Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Naszym celem jest zrozumienie, w jaki sposób sygnały mechaniczne i biochemiczne koordynują morfogenezę zwierząt, w tym wykrywanie i reagowanie na siły komórek i cząsteczek. Odkryto, że więcej cząsteczek jest mechanowrażliwych, funkcjonuje inaczej pod różnymi poziomami napięcia. Jednak kontekst fizjologiczny i funkcja tych wrażliwych na siłę zdarzeń pozostają w dużej mierze nieznane.

Ze względu na dynamiczną naturę zdarzeń wrażliwych na siłę, nasza dziedzina w dużej mierze opiera się na szybkim obrazie fluorescencyjnym i nagrywaniu poklatkowym w celu uchwycenia zachowań molekuł i komórek. Wiele fluorescencyjnie znakowanych białek nie jest wystarczająco jasnych, aby można je było zobrazować, i wymaga to specjalnej rozdzielczości czasowej bez znacznego blanszenia. Z drugiej strony, tradycyjne metody immunofluorescencji mogą uchwycić naturalne lub cząsteczkowe i komórkowe cechy dopiero po utrwaleniu.

Ta metoda, ścieżka do dynamicznego śledzenia lokalizacji wielu receptorów białkowych bez obfitości głównych szlaków sygnałowych, takich jak szlaki Notch, WNT i BMP. Ostatecznie, oprócz tradycyjnych liniowych kaskad sygnalizacyjnych, możemy wskazać, kiedy i gdzie występują zdarzenia sygnalizacyjne w skalach subkomórkowych. Na początek dodaj 110 mikrolitrów mieszanki przeciwciał do probówki zawierającej barwnik Alexa Fluor 594.

Odwróć probówkę kilka razy, aby dokładnie wymieszać składniki. Inkubować probówkę na rotatorze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zmontuj kolumnę oczyszczającą z zestawu do koniugacji i przygotuj 1,5 mililitra złoża żywicy.

Odwiruj kolumnę o sile 1100G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar płynu z żywicy. Dodaj mieszaninę reakcyjną kroplami do górnej części kolumny z żywicą. Wirować w temperaturze 1100G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać etykietę przeciwciała.

Na początek umieść 200 nowo wyklutych dorosłych drosophili w plastikowej klatce w kształcie cylindra. Uszczelnij jedną stronę klatki porowatą metalową siatką do wentylacji, a drugą sokiem owocowym na płycie agarowej z pastą drożdżową. W dniu wstrzyknięcia należy wymienić płytkę agarową w klatce na płytkę z sokiem owocowym zawierającą minimalną ilość pasty drożdżowej.

Inkubuj płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę, aby zebrać zarodki. Następnie wyjmij płytkę z klatki, aby zatrzymać składanie jaj i wysiaduj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dodatkowe dwie godziny, aby uzyskać zarodki w wieku od dwóch do trzech godzin. Aby usunąć skorupkę jajka z zarodków, wprowadź dwa mililitry 50% roztworu wybielacza na talerz z sokiem owocowym.

Za pomocą pędzla delikatnie usuń zarodki z płytki i inkubuj szalkę przez dwie minuty, obracając ją co 30 sekund, aby zwiększyć skuteczność usuwania skorupek jaj. Następnie wlej mieszaninę zarodków i wybielacza do nylonowego sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów. Kompleksowo spłucz zarodki butelką z wodą, aby usunąć wszelkie resztki wybielacza i pasty drożdżowej.

Za pomocą czystej żyletki wytnij prostokątny blok agarozy i umieść go na szklanym szkiełku. Za pomocą pędzla przenieś zarodki z sitka do bloku żelowego i rozprowadź je równomiernie wzdłuż linii środkowej bloku, delikatnie szczotkując. Teraz przygotuj pęsetę, której dwie nogi są bezpiecznie sklejone ze sobą, tworząc jeden ostry punkt.

Pod mikroskopem preparacyjnym wybierz pojedyncze zarodki za pomocą pęsety i wyrównaj je wzdłuż przedłużonej krawędzi bloków żelu. Odpipetować 10 mikrolitrów kleju heptanowego w połowie szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 na 50 milimetrów. Użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić klej na prostokątnym obszarze o wymiarach 0,5 na trzy centymetry.

Za pomocą pęsety z płaską końcówką podnieś pokrytą klejem szkiełko nakrywkowe i trzymaj je stabilnie nad zarodkami, upewniając się, że strona z klejem jest skierowana w stronę zarodków pod kątem około 45 stopni. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do bloku żelu, pozwalając zarodkom dotknąć kleju. Szybko zwolnij nacisk i podnieś szkiełko nakrywkowe.

Następnie nalej 10 mikrolitrów wody na środek świeżego szklanego szkiełka. Umieść na nim szkiełko nakrywkowe z zarodkiem, upewniając się, że strona z zarodkiem jest skierowana do góry. Następnie nałóż 40 mikrolitrów oleju halowęglowego na jeden koniec paska zarodka.

Ustaw szkiełko pod kątem, aż olej halowęglowy pokryje powierzchnię zarodka. Na początek napełnij każdą igłę pięcioma mikrolitrami roztworu GFP Nanobody znakowanego fluorem Alexa. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 25 na 25 milimetrów na szklanej powierzchni szkiełka.

Odpipetuj 40 mikrolitrów oleju halowęglowego na szkiełko podstawowe i rozprowadź je wzdłuż obwodu szkiełka nakrywkowego. Pod mikroskopem iniekcyjnym przyłożyć końcówkę igły do krawędzi szkiełka nakrywkowego zanurzonego w oleju. Wyreguluj odpowiednio ciśnienie powietrza wtryskowego PicoPump.

Zastąp puste szkiełko szkiełkiem przygotowanym szkiełkiem zarodkowym Drosophila. Ustawić końcówkę igły do wstrzykiwań prostopadle do przedniej tylnej osi zarodka. Użyj manipulatora etapu XY, aby poprowadzić zarodki w kierunku igły, aż końcówka dotrze do środka żółtka, i pompuj dwa do trzech razy, aby wprowadzić przeciwciała do żółtka.

Za pomocą manipulatora stopnia XY należy odciągnąć zarodki od igły po wstrzyknięciu i przejść do następnego zarodka. Pozwól zarodkom inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż osiągną pożądany etap rozwoju. Po inkubacji zidentyfikuj zarodki pod soczewką o małej mocy z oświetleniem w jasnym polu i zmień na soczewkę 40x lub 63x, aby uzyskać fluorescencyjne obrazowanie na żywo o wysokiej rozdzielczości.

Po wstrzyknięciu stosunek sygnału do szumu receptora Notch poprawia się znacznie porównywalnie do jakości sygnału immunofluorescencji. Co więcej, wstrzyknięcie przeciwciała pozwoliło na czasową charakterystykę lokalizacji Notch w 45-sekundowych odstępach czasu bez widocznej utraty intensywności sygnału w ciągu pięciominutowego okna obrazowania. Obrazowanie na żywo embrionalnej fosfotyrozyny wykazało, że fosforylacja tyrozyny jest wysoce wzbogacona w połączeniach trójkomórkowych.

Dodatkowo zaobserwowano nową drugą populację sygnału fosfotyrozyny pod środkiem błony wierzchołkowej. Obrazowanie dwukolorowe ujawniło, że ta populacja sygnału fosfotyrozyny jest bliska miozyny przyśrodkowej. Ponadto środkowa populacja fosfotyrozyny wykazywała podobne wzorce pulsacyjnej koalescencji i dysprosacji, jak wykazano w przypadku miozyny przyśrodkowej.