Name: Izolacja pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń do modelowania in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Naucz się izolować pierwotne komórki nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu świń w celu tworzenia realistycznych modeli chorób siatkówki in vitro. Ta technika pozwala uzyskać wysokiej jakości komórki w krótkim czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Farhadowi Farjoodowi za pomoc w hodowli i izolacji świńskich komórek RPE oraz Thomasowi Harrisowi za pomoc w SEM. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Microscopy Core Facility na Uniwersytecie Stanowym Utah dla analizy SEM. Placówka utrzymuje skaningowy mikroskop elektronowy zakupiony w ramach grantu National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). Finansowanie tego badania zostało zapewnione przez National Institutes of Health poprzez grant 1R15EY028732 (Vargis) oraz grant Fundacji BrightFocus M2019109 (Vargis). Dodatkowe fundusze zostały zapewnione przez Undergraduate Research and Creative Opportunities Grant (Weatherston) z Biura Badań Uniwersytetu Stanowego Utah oraz grant zalążkowy (Vargis) z Centrum Badań nad Chorobą Alzheimera i Demencją Uniwersytetu Stanowego Utah.

Oczy używane w tej procedurze są uzyskiwane pośmiertnie z lokalnego, sprawdzonego przez USDA sklepu mięsnego, i nie jest wykonywana żadna praca na żywych zwierzętach. Po uśmierceniu zwierząt mija około 2 godzin, zanim oczy zostaną wyłuszczone. Ponieważ może zacząć dochodzić do rozpadu tkanek, ważne jest, aby podczas transportu oczy były chłodne, aby zapobiec dalszej próchnicy. W tej procedurze oczy są natychmiast umieszczane w lodówce po enukleacji. Następnie worek z oczami umieszcza się w zlewce polipropylenowej o pojemności 1000 ml i otacza lodem w chłodziarce o pojemności 8 litrów. Ważne jest, aby nie kłaść oczu bezpośrednio na lodzie. Po dotarciu oczu do laboratorium przeprowadza się izolację komórek RPE w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Bardzo ważne jest, aby zakończyć ten proces w ciągu 3-5 godzin. Ten protokół został zoptymalizowany pod kątem przetwarzania 10 oczu.
1. Przygotowanie porcji zapasów DNazy
UWAGA: Zaleca się, aby ten krok został wykonany przed izolacją.
<ol>
	<li>Przygotować 5 mM roztwór chlorku wapnia ze sterylną wodą dejonizowaną. 
	UWAGA: Chlorek wapnia w proszku może powodować poważne podrażnienie lub uszkodzenie oczu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Dodać 5 mM roztworu chlorku wapnia do proszku DNazy (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać końcowe stężenie DNazy 3 mg/ml. Upewnij się, że roztwór jest dokładnie wymieszany. 
	UWAGA: DNaza stanowi zagrożenie uczulające drogi oddechowe. Nie wdychać proszku/substancji.</li>
	<li>Porcjować małe objętości, na przykład 1 ml, do probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Zamrozić podwielokrotności w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Ustawianie obszaru sekcji
<ol>
	<li>Przenieś sterylne narzędzia preparacyjne i sprzęt do hodowli komórkowych do szafki bezpieczeństwa biologicznego: obłożenie chirurgiczne, szalki Petriego, sitka do komórek, płytki studzienkowe, gazę, pęsetę, rączkę skalpela, ostrze skalpela i nożyczki do tęczówki (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Za pomocą pęsety rozłóż obłożenie chirurgiczne. Umieść jedną 6-dołkową płytkę na serwety chirurgicznej i zdejmij pokrywkę.</li>
	<li>Umieścić podwielokrotność sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco na lodzie i umieścić w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Napełnij jedną studzienkę 6-dołkowej płytki do połowy (około 6 ml) 10% roztworem jodu powidonu.</li>
	<li>Napełnij pozostałe studzienki schłodzonym DPBS.</li>
	<li>Zdejmij pokrywkę z jednej z szalek Petriego i umieść ją odwróconą na serwety chirurgicznej. Odłóż podstawę szalki Petriego jako pojemnik na odpady.</li>
	<li>Umieścić podwielokrotność pożywki do hodowli komórkowych (zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), 1% antybiotyki/leki przeciwgrzybicze) i podwielokrotność 0,25% trypsyny/EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wyjmij roztwór podstawowy DNazy z zamrażarki (więcej informacji można znaleźć w pozostałej części protokołu).</li>
</ol>
3. Usuwanie tkanek zewnętrznych
UWAGA: Usuwanie tkanek zewnętrznych może być wykonane poza kabiną bezpieczeństwa biologicznego. Sprawdź oko przed cięciem, aby upewnić się, że twardówka nie została przebita, źrenica nie jest zamglona, a nerw wzrokowy jest obecny. Odrzuć oczy, które nie spełniają tych kryteriów.
<ol>
	<li>Trzymając jedną ręką mięsień przyczepiony do oka, drugą ręką delikatnie odetnij skalpelem tkankę otaczającą twardówkę. Uważaj, aby nie zmiażdżyć oka ani przypadkowo nie przeciąć twardówki. Jeśli twardówka zostanie przecięta i odsłoni czarne wnętrze, wyrzuć oko. 
	UWAGA: Rękawica odporna na przecięcia jest wysoce zalecana dla dłoni trzymającej mięsień w celu ochrony przed przypadkowymi skaleczeniami.</li>
	<li>Przytnij nerw wzrokowy zakrzywionymi nożyczkami do tęczówki na długość nie większą niż 3 mm. Jeśli nerw wzrokowy jest zbyt długi, muszla oczna nie będzie później prawidłowo osadzona w sitku komórkowym.</li>
	<li>Umieść oko na lodzie rogówką w dół.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.1-3.3, aż zewnętrzna tkanka zostanie usunięta z każdego oka.</li>
</ol>
4. Sekcja oka
<ol>
	<li>Za pomocą pęsety przenieś oko do komory bezpieczeństwa biologicznego i do studzienki zawierającej 10% roztwór jodu powidonu, a następnie obróć oko, aby upewnić się, że jest całkowicie pokryte roztworem jodu. Aby narzędzia były jak najbardziej sterylne, pęsety te powinny być używane wyłącznie do dotykania zewnętrznej strony oka.</li>
	<li>Gdy oko znajduje się w roztworze jodu, umieść sterylną gazę na płytkiej, odwróconej pokrywce przygotowanej wcześniej szalki Petriego. Na osobnej szalce Petriego umieść sitko do komórek. Sitka do komórek należy używać wyłącznie do podparcia muszli ocznej, a nie do separacji komórek.</li>
	<li>Po pozostawieniu oka w roztworze jodu przez około 30 s, przemyj oko, zanurzając je w studzienkach zawierających DPBS na około 5 s każdy, przechodząc od studzienki do studzienki, aby stopniowo rozcieńczać roztwór jodu, i przenieś oko na sterylną gazę.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie za pomocą skalpela poniżej ora serrata lub mniej więcej 1/3 kuli ziemskiej od krawędzi tęczówki.</li>
	<li>Po nacięciu użyj nożyczek do tęczówki, aby przeciąć równomiernie wzdłuż obwodu kuli ziemskiej, równolegle do rogówki. Podczas manewrowania okiem używaj pęsety tylko do dotykania zewnętrznej strony oka lub gazy, aby zachować sterylność.</li>
	<li>Użyj pęsety, aby chwycić nerw wzrokowy i delikatnie oderwij gałkę od gazy. Ciało szkliste powinno wypaść z kuli ziemskiej. W razie potrzeby delikatnie potrząśnij okiem, aby pomóc usunąć ciało szkliste. 
	UWAGA: Jeśli ciało szkliste jest bardzo trudne do usunięcia, spróbuj przyciąć niżej na kuli ziemskiej.</li>
	<li>Delikatnie umieść muszlę oczną w przygotowanym sitku do komórek, wnętrzem muszli ocznej skierowanym do góry. Jeśli jest nierówny, użyj pęsety, aby wyregulować muszlę oczną, aby nacięcie było jak najbardziej poziome.</li>
	<li>Delikatnie dodaj schłodzony DPBS do muszli ocznej, tak aby poziom płynu znajdował się tuż poniżej najniższego punktu nacięcia. Ten DPBS zostanie usunięty po usunięciu siatkówki nerwowej. 
	UWAGA: Objętość dodanego DPBS będzie się różnić w zależności od wielkości oczu i miejsca nacięcia.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 4.1-4.8, aż wszystkie oczy zostaną wycięte.</li>
</ol>
5. Usuwanie siatkówki nerwowej i dysocjacja RPE
UWAGA: Poniższa sekcja jest łatwiejsza do wykonania etapami. W tej konfiguracji proces ten jest wykonywany na jednej partii (zwykle 3 muszlach ocznych) na raz. W przypadku kroków 5.1-5.7 każdy krok należy wykonać na całej partii przed przejściem do następnego kroku.
<ol>
	<li>Pod latarką znajdź obszary, w których siatkówka nerwowa (biała/różowa) zaczyna odłączać się od RPE (). Następnie pęsetą delikatnie chwyć uniesioną siatkówkę nerwową i oderwij ją. 
	UWAGA: Jeśli nie ma obszarów, w których siatkówka nerwowa się odrywa, użyj pęsety, aby delikatnie chwycić ją w pobliżu górnej części muszli ocznej. Stosując tę metodę, jeśli dojdzie do uszkodzenia RPE/naczyniówki, komórki te nie zostaną zdysocjowane podczas pobierania RPE.</li>
	<li>Delikatnie zbierz siatkówkę nerwową w pobliżu tarczy nerwu wzrokowego.</li>
	<li>Odessać siatkówkę nerwową za pomocą pipety Pasteura podłączonej do systemu aspiracji próżniowej. Zaleca się pierzenie aspiracji, aby pomóc w procesie usuwania. 
	UWAGA: Końcówkę pipety można umieścić na końcu pipety Pasteura, aby zmniejszyć ssanie.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj dodatkowy schłodzony DPBS, aby zastąpić to, co zostało zasysane.</li>
	<li>Usuń pozostałą siatkówkę nerwową, ponownie zasysając. Tym razem usuń jak najwięcej DPBS, nie naruszając odsłoniętego RPE.</li>
	<li>Delikatnie dodaj trypsynę do muszli ocznej. Utrzymuj poziom objętości poniżej linii nacięcia i wszelkich odcinków uszkodzonego RPE, aby zmniejszyć zanieczyszczenie. 
	UWAGA: Trypsyna jest enzymem, który w kontakcie powoduje podrażnienie skóry i oczu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Po dodaniu trypsyny do każdego oka upewnij się, że pokrywka szalki Petriego została wymieniona. Następnie przenieść szalkę Petriego do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.</li>
	<li>Powtarzać kroki 5.1-5.7 dla każdej partii, aż wszystkie muszle oczne zostaną przetworzone.</li>
</ol>
6. Kolekcja RPE
<ol>
	<li>Zbierz komórki RPE z każdej partii oczu (2-3 oczek) i umieść je w jednej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, aby uprościć proces wysiewu.
	<ol>
		<li>Pod latarką delikatnie rozetrzyj za pomocą pipety o pojemności 1000 μl, aby usunąć komórki RPE. Jeśli komórki RPE nie odrywają się, dodaj świeżą trypsynę i inkubuj przez dodatkowe 10-15 minut. Uważaj, aby nie zeskrobać siatkówki.</li>
		<li>Zebrać komórki RPE w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Umyj muszlę oczną pożywką do hodowli komórkowych, aby zebrać pozostałe komórki i zneutralizować trypsynę. Upewnij się, że w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml znajduje się co najmniej dwukrotnie większa objętość pożywki niż trypsyna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtarzaj krok 6.1, aż komórki RPE zostaną pobrane ze wszystkich muszli ocznych.</li>
	<li>Odwirować zawiesiny komórek o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
7. Przygotowanie roztworu roboczego DNazy
<ol>
	<li>Obliczyć objętość roztworu podstawowego DNazy o stężeniu 3 mg/ml (przygotowanego w kroku 1) potrzebną do dodania do pożywki do hodowli komórkowej dla końcowego stężenia 100 μg/ml i końcowej objętości 3 ml na probówkę komórek (tj. dla trzech probówek wirówkowych komórek wymagane jest 9 ml roztworu DNazy o stężeniu 100 μg/mL).</li>
	<li>Połączyć odpowiednie objętości roztworu podstawowego DNazy i pożywki do hodowli komórkowych. Stosowanie DNazy w roztworze roboczym pomaga zapobiegać zlepianiu się komórek i umożliwia równomierne wysiewanie komórek.</li>
</ol>
8. Rozsiewanie komórek RPE
<ol>
	<li>Po odwirowaniu w kroku 6.3 usunąć supernatanty z każdej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
	<li>Zawiesić każdą osadkę komórkową w 3 ml roztworu roboczego DNazy.</li>
	<li>Umieścić 15 ml probówek wirówkowych zawierających zawieszone komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 15 minut.</li>
	<li>Po inkubacji odwirować zawiesiny komórkowe przy sile 150 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatanty, uważając, aby nie naruszyć osadów komórkowych.</li>
	<li>Zawiesić każdy osad komórkowy w 3 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Dla każdej probówki wirówkowej zawierającej 2-3 oczka komórek RPE, wysiewaj jedną studzienkę z 6-dołkowej płytki (przejście 0).</li>
	<li>Ostrożnie przenieść 6-dołkową płytkę z nasionami do nawilżonego inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
9. Pierwotna hodowla komórek RPE świni
<ol>
	<li>Pozwól nowo zasianym komórkom RPE przyczepić się przez 48-72 godziny przed przeniesieniem płytki. Podczas pierwszej wymiany pożywki można przeprowadzić płukanie świeżą pożywką do hodowli komórkowych, aby usunąć nadmiar resztek komórkowych.</li>
	<li>Pożywkę do hodowli komórkowych należy wymieniać co 48 godzin.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną zbieżność, przejdź na pożywkę do hodowli komórkowej o stężeniu FBS 2% i utrzymuj do eksperymentów.</li>
</ol>
10. Walidacja komórek RPE
<ol>
	<li>Barwienie immunocytochemiczne (ICC)
	<ol>
		<li>Utrwal komórki w 4% formaldehydzie w DPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyć dwukrotnie DPBS.</li>
		<li>Przepuszczalność komórek (w razie potrzeby) za pomocą 0,2% Triton-X 100 w DPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyć dwukrotnie DPBS.</li>
		<li>Zastosować roztwór blokujący 3% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w DPBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać przeciwciało pierwszorzędowe w rozcieńczeniu 1:100 (lub zalecanym stężeniu producenta) (patrz tabela materiałów) i odstawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj trzy razy DPBS przez 5 minut każdy.</li>
		<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe (w razie potrzeby) w stężeniu 2 μg/ml (lub zalecanym stężeniu producenta) (patrz tabela materiałów) i odstawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć trzy razy DPBS przez 5 minut każdy, jeśli stosowane jest przeciwciało drugorzędowe.</li>
		<li>Dodać sondę do barwienia jądrowego o stężeniu producenta (patrz tabela materiałów) i pozostawić na 25 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj trzy razy PBS przez 5 minut każdy.</li>
		<li>Jeśli znajduje się na wkładce do hodowli komórkowej, zamontuj na szkiełku mikroskopowym za pomocą szkiełka nakrywkowego za pomocą podłoża montażowego, jak opisano przez Rickabaugh i Weatherston et al.20. W przeciwnym razie komórki obrazu w DPBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z procedurą opisaną przez Harrisa i wsp.21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trans nabłonkowy opór elektryczny (TEER)
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem producenta dotyczącym pomiaru TEER (patrz tabela materiałów) z 1 ml pożywki hodowlanej w komorze podstawowej15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test immunoenzymatyczny (ELISA)
	<ol>
		<li>Wykonaj test ELISA15 przy użyciu multipleksowego zestawu do testowania immunoenzymów ludzkich zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela Materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

A Cost-Effective Method for Isolating Primary RPE Cells from Porcine Eyes

<ol><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+nature+of+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The dynamic nature of Bruch's membrane.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).</li>
<li>Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelium+polarity+in+health+and+blinding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).</li>
<li>Georgiadis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tight+junction+associated+signalling+proteins+ZO-1+and+ZONAB+regulate+retinal+pigment+epithelium+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice.</a> PLOS One. 5 (12), e15730(2010).</li>
<li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li>
<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Yang, S., Zhou, J., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+diseases+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Functions and diseases of the retinal pigment epithelium.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 727870(2021).</li>
<li>Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE65+is+the+isomerohydrolase+in+the+retinoid+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).</li>
<li>Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+roles+of+RPE65+S-palmitoylation+in+membrane+association+and+visual+cycle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5218(2019).</li>
<li>Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelium+and+age-related+macular+degeneration%3A+A+review+of+major+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).</li>
<li>Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+barrier+breakdown+in+diabetic+retinopathy%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Biology%2C+Diseases%2C+and+Informatics%22%5BJournal%5D)">RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing.</a> Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).</li>
<li>Hellinen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+artificially+re-pigmented+ARPE-19+retinal+pigment+epithelial+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13761(2019).</li>
<li>Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+differentiation+of+the+human+RPE+cell+line%2C+ARPE-19%2C+induced+by+nicotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide.</a> Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).</li>
<li>Samuel, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriately+differentiated+ARPE-19+cells+regain+phenotype+and+gene+expression+profiles+similar+to+those+of+native+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells.</a> Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).</li>
<li>Middleton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+ophthalmology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Porcine ophthalmology.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).</li>
<li>Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+mechanical+stress+in+primary+porcine+RPE+cells+induces+angiogenic+factor+expression+and+in+vitro+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis.</a> Journal of Biological Engineering. 14, 13(2020).</li>
<li>Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).</li>
<li>Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+monolayer+to+complement+retinal+ex+vivo+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures.</a> STAR Protocols. 4 (3), 102443(2023).</li>
<li>Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+cryosectioning+of+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+on+transwell+cell+culture+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101758(2022).</li>
<li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).</li>
<li>Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+biomimetic+in+vitro+model+of+bruch%27s+membrane+using+hagfish+slime+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+recombinant+spider+silk+proteins+to+develop+a+synthetic+bruch%27s+membrane+for+modeling+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).</li>
<li>Zou, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+tight+junction+between+RPE+cells+with+tissue+factor+targeting+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide.</a> International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).</li>
</ol>

Protokół ten opisuje, jak wyizolować komórki RPE z oczu świni. Pigmentacja i morfologia kostki brukowej są widoczne w ciągu 7 dni od izolacji (ryc. 1B). Co więcej, dane TEER wskazują na tworzenie się ścisłych połączeń22 i zdrową monowarstwę (ryc. 5). Wyniki te pokazują, że komórki RPE wyizolowane tą metodą są podobne do ludzkich RPE i mogą być korzystne w modelach hodowli komórek siatkówki.
Oczy użyte w tym manuskrypcie zostały uzyskane pośmiertnie z lokalnego sklepu mięsnego, ale można je również uzyskać z innych źródeł, takich jak środowiska akademickie z udziałem współpracowników używających produktów wieprzowych. Ważne jest, aby rozpocząć zabieg jak najszybciej po śmierci zwierzęcia i zachować chłód oczu przed zabiegiem. Podczas izolacji ważne jest, aby nie zakłócać RPE aż do rozcierania po trypsynizacji. Ta pielęgnacja jest najbardziej krytyczna podczas złuszczania siatkówki nerwowej, ponieważ brak ostrożności może prowadzić do złapania błony Brucha1 pęsetą i wprowadzenia do roztworu innych typów komórek.
Chociaż ta procedura została zoptymalizowana pod kątem naszych warunków, można wprowadzić pewne zmiany w metodologii. Na przykład, jeśli pożądane są określone gęstości wysiewu, komórki można policzyć po inkubacji DNazy. Dodatkowo, jeśli aspiracja próżniowa nie działa, siatkówkę nerwową można usunąć, ostrożnie przycinając małymi, zakrzywionymi nożyczkami. Podczas wysiewu do eksperymentów można zastosować wysoką gęstość wysiewu, taką jak 2,5 x 105 komórek/cm2 , aby zapobiec nadmiernemu podziałowi komórkowemu. Ponadto wielokrotne pasażowanie nie jest zalecane, ponieważ komórki mogą zacząć tracić swoje natywne fenotypy. Chociaż w tym badaniu wykorzystano komórki pasażu 1 do eksperymentów, dodatkowe pasaże mogą być potencjalnie użyte, jeśli zachowany zostanie fenotyp i charakterystyka RPE. Wreszcie, stężenie 1% FBS może być użyte do subkultury lub eksperymentów zamiast 2%, jeśli jest to pożądane.
Ta metoda ma kilka wad. Po pierwsze, trudno jest odtworzyć lub uzyskać wiek zwierzęcia, płeć, rasę i czas śmierci, które są częstymi problemami w pierwotnej izolacji komórek. Po drugie, nadmierna trypsyna może szybko doprowadzić do powstania nieprawidłowych komórek, co zostało również zauważone przez Fietza i wsp.17. Jednak ostatecznie metoda ta oferuje niedrogi i skuteczny sposób na uzyskanie pierwotnych ogniw RPE. Komórki te nie wymagają długiego czasu różnicowania, jak iPSC. Te świnie RPE mają również z natury kluczowe struktury, takie jak mikrokosmki i pigmentacja15,16, w przeciwieństwie do ich niezróżnicowanych odpowiedników. W związku z tym komórki te oferują bardziej reprezentatywny typ komórek do badań siatkówki. Wreszcie, metoda ta może być bardzo korzystna dla obszarów wiejskich lub instytucji, które nie mają dostępu do ludzkich oczu dawcy, w celu wytworzenia modeli siatkówki analogicznych do modeli ludzkich w celu zrozumienia wzroku i choroby.

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to monowarstwa znajdująca się w zewnętrznej siatkówce pomiędzy błoną Brucha a fotoreceptorami1. Komórki RPE tworzą ścisłe połączenia z białkami, takimi jak zonula occludens-1 (ZO-1) i mają charakterystyczny fenotyp charakteryzujący się pigmentacją i morfologią heksagonalną2,3. Komórki te przyczyniają się do bariery krew-siatkówka, wspierając w ten sposób zdrowie fotoreceptorów i utrzymując homeostazę siatkówki4,5. Dodatkowo, komórki RPE odgrywają kluczową rolę w widzeniu, pochłaniając światło i przetwarzając niezbędne komponenty dla fotoreceptorów6. Na przykład RPE65, białko o wysokiej ekspresji w komórkach RPE, przekształca estry all-trans retinylu w 11-cis retinol7,8. Biorąc pod uwagę mnogość funkcji pełnionych przez komórki RPE, ich dysfunkcja jest związana z różnymi chorobami, w tym zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem i retinopatią cukrzycową9,10. Aby lepiej zrozumieć patologie siatkówki i opracować nowe metody leczenia, często stosuje się modele siatkówki in vitro.
Aby wygenerować reprezentatywne modele zdrowych lub chorych siatkówk, konieczne jest użycie mimetycznego typu komórek RPE. Dostępna na rynku linia komórkowa ARPE-19 nie ma natywnych fenotypów, takich jak pigmentacja, podczas gdy iPSC mogą potrzebować miesięcy, aby się rozróżnić11,12,13. Chociaż ludzkie oczy dawcy mogą być idealne, często nie są łatwo dostępne dla wielu laboratoriów badawczych.
Tutaj opracowaliśmy metodę wykorzystania oczu świni, które mają wiele podobieństw do oczu ludzkich14, do uzyskania pierwotnych komórek RPE. Te pierwotne komórki RPE świni zostały wykorzystane w wielu modelach siatkówki15,16. Komórki te są nie tylko opłacalne, ale także wymagają mniej czasu na ich pozyskanie niż komórki iPS lub oczy dawcy. Dodatkowo wykazują cechy rodzime, takie jak pigmentacja i mikrokosmki. Chociaż istnieją podobne protokoły ekstrakcji RPE u świń17,18,19, ta prosta i szczegółowa technika dodatkowo weryfikuje dysocjację enzymatyczną i wykorzystuje materiały powszechnie spotykane w większości laboratoriów hodowli komórkowych.

<table><tbody><tr><td>6 Szklana płyta dolna Micro-well ze szkłem nakrywkowym Micro-Well #1</td><td>14 mm Cellvis</td><td>P06-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-Przeciwgrzybicza (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Szafka</td><td></td><td></td><td></td>bezpieczeństwa</tr><tr><td>biologicznego Chlorek wapnia, suszony, proszek, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13191.30</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-363-548</td><td>jedna probówka</td></tr><tr><td>wirówkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr> na oko<tr><td>, 15 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Chłodnica, 8 L</td><td>Igloo</td><td>32529</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Płytka wielodołkowa Transwell z przepuszczalnymi wkładkami z membrany poliestrowej</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>07-200-154</td><td>Wkłady hodowlane Rękawice</td></tr><tr><td>odporne na przecięcie</td><td>Dowellife</td><td>712971375857</td><td></td></tr><tr><td>Cytiva&nbsp; HyClone Dulbecco's Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, roztwór</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SH3026401</td><td>tylko do rozcieńczeń ICC&nbsp;</td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td></td><td>dejonizowana</td></tr><tr><td>DMEM, 1x z 4,5 g/L glukozy, L-glutaminą i pirogronianem sodu</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modyfikowana - wapń - magnez</td><td>Cytiva</td><td>SH3002B.02</td><td>przechowywana w temperaturze 4 & st.; Zestaw</td></tr><tr><td>C ELISA, Q-Plex Ludzka angiogeneza (9-Plex)&nbsp;</td><td>Quansys Biosciences, Logan, UT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie ENDOHM 6 TEER</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Avantor</td><td>232B20</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&nbsp; Albumina surowicy bydlęcej (BSA) w proszku bez DNaz i proteaz</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP9706100</tr><tr><td>Latarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, klasa ACS, 36.5% (w/w) do 38.0% (w/w), LabChem</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gąbki LC146501 z gazy</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-415-504</td><td>Jedno na oko</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32728</td><td>RPE65</td></tr><tr><td>przeciwciało wtórne Ice&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Zmiażdżony preferowany</td></tr><tr>mikroskop <td></td><td></td><td></td><td>z kontrastem z odwróconą fazą</td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Odczynnik NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki z cienką końcówką irysa, klasy standardowej, zakrzywione, 4,5"</td> <td>Cole-Palmer</td><td>EW-10818-05</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irysa, 11 cm, proste, węglik wolframu</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>50-822-379</td><td></td></tr><tr><td>LSM-710 Mikroskop konfokalny</td><td>Szalka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petriego Zeiss, 100 mm x 20 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>jeden na 2-3 oczy i jeden do powierzchni preparcyjnej/odpadów&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór powidonu i jondyny, 10%</td> <td>ekwiwalent</td><td>49035-050-34</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne RPE65 (401.8B11.3D9), Invitrogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA116578</td> Przeciwciało <td>pierwotne RPE65</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela Rozmiar 10</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeści do skalpela Styl 3</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>50-118-4164</td><td></td></tr><tr><td>Obłożenie chirurgiczne, 18 x 26"</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>50-209-1792</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td> do hodowli tkankowych <td>37 &deg; C, 5% CO2, 95% wilgotności</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych, 6 dołków</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>Jeden do przemywania oczu i jeden do siewu&nbsp;</td></tr><tr><td>Trójkątna zlewka polipropylenowa, 1000 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-955-111F</td><td></td></tr><tr><td>Tryton&nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25%, 2,21 mM EDTA w HBSS; bez Ca, Mg, Pęseta z wodorowęglanu sodu</td><td>Corning</td><td>25053Cl</td><td></td></tr><tr><td>Styl 20A</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>17-467-231</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Styl 2A</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>50-238-47</td><td>do usuwania siatkówki nerwowej</td></tr><tr><td>Pęseta Style 5-SA-PI</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>17-467-168</td><td></td></tr><tr><td>System zasysania</td><td></td><td></td><td></td>próżniowego</tr><tr><td>Łaźnia wodna, 37 &deg; </td> Przeciwciało monoklonalne C <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>33-911-1</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z ZO-1</td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń do modelowania in vitro

Isolation of Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells for In Vitro Modeling

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) jest kluczową monowarstwą w zewnętrznej siatkówce, odpowiedzialną za wspieranie fotoreceptorów. Zwyrodnienie RPE często występuje w chorobach charakteryzujących się postępującą utratą wzroku, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). Badania nad AMD często opierają się na ludzkich oczach dawcy lub indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC) jako reprezentacji RPE. Jednak te źródła RPE wymagają dłuższych okresów różnicowania i znacznej wiedzy specjalistycznej w zakresie hodowli. Ponadto niektóre instytucje badawcze, zwłaszcza te na obszarach wiejskich, nie mają łatwego dostępu do oczu dawcy. Chociaż istnieje dostępna na rynku nieśmiertelnikowa linia komórkowa RPE (ARPE-19), brakuje jej podstawowych funkcji RPE in vivo i nie jest powszechnie akceptowana w wielu publikacjach naukowych z zakresu okulistyki. Istnieje pilna potrzeba pozyskania reprezentatywnych pierwotnych ogniw RPE z łatwiej dostępnego i bardziej opłacalnego źródła. Protokół ten wyjaśnia izolację i subkulturę pierwotnych komórek RPE uzyskanych pośmiertnie z oczu świni, które mogą być pozyskiwane lokalnie od dostawców komercyjnych lub akademickich. Protokół ten wymaga powszechnych materiałów zwykle znajdowanych w laboratoriach hodowli tkankowych. Rezultatem jest podstawowa, zróżnicowana i opłacalna alternatywa dla iPSC, ludzkich oczu dawcy i komórek ARPE-19.

Stosując tę procedurę, pomyślnie wyizolowano pierwotne komórki RPE z oczu świń. Rycina 1A przedstawia komórki RPE 3 dni po izolacji z charakterystyczną pigmentacją. Po 1 tygodniu wzrostu komórki osiągnęły pełną konfluencję i utworzyły zdrową monowarstwę (Rycina 1B). Następnie komórki przeniesiono do insertów hodowlanych, gdzie zachowały swoją pigmentację i morfologię (Rycina 1C), co dodatkowo potwierdza skuteczność procedury izolacji. Hodowle, które nie wykazywały tych cech, a zamiast tego prezentowały zmienną morfologię i nadmierną pigmentację (Rycina 1D), uznano za potencjalnie zanieczyszczone komórkowo i nie wykorzystano ich w eksperymentach. Komórki RPE wyizolowane w niniejszym opracowaniu wykazują ekspresję RPE65, białka silnie wyrażanego w komórkach RPE (Rycina 2). Obszary, w których ekspresja RPE65 wydaje się niższa, wynikają prawdopodobnie z blokowania fluorescencji przez pigmentację, ponieważ obszary te odpowiadają komórkom silniej spigmentowanym (Rycina 2A). Innym charakterystycznym białkiem ekspresjonowanym przez wyizolowane komórki RPE był VEGF. Po 10 dniach VEGF był silniej ekspresjonowany po stronie podstawnej monowarstwy RPE z koncentracją 2612.5 ± 28.0 pg/mL w porównaniu ze stroną apikalną z koncentracją 2141.2 ± 53.5 pg/mL (Rycina 3). Pierwotne komórki RPE świń posiadają również mikrokosmki i morfologię brukową (Rycina 4). Dodatkowo, podczas wzrostu na insertach hodowlanych, odczyty TEER wzrosły z 166.1 ± 75.9 Ω∙cm2 w 7. dniu do 363.4 ± 9.0 Ω∙cm2 po 14 dniach (Rycina 5), co wskazuje na spójne tworzenie zdrowych połączeń ścisłych w czasie22. Aby dokładniej zbadać tworzenie połączeń, przeanalizowano ekspresję ZO-1 w komórkach RPE, która była zlokalizowana na granicach komórek, co sugeruje prawidłowe tworzenie połączeń i integralność monowarstwy (Rycina 6).
<img alt="Mikrografie elektronowe pokazujące skupianie się nanocząstek w hodowlach komórkowych, ilustrujące badanie agregacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Pierwotne RPE po wysianiu na płytki wielodołkowe i podpodziału. Zdrowe komórki RPE 3 dni po izolacji (A), w pełni konfluencyjna monowarstwa 7 dni po izolacji (B), RPE pomyślnie przeniesione na wkładkę do hodowli (C) oraz obszary potencjalnej kontaminacji komórkowej (strzałki) w hodowli RPE (D). Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; barwienie komórek; fluorescencja czerwona i niebieska; analiza komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obrazy immunocytochemiczne wykazujące ekspresję RPE65 w komórkach RPE świni. Obrazy w polu jasnym (A), RPE65 (B), jąder komórkowych (C) oraz obraz złożony (D) komórek 15 dni po wysianiu. Należy zauważyć, że ziarniste tło na obrazie w polu jasnym to porowata membrana wkładu hodowlanego. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównawczy stężenia VEGF; apikalne vs bazalne; wykres słupkowy; analiza statystyczna; biologia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Ekspresja VEGF po stronie apikalnej i bazalnej monowarstwy RPE. Stężenie VEGF określono za pomocą testu ELISA wykonanego po 10 dniach wzrostu komórek na wkładkach hodowlanych. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe dla n = 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig03largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii elektronowej skaningowej przedstawiający strukturę porowatą; analiza inżynierii materiałowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obraz z mikroskopii elektronowej skaningowej (SEM) pierwotnych komórek RPE świni. Komórki hodowano przez 30 dni przed wykonaniem obrazowania. Pasek skali = 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy pomiaru rezystancji; rezystancja w Ω*cm² w dniach 7, 10, 14; wyniki eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Pomiary TEER wykonane na komórkach RPE hodowanych na wkładkach do hodowli komórkowych. Wartości rezystancji po 7, 10 i 14 dniach wzrostu. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe dla n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig05largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna hodowli komórkowych; A: kontrast fazowy, B-D: barwienie fluorescencyjne zielone/niebieskie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66079/66079fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Obrazy immunocytochemiczne wykazujące ekspresję ZO-1 w komórkach RPE świni. Obrazy w świetle przechodzącym (A), ZO-1 (B), jąder komórkowych (C) oraz obraz złożony (D) komórek 6 dni po wysianiu na płytki z dołkami o szklanym dnie. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66079/66079fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje procedurę pozyskiwania i hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z lokalnie pozyskiwanych oczu świń. Komórki te służą jako wysokiej jakości alternatywa dla komórek macierzystych i nadają się do badań siatkówki in vitro.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń do modelowania in vitro

The retinal pigment epithelium (RPE) is a crucial monolayer in the outer retina responsible for supporting photoreceptors. RPE degeneration commonly ...

Projektujemy modele chorób, aby naśladować aspekty patologii siatkówki. Dzięki tym modelom możemy lepiej zrozumieć rolę komórek RPE w chorobach w oparciu o ich reakcję na zmiany fizyczne, na przykład gdy na monowarstwie występuje naprężenie lub membrana BREX gęstnieje wraz z wiekiem. Jednym z największych wyzwań jest posiadanie reprezentatywnego typu ogniwa.W porównaniu z powszechnie stosowaną unieśmiertelnioną linią komórkową, pierwotne komórki wyizolowane tą techniką sprawiają, że nasze modele chorób są bardziej realistyczne w stosunku do tego, co dzieje się w naszych oczach. Technika ta zapewnia nam metodę uzyskiwania wysokiej jakości komórek bez konieczności długiego różnicowania. Ponadto korzystamy z zasobów, które są powszechnie dostępne dla laboratoriów badawczych, co sprawia, że jest to bardziej opłacalne.Idąc dalej, chcemy przyjrzeć się, w jaki sposób naturalne zmiany, które zachodzą w oczach podczas starzenia się, mogą prowadzić do wczesnych stadiów AMD. Chcemy lepiej zrozumieć te zmiany, abyśmy mogli zidentyfikować konkretne cele leczenia. Gdy wyłuszczone oczy świni z warsztatu mięsnego kontrolowanego przez USDA dotrą do laboratorium, przystąp do usuwania tkanek zewnętrznych.Jedną ręką przytrzymaj mięsień przyczepiony do oka. Za pomocą skalpela delikatnie odetnij drugą ręką tkankę otaczającą twardówkę. Użyj zakrzywionych nożyczek do tęczówki, aby przyciąć nerw wzrokowy, a następnie umieść oko na lodzie z rogówką skierowaną w dół.W celu wycięcia, za pomocą pęsety, przenieś oko do studzienki zawierającej 10% roztwór jodu powidonu i obróć je, aby upewnić się, że jest w pełni pokryte. Umieść sterylną gazę na płytkim, odwróconym wieczku szalki Petriego. Umieść sitko do komórek na osobnej szalce Petriego.Przenieść oko z roztworu jodu powidonu do studzienki zawierającej DPBS i myć je przez około pięć sekund, a następnie stopniowo przenosić do następnych studzienek zawierających DPBS, aby rozcieńczyć roztwór jodu. Następnie umieść oko na sterylnej gazie. Za pomocą skalpela wykonaj małe nacięcie poniżej ora serrata lub mniej więcej 1/3 w dół kuli ziemskiej od krawędzi tęczówki.Użyj nożyczek do tęczówki, aby ciąć równomiernie wzdłuż obwodu kuli ziemskiej równolegle do rogówki. Użyj pęsety, aby chwycić nerw wzrokowy i delikatnie oderwij gałkę od gazy. Umieść muszlę oczną w przygotowanym sitku do komórek wnętrzem muszli ocznej skierowanym do góry.Delikatnie dodaj schłodzony DPBS do muszli ocznej, upewniając się, że poziom płynu znajduje się tuż poniżej najniższego punktu nacięcia. Aby rozpocząć, wysterylizuj i wypreparuj wyłuszczone oczy uzyskane z rzeźni kontrolowanej przez USDA, aby przygotować oko cu. Delikatnie umieść muszlę oczną wnętrzem skierowanym do góry na szalce Petriego zawierającej sitko do komórek.Dodaj schłodzony DPBS do muszli ocznej, upewniając się, że poziom płynu znajduje się tuż poniżej najniższego punktu nacięcia. Pod latarką znajdź miejsca, w których siatkówka nerwowa zaczyna odłączać się od nabłonka barwnikowego siatkówki. Następnie pęsetą delikatnie chwyć uniesioną siatkówkę nerwową i oderwij ją.Delikatnie zbierz siatkówkę nerwową w pobliżu tarczy nerwu wzrokowego. Za pomocą pipety Pasteura podłączonej do systemu aspiracji próżniowej odessaj siatkówkę nerwową. Ostrożnie dodaj dodatkowy schłodzony DPBS, aby zastąpić zasysaną objętość.Teraz odessaj ten dodany DPBS, aby usunąć pozostałą siatkówkę nerwową. Po usunięciu siatkówki nerwowej ze wszystkich muszli ocznych, delikatnie dodaj trypsynę do każdej muszli ocznej i załóż pokrywkę szalki Petriego. Inkubuj oczy z trypsyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 30 minut.Pod latarką użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby delikatnie usunąć komórki nabłonka barwnikowego siatkówki z każdej muszli ocznej. Przenieś usunięte komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Umyj muszlę oczną pożywką do hodowli komórkowych, aby zebrać pozostałe komórki, a także zneutralizować trypsynę.Wymieszaj te pożywki zawierające komórki z wcześniej pobranymi komórkami. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 250 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.Zawiesić każdą osadkę komórkową w trzech mililitrach roztworu roboczego DNazy. Zawiesinę komórkową inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 15 minut, a następnie odwirować w temperaturze 150 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach świeżej pożywki do hodowli komórkowych.Przenieś komórki uzyskane z dwóch do trzech oczu w jednym dołku sześciodołkowej płytki i rozważ to jako przejście zero. Następnie ostrożnie przenieś sześciodołkową płytkę z nasionami do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pierwotne komórki nabłonka barwnikowego siatkówki wyizolowano z oczu świń z charakterystyczną pigmentacją widoczną trzy dni po izolacji.Komórki osiągnęły pełną konfluencję po tygodniu, co wskazuje na zdrową monowarstwę. Kultury wykazujące nieprawidłową morfologię i nadmierną pigmentację zostały uznane za skażone i nie zostały wykorzystane w eksperymentach.

isolation-primary-porcine-retinal-pigment-epithelial-cells-for-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy powtarzalną metodę hodowli konfluentnych monowarstw ludzkich płodowych komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (hfRPE), które wykazują morfologię, fizjologię, polarność oraz wzorce ekspresji białek i genów charakterystyczne dla natywnej tkanki dorosłego organizmu. Praca ta została rozszerzona o model zwierzęcy kilku chorób oczu.

Modele eksperymentalne do badania fizjologii i patofizjologii nabłonka pigmentowego siatkówki

W tym filmie pokazujemy procedurę pozyskiwania komórek nabłonka pigmentowego oka od modelu królika. Komórki są pomocne w opracowywaniu strategii terapeutycznych w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.

Izolowanie komórek IPE i RPE: technika pozyskiwania komórek nabłonka pigmentowego oka z oka królika

W tym filmie opisujemy technikę izolowania komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki z oczu świń w celu uzyskania ich pierwotnych kultur do badań in vivo i ex vivo. Te komórki pigmentowe mogą być genetycznie modyfikowane w celu zbadania metod regeneracyjnych w leczeniu chorób oczu.

Izolacja komórek IPE i RPE: technika uzyskiwania pigmentowanych komórek nabłonkowych z izolowanego oka świni

Ten film pokazuje procedurę izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i komórek nabłonka barwnika tęczówki (IPE) z pobranych oczu bydła. Wyizolowane komórki można hodować w celu zbadania ich roli w leczeniu chorób oczu.

Izolowanie komórek RPE i IPE z oka bydła: procedura zbierania i hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego bydła

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Tutaj prezentowana jest łatwa do naśladowania metoda hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świni in vitro.

Pierwotna hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń

Opisujemy prostą i skuteczną metodę izolowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od oczu młodych pigmentowanych świnek morskich. Procedura ta pozwala na dalsze badania biologii molekularnej wyizolowanego RPE, w tym analizy ekspresji genów.

Izolacja komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu świnki morskiej

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Naucz się izolować pierwotne komórki nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu świń w celu tworzenia realistycznych modeli chorób siatkówki in vitro. Ta technika pozwala uzyskać wysokiej jakości komórki w krótkim czasie.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń do modelowania in vitro

Przeglądaj więcej filmów