Izolacja pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń do modelowania in vitro

Projektujemy modele chorób, aby naśladować aspekty patologii siatkówki. Dzięki tym modelom możemy lepiej zrozumieć rolę komórek RPE w chorobach w oparciu o ich reakcję na zmiany fizyczne, na przykład gdy na monowarstwie występuje naprężenie lub membrana BREX gęstnieje wraz z wiekiem. Jednym z największych wyzwań jest posiadanie reprezentatywnego typu ogniwa.

W porównaniu z powszechnie stosowaną unieśmiertelnioną linią komórkową, pierwotne komórki wyizolowane tą techniką sprawiają, że nasze modele chorób są bardziej realistyczne w stosunku do tego, co dzieje się w naszych oczach. Technika ta zapewnia nam metodę uzyskiwania wysokiej jakości komórek bez konieczności długiego różnicowania. Ponadto korzystamy z zasobów, które są powszechnie dostępne dla laboratoriów badawczych, co sprawia, że jest to bardziej opłacalne.

Idąc dalej, chcemy przyjrzeć się, w jaki sposób naturalne zmiany, które zachodzą w oczach podczas starzenia się, mogą prowadzić do wczesnych stadiów AMD. Chcemy lepiej zrozumieć te zmiany, abyśmy mogli zidentyfikować konkretne cele leczenia. Gdy wyłuszczone oczy świni z warsztatu mięsnego kontrolowanego przez USDA dotrą do laboratorium, przystąp do usuwania tkanek zewnętrznych.

Jedną ręką przytrzymaj mięsień przyczepiony do oka. Za pomocą skalpela delikatnie odetnij drugą ręką tkankę otaczającą twardówkę. Użyj zakrzywionych nożyczek do tęczówki, aby przyciąć nerw wzrokowy, a następnie umieść oko na lodzie z rogówką skierowaną w dół.

W celu wycięcia, za pomocą pęsety, przenieś oko do studzienki zawierającej 10% roztwór jodu powidonu i obróć je, aby upewnić się, że jest w pełni pokryte. Umieść sterylną gazę na płytkim, odwróconym wieczku szalki Petriego. Umieść sitko do komórek na osobnej szalce Petriego.

Przenieść oko z roztworu jodu powidonu do studzienki zawierającej DPBS i myć je przez około pięć sekund, a następnie stopniowo przenosić do następnych studzienek zawierających DPBS, aby rozcieńczyć roztwór jodu. Następnie umieść oko na sterylnej gazie. Za pomocą skalpela wykonaj małe nacięcie poniżej ora serrata lub mniej więcej 1/3 w dół kuli ziemskiej od krawędzi tęczówki.

Użyj nożyczek do tęczówki, aby ciąć równomiernie wzdłuż obwodu kuli ziemskiej równolegle do rogówki. Użyj pęsety, aby chwycić nerw wzrokowy i delikatnie oderwij gałkę od gazy. Umieść muszlę oczną w przygotowanym sitku do komórek wnętrzem muszli ocznej skierowanym do góry.

Delikatnie dodaj schłodzony DPBS do muszli ocznej, upewniając się, że poziom płynu znajduje się tuż poniżej najniższego punktu nacięcia. Aby rozpocząć, wysterylizuj i wypreparuj wyłuszczone oczy uzyskane z rzeźni kontrolowanej przez USDA, aby przygotować oko cu. Delikatnie umieść muszlę oczną wnętrzem skierowanym do góry na szalce Petriego zawierającej sitko do komórek.

Dodaj schłodzony DPBS do muszli ocznej, upewniając się, że poziom płynu znajduje się tuż poniżej najniższego punktu nacięcia. Pod latarką znajdź miejsca, w których siatkówka nerwowa zaczyna odłączać się od nabłonka barwnikowego siatkówki. Następnie pęsetą delikatnie chwyć uniesioną siatkówkę nerwową i oderwij ją.

Delikatnie zbierz siatkówkę nerwową w pobliżu tarczy nerwu wzrokowego. Za pomocą pipety Pasteura podłączonej do systemu aspiracji próżniowej odessaj siatkówkę nerwową. Ostrożnie dodaj dodatkowy schłodzony DPBS, aby zastąpić zasysaną objętość.

Teraz odessaj ten dodany DPBS, aby usunąć pozostałą siatkówkę nerwową. Po usunięciu siatkówki nerwowej ze wszystkich muszli ocznych, delikatnie dodaj trypsynę do każdej muszli ocznej i załóż pokrywkę szalki Petriego. Inkubuj oczy z trypsyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 30 minut.

Pod latarką użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby delikatnie usunąć komórki nabłonka barwnikowego siatkówki z każdej muszli ocznej. Przenieś usunięte komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Umyj muszlę oczną pożywką do hodowli komórkowych, aby zebrać pozostałe komórki, a także zneutralizować trypsynę.

Wymieszaj te pożywki zawierające komórki z wcześniej pobranymi komórkami. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 250 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.

Zawiesić każdą osadkę komórkową w trzech mililitrach roztworu roboczego DNazy. Zawiesinę komórkową inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 15 minut, a następnie odwirować w temperaturze 150 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach świeżej pożywki do hodowli komórkowych.

Przenieś komórki uzyskane z dwóch do trzech oczu w jednym dołku sześciodołkowej płytki i rozważ to jako przejście zero. Następnie ostrożnie przenieś sześciodołkową płytkę z nasionami do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pierwotne komórki nabłonka barwnikowego siatkówki wyizolowano z oczu świń z charakterystyczną pigmentacją widoczną trzy dni po izolacji.

Komórki osiągnęły pełną konfluencję po tygodniu, co wskazuje na zdrową monowarstwę. Kultury wykazujące nieprawidłową morfologię i nadmierną pigmentację zostały uznane za skażone i nie zostały wykorzystane w eksperymentach.