Name: Monitorowanie mechanicznej ewolucji tkanki podczas zamykania cewy nerwowej zarodka pisklęcia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Poznaj mikroskopię Brillouina do monitorowania mechanicznych właściwości tkanki płytek nerwowych podczas neurulacji zarodka pisklęcia. Ta nieinwazyjna metoda pozwala na obrazowanie mechaniki tkanek żywych zarodków hodowanych ex ovo w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663).

Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Stanowego Wayne.
1. Przygotowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Użyj 70% roztworu etanolu do czyszczenia i sterylizacji nożyczek i pęsety. Przygotuj również jednorazowe pipety i strzykawkę.</li>
	<li>Przygotuj podłoże myjące, dodając 3,595 g NaCl do 495 ml wody dejonizowanej. Następnie dodać 5 ml penicyliny-streptomycyny (5 j./ml) do pożywki. Napełnić szalkę Petriego o średnicy 100 mm medium myjącym i ogrzać ją do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj potrawy z kulturą zgodnie z Rysunek 1, który ilustruje ogólną konfigurację.
	<ol>
		<li>Przygotuj kawałek bibuły filtracyjnej, pokrój go na prostokątny kształt około 17 mm × 20 mm i usuń cztery rogi. Utwórz pusty środek w bibule filtracyjnej o wielkości około 7 mm × 10 mm do zabezpieczenia zarodka (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, po lewej). 
		UWAGA: Pobieranie zarodków opisano w kroku 2.</li>
		<li>Przymocuj dostępny w handlu pierścień (Φ = 1 cal, patrz Tabela materiałów) z elastyczną warstwą folii (tj. Folii parafinowej), upewniając się, że elastyczna folia ma również pusty środek. Ten pierścień z folią będzie służył do przytrzymywania bibuły filtracyjnej z zarodkiem.</li>
		<li>Na koniec umieść przygotowany pierścień na szalce Petriego o średnicy 35 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, po prawej). 
		UWAGA: Bibuła filtracyjna służy do zabezpieczania i przytrzymywania wyekstrahowanego zarodka poprzez umieszczenie bibuły filtracyjnej na membranie i pozostawienie zarodka w środkowym pustym obszarze (co zostanie szczegółowo opisane w kroku 2). Cztery rogi zostały przycięte tak, aby pasowały do rozmiaru pierścienia zewnętrznego (nie jest to konieczne, jeśli jest już zamontowany). Naczynie hodowlane ze szklanym dnem o średnicy 35 mm służy do lepszej propagacji wiązki laserowej. Naczynie posiada wewnętrzną studzienkę (Φ = 23 mm), którą można wypełnić białkiem do hodowli ex ovo. Średnica pierścienia musi być większa niż średnica studni wewnętrznej, aby studnia mogła być pokryta elastyczną folią na pierścieniu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1, wstawka). Rozmiar bibuły filtracyjnej nie jest ograniczony i można go modyfikować w zależności od rozmiaru wybranego pierścienia i naczynia hodowlanego. Alternatywnie dno naczynia może być wstępnie pokryte warstwą agarozy (grubość: ~1 mm). Usuwając agarozę ze środka warstwy za pomocą ostrza, można stworzyć studzienkę o kształcie podobnym do pustego środka elastycznej folii do ładowania białka. Jednym z krytycznych punktów jest to, że cztery boki pustej bibuły filtracyjnej muszą mieć wystarczającą szerokość (> 5 mm), aby zapewnić przymocowanie zarodka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja i hodowla ex ovo zarodka kurczaka
UWAGA: Ten krok jest modyfikowany na podstawie poprzednio opublikowanych raportów40,41.
<ol>
	<li>Po wstępnej hodowli wyjmij jajo z inkubatora i umieść je na długiej osi na tacy kartonowej na jajka. Oczyść skorupkę jajka 70% etanolem, upewniając się, że pokryła całą powierzchnię, a następnie pozwól jej odpocząć przez 15 minut.</li>
	<li>Trzymaj jajko na jego krótkiej osi i rozbij je na dole. Otwórz jajko na czystej szalce Petriego o średnicy 100 mm, aby wydobyć z niej zawartość, jak pokazano na rysunku Rysunek 2. Upewnij się, że nie obracasz jajka podczas trzymania i rozbijania.</li>
	<li>Za pomocą pipety przenieś i zbierz około 10 ml cienkiego białka (tj. płynnego białka42) do probówki o pojemności 15 ml do hodowli ex ovo. Napełnij środkową studzienkę naczynia hodowlanego zebranym cienkim białkiem (około 0,9 ml), jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 3. Proces napełniania powinien być powolny, unikając tworzenia się pęcherzyków wewnątrz studni. Upewnij się, że naczynie hodowlane z białkiem jest ogrzane do temperatury 37 °C. 
	UWAGA: To danie będzie używane do hodowli zarodka ex ovo. Nowe naczynia hodowlane wypełnione pożywką do płukania zostaną użyte podczas obrazowania Brillouin (patrz krok 3).</li>
	<li>Za pomocą bibuły delikatnie usuń grube białko (tj. lepkie białko) przyczepione do zarodka, ostrożnie oddzielając białko od błony witeliny, jak pokazano na Rysunek 4. Unikać bezpośredniego kontaktu z membraną witelinową.</li>
	<li>Po usunięciu całego gęstego białka ostrożnie przymocuj bibułę filtracyjną do membrany witelinowej. Upewnij się, że oś ciała zarodka jest wyrównana z długą osią środkowego prostokąta na bibule filtracyjnej. Użyj nożyczek, aby przeciąć membranę otaczającą bibułę filtracyjną.</li>
	<li>Za pomocą pęsety delikatnie odciągnij izolowaną bibułę filtracyjną od żółtka w kierunku ukośnym. Odwróć bibułę filtracyjną do góry nogami, aby ustawić zarodek grzbietową stroną do dołu (w przypadku konfiguracji mikroskopu odwróconego). Ostrożnie zanurzyć całą bibułę filtracyjną z jednej strony długiej osi w szalce Petriego o średnicy 100 mm z medium myjącym w sposób ukośniowy.</li>
	<li>Zmyj pozostałe żółtko, delikatnie rozpylając medium myjące równolegle do bibuły filtracyjnej za pomocą czystej pipety. Unikaj bezpośredniego rozpylania środka myjącego na membranę.</li>
	<li>Po oczyszczeniu całego żółtka ostrożnie wyjmij bibułę filtracyjną z podłoża myjącego i użyj bibuły, aby wchłonąć nadmiar pożywki z krawędzi. Następnie umieść bibułę filtracyjną z zarodkiem na szalce hodowlanej, upewniając się, że grzbietowa strona zarodka jest skierowana w dół, jak pokazano na rysunku Rysunek 5. Aby utrzymać wilgotność, umieść w naczyniu zwilżoną bibułę.</li>
	<li>Przenieś naczynie hodowlane do inkubatora na etapie hodowli w celu hodowli ex ovo.</li>
</ol>
3. Pomiar Brillouina zarodka
<ol>
	<li>Przygotuj kolejny zestaw naczyń hodowlanych i napełnij je roztworem do mycia. Upewnij się, że środek myjący jest podgrzany do 37 °C.</li>
	<li>Gdy zarodek osiągnie pożądany etap rozwoju, przenieś bibułę filtracyjną wraz z zarodkiem do naczynia hodowlanego wypełnionego pożywką do mycia. Umieścić szalkę hodowlaną w inkubatorze pod mikroskopem Brillouin (patrz Tabela Materiałów).
	<ol>
		<li>Przed przeprowadzeniem pomiaru Brillouina zapisz obraz całego zarodka w jasnym polu w celach informacyjnych. Szczegółowa konfiguracja mikroskopu Brillouin została wcześniej opisana30 i jest podsumowana w sekcji Wyniki (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz sygnał Brillouina wody i metanolu, który zostanie użyty w kroku 4 w procesie kalibracji.</li>
	<li>Dostosuj moc lasera padającego i czas ekspozycji kamery urządzenia zwielokrotniającego elektrony ze sprzężeniem ładunkowym (EMCCD, patrz Tabela materiałów), aby osiągnąć co najmniej 10 000 zliczeń sygnału Brillouina. Korzystając z obrazu w jasnym polu jako przewodnika, ustaw zakres skanowania i rozmiar kroku. Uzyskaj obraz Brillouina obszaru zainteresowania, skanując zarodek za pomocą etapu translacyjnego 2D. 
	UWAGA: Zakres skanowania poziomego można określić na podstawie obrazu w jasnym polu, a zakres skanowania w pionie (tj. głębokość) można określić na podstawie siły sygnału uzyskanej z szybkiego i zgrubnego skanowania. Aby zapobiec fotouszkodzeniom zarodka, ogranicz moc padania do 25 mW i ustaw czas naświetlania kamery EMCCD na 50 ms. Wybierz rozmiar kroku 2 μm w kierunku poziomym i 1 μm w kierunku pionowym, aby zrównoważyć jakość obrazowania i czas akwizycji.</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania ostrożnie usuń bibułę filtracyjną z zarodkiem i użyj bibuły, aby wchłonąć nadmiar pożywki myjącej. Następnie umieść bibułę filtracyjną z powrotem w naczyniu hodowlanym wypełnionym cienkim białkiem w celu ciągłego wyhodowania w inkubatorze na etapie.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.2-3.5 w regularnych odstępach czasu (np. 1,5 godziny), aby uchwycić poklatkowe obrazy Brillouina w miarę rozwoju zarodka.</li>
	<li>Zrekonstruuj obraz 2D Brillouin, wykonując krok 4.</li>
</ol>
4. Rekonstrukcja obrazu Brillouina
<ol>
	<li>Skalibruj spektrometr Brillouina przy użyciu sygnałów Brillouina wody i metanolu, aby obliczyć swobodny zakres widmowy (FSR) i współczynnik konwersji pikseli na częstotliwość (PR) spektrometru30. Skalibrowane wartości FSR i PR zostaną wykorzystane do obliczenia przesunięcia Brillouina zarodka w każdym pikselu. 
	UWAGA: Rysunek 7A przedstawia surowe widmo Brillouina uchwycone przez kamerę EMCCD. Sumując widmo w pionie, a następnie wykonując dopasowanie Lorentza, można uzyskać odległość piku Δd dwóch kropek (<silna klasa="xfig">Rysunek 7B). Uzyskując odległość szczytową wody Δdwody i metanolu Δdmetanolu, FSR i PR można obliczyć na podstawie równań30: PR = 2·(ωmetanol-ω woda)/(Δdwoda- Δdmetanol), a FSR = 2·ωwoda + PR·Δdwoda, ze znanym przesunięciem Brillouina wody ωwoda = 6,01 GHz i metanol ωmetanol = 4,49 GHz przy 660 nm.</li>
	<li>Uzyskać odległość szczytową sygnału Brillouina dla każdego piksela próbki. Oblicz przesunięcie Brillouina na podstawie skalibrowanych FSR i PR: ωpróbka = 0,5 (FSR - PR x Δdpróbka)30, gdzieω próbka jest przesunięciem Brillouina próbki, apróbka Δd jest odległością szczytową sygnału Brillouina.</li>
	<li>Zrekonstruuj obraz 2D Brillouina na podstawie przesunięć Brillouina wszystkich pikseli. 
	UWAGA: Aby przeprowadzić analizę lokalną, można wybrać obszar zainteresowania (np. płytkę neuronową) z uzyskanego obrazu Brillouina i określić ilościowo jego właściwości mechaniczne. Powszechnym podejściem jest obliczenie średniego przesunięcia Brillouina dla wybranego regionu.</li>
</ol>

Longitudinal Monitoring of Neural Plate Mechanics in Chick Embryo Development

<ol><li>Greene, N. D. E., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural tube defects.</a> Annual Review of Neuroscience. 37 (1), 221-242 (2014).</li>
<li>Suzuki, M., Morita, H., Ueno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+cell+shape+changes+that+contribute+to+vertebrate+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of cell shape changes that contribute to vertebrate neural tube closure.</a> Development, Growth & Differentiation. 54 (3), 266-276 (2012).</li>
<li>Nikolopoulou, E., Galea, G. L., Rolo, A., Greene, N. D. E., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tube+closure%3A+Cellular%2C+molecular+and+biomechanical+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural tube closure: Cellular, molecular and biomechanical mechanisms.</a> Development. 144 (4), 552-566 (2017).</li>
<li>Juriloff, D. M., Harris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+neural+tube+closure+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse models for neural tube closure defects.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 993-1000 (2000).</li>
<li>Copp, A. J., Greene, N. D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+development+of+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%3A+A+Journal+of+the+Pathological+Society+of+Great+Britain+and+Ireland%22%5BJournal%5D)">Genetics and development of neural tube defects.</a> The Journal of Pathology: A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland. 220 (2), 217-230 (2010).</li>
<li>Wang, M., De Marco, P., Capra, V., Kibar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+role+of+the+non-canonical+wnt%2Fplanar+cell+polarity+pathway+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Update on the role of the non-canonical wnt/planar cell polarity pathway in neural tube defects.</a> Cells. 8 (10), 1198(2019).</li>
<li>Galea, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+coupling+facilitates+spinal+neural+tube+closure+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biomechanical coupling facilitates spinal neural tube closure in mouse embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (26), E5177-E5186 (2017).</li>
<li>Moon, L. D., Xiong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+neural+tube+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanics of neural tube morphogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 130, 56-69 (2022).</li>
<li>Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+spatiotemporal+contribution+of+morphogenetic+events+and+mechanical+tissue+coupling+during+xenopus+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct spatiotemporal contribution of morphogenetic events and mechanical tissue coupling during xenopus neural tube closure.</a> Development. 149 (13), (2022).</li>
<li>De Goederen, V., Vetter, R., Mcdole, K., Iber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hinge+point+emergence+in+mammalian+spinal+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hinge point emergence in mammalian spinal neurulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2117075119(2022).</li>
<li>Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somitic+mesoderm+morphogenesis+is+necessary+for+neural+tube+closure+during+xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Somitic mesoderm morphogenesis is necessary for neural tube closure during xenopus development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1091629(2023).</li>
<li>Nikolopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+neural+tube+closure+depends+on+regulation+of+surface+ectoderm+identity+and+biomechanics+by+grhl2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spinal neural tube closure depends on regulation of surface ectoderm identity and biomechanics by grhl2.</a> Nature Communications. 10 (1), 2487(2019).</li>
<li>Nychyk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vangl2-environment+interaction+causes+severe+neural+tube+defects%2C+without+abnormal+neuroepithelial+convergent+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Vangl2-environment interaction causes severe neural tube defects, without abnormal neuroepithelial convergent extension.</a> Disease Models & Mechanisms. 15 (1), 049194(2022).</li>
<li>Li, B., Brusman, L., Dahlka, J., Niswander, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmem132a+ensures+mouse+caudal+neural+tube+closure+and+regulates+integrin-based+mesodermal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tmem132a ensures mouse caudal neural tube closure and regulates integrin-based mesodermal migration.</a> Development. 149 (17), (2022).</li>
<li>Zulueta-Coarasa, T., Fernandez-Gonzalez, R. Laser ablation to investigate cell and tissue mechanics in vivo. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZulueta-Coarasa%2C+T+%22Integrative+Mechanobiology%3A+Micro-and+Nano+Techniques+in+Cell+Mechanobiology%22">Integrative Mechanobiology: Micro-and Nano Techniques in Cell Mechanobiology</a>. , Cambridge University Press. 128-147 (2015).</li>
<li>Wiebe, C., Brodland, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+properties+of+embryonic+epithelia+measured+using+a+novel+instrument%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Tensile properties of embryonic epithelia measured using a novel instrument.</a> Journal of Biomechanics. 38 (10), 2087-2094 (2005).</li>
<li>Luu, O., David, R., Ninomiya, H., Winklbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+mechanical+properties+of+xenopus+embryonic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large-scale mechanical properties of xenopus embryonic epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), 4000-4005 (2011).</li>
<li>Maître, J. L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+cell-autonomous+contractility+drives+compaction+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo.</a> Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 429-436 (2008).</li>
<li>Zamir, E. A., Srinivasan, V., Perucchio, R., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+asymmetry+in+the+embryonic+chick+heart+during+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical asymmetry in the embryonic chick heart during looping.</a> Annals of Biomedical Engineering. 31, 1327-1336 (2003).</li>
<li>Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1416-1421 (2015).</li>
<li>Savin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+growth+and+form+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On the growth and form of the gut.</a> Nature. 476 (7358), 57-62 (2011).</li>
<li>Almonacid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+diffusion+positions+the+nucleus+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 470-479 (2015).</li>
<li>Campàs, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2014).</li>
<li>Campàs, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 55, 119-130 (2016).</li>
<li>Christian, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+biomechanical+mapping+of+embryos+with+reverberant+optical+coherence+elastography+%28Rev-OCE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D biomechanical mapping of embryos with reverberant optical coherence elastography (Rev-OCE).</a> Proceedings of SPIE. , 123670(2023).</li>
<li>Scarcelli, G., Yun, S. H. J. N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+brillouin+microscopy+for+three-dimensional+mechanical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Confocal brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging.</a> Nature Photonics. 1 (1), 39-43 (2008).</li>
<li>Scarcelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+three-dimensional+mapping+of+intracellular+hydromechanical+properties+by+brillouin+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by brillouin microscopy.</a> Nature Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).</li>
<li>Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brillouin+microscopy%3A+An+emerging+tool+for+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Brillouin microscopy: An emerging tool for mechanobiology.</a> Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).</li>
<li>Zhang, J., Scarcelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+mechanical+properties+of+biological+materials+via+an+add-on+brillouin+module+to+confocal+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on brillouin module to confocal microscopes.</a> Nature Protocols. 16 (2), 1251-1275 (2021).</li>
<li>Boyd, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoyd%2C+RW+%22Nonlinear+optics%22">Nonlinear optics</a>. , Academic press. (2020).</li>
<li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+age-related+stiffening+in+the+crystalline+lens+by+brillouin+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by brillouin optical microscopy.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li>
<li>Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brillouin+optical+microscopy+for+corneal+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Brillouin optical microscopy for corneal biomechanics.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 185-190 (2012).</li>
<li>Antonacci, G., Braakman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+subcellular+structures+by+non-invasive+brillouin+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of subcellular structures by non-invasive brillouin microscopy.</a> Scientific Reports. 6 (1), 37217(2016).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+biomechanics+during+cranial+neural+tube+closure+measured+by+brillouin+microscopy+and+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue biomechanics during cranial neural tube closure measured by brillouin microscopy and optical coherence tomography.</a> Birth Defects Research. 111 (14), 991-998 (2019).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanics+within+intact+cells+is+regulated+by+cytoskeletal+network+and+internal+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanics within intact cells is regulated by cytoskeletal network and internal nanostructures.</a> Small. 16 (18), 1907688(2020).</li>
<li>Elsayad, K., Polakova, S., Gregan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanical+properties+in+biology+using+brillouin+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing mechanical properties in biology using brillouin microscopy.</a> Trends in Cell Biology. 29 (8), 608-611 (2019).</li>
<li>Poon, C., Chou, J., Cortie, M., Kabakova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brillouin+imaging+for+studies+of+micromechanics+in+biology+and+biomedicine%3A+From+current+state-of-the-art+to+future+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Photonics%22%5BJournal%5D)">Brillouin imaging for studies of micromechanics in biology and biomedicine: From current state-of-the-art to future clinical translation.</a> Journal of Physics: Photonics. 3 (1), 012002(2020).</li>
<li>Handler, C., Scarcelli, G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+mechanical+imaging+of+neural+tube+closure+in+live+embryo+using+brillouin+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Time-lapse mechanical imaging of neural tube closure in live embryo using brillouin microscopy.</a> Scientific Reports. 13 (1), 263(2023).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 220 (3), 284-289 (2001).</li>
<li>Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+submerged+filter+paper+sandwich+for+long-term+ex+ovo+time-lapse+imaging+of+early+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54636(2016).</li>
<li>Nys, Y., Guyot, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNys%2C+Y+%22Improving+the+safety+and+quality+of+eggs+and+egg+products%2C+vol+1%3A+Egg+chemistry%2C+production+and+consumption%22">Improving the safety and quality of eggs and egg products, vol 1: Egg chemistry, production and consumption</a>. Nys, Y., Bain, M., VanImmerseel, F. , 83-132 (2011).</li>
<li>Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+speed+sub-ghz+spectrometer+for+brillouin+scattering+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High speed sub-ghz spectrometer for brillouin scattering analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53468(2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Schlüßler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li>
<li>Williams, R. M., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424(2021).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).</li>
<li>Edrei, E., Scarcelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+in+spectroscopy+and+densely+labeled-fluorescence+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics in spectroscopy and densely labeled-fluorescence applications.</a> Optics Express. 26 (26), 33865-33877 (2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Na wczesny rozwój zarodka mogą łatwo wpływać zakłócenia zewnętrzne. Dlatego należy zachować najwyższą ostrożność podczas ekstrakcji i przenoszenia próbki. Jednym z potencjalnych problemów jest oderwanie się zarodka od bibuły filtracyjnej, co może prowadzić do obkurczenia się błony witeliny i skutkować przechyleniem artefaktu płytki nerwowej w obrazowaniu Brillouin. Co więcej, to kurczenie się może zatrzymać rozwój zarodka. Należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych kroków, aby zapobiec oderwaniu. Po pierwsze, w kroku 2.4 ...

Wady cewy neuralnej (NTDs) to ciężkie wady wrodzone ośrodkowego układu nerwowego spowodowane nieprawidłowościami w zamknięciu cewy neuralnej (NTC) podczas rozwoju embrionalnego1. Etiologia NTDs jest złożona. Badania wykazały, że NTC obejmuje sekwencję procesów morfogenetycznych, w tym rozszerzenie konwergentne, wyginanie płyty neuralnej (np. konstrykcję apikalną), uniesienie fałdów neuralnych i wreszcie adhezję fałdów neuralnych. Procesy te są regulowane przez liczne mechanizmy molekularne i genetyczne2,3, a każda dysfunkcja w tych procesach może prowadzić do powstania NTDs4,5,6. Ponieważ narastające dowody sugerują, że sygnały mechaniczne również odgrywają kluczową rolę podczas NTC3,7,8,9,10,11, a ponadto wykazano powiązania między genami a sygnałami mechanicznymi12,13,14, konieczne stało się zbadanie biomechaniki tkanek podczas neurulacji.
Opracowano kilka technik pomiaru właściwości mechanicznych tkanek embrionalnych, w tym ablację laserową (LA)15, dyssekcję i relaksację tkanek (TDR)16,17, aspirację mikropipetą (MA)18, nanoindentację opartą na mikroskopii sił atomowych (AFM)19, mikroindentery (MI) i mikroplatek (MP)20, mikrorheologię (MR) z wykorzystaniem pęset optycznych/magnetycznych21,22,23 oraz sensory oparte na kropelkach24. Istniejące metody pozwalają na pomiar właściwości mechanicznych w rozdzielczościach przestrzennych od skali podkomórkowej do skali tkankowej. Jednak większość z tych metod jest inwazyjna, ponieważ wymagają one kontaktu z próbką (np. MA, AFM, MI i MP), wstrzykiwania materiałów zewnętrznych (np. MR i sensory oparte na kropelkach) lub dyssekcji tkanek (np. LA i TDR). W rezultacie monitorowanie ewolucji mechanicznej tkanki płytki neuronalnej in situ przy użyciu istniejących metod jest trudne25. Niedawno rezonansowa elastografia optycznej koherencji wykazała potencjał w bezkontaktowym mapowaniu mechanicznym z wysoką rozdzielczością przestrzenną26.
Konfokalna mikroskopia Brillouina to rozwijająca się metoda optyczna, która umożliwia bezkontaktową kwantyfikację biomechaniki tkanek z rozdzielczością podkomórkową27,28,29,30. Mikroskopia Brillouina opiera się na zasadzie spontanicznego rozpraszania światła Brillouina, czyli oddziaływania między padającym światłem laserowym a falą akustyczną wywołaną fluktuacjami termicznymi w materiale. W konsekwencji światło rozproszone ulega przesunięciu częstotliwości, znanemu jako przesunięcie Brillouina ωR, zgodnie z równaniem31:
<img alt="Wzór na częstotliwość Bragga, równanie ωB; kluczowe dla badań nad krystalografią falową." src="/files/ftp_upload/66117/66117eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> (1)
Tutaj <img alt="Diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, ilustrujący zrównoważenie sił, edukacyjny koncept fizyki." src="/files/ftp_upload/66117/66117eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2"> to współczynnik załamania światła materiału, λ to długość fali światła padającego, M' to moduł podłużny, ρ to gęstość masy, a θ to kąt między światłem padającym a rozproszonym. Dla tego samego rodzaju materiałów biologicznych stosunek współczynnika załamania do gęstości <img alt="Symbol matematyczny n/√ρ w równaniach równowagi statycznej." src="/files/ftp_upload/66117/66117eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 3"> jest w przybliżeniu stały28,32,33,34,35,36. Zatem przesunięcie Brillouina może być bezpośrednio wykorzystane do szacowania względnych zmian mechanicznych w procesach fizjologicznych. Wykonalność mikroskopii Brillouina została potwierdzona w różnych próbkach biologicznych29,37,38. Niedawno zaprezentowano obrazowanie mechaniczne w czasie (time-lapse) żywego zarodka kurczaka poprzez połączenie mikroskopu Brillouina z systemem inkubacji na stoliku przedmiotowym39. Niniejszy protokół zawiera szczegółowe opisy przygotowania próbek, realizacji eksperymentu oraz post-processingu i analizy danych. Mamy nadzieję, że podjęte działania ułatwią szerokie zastosowanie bezkontaktowej technologii Brillouina w badaniu regulacji biomechanicznej w rozwoju zarodkowym i wadach wrodzonych.

<table><tbody><tr><td>Szalka Petriego 100 mm&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>zmotoryzowana scena 2D&nbsp;</td><td>Prior Scientific</td><td>H117E2</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalka Petriego</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Brillouin z inkubatorem na stoliku</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Jest to niestandardowy system mikroskopu Brillouin oparty na Ref. 30</td></tr><tr><td>Jaja kurze</td><td>University of Connecticut</td><td>Kamera N/A</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>CS2100M-USB</td><td></td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>#2701</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>1004-070</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli in ovo</td><td>GQF Manufacturing Company Inc.&nbsp;</td><td>GQF 1502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień</td><td>Thorlabs</td><td>SM1RR</td><td></td></tr><tr><td>Korpus mikroskopu</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator sceniczny</td><td>Oko labs</td><td>OKO-H301-PRIOR-H117</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-6M</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Instrumenty Artman</td><td>N/A</td><td>3szt Mikro nożyczki 5</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>Bibułka</td><td>Kimwipes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubka</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td> DR <td>Instruments</td><td>N/A</td><td>Zestaw kleszczy do mikrodysekcji&nbsp;</td></tr></tbody></table>

monitorowanie mechanicznej ewolucji tkanki podczas zamykania cewy nerwowej zarodka pisklęcia

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

Zamknięcie cewy nerwowej (NTC) jest krytycznym procesem podczas rozwoju embrionalnego. Niepowodzenie w tym procesie może prowadzić do wad cewy nerwowej, powodując wady wrodzone, a nawet śmiertelność. NTC obejmuje szereg mechanizmów na poziomie genetycznym, molekularnym i mechanicznym. Chociaż regulacja mechaniczna staje się w ostatnich latach coraz bardziej atrakcyjnym tematem, pozostaje w dużej mierze niezbadana ze względu na brak odpowiedniej technologii do przeprowadzania mechanicznych testów 3D tkanki embrionalnej in situ. W odpowiedzi opracowaliśmy protokół ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanki embrionalnej kurczaka w sposób bezkontaktowy i nieinwazyjny. Osiąga się to poprzez zintegrowanie konfokalnego mikroskopu Brillouina z systemem inkubacji na stoliku. Aby zbadać mechanikę tkankową, pobiera się wstępnie wyhodowany zarodek i przenosi go do inkubatora na etapie hodowli ex ovo. Jednocześnie obrazy mechaniczne tkanki płytki nerwowej są rejestrowane przez mikroskop Brillouin w różnych punktach czasowych rozwoju. Protokół ten zawiera szczegółowe opisy przygotowania próbki, realizacji eksperymentów mikroskopowych Brillouin oraz przetwarzania końcowego i analizy danych. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogą badać mechaniczną ewolucję tkanki embrionalnej podczas rozwoju podłużnego.

Rysunek 6 przedstawia schemat mikroskopu Brillouina. System wykorzystuje laser o długości fali 660 nm jako źródło światła. Bezpośrednio za głowicą lasera umieszczono izolator w celu odrzucenia światła odbitego wstecz, a do regulacji mocy lasera zastosowano filtr neutralnoprzepuszczalny (ND). Para soczewek L1 i L2 o ogniskowych odpowiednio f1 = 16 mm i f2 = 100 mm służy do rozszerzenia wiązki laserowej. Płytka półfalowa (HWP) i polaryzator liniowy (Polarizer 1) są wykorzystywane do regulacji ...

Ten protokół został opracowany do podłużnego monitorowania właściwości mechanicznych tkanki płytki nerwowej podczas neurulacji zarodka pisklęcia. Opiera się on na integracji mikroskopu Brillouin i systemu inkubacji na etapie, umożliwiającego mechaniczne obrazowanie na żywo tkanki płytki nerwowej w zarodkach piskląt hodowanych ex ovo.

Monitorowanie mechanicznej ewolucji tkanki podczas zamykania cewy nerwowej zarodka pisklęcia

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

Celem tych badań jest opracowanie nowego narzędzia, które będzie w stanie mierzyć mechanikę tkanek żywego zarodka. Za pomocą tego narzędzia chcemy zrozumieć, jak ewoluuje mechanika tkanki, gdy zarodek doświadcza zamknięcia cewy nerwowej. Może nam to pomóc w zrozumieniu mechanicznych regulacji w rozwoju embrionalnym.Aby zmierzyć sztywność tkanki, obecne metody, takie jak mikroskopia sił atomowych, nanowgłębienie i aspiracja mikropipetą, wymagają fizycznego kontaktu z próbką i przyłożenia siły w celu jej odkształcenia. Jest to duże wyzwanie dla pomiaru mechaniki tkanek żywego zarodka in situ. W tym przypadku zastosowaliśmy technologię optyczną zwaną mikroskopią Brillouina.W porównaniu z innymi technologiami, mikroskopia Brillouin wykorzystuje tylko skupioną wiązkę do pomiaru mechaniki tkanek. Jest to więc metoda bezkontaktowa i nieinwazyjna, która ma pewną rozdzielczość makroprzestrzenną. Pozwala nam to na uchwycenie poklatkowego obrazu mechanicznego żywego zarodka in situ W przyszłości chcemy dokładnie zrozumieć rolę mechaniki tkanek w rozwoju embrionalnym.W szczególności chcemy zbadać, w jaki sposób czynniki genetyczne, biochemiczny szlak sygnałowy i mechanika tkanek koordynują się ze sobą w morfogenezie. Może to dostarczyć nam nowych informacji na temat zapobiegania chorobom porodowym, takim jak wady cewy nerwowej. Aby rozpocząć, pokrój bibułę filtracyjną na prostokątny kształt o wymiarach około 17 na 20 milimetrów i usuń cztery rogi.Następnie utwórz około 7 na 10 milimetrów pustego środka w bibule filtracyjnej. Przymocuj dostępny w handlu pierścień do elastycznej warstwy folii i utwórz pusty środek w elastycznej warstwie folii. Umieść przygotowany pierścień na 35-milimetrowej szalce Petriego.Po wstępnym wyhodowaniu wyjmij jajo z inkubatora i umieść je na długiej osi na tacy kartonowej na jajka. Oczyść całą powierzchnię skorupki jajka 70% etanolem i pozwól jej odpocząć przez 15 minut. Trzymaj jajko na jego krótkiej osi i rozbij je na dole.Otwórz jajko na czystej, 100-milimetrowej szalce Petriego, aby wydobyć z niej zawartość. Za pomocą pipety przenieś około 10 mililitrów cienkiego białka do 15-mililitrowej probówki w celu hodowli ex ovo. Napełnij środkową studzienkę naczynia hodowlanego cienkim białkiem.Za pomocą bibuły delikatnie usuń grube białko przyczepione do błony witelinowej zarodka. Teraz ostrożnie przymocuj bibułę filtracyjną do membrany witelinowej, upewniając się, że oś ciała zarodka jest wyrównana ze środkowym prostokątem na bibule filtracyjnej. Przetnij nożyczkami membranę otaczającą bibułę filtracyjną.Za pomocą pęsety delikatnie odciągnij izolowaną bibułę filtracyjną od żółtka w kierunku ukośnym. Odwróć bibułę filtracyjną do góry nogami, aby ustawić zarodek grzbietową stroną do dołu. Ostrożnie zanurz całą bibułę filtracyjną z jednej strony długiej osi w 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej pożywkę WASH.Za pomocą czystej pipety delikatnie rozpyl pożywkę WASH równolegle do bibuły filtracyjnej, aby usunąć resztki żółtka. Następnie ostrożnie wyjmij bibułę filtracyjną z pożywki WASH i użyj bibuły, aby wchłonąć nadmiar pożywki z krawędzi zarodka. Umieść bibułę filtracyjną z zarodkiem na szalce hodowlanej, upewniając się, że grzbietowa strona zarodka jest skierowana w dół.Przenieś naczynie hodowlane do inkubatora na miejscu w celu przeprowadzenia hodowli ex ovo. Zbuduj naczynia hodowlane za pomocą ciepłego podłoża WASH. Gdy zarodek osiągnie pożądane stadium rozwoju, przenieś bibułę filtracyjną z zarodkiem do naczynia hodowlanego wypełnionego pożywką WASH.Umieścić szalkę hodowlaną w inkubatorze mikroskopu Brillouin. W procesie kalibracji zmierz sygnał Brillouina wody. Następnie zmierz sygnał Brillouina metanolu.W przypadku obrazowania w jasnym polu za pomocą czterokrotnej soczewki obiektywowej dostosuj punkt oświetlenia lasera do drugiej pary somitów, a następnie przełącz się na czterdziestokrotną soczewkę obiektywową i wykonaj precyzyjną regulację punktu laserowego do środka tuby nerwowej. Odblokuj wiązkę laserową i dostosuj płaszczyznę ogniskowej. Zeskanuj zarodek za pomocą dwuwymiarowego etapu translacyjnego i uzyskaj obraz Brillouina obszaru zainteresowania.Po zakończeniu skanowania ostrożnie usuń bibułę filtracyjną z zarodkiem. Użyj bibuły, aby wchłonąć nadmiar pożywki WASH z zarodka. Umieść zarodek z powrotem w naczyniu hodowlanym wypełnionym cienkim białkiem w celu ciągłego rozmnażania.W celu rekonstrukcji obrazu Brillouin załaduj dane sygnału wody i metanolu. Kliknij ustaw region i wybierz region z czterema kropkami do obliczania parametrów kalibracji. Zapisz wyniki kalibracji.Załaduj dane skanowania zarodków i kliknij start, aby przetworzyć parametry. Na koniec zrekonstruuj obraz Brillouina 2D na podstawie przesunięć Brillouina wszystkich pikseli. Przesunięcie Brillouina w szacowanym module podłużnym płytki nerwowej w stosunku do liczby somitów i czasu inkubacji wykazało wzrost przesunięcia Brillouina tkanki podczas zamykania cewy nerwowej.

monitoring-mechanical-evolution-tissue-during-neural-tube-closure

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Indukcja neuralna jest pierwszym etapem formowania się mózgu. Jest to mechanizm, dzięki któremu węzeł Hensen’a (organizator) instruuje sąsiednie tkanki do przyjęcia losu neuralnego, tzn. do przekształcenia się w układ nerwowy. Niniejszy film prezentuje test indukcji neuralnej w embrionie kurczaka.

Analiza indukcji neuralnej w embrionie kurczaka

W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która została opracowana w celu zbadania właściwości sygnalizacyjnych i wzorowania powierzchniowego ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.

Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonków ektodermalnych podczas rozwoju kraniofacjalnego

Niniejszy artykuł opisuje znakowanie powierzchniowe oraz hodowlę tkanek ex ovo we wczesnym embrionie kurczaka. Przedstawiono techniki umożliwiające obrazowanie w jasnym polu, fluorescencyjne oraz z wykorzystaniem tomografii optycznej koherencyjnej w trybie time-lapse. Śledzenie znaczników powierzchniowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną pozwala na obliczenie wielkości kinematycznych, takich jak odkształcenia morfogenetyczne, zarówno w dwóch, jak i w trzech wymiarach.

Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Opisano metodę umożliwiającą bezpośrednią manipulację farmakologiczną embrionów myszy podczas neurulacji z pominięciem metabolizmu matczynego. Technikę tę można dostosować do badania różnych aspektów neurulacji poprzez zmianę punktu czasowego oraz zastosowanego czynnika farmakologicznego.

Zamykanie rurki neuralnej w kulturze całych embrionów myszy

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Ten film ilustruje technikę izolowania fałdów nerwowych czaszki od śródmózgowia zarodków piskląt. Przedstawiono szczegółowy proces rozwarstwiania fałdów nerwowych, ich rozmieszczenia i mocowania na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, a następnie obserwację migracji komórek grzebienia nerwowego z fałdów nerwowych.

Izolowanie fałdów nerwowych czaszki od zarodka kurcząt w celu hodowli komórek grzebienia nerwowego

Oglądanie i dostęp do zarodka kurczaka podczas rozwoju może być wyzwaniem. Opracowaliśmy metodę ex ovo, która jest prosta, opłacalna i może być łatwo stosowana w klasie lub w środowisku badawczym. Metoda ta zapewnia dostęp do zarodka w późnych stadiach rozwoju zarodkowego (HH 40).

Zoptymalizowana hodowla ex-ovo zarodków piskląt do zaawansowanych etapów rozwoju

Tutaj informujemy o podwójnym znakowaniu komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych za pomocą wewnątrzgatunkowego szczepienia rurki nerwowejGFP w połączeniu z wewnątrznaczyniowym wstrzyknięciem DiI. Ta eksperymentalna technika pozwala nam jednocześnie wizualizować i badać rozwój układu nerwowego (jelitowego) wywodzącego się z NCC i układu naczyniowego podczas organogenezy.

Podwójne znakowanie komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych w zarodkach kurczaków za pomocą szczepienia cewy nerwowejpiskląt GFP i wstrzyknięcia barwnika karbocyjaniny DiI

Tutaj prezentujemy protokół wprowadzający zestaw nowych eksperymentów ex-ovo i podejść do modelowania fizycznego do badania mechaniki morfogenezy podczas wczesnego skręcania mózgu u zarodków piskląt.

Badanie roli sił fizycznych we wczesnej morfogenezie embrionalnej piskląt

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Poznaj mikroskopię Brillouina do monitorowania mechanicznych właściwości tkanki płytek nerwowych podczas neurulacji zarodka pisklęcia. Ta nieinwazyjna metoda pozwala na obrazowanie mechaniki tkanek żywych zarodków hodowanych ex ovo w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie mechanicznej ewolucji tkanki podczas zamykania cewy nerwowej zarodka pisklęcia

Przeglądaj więcej filmów