Generowanie linii komórkowej U937 z nokautem RIP1 przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Nasze badania koncentrują się na programowej śmierci komórek ssaków, w szczególności badając równowagę między apoptozą a nekroptozą w kontekście hiperglikemii. Ostatnio wykazano, że kinaza RIP1 białka śmierci komórkowej moduluje ekspresję genów podczas nekroptozy. Naszym obecnym wyzwaniem eksperymentalnym jest genetyczne manipulowanie komórkami odpornościowymi, które rosną w zawiesinie, w szczególności wyeliminowanie genu kinazy RIP1 za pomocą CRISPR-Cas9.

Nasz protokół ma dwie wyraźne zalety. Poprawia metody transfekcji komórek odpornościowych, które rosną w zawiesinie, za pomocą lentiwirusa i eliminuje potrzebę klonowania pojedynczych komórek podczas procesu tworzenia genetycznego nokautu za pomocą CRISPR-Cas9, Nasze wyniki utorowały drogę do zbadania roli kinazy RIP1 w hiperglikemii w nekroptozie. Aby rozpocząć smugę kwadrantową, Escherichia coli zawiera przewodnik wektora lentiwirusowego RNA na płytkach agarowych Luria-Bertani lub LB, uzupełnionych 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni, aż poszczególne kolonie będą widoczne w najbardziej rozcieńczonym obszarze na płytce. Po inkubacji, za pomocą sterylnej pętli, wybierz pojedynczą kolonię i dodaj ją do pięciu mililitrów bulionu LB, uzupełnionych 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Odpowietrzyć i przykleić taśmą nakrętkę rurki.

Inkubuj probówkę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 225 obr./min przez osiem godzin. W międzyczasie dodaj 40 mililitrów bulionu LB, uzupełnionego 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny do czterech 50-mililitrowych probówek. Po inkubacji przenieś 40 mikrolitrów wyhodowanej kultury do każdej z czterech probówek.

Odpowietrzyć i zakleić taśmą nakrętki probówek przed inkubacją w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 225 obr./min przez 12 do 16 godzin. Następnego dnia odwirować kultury w stężeniu 3,220 x g w wahadłowym wirniku kubełkowym przez 20 minut. Zdekantować supernatanty do zlewki na odpady i połączyć wszystkie cztery granulki w 10 mililitrach bulionu LB, uzupełnionego ampicyliną.

Odwirować połączone granulki z maksymalną prędkością w obracającym się wirniku kubełkowym przez 20 minut, aby uzyskać pojedynczą osadkę i wyrzucić jak najwięcej supernatantów do zlewki na odpady. Wysiewaj HEK293T komórki w stężeniu od trzech do pięciu razy 10 do potęgi sześciu komórek do kolby T25 zawierającej DMEM. Inkubować kolbę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

W międzyczasie przygotuj mieszaninę transfekcji, używając stosunku plazmidów 1:1:1:1 i stosunku 3:1 odczynnika do transfekcji do plazmidowego DNA ze zredukowaną pożywką surowicy. Wymieszać 75 mikrolitrów odczynnika do transfekcji, 2 500 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy i 25 mikrogramów całkowitego plazmidowego DNA. Pozostaw mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut.

Następnie ostrożnie odpipetować mieszaninę transfekcji na zlewające się HEK293T komórek w kolbie zawierającej podłoże. Delikatnie zamieszać kolbę, aby zapewnić odpowiednią homogenizację mieszaniny i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po dwóch dniach inkubacji przenieść pożywkę z kolby komórkowej producenta HEK293T do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Odwirować probówkę o masie 800 x g przez pięć minut, aby rozpalić pozostałe HEK293T komórek. Ostrożnie usunąć cały sklarant zawierający wirusa, nie naruszając osadu i przenieść go do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Policz i oblicz wymaganą objętość zawiesiny ogniw U937, aby uzyskać osad o wymiarach 2 x 10 do mocy sześciu ogniw.

Następnie odwirować zawiesinę komórek w 15-mililitrowej probówce o stężeniu 400 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant, pozostawiając osad komórkowy w probówce. Zawiesić osad komórkowy w supernatencie zawierającym wirusa i odwirować probówkę o stężeniu 290 x g przez 60 minut. Po odwirowaniu należy użyć pipety do ponownego zawieszenia osadu z supernatantem zawierającym wirusa w probówce.

Umieść rurkę na rotatorze na końcu na końcu na 60 minut. Następnie odwirować probówkę o sile 400 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić osad w stosunku 1:1 wirusa zawierającego supernatanty i kompletną pożywkę RPMI 1640, uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FBS. Przenieść mieszaninę komórek do nowej kolby do hodowli tkankowej T25 i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Po inkubacji odwirować komórki U937 przy 400 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad za pomocą kompletnej pożywki RPMI 1640, uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS i pięcioma mikrogramami na mililitr puromycyny. Przenieść kulturę komórkową do kolby T25.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa do trzech tygodni, sprawdzając komórki co jeden do dwóch dni pod kątem oznak wzrostu. Analiza Western blot potwierdziła utratę ekspresji białka RIP1 w zmutowanych komórkach RIP1 CRISPR bez wykrywalnego sygnału w porównaniu z silnym sygnałem w komórkach kontrolnych typu dzikiego i niedocelowego. Leczenie TCZ indukowało znaczną śmierć komórek nekroptotycznych w komórkach kontrolnych typu dzikiego i niedocelowego, która została odwrócona przez leczenie nekrosatyną-1.

W przeciwieństwie do tego, komórki nokautujące RIP1 CRISPR wykazały znacznie niższą śmierć komórek w porównaniu z komórkami kontrolnymi typu dzikiego i niedocelowym bez wpływu nekrosotyny-1, co wskazuje na utratę funkcji RIP1. Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek wykazała znaczny wzrost produkcji ponadtlenków mitochondriów w komórkach kontrolnych typu dzikiego i niedocelowych po leczeniu TCZ, który został zmniejszony po leczeniu nekrostyną-1. Komórki nokautujące RIP1 CRISPR wykazywały minimalną produkcję ponadtlenku mitochondriów bez zauważalnego efektu leczenia nekrosatyną-1.