat (H+L) HRP</td><td>Sigma</td><td>AP307P (Zobacz materiał AP307P)</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T komórek</td><td>Kontroler ATCC (Kontroler T</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora</td><td>Naukowy Nowy Brunszwik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Rosół LB</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>LV-MAX Lentiviral Packaging Mix</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>Numer referencyjny A43237</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Czerwony</td><td>MedChemExpress (Ekspres Medyczny)</td><td>HY-D1055 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nekrostatyna-1</td><td>MedChemExpress (Ekspres Medyczny)</td><td>HY-14622A</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał P7255 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki RIP1 mAb</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3493</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE i sprzęt do western blot</td><td>Przedsiębiorstwo BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td>MedChemExpress (Ekspres Medyczny)</td><td>HY-P7058 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>U937 Ludzkie monocyty</td><td>Kontroler ATCC (Kontroler T</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System oznaczania proliferacji komórek WST-1</td><td>Takara</td><td>Zobacz materiał MK400</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji DNA X-tremeGENE 9</td><td>Diagnostyka Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>z-VAD-FMK</td><td>APExBIO</td><td>Wersja robocza A1902</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie linii komórkowej u937 z nokautem rip1 przy użyciu systemu crispr-cas9

Generation of a RIP1 Knockout U937 Cell Line Using the CRISPR-Cas9 System

Protokół ten przedstawia procedurę wybijania genu RIP1 za pomocą CRISPR/Cas9 w ludzkiej linii komórkowej monocytów U937. Metoda wykorzystuje wyznaczone plazmidy przewodnikowe RNA i plazmidy upakowania lentiwirusa w celu uzyskania nokautu genu RIP1. Protokół rozwiązuje problemy i ulepsza tradycyjne metody CRISPR, umożliwiając jego replikację w przyszłych badaniach nad śmiercią komórki. Uzyskane w ten sposób zmutowane komórki można wykorzystać do badania mechanistycznych zmian w śmierci komórki, w których w przeciwnym razie odgrywałyby rolę funkcjonalne białka RIP1. Testy żywotności wykazały znaczne zmniejszenie śmierci komórek w komórkach nokautowych po indukcji nekroptozy. Mikroskopia fluorescencyjna ujawniła wyraźny spadek mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach nokautujących w tych samych warunkach. Razem te testy funkcjonalne potwierdzają utratę białka RIP1. Procedura ta, zoptymalizowana do użytku z ludzkimi monocytami U937, może być również dostosowana do celowania w inne kluczowe regulatory śmierci komórki, dając funkcjonalne, nieśmiertelne mutanty. Potencjalne pułapki są omawiane w całym tekście, aby zapewnić wgląd w wyzwania, które mogą pojawić się podczas generowania mutantów.

Po uzyskaniu konfluencyjnej populacji mutantów CRISPR linii komórkowej U937 z wyciszonym genem RIP1, przeprowadzono analizę SDS-PAGE oraz Western blot. Analiza Western blot została wykorzystana do potwierdzenia pomyślnego stworzenia linii komórkowej mutantów CRISPR RIP1 poprzez ocenę utraty poziomów ekspresji białka RIP1. Określenie to oparto na wynikach porównawczych monocytów U937 typu WT oraz komórek NTC. Na Rysunku 2 ekspresja RIP1 nie została wykryta w komórkach mutant...

W miarę jak protokoły związane z CRISPR stają się coraz bardziej użyteczne i dostępne, w określonych warunkach eksperymentalnych nadal mogą pojawić się komplikacje i przeszkody. Protokół ten przedstawia w zarysie tworzenie wchodzącej w interakcję z receptorem ludzkiej linii komórkowej kinazy serynowo-treoninowej 1 (RIPK1/RIP1) przy użyciu CRISPR/Cas9 i podkreśla potencjalne wyzwania napotkane podczas tego procesu.

Generowanie linii komórkowej U937 z nokautem RIP1 przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

This protocol outlines a procedure for knocking out the RIP1 gene using CRISPR/Cas9 in the human monocyte U937 cell line. The method utilizes designated ...

Nasze badania koncentrują się na programowej śmierci komórek ssaków, w szczególności badając równowagę między apoptozą a nekroptozą w kontekście hiperglikemii. Ostatnio wykazano, że kinaza RIP1 białka śmierci komórkowej moduluje ekspresję genów podczas nekroptozy. Naszym obecnym wyzwaniem eksperymentalnym jest genetyczne manipulowanie komórkami odpornościowymi, które rosną w zawiesinie, w szczególności wyeliminowanie genu kinazy RIP1 za pomocą CRISPR-Cas9.Nasz protokół ma dwie wyraźne zalety. Poprawia metody transfekcji komórek odpornościowych, które rosną w zawiesinie, za pomocą lentiwirusa i eliminuje potrzebę klonowania pojedynczych komórek podczas procesu tworzenia genetycznego nokautu za pomocą CRISPR-Cas9, Nasze wyniki utorowały drogę do zbadania roli kinazy RIP1 w hiperglikemii w nekroptozie. Aby rozpocząć smugę kwadrantową, Escherichia coli zawiera przewodnik wektora lentiwirusowego RNA na płytkach agarowych Luria-Bertani lub LB, uzupełnionych 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny.Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni, aż poszczególne kolonie będą widoczne w najbardziej rozcieńczonym obszarze na płytce. Po inkubacji, za pomocą sterylnej pętli, wybierz pojedynczą kolonię i dodaj ją do pięciu mililitrów bulionu LB, uzupełnionych 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Odpowietrzyć i przykleić taśmą nakrętkę rurki.Inkubuj probówkę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 225 obr./min przez osiem godzin. W międzyczasie dodaj 40 mililitrów bulionu LB, uzupełnionego 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny do czterech 50-mililitrowych probówek. Po inkubacji przenieś 40 mikrolitrów wyhodowanej kultury do każdej z czterech probówek.Odpowietrzyć i zakleić taśmą nakrętki probówek przed inkubacją w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 225 obr./min przez 12 do 16 godzin. Następnego dnia odwirować kultury w stężeniu 3,220 x g w wahadłowym wirniku kubełkowym przez 20 minut. Zdekantować supernatanty do zlewki na odpady i połączyć wszystkie cztery granulki w 10 mililitrach bulionu LB, uzupełnionego ampicyliną.Odwirować połączone granulki z maksymalną prędkością w obracającym się wirniku kubełkowym przez 20 minut, aby uzyskać pojedynczą osadkę i wyrzucić jak najwięcej supernatantów do zlewki na odpady. Wysiewaj HEK293T komórki w stężeniu od trzech do pięciu razy 10 do potęgi sześciu komórek do kolby T25 zawierającej DMEM. Inkubować kolbę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.W międzyczasie przygotuj mieszaninę transfekcji, używając stosunku plazmidów 1:1:1:1 i stosunku 3:1 odczynnika do transfekcji do plazmidowego DNA ze zredukowaną pożywką surowicy. Wymieszać 75 mikrolitrów odczynnika do transfekcji, 2 500 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy i 25 mikrogramów całkowitego plazmidowego DNA. Pozostaw mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut.Następnie ostrożnie odpipetować mieszaninę transfekcji na zlewające się HEK293T komórek w kolbie zawierającej podłoże. Delikatnie zamieszać kolbę, aby zapewnić odpowiednią homogenizację mieszaniny i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po dwóch dniach inkubacji przenieść pożywkę z kolby komórkowej producenta HEK293T do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Odwirować probówkę o masie 800 x g przez pięć minut, aby rozpalić pozostałe HEK293T komórek. Ostrożnie usunąć cały sklarant zawierający wirusa, nie naruszając osadu i przenieść go do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Policz i oblicz wymaganą objętość zawiesiny ogniw U937, aby uzyskać osad o wymiarach 2 x 10 do mocy sześciu ogniw.Następnie odwirować zawiesinę komórek w 15-mililitrowej probówce o stężeniu 400 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant, pozostawiając osad komórkowy w probówce. Zawiesić osad komórkowy w supernatencie zawierającym wirusa i odwirować probówkę o stężeniu 290 x g przez 60 minut. Po odwirowaniu należy użyć pipety do ponownego zawieszenia osadu z supernatantem zawierającym wirusa w probówce.Umieść rurkę na rotatorze na końcu na końcu na 60 minut. Następnie odwirować probówkę o sile 400 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić osad w stosunku 1:1 wirusa zawierającego supernatanty i kompletną pożywkę RPMI 1640, uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FBS. Przenieść mieszaninę komórek do nowej kolby do hodowli tkankowej T25 i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.Po inkubacji odwirować komórki U937 przy 400 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad za pomocą kompletnej pożywki RPMI 1640, uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS i pięcioma mikrogramami na mililitr puromycyny. Przenieść kulturę komórkową do kolby T25.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa do trzech tygodni, sprawdzając komórki co jeden do dwóch dni pod kątem oznak wzrostu. Analiza Western blot potwierdziła utratę ekspresji białka RIP1 w zmutowanych komórkach RIP1 CRISPR bez wykrywalnego sygnału w porównaniu z silnym sygnałem w komórkach kontrolnych typu dzikiego i niedocelowego. Leczenie TCZ indukowało znaczną śmierć komórek nekroptotycznych w komórkach kontrolnych typu dzikiego i niedocelowego, która została odwrócona przez leczenie nekrosatyną-1.W przeciwieństwie do tego, komórki nokautujące RIP1 CRISPR wykazały znacznie niższą śmierć komórek w porównaniu z komórkami kontrolnymi typu dzikiego i niedocelowym bez wpływu nekrosotyny-1, co wskazuje na utratę funkcji RIP1. Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek wykazała znaczny wzrost produkcji ponadtlenków mitochondriów w komórkach kontrolnych typu dzikiego i niedocelowych po leczeniu TCZ, który został zmniejszony po leczeniu nekrostyną-1. Komórki nokautujące RIP1 CRISPR wykazywały minimalną produkcję ponadtlenku mitochondriów bez zauważalnego efektu leczenia nekrosatyną-1.

generation-rip1-knockout-u937-cell-line-using-crispr-cas9

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej modyfikacji pierwotnych lub rozszerzonych komórek NK (ang. human natural killer) za pomocą rybonukleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy ludzkie komórki NK z niedoborem receptora 2 czynnika wzrostu b (TGFBR2) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1).

Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

W tym protokole opisujemy procedury techniczne do generowania myszy z nokautem specyficznym dla brązowej tkanki tłuszczowej (BAT), wykorzystując połączony system Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i systemu jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) związanego z adenowirusem (AAV). Opisane etapy obejmują projektowanie sgRNA, przygotowanie cząstek AAV-sgRNA oraz mikroiniekcję AAV do płatów BAT.

Generowanie myszy z nokautem specyficznych dla brązowego tłuszczu przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i jednoprzewodnikowego systemu RNA wirusa związanego z adenowirusem

Ten artykuł opisuje budowę komórek nokautujących białko-E związanych z centromerem (CENP-E) przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i trzech strategii przesiewowych opartych na fenotypie. Wykorzystaliśmy linię komórkową z nokautem CENP-E do opracowania nowatorskiego podejścia do walidacji swoistości i toksyczności inhibitorów CENP-E, co jest przydatne przy opracowywaniu leków i badaniach biologicznych.

Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Poznaj technologię CRISPR-Cas9 do tworzenia linii komórkowej U937 z nokautem genu RIPK1. Metoda ta pozwala badać sygnalizację komórkową i pokazuje wyzwania w edycji genów.

Generowanie linii komórkowej U937 z nokautem RIP1 przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Przeglądaj więcej filmów