Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej
12 stycznia 2024
Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.
Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa jest całkowicie stabilną techniką mikroskopową, która może łączyć informacje lokalizacyjne dostarczane przez mikroskopię fluorescencyjną i ultrastrukturę za pomocą mikroskopii elektronowej. Jednak głównym wyzwaniem tej techniki jest zachowanie sond fluorescencyjnych lub fluorescencyjnych po prostym przygotowaniu EM. Korzystając z tego białka fluorescencyjnego, możemy uzyskać światło korelacyjne Epon po osadzeniu pod mikroskopem elektronowym, które może jednocześnie utrzymywać fluorescencję i ultrastrukturę.
Na początek weź blok tkanki mózgowej myszy i przytnij jego powierzchnię do trapezu pod kątem prostym. Za pomocą noża diamentowego z ultramikrotomem wytnij odcinki o grubości 100 nanometrów. Oddziel pojedynczą sekcję od taśmy sekcji i zanurz ją w łaźni wodnej.
Dodaj kroplę podwójnie destylowanej wody do środka szkła nakrywkowego pokrytego nanocząsteczkami złota. Użyj pętli próbki, aby podnieść sekcję i odwrócić ją na powierzchnię kropli wody. Usuń pętlę próbki, pozostawiając sekcję na powierzchni kropli wody.
Następnie za pomocą markera narysuj pierścień wokół sekcji po przeciwnej stronie szkła nakrywkowego. Na początek weź ultra cienki fragment tkanki mózgowej myszy wyrażający mScarlet. Dodaj 10 mikrolitrów bufora montażowego na ultra cienką część na szkle nakrywkowym i umieść nową czystą szklankę nakrywkową na buforze montażowym.
Umieść dwie szklanki nakrywkowe z ultra cienką sekcją w komorze obrazowania. Zlokalizuj przekrój za pomocą markera pierścienia w trybie obrazowania w jasnym polu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i przejdź do jednego rogu sekcji. Włącz białe światło i uchwyć obraz w jasnym polu.
Następnie wyłącz białe światło, aktywuj laser i uchwyć obrazy fluorescencyjne o tym samym polu widzenia. Wyłącz laser i przejdź do sąsiedniego pola widzenia z 10% zachodzeniem na siebie. Uchwyć zarówno obraz jasnego, jak i fluorescencyjnego drugiego pola widzenia i zarejestruj ścieżkę obrazowania, aby zszyć pole widzenia.
Teraz użyj mapy nawigacyjnej, aby wskazać interesujące komórki. Aktywuj laser i uchwyć 300 klatek fluorescencyjnych obrazów interesującej Cię komórki. Następnie wyłącz laser.
Następnie aktywuj białe światło i wykonaj około 100 sekwencyjnych zdjęć w jasnym polu. Aby przygotować skrawki do mikroskopii elektronowej, napełnij szklany słoik podwójnie destylowaną wodą. Zdejmij okulary nakrywkowe, przytrzymując ultracienkie sekcje z komory obrazowania, i oddziel je pęsetą.
Zacisnąć szkło nakrywkowe z sekcją. Zmyć bufor montażowy wodą podwójnie destylowaną i pozostawić do wyschnięcia. Używając jednostronnego ostrza, naciąć haszysz wokół ultracienkiej sekcji.
Upuść 10 mikrolitrów 12% kwasu fluorowodorowego w każdy róg wyniku. Powoli umieść szklankę nakrywkową w wodzie. Następnie unieś folię pioliform i ultra cienki odcinek na powierzchni wody.
Umieść niepowlekaną siatkę szczelinową na sekcji, aby uchwycić ją w środku siatki. Przykryj szklane szkiełko parafilmem. Podnieś siatkę z folią w kształcie pioli i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.
Na początek uchwyć jasne pole i fluorescencyjne obrazy tkanki mózgowej myszy wyrażającej mScarlet. Zlokalizuj surowe dane, aby utworzyć mapę nawigacyjną składającą się z kilku obrazów w jasnym polu różnych pól widzenia na obrazie J. Następnie otwórz obraz J, przejdź przez wtyczki, kliknij łączenie i wybierz łączenie siatki lub kolekcji. Kliknij siatkę typu, wąż według kolumny.
Wybierz kolejność w górę i w lewo, a następnie kliknij ustaw rozmiar plasterka. Przejdź do wybranej ścieżki danych i kliknij ustaw nazwę pliku, a następnie sprawdź fuzję wyświetlacza. Aby zaimportować sekwencyjne obrazy w jasnym polu określonej komórki, kliknij plik i wybierz import, a następnie sekwencję obrazów.
Aby uzyskać projekcję sumy intensywności tych obrazów, przejdź do pozycji obraz, wybierz pozycję stosy, kliknij pozycję Projekcja Z, a następnie kliknij pozycję wycinki sumy. Następnie wybierz edytuj i kliknij przycisk Odwróć, aby odwrócić obraz projekcji sumy intensywności i poprawić widoczność nanocząstek złota. Następnie zaimportuj sekwencyjne obrazy fluorescencyjne.
Aby utworzyć obraz projekcji o sumie intensywności, kliknij przycisk Obraz i wybierz stosy. Następnie przejdź do rzutowania Z, kliknij suma wycinków i zapisz obrazy w formacie TIFF. Umożliwia otwieranie obrazów projekcji sumy intensywności obrazów w jasnym polu i obrazów fluorescencyjnych.
Przejdź do obrazu, wybierz kolor i kliknij przycisk Scal kanały, aby scalić projekcję sumy intensywności obrazu w jasnym polu z obrazem fluorescencyjnym. Następnie wybierz obraz i kliknij typ, a następnie kolor RGB, aby przekonwertować format obrazu kompozytowego na RGB. Nanocząstki złota będą miały kolor zielony, a białko fluorescencyjne będzie czerwone.
Następnie zapisz obraz jako plik TIFF. Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie rejestracyjne i wyszukaj EasyClemv0. Po znalezieniu kliknij EasyClemv0, kliknij obraz lub sekwencję i wybierz opcję Otwórz, aby zaimportować obraz z mikroskopii elektronowej i obrazy złożone obrazów jasnego pola i fluorescencji.
W interfejsie EasyClemv0 kliknij 2D XYT, aby wybrać niesztywny 2D lub 3D jako tryb wyrównania. W oknie EasyClemv0 kliknij pole rozwijane po prawej stronie wybranego obrazu, który zostanie przekształcony i zmieniony rozmiar, prawdopodobnie FM, aby wybrać kompozytowy kolor RGB TIFF, a następnie kliknij pole rozwijane po prawej stronie wybranego obrazu, który nie zostanie zmodyfikowany, prawdopodobnie EM, aby wybrać sześć obrazów TIFF. Kliknij start, aby rozpocząć proces rejestracji.
W oknie obrazu mikroskopii elektronowej w formacie TIFF z szóstym obrazem kliknij nanocząstkę złota, aby umieścić na niej punkt jeden. W oknie obrazu mikroskopii fluorescencyjnej kompozytowy kolor RGB TIFF kliknij odpowiednią nanocząstkę złota, aby umieścić na niej punkt jeden. Następnie kliknij transformację aktualizacji, aby potwierdzić wyrównanie sygnałów fluorescencji i mikroskopii elektronowej nanocząstek złota i zakończ rejestrację, klikając stop.
Aby wyeksportować wyrównany stos obrazów zawierający obrazy z czterech kanałów, kliknij nałożony obraz, wybierz obraz lub sekwencję, a następnie kliknij przycisk Zapisz jako. Teraz otwórz obraz J, kliknij plik i wybierz otwarty, aby zaimportować nałożony obraz. Przejdź do obrazu, kliknij pozycję Stosy, a następnie ułóż dwa obrazy w stos, aby rozdzielić je na cztery obrazy kanału.
Następnie wybierz obraz i kliknij kolor, a następnie scal kanały, aby scalić trzy kanały w obraz kompozytowy. Aby przekonwertować obraz kompozytowy na obraz korelacyjny z mikroskopii świetlnej i elektronowej, wybierz obraz, a następnie wybierz typ i kliknij opcję Kolor RGB.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej z wykorzystaniem zatopienia w żywicy Epon po utrwaleniu, z użyciem białka fluorescencyjnego mScarlet. Metoda ta skutecznie zachowuje zarówno fluorescencję, jak i ultrastrukturę, co czyni ją przydatną w różnorodnych zastosowaniach biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa
- Zastosowania białek fluorescencyjnych
- Techniki mikroskopowe
Wstęp
- Łączenie mikroskopii fluorescencyjnej z mikroskopią elektronową
- Wyzwania w zachowaniu fluorescencji podczas przygotowania próbek
- Zastosowanie mScarlet w celu poprawy obrazowania
Zastosowane metody
- Techniki korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej
- Tkanka mózgu myszy jako model biologiczny
- Zatapianie po utrwaleniu z użyciem Epon i mScarlet
Główne wyniki
- Skuteczne zachowanie fluorescencji i ultrastruktury
- Szczegółowe obrazowanie tkanki mózgowej
- Efektywne dopasowanie sygnałów fluorescencji i mikroskopii elektronowej
Wnioski
- Badanie demonstruje niezawodną metodę korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej
- Wskazuje na potencjał do szerszych zastosowań w badaniach biologicznych
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) z wykorzystaniem zatapiania w żywicy Epon umożliwia jednoczesne zachowanie fluorescencji i ultrastruktury, rozwiązując tym samym krytyczny problem w obrazowaniu komórkowym na etapie odkrywania. Możliwość ta usprawnia ograniczanie ryzyka mechanistycznego i walidację celów poprzez zapewnienie wysokiej rozdzielczości kontekstu przestrzennego dla lokalizacji molekularnej. Metoda ta wspiera pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych wczesnych etapów odkrywania oraz w potokach badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną lokalizację celów molekularnych w zachowanej ultrastrukturze komórkowej.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez korelację sygnałów fluorescencyjnych z cechami ultrastrukturalnymi.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki bezpośredniej wizualizacji zależności molekularnych i strukturalnych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie wdrażania celów do etapu odkrywania.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane przekroje biologiczne do późniejszych etapów procesów obrazowania wysokotreściowego.
- Zapewnia powtarzalność i ilościowe wyniki obrazowania poprzez zachowanie zarówno fluorescencji, jak i ultrastruktury.
- Wspiera standaryzację i skalowalność testów w zastosowaniach przesiewowych wymagających rozdzielczości przestrzennej.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na struktury podkomórkowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane o lokalizacji molekularnej ze zmianami ultrastrukturalnymi istotnymi dla choroby w modelach przedklinicznych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez integrację multimodalnych danych obrazowych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o solidne dowody przestrzenne i molekularne.
- Usprawnia opracowywanie biomarkerów translacyjnych poprzez korelację fluorescencji z patologią ultrastrukturalną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od wczesnej walidacji celu po badania przedkliniczne, łącząc lokalizację molekularną z analizą ultrastrukturalną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez korelację danych molekularnych i strukturalnych.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do rozwoju testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary o wysokiej rozdzielczości oraz wyniki rejestracji obrazów do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie markerów molekularnych do ultrastruktury istotnej dla choroby w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania obrazowania w różnorodnych programach B+R wymagających mikroskopii korelacyjnej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy obrazowania i zapewnia powtarzalność między eksperymentami.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych danych przestrzennych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów w fazie odkrywania i badań przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga biegłości zarówno w technikach mikroskopii fluorescencyjnej, jak i elektronowej.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury obrazowej oraz oprogramowania do rejestracji obrazów.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania próbek i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych typów tkanek lub systemów modelowych.
- Zależność od kompatybilności białek fluorescencyjnych z zatapianiem w Epon i przygotowaniem do EM.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:44
Ultrathin Sectioning for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM)
1:33
Creating the Navigation Map for CLEM and Preparation of the Ultrathin Sections for Electron Microscopy
4:07
Image Analysis of Brightfield and Fluorescence Images of the Mouse Brain Sections for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy
6:16
Registration of the Fluorescence Microscopy Image with the Electron Microscopy Image for Correlative Light and Electron Microscopy
