Indukcja ostrego udaru niedokrwiennego u myszy przy użyciu techniki niedrożności dystalnej tętnicy środkowej
15 grudnia 2023
Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia modelu dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) poprzez przezczaszkową elektrokoagulację u myszy C57BL/6J i oceny późniejszego zachowania neurologicznego i cech histopatologicznych.
W niniejszym badaniu mamy na celu zapewnienie kompleksowego i szczegółowego protokołu do ustalenia modelu niedrożności przyśrodkowej tętnicy mózgowej u myszy C57BL / 6NJ przy użyciu obliczeń elektrod przezczaszkowych i oceny późniejszego zachowania neurologicznego i cech histopatologicznych. Przyśrodkowa tętnica mózgowa (MCA) jest uznawana za podstawowy zestaw udaru niedokrwiennego u ludzi. Metody okluzji MCA, w tym technika otaczania kraniotomii, ogniskowe wprowadzenie chemiczne i okluzja morfologiczna, były kosztownie stosowane do wywoływania ogniskowego niedokrwienia mózgu u gryzoni
.W porównaniu z innymi modelami udaru niedokrwiennego, model ten ma tę zaletę, że jest mniej inwazyjny chirurgicznie, mniejszy rozmiar przekroczenia i wyższy wskaźnik przeżycia, co czyni go bardziej odpowiednim do badania długotrwałej poprawy funkcjonalnej po udarze niedokrwiennym. Ogólnie rzecz biorąc, obecne podejście skutecznie generuje wiarygodny eksperymentalny model udaru niedokrwiennego, który charakteryzuje się wysoką przeżywalnością i doskonałą powtarzalnością. W związku z tym metodologia ta służy jako nieocenione narzędzie zarówno w badaniach podstawowych, jak i translacyjnych w dziedzinie udaru mózgu.
W przyszłości zastosujemy paradygmaty zachowań, takie jak rozpoznawanie nowych obiektów i labirynt wodny, aby zbadać dynamiczne zmiany w zdolnościach uczenia się długoterminowego i pamięci wśród myszy z dystalnym zamknięciem MCA. Umożliwi nam to ustalenie zasadności wykorzystania ich jako modelu zwierzęcego do badań nad zaburzeniami poznawczymi po udarze. Aby rozpocząć, przetrzyj tablicę chirurgiczną ogrzewania 75% etanolem i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza.
Umieść znieczuloną mysz w prawej pozycji bocznej na tablicy, z głową odchyloną na bok. Aby chronić rogówkę przed wysuszeniem, nałóż maść do oczu. Po zgoleniu sierści od lewej orbity do lewego kanału słuchowego użyj kremu do depilacji, aby usunąć pozostałą sierść.
Trzykrotnie zdezynfekuj obszar operacyjny jodonem powidonu i 75% etanolem. Przeprowadź ocenę uszczypnięcia palców u stóp. Po wykonaniu pionowego nacięcia między lewym oczodołem a lewym kanałem słuchowym, cofnij miękką tkankę skórną, aby odsłonić mięsień skroniowy.
Za pomocą prostych mikrokleszczy oddziel wierzchołkowy i grzbietowy segment mięśnia skroniowego od czaszki. Zidentyfikuj rozwidlenie w kształcie litery Y środkowej tętnicy mózgowej lub MCA poniżej kości skroniowej. Następnie, za pomocą elektrycznego wiertła czaszkowego, rozrzedź czaszkę, aby utworzyć okno kostne, aż opona twarda stanie się widoczna.
Usuń oponę twardą powyżej MCA za pomocą zakrzywionych mikrokleszczyków. Za pomocą elektrycznych kleszczy do krzepnięcia skrzepnij tętnicę w miejscach proksymalnych i dystalnych do rozwidlenia. Monitoruj przepływ krwi w lewej gałęzi korowej MCA w laserowym mierniku przepływu krwi plamkowej.
Następnie zszyć mięsień i skórę oddzielnie szwami z kwasem poliglikolowym i nałożyć żel sodowy diklofenak i maść mupirocyny na nacięcie skóry. Umieść mysz w komorze odzyskiwania. Aby wykonać test siły chwytu we wcześniej opracowanym dystalnym modelu MCAO, chwyć tylną część ogona myszy i stopniowo opuszczaj mysz, aż przytrzyma poziomą belkę obiema przednimi łapami.
Trzymając ciało poziomo, pociągnij mysz do tyłu ze stałą prędkością dwóch centymetrów na sekundę. Kiedy mysz wypuści przednie łapy z drążka, zapisz szczytową siłę w gramach. Aby wykonać test na tyczce, umieść mysz pionowo na drewnianej tyczce.
Zapisz czas potrzebny myszy na odwrócenie się i całkowity czas zejścia ze słupa z 60-sekundowym czasem granicznym. Aby przeprowadzić test klejenia, przymocuj łatkę taśmy klejącej do prawej przedniej łapy myszy. Włóż mysz z powrotem do klatki hodowlanej i zapisz czas potrzebny myszy na usunięcie kleju z 60-sekundowym czasem odcięcia.
Aby przeprowadzić test cylindra, przetrzyj otwarty cylinder z przezroczystego szkła 75% etanolem i umieść w nim mysz. Za pomocą kamery nagrywaj jego spontaniczne zachowanie eksploracyjne w pozycji stojącej przez trzy minuty. Dystalne myszy MCAO wykazały znaczne zmniejszenie siły chwytu i wskaźnika użycia przedniej łapy po stronie przeciwnej w porównaniu z grupą operowaną pozorowaną.
Co więcej, myszy z okludacją wykazały znaczny wzrost czasu opadania w teście ciągnięcia i czasu potrzebnego na usunięcie kleju. Na początek uzyskaj wypreparowany mózg poddanego eutanazji dystalnego modelu myszy MCAO po testach behawioralnych i umieść go w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 20 minut. Następnie umieść mózg w jednomilimetrowej macierzy mózgowej i za pomocą ostrzy mikrotomu pokrój mózg na dwumilimetrowe odcinki wieńcowe.
Przenieś skrawki mózgu na 24-dołkową płytkę hodowlaną i dodaj 2% TTC, aby pokryć tkankę mózgową. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie ostrożnie zamocuj część mózgu w 4% roztworze paraformaldehydu na 15 minut.
Za pomocą skanera wykonaj skanowanie optyczne wycinków mózgu. Analiza histologiczna mózgu ujawniła nieuporządkowane ułożenie komórek neuronalnych i znaczne zmniejszenie gęstości komórek NeuN-dodatnich w obszarze okołozawałowym dystalnych myszy z MCA.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół ustanawiania modelu dystalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) u myszy C57BL/6J z wykorzystaniem przezczaszkowej elektrokoagulacji. Koncentruje się ono na ocenie wynikających z tego zachowań neurologicznych oraz cech histopatologicznych obserwowanych po zamknięciu naczynia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ocena zachowania neurologicznego
- Analiza histopatologiczna
- Modelowanie udaru niedokrwiennego
Wstęp
- Tętnica środkowa mózgu (MCA) odgrywa kluczową rolę w udarach niedokrwiennych u ludzi.
- Istnieje wiele metod zamykania MCA, jednak dMCAO oferuje korzyści pod kątem inwazyjności chirurgicznej oraz wskaźników przeżywalności.
- Model ten jest przydatny do badania długoterminowego powrotu funkcji.
Cel badania
- W celu stworzenia wiarygodnego eksperymentalnego modelu udaru niedokrwiennego u gryzoni.
- W celu oceny wyników behawioralnych i zmian histopatologicznych po udarze.
- W celu wykorzystania modelu w przyszłych badaniach nad upośledzeniem funkcji poznawczych.
Zastosowane metody
- Do indukowania dMCAO zastosowano przezczaszkową elektrokoagulację.
- W celu zbadania zmian neurologicznych po zamknięciu naczynia wykorzystano myszy C57BL/6J.
- Zastosowano testy behawioralne, takie jak pomiar siły chwytu, test słupa, test usuwania substancji klejącej oraz test cylindra.
- Po ocenach behawioralnych przeprowadzono badanie histologiczne tkanki mózgowej.
Główne wyniki
- U myszy stwierdzono znaczące obniżenie siły chwytu oraz wydłużenie czasu schodzenia w różnych testach behawioralnych.
- Analiza histologiczna wykazała zaburzenie rozmieszczenia neuronów oraz zmniejszoną gęstość komórkową w obszarze okołozawałowym.
Wnioski
- Badanie ustanawia solidny model dMCAO o wysokiej powtarzalności do badań nad udarem mózgu.
- Metodologia ta pozwoli na lepsze zrozumienie skutków strukturalnych i behawioralnych po udarze niedokrwiennym.
- Przyszłe zastosowania mogą koncentrować się na upośledzeniach poznawczych w procesie rekonwalescencji po udarze.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model mysi z niedrożnością dystalnej części tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) stanowi powtarzalny i istotny translacyjnie system do badania patofizjologii udaru niedokrwiennego oraz oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych. Umiarkowany, ograniczony do kory obszar zawału oraz wysoki wskaźnik przeżywalności umożliwiają rzetelną ocenę wyników neurologicznych i histopatologicznych, co zwiększa wiarygodność prognostyczną wczesnych etapów walidacji celów terapeutycznych. Model ten jest strategicznie przydatny do selekcji projektów badawczych oraz minimalizowania ryzyka mechanistycznego w przedklinicznych badaniach naczyniowo-mózgowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych ukierunkowanych na neuroprotekcję i regenerację po udarze.
- Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez modelowanie degeneracji neuronów i aktywacji gleju w kontrolowanym systemie.
- Ułatwia walidację funkcjonalną celów terapeutycznych dzięki mierzalnym punktom końcowym behawioralnym i histologicznym.
- Zapewnia wiarygodność prognostyczną w procesie wdrażania celów naczyniowo-nerwowych w potoku odkryć leków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowany system in vivo do przesiewania związków i interwencji neuroprotekcyjnych.
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne testy behawioralne, takie jak test siły chwytu, test słupka, test przylegania oraz test cylindra.
- Umożliwia ilościowy pomiar wielkości zawału i utraty neuronów w celu porównawczej oceny związków.
- Wspiera skalowalność analizy i ponowne wykorzystanie platformy w programach badawczych nad naczyniami neurovascularnymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z mechanizmami istotnymi dla choroby, które obserwuje się w przebiegu udaru korowego u ludzi.
- Zapewnia ciągłość procesu od wczesnego etapu odkryć po przedkliniczną walidację wyników funkcjonalnych i histopatologicznych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o translacyjnie istotne odczyty behawioralne i komórkowe.
- Wspiera przyszłe badania nad upośledzeniem funkcji poznawczych i długoterminowym powrotem do sprawności po udarze.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model dMCAO wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, łącząc wczesne studia mechanistyczne z translationalnymi ocenami skuteczności terapii udaru.
- Biologia odkryć: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków neuroprotekcji oraz regeneracji.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki behawioralne i histologiczne do selekcji związków.
- Analityka: Pozwala na statystyczne porównanie deficytów neurologicznych i parametrów zawałów pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Pozwala na zestawienie wyników przedklinicznych z patologią udaru u ludzi w celu walidacji biomarkerów i punktów końcowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako zestandaryzowana platforma do międzyprogramowej oceny interwencji naczyniowo-mózgowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w udarze mózgu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, reprodukowalne i skalowalne procedury in vivo dla badań naczyniowo-nerwowych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne kapitałowo rozwijanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów neuroprotekcyjnych i regeneracyjnych w oparciu o analizę ryzyka.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest biegłość w technikach mikrochirurgicznych oraz w fenotypowaniu behawioralnym gryzoni.
- Konieczny jest dostęp do specjalistycznej aparatury do elektrokoagulacji i testów behawioralnych.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja protokołów chirurgicznych i analitycznych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja może być konieczna w przypadku różnych szczepów myszy lub modeli chorób współistniejących.
- Model ogranicza się do udarów korowych i może nie oddawać wszystkich aspektów heterogeniczności udarów u ludzi.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:19
Distal Middle Artery Occlusion Procedure to Induce Ischemic Stroke in Mice
4:18
Neurological Behavioral Tests in Distal Middle Artery Occluded Mice to Study Ischemic Stroke Outcomes
6:09
Mouse Brain Histology to Study the Pathological Mechanisms of Ischemic Stroke Induced by Distal Middle Artery Occlusion
