Przekształcanie statycznych modeli tkanek barierowych w dynamiczne systemy mikrofizjologiczne

Opracowujemy modułowe systemy mikrofizjologiczne, które naśladują ludzkie tkanki barierowe. Nasz system jest wyjątkowy, ponieważ można go przekonfigurować ze statycznej hodowli z otwartą studnią na system o zwiększonym przepływie. Ta elastyczność pozwala na wykorzystanie platformy zarówno w laboratoriach zajmujących się naukami biologicznymi, jak i inżynierią.

Przedstawiamy protokół tworzenia rekonfigurowalnej platformy z otwartą studnią z obrazowaniem kultury i stylu życia wspomaganym przepływem. Jest kompatybilny z konwencjonalnymi protokołami nauk biologicznych. Nasza rekonfigurowalna konstrukcja pozwala użytkownikom przełączać się między trybem otwartej studni a trybem mikroprzepływowym podczas eksperymentu i pozwala użytkownikowi przeprowadzić każdy krok w formacie, z którym czuje się komfortowo.

Zacznij od wytworzenia szablonu do tworzenia wzorów dla modułu głównego. Aby to zrobić, wytnij laserowo arkusz akrylowy zgodnie z pożądanym projektem, aby utworzyć szereg wnęk, jak pokazano na ekranie. Następnie usuń warstwę ochronną z kleju samoprzylepnego lub folii PSA przymocowanej do arkusza.

Przymocuj arkusz akrylowy do formy. Następnie, utrzymując stosunek 10 is do 1 zasady do utwardzacza, dokładnie wymieszaj prepolimer polidimetylosiloksanu lub PDMS. Odgazować mieszaninę w komorze próżniowej, aż do usunięcia widocznych pęcherzyków.

Powoli wlej odgazowanie PDMS do wnęk formy, wyrównując ją płaską krawędzią. Utwardź PDMS w formie na gorącej płycie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez godzinę. Pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.

Następnie za pomocą pęsety z płaską końcówką wyjmij szablony z jam formy. Aby wytworzyć moduł przepływowy, wytnij laserowo arkusz akrylowy, aby utworzyć szereg wnęk w kształcie koniczyny, jak pokazano na ekranie. Usuń warstwę ochronną z folii PSA przymocowanej do arkusza wycinanego laserowo i przymocuj arkusz do formy silikonowej, wyrównując trójkątne znaki wyrównania.

Powoli wlej odgazowanie PDMS do wnęk formy i wyrównaj je płaską krawędzią. Umieść formę na gorącym talerzu i piecz PDMS w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez godzinę. Pozwól formie ostygnąć do temperatury pokojowej.

Za pomocą pęsety z płaską końcówką ostrożnie wyjmij moduły przepływowe z wnęk formy. Ustaw moduł przepływu tak, aby elementy mikrokanału były skierowane do góry. Za pomocą stempla do biopsji utwórz porty wlotowe i wylotowe rdzenia na końcu kanału.

Aby wykonać dolną i górną obudowę akrylową, wytnij laserowo dwumilimetrowy arkusz akrylowy, aby utworzyć górną obudowę z otworami do włożenia magnesu. Podobnie, wytnij laserowo arkusz akrylowy, aby wygenerować dolną obudowę z magnetycznymi otworami wprowadzającymi. Po usunięciu warstwy ochronnej PSA z arkuszy, przymocuj dolną obudowę do szklanego szkiełka nakrywkowego.

Wciśnięty tak, aby pasował do niklowanych magnesów neodymowych o średnicy 4,75 milimetra w laserowo wyciętych otworach obudów. Moduł z rdzeniem otwartej studni umieszczony w specyficznej wnęce utworzonej przez dolną obudowę i szkiełko nakrywkowe. Następnie moduł przepływowy, w tym mikrokanał i porty dostępowe, został zamontowany w studni modułu głównego.

Moduł przepływowy został bezpiecznie uszczelniony względem silikonowej warstwy nośnej membrany za pomocą magnesów osadzonych w dolnej i górnej obudowie. Wyjmowany szablon został zaprojektowany tak, aby pasował do otwartej studzienki modułu głównego i zapewniał specjalne okno dla komórek, aby mogły osiąść preferencyjnie na powierzchni membrany. Na początek pokryj membranę zmontowanej rekonfigurowalnej platformy do hodowli komórkowej pięcioma mikrogramami fibronektyny na centymetr kwadratowy przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby poprawić przyczepienie komórek.

Następnie za pomocą pipety P200 odessać roztwór powlekający. Umieść szablon wzoru w dołku modułu głównego. Dodaj nośnik komórkowy do studzienki i dolnego kanału urządzenia.

Wysiej ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej do studni. Umieść urządzenie na szalce Petriego. Dodaj 15-mililitrową stożkową nasadkę rurki zawierającą dejonizowaną wodę do szalki Petriego, aby utrzymać lokalną wilgotność.

Przenieś zestaw szalki Petriego do inkubatora. Aby wyhodować komórki pod przepływem, przystąp do rekonfiguracji platformy z trybu otwartej studni na tryb mikroprzepływowy. Aby to zrobić, napełnij zbiorniki i rurki pożywką do wzrostu komórek śródbłonka.

Umieść dolną obudowę na stoliku na próbkę. Włóż moduł z rdzeniem otwartej studzienki do dolnej obudowy. Następnie usuń szablon, zaessaj pożywkę komórkową z dołka modułu i umieść moduł przepływowy w studzience.

Następnie umieść górną obudowę, aby uszczelnić moduł przepływowy w dobrze osadzonym module rdzeniowym. Podłącz końcówki dozujące wlotowe i wylotowe do portów modułu przepływu. Uruchom pompę perystaltyczną, aby wprowadzić przepływ płynu do układu.

Zatrzymaj pompę, gdy zostanie osiągnięty żądany czas ekspozycji na przepływ o dużej natężeniu. Wyjmij końcówki dozujące wlotowe i wylotowe. Następnie zdejmij górną obudowę.

Delikatnie wyjmij moduł przepływu ze studni za pomocą pęsety. Na koniec dodaj 100 mikrolitrów pożywki komórkowej do dołka przed przeprowadzeniem pożądanego testu. Komórki hodowane pod przepływem ustawiały się wzdłuż kierunku przepływu, podczas gdy komórki hodowane bez przepływu pozostawały zorientowane losowo.

Narażenie komórek na czysty stres spowodowało regulację w górę czynnika podobnego do Kuppela 2 i śródbłonkowej syntazy tlenku azotu, które pełnią kluczowe role i zapewniają zdrowe naczynia krwionośne.