Name: Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięcia przeciwciał fluorescencyjnych do zarodków Drosophila w celu wizualizacji białek o niskiej liczebności. Technika ta umożliwia obserwację dynamicznych procesów komórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Jennifer A. Zallen za dostarczenie linii Sqh-GFP Drosophila i wsparcie dla początkowego rozwoju tej techniki, oraz dr Francois Schweisguth za dostarczenie linii Notch-GFP Drosophila. Praca ta była wspierana przez fundusze z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (32270809) dla H.H.Yu, hojne wsparcie finansowe i kadrowe ze Szkoły Nauk Przyrodniczych, SUSTech oraz fundusze dla Y. Yana z Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722.

Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i zgodą Szkoły Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu SUSTech. Użyty organizm to Drosophila melanogaster, a genotypy to Notch-Knockin-GFP (chromosom X) i Sqh-sqh-GFP (chromosom II), hojnie dostarczone przez laboratoria odpowiednio dr Francois Schweisguth (Instytut Pasteura) i dr Jennifer Zallen (Instytut Sloan Kettering). Chociaż protokół ten koncentruje się głównie na aspektach znakowania przeciwciał i obrazowania na żywo, zapoznaj się z opublikowanymi raportami, aby uzyskać bardziej szczegółowe opisy pobierania i wstrzykiwania zarodków Drosophila15,16.
1. Fluorescencyjne znakowanie przeciwciał
<ol>
	<li>Najlepiej stosować przeciwciała monoklonalne lub nanociała dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Przygotować podstawowe stężenie przeciwciał na poziomie 1 mg/ml lub wyższym. 
	UWAGA: W tym badaniu jako przykład użyto GFP nanobody (patrz Tabela materiałów). Dostępny na rynku GFP nanobody jest pakowany w stężeniu 1,0 mg/ml i objętości 250 μl. Dodatkowo stosuje się dostępny na rynku zestaw do znakowania przeciwciał (patrz Tabela materiałów), który sprzęga Alexa Fluor 594 z pierwszorzędowymi aminami białek poprzez reakcję estru sukcynimidylu11. Co ważne, ten proces znakowania nie zmienia znacząco stężenia przeciwciał.</li>
	<li>Przygotować 1 M roztwór wodorowęglanu sodu, ponownie zawieszając składnik B (dostarczony w zestawie do znakowania przeciwciał) w 1 ml wody dejonizowanej.</li>
	<li>Dostosować stężenie przeciwciał do 1,0 mg/ml, a następnie dodać 1/10objętości (10 μl na 100 μl nanociała GFP) 1 M roztworu wodorowęglanu sodu.</li>
	<li>Dodać 110 μl mieszaniny przeciwciał (z kroku 1.3) bezpośrednio do probówki zawierającej barwnik Alexa Fluor 594. Odwrócić do mieszania (nie wirować) i inkubować na rotatorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmontuj kolumnę oczyszczającą z zestawu do koniugacji (patrz Tabela materiałów). Przygotować złoże żywicy o pojemności 1,5 ml (dostarczone w zestawie do znakowania przeciwciał) i odwirować kolumnę przy 1100 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT), aby usunąć nadmiar płynu z żywicy.</li>
	<li>Dodać mieszaninę reakcyjną (z kroku 1.4) kroplami na górę kolumny z żywicą i odwirować przy 1100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania znakowanego przeciwciała. Pobrane przeciwciało powinno mieć różowy kolor, a objętość powinna być nieco mniejsza niż 100 μl. Przechowywać w owiniętych folią lub ciemnych probówkach w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodków Drosophila
<ol>
	<li>Umieść 200 nowo wyklutych dorosłych Drosophila w plastikowej klatce w kształcie cylindra (średnica = 5 cm, wysokość = 8 cm) ze stosunkiem samców do samic 1: 10. Uszczelnij jedną stronę porowatą metalową siatką do wentylacji, a drugą stronę płytką agarową z sokiem owocowym/pastą drożdżową.</li>
	<li>Zmieniaj płytkę co 12 godzin przez trzy dni przed pobraniem zarodków. Pozwala to na synchronizację składania jaj przez Drosophila i poprawia wydajność zbierania.</li>
	<li>W dniu wstrzyknięcia należy zmienić klatkę na talerz z sokiem owocowym z minimalną ilością pasty drożdżowej i zbierać zarodki w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę. Jeżeli pierwsza runda pobierania nie daje wystarczającej liczby zarodków (<50 zarodków), należy wyrzucić pierwszą płytkę i powtarzać ten krok w drugiej rundzie pobierania, aż w ciągu 1 godziny zostanie złożonych więcej niż 100 zarodków.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z klatki, aby zatrzymać składanie jaj i inkubować w temperaturze 25 °C przez kolejne 2 godziny, aby uzyskać zarodki w wieku 2-3 godzin. Prawidłowy etap rozwoju zarodków ma kluczowe znaczenie dla powodzenia wstrzyknięcia przeciwciał.</li>
	<li>Aby usunąć skorupkę zarodków, dodaj 2 ml 50% wybielacza do talerza z sokiem owocowym i delikatnie usuń zarodki z płytki za pomocą pędzla (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A-4). Często zarodki są układane bezpośrednio na paście drożdżowej. W takim przypadku dopuszczalne jest wcieranie pasty drożdżowej w roztwór wybielacza, aby zebrać wszystkie zarodki.</li>
	<li>Inkubuj pływające zarodki w 50% wybielaczu przez 2 minuty i obracaj talerz z sokiem owocowym co 30 sekund, aby poprawić skuteczność usuwania skorupek jaj.</li>
	<li>Przenieś mieszankę zarodków i wybielaczy, wlewając ją do sitka do komórek nylonowych o średnicy 70 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-7). Dokładnie umyj zarodki za pomocą butelki z wodą, aby usunąć resztki wybielacza i pasty drożdżowej. Całkowicie osusz sitko do komórek ręcznikami papierowymi, upewniając się, że nadmiar wody wokół zarodków został usunięty.</li>
</ol>
3. Wyrównanie i wysuszenie zarodka
<ol>
	<li>Przygotuj żel 4% agarozowy o wymiarach 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (szerokość, długość, wysokość) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A-9) i pozwól żelowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Wytnij blok agarozy o wymiarach 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (szerokość, długość, wysokość) za pomocą czystej żyletki i umieść klocek na szkiełku podstawowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-2). Sprawdź blok żelu pod lunetą preparacyjną, aby upewnić się, że krawędzie są przycięte prosto, a powierzchnia jest płaska i sucha.</li>
	<li>Przenieś zarodki z sitka na blok żelowy za pomocą pędzla. Rozłóż zarodki równomiernie wzdłuż linii środkowej bloku, delikatnie szczotkując. Idealnie, skupiska zarodków są rozdzielane na pojedyncze lub dublety, nie stykając się ze sobą.</li>
	<li>Przygotuj pęsetę z dwiema nogami ściśle sklejonymi ze sobą, aby utworzyć jedną cienką końcówkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-5). Pod lunetą sekcyjną podnieś pojedyncze zarodki za pomocą pęsety i umieść je wzdłuż dłuższej krawędzi bloku żelu. Wyrównaj 20-30 zarodków, upewniając się, że ich oś przednio-tylna jest równoległa do krawędzi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Odpipetuj 10 μl kleju heptanowego (patrz Tabela materiałów) na środku szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 50 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-1) i rozprowadź klej na prostokątnym obszarze o wymiarach 0,5 cm x 3 cm za pomocą końcówki do pipety. Przed użyciem poczekaj, aż klej całkowicie wyschnie.</li>
	<li>Umieść szkiełko podstawowe z blokiem żelowym na krawędzi biurka, tak aby zarodki były skierowane na zewnątrz. Podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleju za pomocą pęsety z płaską końcówką (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A-6) i przytrzymaj je nieruchomo na zarodkach, stroną kleju skierowaną w stronę zarodków pod kątem około 45 stopni. 
	UWAGA: Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do bloku żelu, aby zarodki miały kontakt z klejem, a następnie szybko zwolnij nacisk i podnieś szkiełko nakrywkowe. Wielkość zastosowanego naprężenia ma kluczowe znaczenie, aby zarodki mogły być stabilnie przymocowane do kleju bez zbyt mocnego nacisku i pękania.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl wody na środek nowego szkiełka podstawowego i umieścić szkiełko nakrywkowe z zarodkami na wierzchu, stroną zarodka skierowaną do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Upewnij się, że używasz wody zamiast lakieru do paznokci lub innego kleju do mocowania szkiełka nakrywkowego do szkiełka podstawowego, ponieważ ta strona szkiełka nakrywkowego zostanie umieszczona bezpośrednio na soczewce konfokalnej w celu obrazowania na żywo.</li>
	<li>Suszyć zarodki w komorze suszącej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A-3) (patrz Tabela Materiałów) przez 10-15 minut, aż błona witelinowa zacznie się marszczyć (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2E). Wymagany czas może się różnić w zależności od wilgotności w pomieszczeniu i powinien być testowany doświadczalnie dla każdych warunków laboratoryjnych.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 40 μl oleju halowęglowego (mieszanina typu 27 i typu 700 w stosunku objętościowym 1:1, patrz tabela materiałów) na jednym końcu paska zarodkowego. Przechyl szkiełko, aż olej halowęglowy pokryje całą powierzchnię zarodków.</li>
</ol>
4. Wstrzykiwanie przeciwciał i obrazowanie
<ol>
	<li>Przygotować kilka szklanych igieł do wstrzykiwań za pomocą ściągacza do mikropipet (ustawienia parametrów znajdują się w Tabeli materiałów) i załadować do każdej igły 5 μl roztworu przeciwciał znakowanych AlexaFluor (od kroku 1.6).</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 25 mm x 25 mm na szkiełku podstawowym na szkiełku podstawowym . Odpipetować 40 μl oleju halowęglowego i rozprowadzić go wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Pod zakresem iniekcji wyrównać końcówkę igły z krawędzią szkiełka nakrywkowego pod olejem. Wyregulować ciśnienie powietrza wtryskowego pikopompy (patrz Tabela Materiałów) tak, aby jedna pompa wytworzyła jeden pęcherzyk wypełniony przeciwciałami. Średnica pęcherzyka powinna być ograniczona do 20-50 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F).</li>
	<li>Zastąp puste szkiełko szkiełkowe szkiełkiem podstawowym zawierającym zarodki pod olejem. Ustawić końcówkę igły do wstrzykiwań prostopadle do osi przednio-tylnej zarodków (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D,G).</li>
	<li>Sprawdź stadium zarodków, aby upewnić się, że większość z nich rozpoczęła celularyzację, ale jeszcze nie rozpoczęła gastrulacji (etap 4 i etap 5), pozostając jako syncytium (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2F,G). 
	UWAGA: Cechą charakterystyczną tego etapu jest brak jakichkolwiek rowków lub fałd oraz obecność owalnej, ciemnej torebki żółtkowej widocznej w środku zarodka. Charakterystyka morfologiczna stadium zarodkowego pod olejem opiera się na rozdziale książki "Stages of Drosophila Embryogenesis" autorstwa Volkera Hartensteina17.</li>
	<li>Użyj manipulatora etapu X-Y, aby przesunąć zarodki w kierunku igły, aż końcówka dotrze do środka żółtka. Pompuj dwa do trzech razy, aby wstrzyknąć przeciwciała do żółtka. Na udane wstrzyknięcie wskazuje szybkie zaniknięcie zmarszczki błony witelinowej w miarę jak zarodki zyskują objętość z roztworu przeciwciała (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 2G).</li>
	<li>Użyj manipulatora stopnia X-Y, aby odsunąć zarodki od igły po wstrzyknięciu i przejść w dół do następnego zarodka. Powtarzaj krok 6, aż wszystkie zarodki znajdujące się na szkiełku zostaną wstrzyknięte.</li>
	<li>Przenieś szkiełko podstawowe z wstrzykniętymi zarodkami do komory wilgotnościowej (<klasa silna="xfig">Ryc. 2A-8). Inkubować w temperaturze 25 °C aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju zarodka.</li>
	<li>Zdejmij szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm ze szkiełka podstawowego i umieść je bezpośrednio w uchwycie szkiełka mikroskopowego. Strona, która nie ma zarodków, będzie zmierzona z celami. Zlokalizuj zarodki za pomocą soczewki o małym powiększeniu w jasnym oświetleniu pola i przełącz się na obiektyw 40x lub 63x, aby uzyskać fluorescencyjne obrazowanie na żywo o wysokiej rozdzielczości.</li>
</ol>

Enhancing Protein Visualization with Antibody-Mediated Live Imaging

<ol><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginnings+of+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">The beginnings of immunofluorescence.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).</li>
<li>Arthur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+the+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of the antibody.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biobanking%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Biobanking, methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).</li>
<li>Ragkousi, K., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+integrity+and+cell+division%3A+Concerted+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control.</a> Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).</li>
<li>Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+the+dividing+cell+and+its+neighbors+regulates+adherens+junction+formation+during+cytokinesis+in+epithelial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue.</a> Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).</li>
<li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+properties+of+aequorin%2C+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan%2C+aequorea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Boshart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+very+strong+enhancer+is+located+upstream+of+an+immediate+early+gene+of+human+cytomegalovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus.</a> Cell. 41 (2), 521-530 (1985).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).</li>
<li>Berg, E. A., Fishman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+antibodies+using+N+-Hydroxysuccinimide+%28NHS%29-fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).</li>
<li>Saerens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+universal+VHH+framework+to+graft+non-canonical+antigen-binding+loops+of+camel+single-domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).</li>
<li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li>
<li>Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localisations+of+the+CPTI+collection+of+YFP-tagged+proteins+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos.</a> Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 50, e2477(2011).</li>
<li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, e2503(2011).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The embryonic development of Drosophila melanogaster.</a> , 9-102 (1997).</li>
<li>Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch-mediated+proliferation+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Notch-mediated proliferation circuitry.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).</li>
<li>Kopan, R., Ilagan,, Ma, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+canonical+Notch+signaling+pathway%3A+unfolding+the+activation+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li>
<li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta%2C+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li>
<li>Struhl, G., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+is+required+for+activity+and+nuclear+access+of+Notch+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila.</a> Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).</li>
<li>Henrique, D., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Notch+signaling%3A+a+simple+logic+deployed+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space.</a> Development. 146 (3), dev172148(2019).</li>
<li>Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-lineage+fate+decisions+involve+of+notch+receptors+basal+to+the+midbody+in+drosophila+sensory+organ+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells.</a> Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinases+and+phosphatases%3A+The+Yin+and+Yang+of+protein+phosphorylation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling.</a> Cell. 80 (2), 225-236 (1995).</li>
<li>Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+phosphotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to phosphotyrosine.</a> Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).</li>
<li>Hunter, T., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+induces+rapid+tyrosine+phosphorylation+of+proteins+in+A431+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells.</a> Cell. 24 (3), 741-752 (1981).</li>
<li>Yu, H. H., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abl+and+Canoe%2FAfadin+mediate+mechanotransduction+at+tricellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions.</a> Science. 370 (6520), eaba5528(2020).</li>
<li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+contractions+of+an+actin%E2%80%93myosin+network+drive+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Przedstawiona procedura przedstawia specjalistyczną metodę znakowania fluorescencyjnego za pomocą niestandardowych przeciwciał, a następnie wstrzykiwania do zarodków Drosophila we wczesnym stadium rozwoju. Technika ta ułatwia wizualizację w czasie rzeczywistym białek lub modyfikacji potranslacyjnych, które występują w małych ilościach i są zazwyczaj trudne do zaobserwowania za pomocą konwencjonalnych metod znakowania GFP/mCherry.
Należy zachować ostrożność przy rozszerzaniu tej metody w celu dokonania porównań ilościowych między zarodkami typu dzikiego i zmutowanymi. Podczas gdy stężenie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych może być utrzymywane na tym samym poziomie między grupą kontrolną i eksperymentalną w immunofluorescencji, ilość wstrzykniętego przeciwciała i skuteczność znakowania mogą się różnić w zależności od zarodka. Dlatego analiza ilościowa powinna ograniczać się do śledzenia zmian intensywności fluorescencji w czasie lub przeprowadzania analizy korelacji z sygnałami innych kanałów w tym samym zarodku podczas wykonywania wielokolorowego obrazowania na żywo. Na przykład analizę kolokalizacji i korelacji można przeprowadzić przy użyciu intensywności p-Tyr i miozyny27, podczas gdy intensywności p-Tyr nie można bezpośrednio porównać między zarodkami typu dzikiego i genem X knockdown przy użyciu metody wstrzykiwania przeciwciał.
Podobnie jak w przypadku innych podejść opartych na znacznikach fluorescencyjnych do badania dynamiki białek, wiązanie przeciwciał może potencjalnie zmienić aktywność, transport lub lokalizację docelowych białek. Dlatego przeciwciała monoklonalne lub nanociała są preferowane w stosunku do przeciwciał poliklonalnych do wstrzykiwań. Ponieważ epitopy przeciwciał monoklonalnych lub nanociał są dobrze zdefiniowane, to, czy blokowanie tych epitopów przeciwciałami zmienia aktywność białka, można modelować na podstawie struktur alfa-krotnych12,25. Z drugiej strony, epitopy przeciwciał poliklonalnych nie są precyzyjnie określone, a ich wiązanie może potencjalnie zmienić lokalizację lub aktywność białka, jeśli kieszenie katalityczne lub peptydy sygnałowe docelowych białek są zablokowane. Po drugie, przeciwciała mogą rozpoznawać niespecyficzne epitopy inne niż białka docelowe, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że nie ma tutaj etapów "wypłukiwania", jak w przypadku immunofluorescencji, w celu usunięcia niespecyficznych wiązań o niższym powinowactwie. Dlatego ważne jest, aby mieć grupy kontrolne, takie jak wstrzykiwanie przeciwciał do komórek pozbawionych epitopu, aby sprawdzić, czy obserwowany sygnał naprawdę odzwierciedla białka docelowe lub inne niespecyficzne epitopy.
Wstrzyknięcie przeciwciał nie różni się od wstrzykiwania siRNA lub gRNA CRISPR pod względem konfiguracji eksperymentalnej. Dlatego większość układów komórkowych, które są podatne na zastrzyki, powinna być kompatybilna z metodą wstrzykiwania przeciwciał. W zarodkach Drosophila przeciwciała sprzężone z fluorem Alexa są stabilne podczas rozwoju, a sygnały fluorescencyjne pozostają wykrywalne po kilku godzinach embriogenezy. W przypadku innych systemów, takich jak zarodki Xenopus lub Danio pręgowany, stężenie i objętość wstrzykniętych przeciwciał powinny być empirycznie testowane poprzez seryjne rozcieńczenia, aby osiągnąć idealną skuteczność znakowania. Ponadto alternatywne barwniki fluorescencyjne, takie jak ATTO10 , mogą potencjalnie oferować lepszy stosunek sygnału do szumu i rozpuszczalność w wodzie.

Immunofluorescencja to podstawowa technika współczesnej biologii komórki, pierwotnie opracowana przez Alberta Coonsa, która umożliwia wykrywanie cząsteczek w ich natywnych przedziałach komórkowych i charakteryzowanie składu molekularnego subkomórkowych organelli lub maszynerii1. W połączeniu z manipulacjami genetycznymi, immunofluorescencja pomaga ugruntować obecnie dobrze akceptowaną koncepcję, że lokalizacja białka jest niezbędna dla jego funkcji2. Oprócz specyficznych przeciwciał pierwotnych i jasnych barwników fluorescencyjnych, sukces tej techniki opiera się na wstępnym procesie zwanym utrwalaniem i przepuszczalnością, który zachowuje morfologię komórkową, unieruchamia antygeny i zwiększa dostępność przeciwciał w przedziałach wewnątrzkomórkowych. Nieuchronnie proces fiksacji i przepuszczalności zabiłby komórki i zakończyłby wszystkie procesy biologiczne3. Dlatego immunofluorescencja dostarcza jedynie migawki z podróży życiowej białek. Jednak wiele procesów biologicznych, takich jak migracja i podziały komórek, ma charakter dynamiczny, co wymaga zbadania zachowań białek w sposób przestrzenno-czasowo rozwiązany4,5.
Aby zbadać dynamikę białek w organizmach żywych, opracowano metody obrazowania na żywo oparte na genetycznie kodowanych białkach fluorescencyjnych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP)6 oraz szybkie mikroskopy konfokalne. Krótko mówiąc, interesujące białko może być genetycznie manipulowane w celu fuzji z GFP7, a następnie ektopowo eksprymowane z promotorów wirusa lub drożdży, takich jak wirus cytomegalii (CMV)8 lub sekwencja aktywacji upstream (UAS)9. Ponieważ GFP ma charakter autofluorescencyjny, nie są wymagane przeciwciała sprzężone z fluoroforem, aby ujawnić lokalizację docelowych białek, co omija konieczność wstępnych procesów utrwalania lub przenikania. W ciągu ostatnich dwóch dekad opracowano znaczniki fluorescencyjne obejmujące całe spektrum długości fal10, umożliwiające wielokolorowe obrazowanie na żywo kilku docelowych białek w tym samym czasie. Jednak w porównaniu z chemicznie modyfikowanymi barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak AlexaFluor lub ATTO, autofluorescencja tych genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych jest stosunkowo słaba i niestabilna, gdy ulega ekspresji z endogennych promotorów, zwłaszcza podczas obrazowania na żywo w dłuższych skalach czasowych10. Chociaż niedobór ten można złagodzić poprzez nadmierną ekspresję znakowanych fluorescencyjnie białek docelowych, wiele z nich o aktywności enzymatycznej, takich jak kinazy i fosfatazy, poważnie zakłóca normalne procesy biologiczne, jeśli nie ulega ekspresji na poziomie fizjologicznym.
Ten protokół przedstawia metodę, która umożliwia fotostabilne oświetlenie celu na podstawie przeciwciał w konfiguracji obrazu na żywo, zasadniczo umożliwiając immunofluorescencję bez procesu fiksacji lub przenikania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Za pomocą prostej reakcji aminowej opartej na NHS11, można sprzęgnąć barwniki fluorescencyjne, takie jak AlexaFluor 488 lub 594, z zasadniczo dowolnym przeciwciałem pierwszorzędowym lub nanociałem GFP/HA/Myc12. Wykorzystując cechę rozwojową polegającą na tym, że wszystkie komórki embrionalne Drosophila mają wspólną cytoplazmę podczas etapu syncytium13, można uzyskać wiązanie antygenu i oświetlenie całych zarodków po wstrzyknięciu przeciwciał sprzężonych z barwnikiem. Dzięki rozszerzającym się bibliotekom endogennie znakowanych białek dostępnych w Drosophila i innych systemach modelowych14, metoda ta może potencjalnie poszerzyć zastosowania tych bibliotek, ujawniając dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie o niskiej liczebności i innych białek nieznakowanych fluorescencyjnie (HA/Myc) w żywych tkankach.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Sangon Biotechnologia</td><td>&nbsp; A620014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania przeciwciał Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A20185</td><td>Kolumna oczyszczająca z kroku 1.6 jest zawarta w tym zestawie</td></tr><tr><td>Mikroskop biologiczny</td><td>SOPTOP</td><td>EX20</td><td>Soczewka okularu: PL 10X/20. Soczewka obiektywu: 10x/0,25</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>Wirówka TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5245</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Komora suszenia&nbsp;</td><td>ZAMEK& LOCK</td><td>HSM8200</td><td>320ml</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Mshot</td><td>MZ62</td><td>Soczewka okularu: WF10X/22mm.</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Drobna super pęseta</td><td>VETUS</td><td>ST-14</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; Okulary nakrywkowe: Prostokąty</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545F</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; Superfrost i handel; Szkiełka mikroskopowe Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>VETUS</td><td>33A-SA</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2198-1L</td><td>Klej heptanowy wykonany jest z dwustronnej taśmy zanurzonej w heptanie</td></tr><tr><td>Odczynnik do odwadniania&nbsp;</td><td>TOKAI</td><td>1-7315-01</td><td>Napełnij do 90% objętości komory osuszania</td></tr><tr><td>Ręczny mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>Procedura: krok 1, Ciepło: 290, siła: 300, odległość: 1.00, opóźnienie: 50, Krok 2, ciepło: 290, siła: 300, odległość: 2.21, opóźnienie: 50&nbsp;</td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa picopump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 830</td><td>Wyrzut: 20 psi; &nbsp; Zasięg: 100ms; Czas trwania: czasowy</td></tr><tr><td>PY20</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-508</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowe szalki Petriego</td><td>Biosharp</td><td>BS-100-SD</td><td></td></tr><tr><td>GFP nanobody</td><td>Chromotek</td><td>gt</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Wizualizacja białek w żywych komórkach za pomocą GFP (Zielone Białko Fluorescencyjne) i innych znaczników fluorescencyjnych znacznie poprawiła zrozumienie lokalizacji, dynamiki i funkcji białek. W porównaniu z immunofluorescencją, obrazowanie na żywo dokładniej odzwierciedla lokalizację białka bez potencjalnych artefaktów wynikających z utrwalenia tkanki. Co ważne, obrazowanie na żywo umożliwia ilościową i czasową charakterystykę poziomów i lokalizacji białek, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamicznych procesów biologicznych, takich jak ruch lub podział komórek. Jednak głównym ograniczeniem metod znakowania fluorescencyjnego jest potrzeba wystarczająco wysokich poziomów ekspresji białek, aby osiągnąć udaną wizualizację. W związku z tym nie można wykryć wielu endogennie znakowanych białek fluorescencyjnych o stosunkowo niskich poziomach ekspresji. Z drugiej strony, ekspresja ektopowa przy użyciu promotorów wirusowych może czasami prowadzić do błędnej lokalizacji białek lub zmian funkcjonalnych w kontekstach fizjologicznych. Aby rozwiązać te problemy, przedstawiono podejście, które wykorzystuje wysoce czułe wykrywanie białek za pośrednictwem przeciwciał w żywych zarodkach, zasadniczo przeprowadzając immunofluorescencję bez konieczności fiksacji tkanek. Jako dowód zasady, endogenny receptor Notch znakowany GFP, który jest ledwo wykrywalny w żywych zarodkach, może być z powodzeniem uwidoczniony po wstrzyknięciu przeciwciała. Co więcej, podejście to zostało zaadaptowane do wizualizacji modyfikacji potranslacyjnych (PTM) w żywych zarodkach, co umożliwiło wykrycie czasowych zmian we wzorcach fosforylacji tyrozyny podczas wczesnej embriogenezy i ujawniło nową subpopulację fosfotyrozyny (p-Tyr) pod błonami wierzchołkowymi. Podejście to można zmodyfikować w celu uwzględnienia innych przeciwciał specyficznych dla białka, specyficznych dla znacznika lub specyficznych dla PTM i powinno być kompatybilne z innymi organizmami modelowymi lub liniami komórkowymi podatnymi na wstrzyknięcie. Protokół ten otwiera nowe możliwości obrazowania na żywo białek o niskiej liczebności lub PTM, które wcześniej były trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod znakowania fluorescencyjnego.

Aby zademonstrować zalety metody wstrzykiwania przeciwciał w porównaniu z obrazowaniem żywych komórek opartym na znacznikach fluorescencyjnych lub immunofluorescencją, przedstawiono dwa studia przypadków charakteryzujące dynamiczną lokalizację rzadkiego receptora błony komórkowej, Notch, oraz rodzaj modyfikacji potranslacyjnej nazywanej fosforylacją tyrozyny w żywych embrionach.
Aktywność sygnalizacji Notch odgrywa kluczową rolę w determinacji losów komórek podczas embriogenezy oraz homeostazy organów u osobników dorosłych18,19. Po aktywacji przez ligandy Delta/Jagged20, domena wewnątrzkomórkowa transmembrane receptor Notch ulega cięciu i jest uwalniana do jądra21, co inicjuje kaskady programów transkrypcyjnych prowadzących do zmian losów komórek22. Statyczna lokalizacja receptora Notch została dobrze scharakteryzowana za pomocą immunofluorescencji w tkankach utrwalonych formaldehydem. Jednak dynamiczna lokalizacja Notch podczas wiązania ligandu lub procesu cięcia wewnątrzkomórkowego pozostaje w dużej mierze nieznana23, ze względu na brak metody obrazowania na żywo tego białka o stosunkowo niskiej obfitości w sposób szybki. W niniejszej pracy wstrzyknęliśmy nanoprzeciwciało GFP sprzężone z AlexaFluor do embrionów wykazujących ekspresję Notch z tagiem GFP z locus endogennego20. Bez wstrzyknięcia Notch-GFP jest ledwo wykrywalny w standardowych warunkach obrazowania na żywo, a sygnał fluorescencyjny szybko zanika podczas obrazowania time-lapse. Po wstrzyknięciu stosunek sygnału do szumu receptora Notch ulega znacznemu poprawieniu i staje się porównywalny z jakością sygnału w immunofluorescencji (Rycina 3A). Co więcej, wstrzyknięcie przeciwciał umożliwia czasową charakterystykę lokalizacji Notch w odstępach 45 s, bez widocznego spadku intensywności sygnału w 5-minutowym oknie obrazowania (Rycina 3B).
Fosforylacja tyrozyny to główny rodzaj potranslacyjnej modyfikacji białek, która pośredniczy w transdukcji sygnałów w wielu szlakach biologicznych24. Opracowano wysoce specyficzne przeciwciała monoklonalne (takie jak PY20 i 4G10) przeciwko fosfotyrozynie (p-Tyr), aby charakteryzować lokalizację i poziomy całkowitej fosforylacji tyrozyny z wykorzystaniem immunofluorescencji oraz western blotów25. Ponieważ nie istnieją znaczniki fluorescencyjne zdolne do śledzenia zmian fosforylacji w czasie rzeczywistym, tkanki lub komórki muszą być utrwalone i barwione lub lizowane i poddawane analizie western blot w różnych punktach czasowych, aby uzyskać obraz stanu fosforylacji w czasie i badać kinetykę fosforylacji tyrozyny po aktywacji sygnału26 (np. po podaniu czynnika wzrostu). Przedział czasowy w tej metodzie wynosi co najmniej kilka minut i jest z natury niedokładny ze względu na zmienny czas wymagany do przeprowadzenia takich procedur jak utrwalanie lub lizy komórek.
W niniejszym przedstawiono dowody na to, że metoda wstrzykiwania przeciwciał umożliwia bezpośrednią wizualizację stanu fosforylacji w żywych embrionach, pozwalając na śledzenie zmian lokalizacji i intensywności fosforylacji tyrozyny w regularnych odstępach czasu mierzonych w sekundach. Przeciwciało PY20 sprzężone z AlexaFluorem wstrzyknięto do embrionów wykazujących ekspresję łańcucha lekkiego miozyny z tagiem GFP, a następnie przeprowadzono dwukolorowe obrazowanie na żywo w interwałach 45 s. Jak wykazano wcześniej, fosforylacja tyrozyny jest silnie wzbogacona w złączach trójpółkomórkowych27, co zostało również potwierdzone za pomocą immunofluorescencji (Ryc. 4A). Co ciekawe, obrazowanie na żywo ujawniło również nową, drugą populację sygnału p-Tyr pod centrum błony apikalnej, której nie obserwuje się przy użyciu immunofluorescencji (Ryc. 4B). Dzięki obrazowaniu dwukolorowemu stwierdzono, że ta populacja sygnału p-Tyr znajduje się w bliskim sąsiedztwie miozyny medialnej (Ryc. 4B, powiększenia), która jest subpopulacją miozyny28 podobnie wyraźną jedynie w warunkach obrazowania na żywo, lecz niemal niewykrywalną za pomocą immunofluorescencji. Ponadto medialna populacja p-Tyr wykazuje podobne wzorce pulsacyjnego łączenia się i rozpraszania (Ryc. 4C), jakie wykazano wcześniej dla miozyny medialnej28. Tożsamość i funkcja medialnej subpopulacji p-Tyr pozostają nieznane. Wspólnie wyniki te demonstrują, że metoda wstrzykiwania przeciwciał może w znacznym stopniu uzupełnić tradycyjne podejścia w celu charakterystyki zachowania białek o niskiej obfitości oraz ujawnić nowe wzorce lokalizacji, które mogły zostać zaburzone podczas procesu immunofluorescencji.
<img alt="Proces przygotowania zarodka Drosophila; wstrzykiwanie przeciwciał, inkubacja, zdechorionizacja; schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66080/66080fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat wstrzykiwania przeciwciał. Schematyczny przebieg procesu ilustrujący kroki zaangażowane w metodę wstrzykiwania przeciwciał. Cały proces, od zbierania zarodków do wstrzyknięcia przeciwciał, trwa zazwyczaj około 4-5 h. Po wstrzyknięciu przeciwciał zarodki można inkubować w komorze wilgotności do pożądanego stadium rozwoju przed obrazowaniem na żywo. AEL, po zniesieniu jaj; RT, temperatura pokojowa; Ab, przeciwciało. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66080/66080fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat zestawu mikroskopowego, szkiełek i szkiełek nakrywkowych; wpływ wysuszenia i iniekcji na próbki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66080/66080fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ustawianie i iniekcja zarodków. (A) Przegląd elementów wymaganych przed iniekcją, w tym szkiełka nakrywkowego, szkiełka przedmiotowego, pudła do wysuszania, pędzla, pęsety, sita do komórek, komory wilgotności oraz żelu agarozowego. (B) Ustawione zarodki przytwierdzone za pomocą kleju heptanowego w centrum szkiełka nakrywkowego i umieszczone na kulecikach do wysuszania. (C) Ustawienie osi przednio-tylnej zarodków równolegle do krawędzi żelu agarozowego. (D) Przegląd zestawu do iniekcji. (E) Porównanie morfologii zarodków przed i po procesie wysuszania, z uwzględnieniem zmarszczenia błony witelinowej po wysuszeniu. (F) Wielkość pęcherzyka iniekcyjnego po pojedynczym naciśnięciu pikopompy. (G) Porównanie morfologii zarodków przed i po iniekcji przeciwciał, podkreślające zanik zmarszczek błony po iniekcji. (E-G) Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu o powiększeniu 10x w mikroskopii w jasnym polu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66080/66080fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Ekspresja Notch-GFP; immunofluorescencja, detekcja GFP, oś czasu obrazowania żywych komórek Alexa-GFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66080/66080fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obrazowanie na żywo receptora Notch we wczesnych embrionach. (A) Lokalizacja endogennego receptora Notch znakowanego GFP za pomocą immunofluorescencji (lewo), bezpośredniego obrazowania na żywo w oparciu o autofluorescencję GFP (środek) oraz po wstrzyknięciu nanoprzeciwciała do GFP sprzężonego z AlexaFluor 594 (prawo). (B) Dynamiczna lokalizacja Notch-GFP obrazowana w odstępach 45 s po wstrzyknięciu przeciwciał. Wszystkie obrazy zostały pozyskane z przodem embrionów skierowanym w lewo i stroną brzuszną skierowaną w dół. Paski skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66080/66080fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja Alexa594 p-Tyr i miozyny w komórkach; schemat obrazowania przeciwciał w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66080/66080fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazowanie na żywo wzorców fosfotyrozyny w embrionach. (A) Lokalizacja fosforylowanej tyrozyny (p-Tyr) w utrwalonych embrionach za pomocą immunofluorescencji. (B) Lokalizacja p-Tyr (magenta) w żywych embrionach ekspresujących łańcuch lekki miozyny z etykietą GFP (zielony). Biała przerywana ramka wskazuje powiększenie medialnej populacji fosfotyrozyny i miozyny pod błoną apikalną. Paski skali = 10 µm. (C) Lokalizacja p-Tyr i GFP-miozyny obrazowana co 45 s w żywych embrionach. Białe strzałki wskazują medialną populację p-Tyr i miozyny. Wszystkie obrazy zostały wykonane z częścią przednią embrionów po lewej stronie i stroną brzuszna skierowaną w dół. Paski skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66080/66080fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Naszym celem jest zrozumienie, w jaki sposób sygnały mechaniczne i biochemiczne koordynują morfogenezę zwierząt, w tym wykrywanie i reagowanie na siły komórek i cząsteczek. Odkryto, że więcej cząsteczek jest mechanowrażliwych, funkcjonuje inaczej pod różnymi poziomami napięcia. Jednak kontekst fizjologiczny i funkcja tych wrażliwych na siłę zdarzeń pozostają w dużej mierze nieznane.Ze względu na dynamiczną naturę zdarzeń wrażliwych na siłę, nasza dziedzina w dużej mierze opiera się na szybkim obrazie fluorescencyjnym i nagrywaniu poklatkowym w celu uchwycenia zachowań molekuł i komórek. Wiele fluorescencyjnie znakowanych białek nie jest wystarczająco jasnych, aby można je było zobrazować, i wymaga to specjalnej rozdzielczości czasowej bez znacznego blanszenia. Z drugiej strony, tradycyjne metody immunofluorescencji mogą uchwycić naturalne lub cząsteczkowe i komórkowe cechy dopiero po utrwaleniu.Ta metoda, ścieżka do dynamicznego śledzenia lokalizacji wielu receptorów białkowych bez obfitości głównych szlaków sygnałowych, takich jak szlaki Notch, WNT i BMP. Ostatecznie, oprócz tradycyjnych liniowych kaskad sygnalizacyjnych, możemy wskazać, kiedy i gdzie występują zdarzenia sygnalizacyjne w skalach subkomórkowych. Na początek dodaj 110 mikrolitrów mieszanki przeciwciał do probówki zawierającej barwnik Alexa Fluor 594.Odwróć probówkę kilka razy, aby dokładnie wymieszać składniki. Inkubować probówkę na rotatorze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zmontuj kolumnę oczyszczającą z zestawu do koniugacji i przygotuj 1,5 mililitra złoża żywicy.Odwiruj kolumnę o sile 1100G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar płynu z żywicy. Dodaj mieszaninę reakcyjną kroplami do górnej części kolumny z żywicą. Wirować w temperaturze 1100G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać etykietę przeciwciała.Na początek umieść 200 nowo wyklutych dorosłych drosophili w plastikowej klatce w kształcie cylindra. Uszczelnij jedną stronę klatki porowatą metalową siatką do wentylacji, a drugą sokiem owocowym na płycie agarowej z pastą drożdżową. W dniu wstrzyknięcia należy wymienić płytkę agarową w klatce na płytkę z sokiem owocowym zawierającą minimalną ilość pasty drożdżowej.Inkubuj płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę, aby zebrać zarodki. Następnie wyjmij płytkę z klatki, aby zatrzymać składanie jaj i wysiaduj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dodatkowe dwie godziny, aby uzyskać zarodki w wieku od dwóch do trzech godzin. Aby usunąć skorupkę jajka z zarodków, wprowadź dwa mililitry 50% roztworu wybielacza na talerz z sokiem owocowym.Za pomocą pędzla delikatnie usuń zarodki z płytki i inkubuj szalkę przez dwie minuty, obracając ją co 30 sekund, aby zwiększyć skuteczność usuwania skorupek jaj. Następnie wlej mieszaninę zarodków i wybielacza do nylonowego sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów. Kompleksowo spłucz zarodki butelką z wodą, aby usunąć wszelkie resztki wybielacza i pasty drożdżowej.Za pomocą czystej żyletki wytnij prostokątny blok agarozy i umieść go na szklanym szkiełku. Za pomocą pędzla przenieś zarodki z sitka do bloku żelowego i rozprowadź je równomiernie wzdłuż linii środkowej bloku, delikatnie szczotkując. Teraz przygotuj pęsetę, której dwie nogi są bezpiecznie sklejone ze sobą, tworząc jeden ostry punkt.Pod mikroskopem preparacyjnym wybierz pojedyncze zarodki za pomocą pęsety i wyrównaj je wzdłuż przedłużonej krawędzi bloków żelu. Odpipetować 10 mikrolitrów kleju heptanowego w połowie szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 na 50 milimetrów. Użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić klej na prostokątnym obszarze o wymiarach 0,5 na trzy centymetry.Za pomocą pęsety z płaską końcówką podnieś pokrytą klejem szkiełko nakrywkowe i trzymaj je stabilnie nad zarodkami, upewniając się, że strona z klejem jest skierowana w stronę zarodków pod kątem około 45 stopni. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do bloku żelu, pozwalając zarodkom dotknąć kleju. Szybko zwolnij nacisk i podnieś szkiełko nakrywkowe.Następnie nalej 10 mikrolitrów wody na środek świeżego szklanego szkiełka. Umieść na nim szkiełko nakrywkowe z zarodkiem, upewniając się, że strona z zarodkiem jest skierowana do góry. Następnie nałóż 40 mikrolitrów oleju halowęglowego na jeden koniec paska zarodka.Ustaw szkiełko pod kątem, aż olej halowęglowy pokryje powierzchnię zarodka. Na początek napełnij każdą igłę pięcioma mikrolitrami roztworu GFP Nanobody znakowanego fluorem Alexa. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 25 na 25 milimetrów na szklanej powierzchni szkiełka.Odpipetuj 40 mikrolitrów oleju halowęglowego na szkiełko podstawowe i rozprowadź je wzdłuż obwodu szkiełka nakrywkowego. Pod mikroskopem iniekcyjnym przyłożyć końcówkę igły do krawędzi szkiełka nakrywkowego zanurzonego w oleju. Wyreguluj odpowiednio ciśnienie powietrza wtryskowego PicoPump.Zastąp puste szkiełko szkiełkiem przygotowanym szkiełkiem zarodkowym Drosophila. Ustawić końcówkę igły do wstrzykiwań prostopadle do przedniej tylnej osi zarodka. Użyj manipulatora etapu XY, aby poprowadzić zarodki w kierunku igły, aż końcówka dotrze do środka żółtka, i pompuj dwa do trzech razy, aby wprowadzić przeciwciała do żółtka.Za pomocą manipulatora stopnia XY należy odciągnąć zarodki od igły po wstrzyknięciu i przejść do następnego zarodka. Pozwól zarodkom inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż osiągną pożądany etap rozwoju. Po inkubacji zidentyfikuj zarodki pod soczewką o małej mocy z oświetleniem w jasnym polu i zmień na soczewkę 40x lub 63x, aby uzyskać fluorescencyjne obrazowanie na żywo o wysokiej rozdzielczości.Po wstrzyknięciu stosunek sygnału do szumu receptora Notch poprawia się znacznie porównywalnie do jakości sygnału immunofluorescencji. Co więcej, wstrzyknięcie przeciwciała pozwoliło na czasową charakterystykę lokalizacji Notch w 45-sekundowych odstępach czasu bez widocznej utraty intensywności sygnału w ciągu pięciominutowego okna obrazowania. Obrazowanie na żywo embrionalnej fosfotyrozyny wykazało, że fosforylacja tyrozyny jest wysoce wzbogacona w połączeniach trójkomórkowych.Dodatkowo zaobserwowano nową drugą populację sygnału fosfotyrozyny pod środkiem błony wierzchołkowej. Obrazowanie dwukolorowe ujawniło, że ta populacja sygnału fosfotyrozyny jest bliska miozyny przyśrodkowej. Ponadto środkowa populacja fosfotyrozyny wykazywała podobne wzorce pulsacyjnej koalescencji i dysprosacji, jak wykazano w przypadku miozyny przyśrodkowej.

visualizing-low-abundance-proteins-post-translational-modifications

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy usprawniony protokół przygotowywania preparatów typu „fillet” (filetowanie) zarodków Drosophila o określonych genotypach. Protokół ten umożliwia efektywne przeprowadzanie różnorodnych przesiewów genetycznych. Pozwala on również na doskonałą wizualizację struktur w późnym stadium rozwoju zarodka.

Żywa dyssekcja zarodków Drosophila: Usprawnione metody przesiewania kolekcji mutantów za pomocą barwienia przeciwciałami

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Informujemy tutaj o solidnej i efektywnej ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów Branchiostoma lanceolatum. Opracowanie techniki mikroiniekcji w tym podstawowym strunacie utoruje drogę dla dalekosiężnych innowacji technicznych w tym powstającym systemie modelowym, w tym obrazowania in vivo i manipulacji specyficznych dla genów.

Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Tutaj opisujemy protokół wykrywania i lokalizacji białka zarodka Drosophila i RNA od pobrania do wstępnego osadzenia i osadzenia, barwienia immunologicznego i hybrydyzacji mRNA in situ.

Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Protokoły te określają, jak scharakteryzować organizację i funkcję zakrywającą złączeń przegrody plisowanej u nabłonka embrionalnego kontrolnego oraz mutacyjnego nabłonka embrionalnego Drosophila.

Eksperymenty immunobarwienia i penetracji barwnika w celu określenia białek styku przegrody w nabłonku embrionalnym Drosophila

Poznaj metodę wstrzyknięcia przeciwciał fluorescencyjnych do zarodków Drosophila w celu wizualizacji białek o niskiej liczebności. Technika ta umożliwia obserwację dynamicznych procesów komórkowych w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów