Name: Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę produkcji biblioteki kombinatorycznej korków w emulsjach woda-w-oleju przy użyciu dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego PDMS. To podejście wspiera badania nad mikrośrodowiskiem nowotworowym i precyzyjną onkologię.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Stacey Martina z NanoLab TuE za pomoc w osadzaniu z fazy gazowej HMDS. Badania te zostały sfinansowane przez Instytut Złożonych Układów Molekularnych (ICMS) na Uniwersytecie Technicznym oraz przez program Grawitacyjny IMAGINE! (numer projektu 24.005.009).

Setup of a Microfluidic Device for Combinatorial Plug  Production

F. E. jest freelancerem dla TheraMe! AG. Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W artykule przedstawiono zestaw protokołów wytwarzania i działania urządzenia mikroprzepływowego opartego na PDMS do automatycznego generowania bibliotek kombinatorycznych w komorach typu woda w oleju zwanych korkami. Połączenie mikrofluidyki z technologią kropelkową zapewnia potężną technikę hermetyzacji niewielkiej ilości odczynników w dużej liczbie komór, otwierając w ten sposób drogę do kombinatorycznych badań przesiewowych na dużą skalę.
Wcześniej opisano kilka technologii generowania chemicznie odrębnych przedziałów za pomocą mikrofluidyki, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia. Kulesa i wsp.50 opisali strategię hermetyzacji komórek z kodami kreskowymi w kropelkach za pomocą płytek mikromiareczkowych i łączenia tych kropel za pomocą pola elektrycznego w celu stworzenia biblioteki kombinatorycznej. Chociaż takie podejście może generować wiele kombinacji kropel, jest ograniczone przez konieczność ręcznej obsługi w przepływie pracy. Tomasi i wsp.51 opracowali platformę mikroprzepływową do łączenia kropelki zawierającej sferoidy (swobodnie pływające agregaty komórek) z kroplą bodźca, umożliwiając w ten sposób manipulowanie mikrośrodowiskiem sferoidalnym. Metoda ta pozwala na badanie ważnych zjawisk, takich jak interakcje komórka-komórka i działanie leków, ale jest to stosunkowo niska przepustowość. Eduati i wsp.46 oraz Utharala i wsp.47 opracowali platformę opartą na zaworach mikroprzepływowych, która może generować biblioteki kombinatoryczne o wysokiej przepustowości w sposób zautomatyzowany. Jednak w tych badaniach zawory są obsługiwane za pomocą urządzenia Braille'a, co wymaga kłopotliwych etapów wyrównania między mikrozaworem a chipem mikroprzepływowym. Kluczową cechą systemu opisanego w artykule jest implementacja pneumatycznych zaworów PDMS do regulacji przepływu płynu w kanałach wejściowych. Ponieważ zawory te są oparte na PDMS, można je dość płynnie zintegrować z etapami produkcji chipa mikroprzepływowego. Ponadto są stosunkowo prostą opcją sterowania przepływem cieczy w kanałach wlotowych, ponieważ mogą być uruchamiane poprzez wywieranie ciśnienia przez zewnętrzne źródło gazu. Wreszcie, można zaprogramować czas i sekwencję zwiększania i obniżania ciśnienia w tych zaworach, automatyzując w ten sposób produkcję różnych populacji korków w sposób wysokoprzepustowy. Inną ważną cechą jest stosowanie reżimów stałego ciśnienia do wstrzykiwania odczynników przez wlot, co pozwala zrezygnować z włączania kanałów odpływowych w celu zmniejszenia akumulacji ciśnienia, która powstaje w reżimie stałego natężenia przepływu. Upraszcza to konstrukcję urządzenia, zmniejsza potrzebę stosowania dodatkowych zaworów i sprzętu do sterowania zaworami kanału odpływowego oraz minimalizuje marnotrawstwo odczynników.
Podczas gdy produkcja urządzeń z PDMS jest stosunkowo nieskomplikowana, wdrożenie takich urządzeń wymaga użycia obszernych akcesoriów sprzętowych, takich jak pneumatyczne zawory elektromagnetyczne (do sterowania uruchamianiem zaworów PDMS), pompy ciśnieniowe (do sterowania przepływem odczynników wlotowych i olejowych) oraz programy programowe (do regulacji zaworów elektromagnetycznych). Chociaż stanowią one znaczną inwestycję, taka konfiguracja zapewnia spójność i niezawodność dla pomyślnego działania urządzenia. Ponadto komponenty sprzętowe i architektura przedstawione w tym protokole są skonfigurowane w sposób modułowy. W związku z tym w przypadku niektórych modułów można zastosować alternatywy w celu obniżenia kosztów lub dostosowania ich do konkretnej potrzeby. Na przykład istnieje wiele pomp, które mogą być używane w zależności od użyteczności, budżetu, dostępności i wygody 52,53,54. Dodatkowe komponenty, takie jak zbiorniki płynu i regulatory temperatury, mogą być wbudowane w wrażliwe odczynniki wlotowe23. Co więcej, projekt ten można skalować w górę lub w dół, aby zaspokoić określone potrzeby naukowe. Na przykład w tym artykule opisano prototyp z ośmioma wlotami, który pozwala na połączenie ośmiu unikalnych odczynników w celu wytworzenia zatyczek. Można to rozbudować do urządzenia z 16 wlotami, co pozwala na większą liczbę wlotów i większe ich kombinacje. W związku z tym będzie potrzebował dodatkowych kanałów sterujących i zaworów elektromagnetycznych do adresowania wlotów, ale taki prototyp pozwala na generowanie większych i bardziej zróżnicowanych bibliotek kombinatorycznych. Wreszcie, w tym artykule, każda populacja czopa jest wytwarzana przez otwarcie trzech z ośmiu wodnych wlotów urządzenia mikroprzepływowego. Zaobserwowano, że dla takiej konfiguracji ciśnienie około 200 mbar dla odczynników olejowych i 400 mbar dla odczynników wodnych odpowiadało reżimowi produkcji grzyba, który jest napędzany wyłącznie przez uruchamianie zaworu. Gdy do oleju (olejów) przyłożono wyższe ciśnienie, zaobserwowano rozpad korków, a zastosowanie niższych ciśnień doprowadziło do stopienia się korków. Optymalny reżim ciśnieniowy dla produkcji korków zależy od wielu czynników, takich jak liczba wlotów przyczyniających się do tworzenia korka, charakter i lepkość płynów oraz wymiary kanałów, i powinien być optymalizowany w razie potrzeby.
Jedną z wad pracy w reżimie stałego ciśnienia jest to, że płyny o różnej lepkości mają różne prędkości przepływu pod stałym ciśnieniem. Dlatego należy upewnić się, że odczynniki wodne przepływające przez wloty mają porównywalną lepkość. Stosowanie płynów o różnej lepkości wpłynie nie tylko na przepływ płynu w kanałach wlotowych, ale także na tworzenie się czopów na skrzyżowaniu T, pogarszając w ten sposób skład populacji czopów. Kolejną wadą jest zanieczyszczenie populacji czopów pozostałościami odczynników na złączu T. Gdy urządzenie przełącza się między produkcją różnych populacji czopów, pierwsza/ostatnia zatyczka w sekwencji każdej populacji ma tendencję do bycia zanieczyszczoną przez poprzednią lub następną populację. Problem ten można przezwyciężyć poprzez wyprodukowanie dodatkowych powtórzeń każdej populacji i zdyskontowanie zanieczyszczonej czopki podczas analizy. Wreszcie, istnieje również możliwość wystąpienia różnic między poszczególnymi urządzeniami wynikającymi z niespójności w produkcji i/lub źródłach zewnętrznych (wahania ciśnienia). Ten problem można złagodzić, wielokrotnie wykorzystując pojedynczy układ mikroprzepływowy i upewniając się, że cały przebieg biblioteki kombinatorycznej jest wykonywany na jednym chipie, aby zminimalizować wpływ tych niespójności.
Urządzenie mikroprzepływowe i towarzyszący mu zestaw protokołów operacyjnych przedstawionych w tym artykule zostały wykorzystane do zademonstrowania produkcji ilościowej biblioteki kombinatorycznej wtyczek. Platforma ta może zatem szybko generować biblioteki kombinatoryczne różnych populacji wtyczek w sposób wysokoprzepustowy. W rezultacie, takie technologie mogą być wykorzystywane do różnych celów przesiewowych, w tym między innymi do kombinatorycznych badań przesiewowych leków na próbkach biopsji pacjenta - dzięki czemu niewielka liczba komórek pobranych z biopsji może być rozprowadzona w dużej liczbie kropel i leczona dużą kombinacją leku przeciwnowotworowego w celu optymalizacji indywidualnej terapii dla danej próbki pacjenta - a tym samym przyspieszenia spersonalizowanej terapii raka46, Rozdział 48,55.

Mikrofluidyka pozwala na manipulowanie małymi ilościami płynów w mikrokanałach1. Skala działania typowych urządzeń mikroprzepływowych wynosi od kilkudziesięciu do kilkuset mikrometrów, co pozwala na miniaturyzację reakcji chemicznych i biologicznych, a tym samym umożliwia przeprowadzanie takich reakcji przy użyciu stosunkowo niewielkich ilości odczynników. Początkowo urządzenia mikroprzepływowe były wytwarzane z materiałów takich jak silicon2 i glass3. Chociaż są one nadal w użyciu4, stwarzają pewne problemy, takie jak kompatybilność z rozpuszczalnikami, wysokie koszty produkcji i trudności w integracji elementów sterujących przepływem płynów5,6. Metodologie wytwarzania oparte na PDMS, określane jako miękka litografia, oferują niedrogą alternatywę dla szybkiego prototypowania urządzeń7 oraz drogę do wytwarzania złożonych urządzeń wielowarstwowych8. Dodanie zaworów i pomp do urządzeń PDMS pozwala na możliwość kontrolowania trasy i prędkości płynów w urządzeniach9,10. Opracowano kilka metod projektowania i uruchamiania mikrozaworów w sposób odwracalny lub nieodwracalny - na przykład zawory bimetaliczne wykonane z krzemu i aluminium, które są uruchamiane termicznie11 lub wykorzystujące gaz generowany w wyniku reakcji elektrochemicznej do odchylania membrany z azotku krzemu12. Gu i in. demonstrują użycie mechanicznych pinów monitora brajlowskiego do wywierania nacisku na mikrokanały w celu regulacji przepływu13. Jednym z zestawów mikrozaworów, który zyskał popularność, są pneumatyczne zawory oparte na PDMS, zapoczątkowane przez grupę Stephena Quake14. Zazwyczaj takie zawory składają się z dwóch ortogonalnych mikrokanałów - kanału przepływowego i kanału sterującego. Po zwiększeniu ciśnienia w kanale sterującym, cienka membrana PDMS odchyla się od kanału przepływowego, zamykając go, a tym samym przerywając przepływ płynu. Po rozhermetyzowaniu membrana rozluźnia się, otwierając w ten sposób kanał przepływowy i umożliwiając wznowienie przepływu płynu. Zawory PDMS umożliwiają w ten sposób regulację przepływu w solidny i odwracalny sposób, ponieważ kanał sterujący może być wielokrotnie zwiększany i rozhermetyzowany15. Dodatkowo, ponieważ takie zawory mogą być uruchamiane przez przyłożenie ciśnienia, otwierają one drogę do cyfrowego sterowania i automatyzacji16. Ponadto, ponieważ są one wykonane z tego samego materiału, można je bezproblemowo zintegrować z produkcją urządzeń opartych na PDMS przy użyciu technik miękkiej litografii8,17,18. Te cechy sprawiają, że zawory PDMS są atrakcyjnym wyborem do regulacji przepływu w urządzeniach mikroprzepływowych. Thorsen i in. wykorzystali zasadę działania takich zaworów do zaprojektowania multipleksera fluidycznego - kombinatorycznego układu zaworów pneumatycznych - do adresowania prawie tysiąca wejściowych kanałów przepływu z dwudziestoma kanałami sterującymi19. Zasada ta została rozszerzona o selektywne kierowanie płynów do mikroprzepływowych chemostatów w układzie scalonym, dzięki czemu unikalne reakcje mogą być przeprowadzane jednocześnie w każdym reaktorze20,21,22,23. Jednak takie mikroreaktory, choć przydatne w optymalizacji wykorzystania ograniczonych odczynników, nie mogą zrównoleglić wielu reakcji i nie są wystarczające do badań wysokoprzepustowych.
Mikrofluidyka kropelkowa to podkategoria mikrofluidyki, która polega na wytwarzaniu kropel poprzez manipulowanie niemieszającym się, wielofazowym przepływem cieczy w urządzeniach mikroprzepływowych24. Tworzenie kropel polega na rozbiciu płynu ciągłego przez wprowadzenie płynu niemieszającego się, co skutkuje ściśnięciem z powodu niestabilności energii międzyfazowej i powstaniem emulsji25. Środki powierzchniowo czynne pomagają w tworzeniu zaokrąglonych kropelek, gdy emulsje opuszczają mikrokanał, stabilizując energie międzyfazowe26. Większe kropelki, zwane czopami, są mniej stabilne i mogą być zbierane w komorze przechowawczej (takiej jak długość rurki) jako zestaw komór wodnych rozmieszczonych po obu stronach przez jedną lub więcej niemieszających się cieczy27. Oprócz miniaturyzacji i podziału na przedziały, mikrofluidyka kropelkowa oferuje również zwiększoną przepustowość reakcji biologicznych, ponieważ można wytworzyć dużą liczbę kropel monodyspersyjnych - każda z nich służy jako nanoreaktor28. Kropelki, raz wygenerowane, mogą być również poddawane dalszym manipulacjom, takim jak splitting29,30, fusion31,32, sorting33,34, i łączenie w struktury wyższego rzędu35,36. Mikrofluidyka kropelkowa zrewolucjonizowała kilka dziedzin i technologii naukowych - od PCR37 do transkryptomiki pojedynczych komórek38, od discovery-leku39,40 do virology41, od sekwencjonowania nowej generacji42 do syntezy chemicznej43.
Integracja miękkiej litografii opartej na PDMS i mikrozaworów z technologią kropelkową to potężna kombinacja, która pozwala na regulację przepływu płynu w mikrokanałach i późniejszą kontrolę nad zawartością kropel. W zależności od otwierania i zamykania kanałów możliwe jest wytworzenie odrębnych populacji kropel, z których każda ma określony skład. Taka platforma mogłaby miniaturyzować, dzielić i zrównoleglać reakcje biochemiczne, a tym samym być użyteczną techniką do kombinatorycznych badań przesiewowych44. Kombinatoryczne badania przesiewowe to wysokoprzepustowa metoda generowania dziesiątek tysięcy kombinacji wybranych odczynników w celu wytworzenia bibliotek składających się z poszczególnych populacji o znanym składzie. Kombinatoryczne badania przesiewowe zostały wykorzystane do odkrycia synergicznych efektów między lekami i antybiotykami w hamowaniu wzrostu bakterii45. W dziedzinie terapii nowotworów kombinatoryczne badania przesiewowe zostały wykorzystane do testowania kombinacji leków przeciwnowotworowych dla danego pacjenta, rozwijając w ten sposób spersonalizowaną terapię46,47. Mathur i in. wykorzystali tę technologię, integrując kombinatoryczne podejście do kodowania kreskowego DNA w celu oceny zmian transkryptomu w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków48. W związku z tym kombinatoryczne badania przesiewowe są potężną, ale dopiero powstającą technologią i istnieje potrzeba opracowania różnorodnych technologii mikroprzepływowych w celu przeprowadzenia i ułatwienia takich procedur przesiewowych.
Celem tego manuskryptu jest przedstawienie kompletnego zestawu protokołów do produkcji dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego zdolnego do generowania kombinatorycznej biblioteki korków typu woda w oleju oraz opisanie sprzętu i oprogramowania potrzebnego do działania takiego urządzenia. Przepływ płynu jest regulowany za pomocą sterowanych ciśnieniowo zaworów pneumatycznych opartych na PDMS, które z kolei są sterowane przez niestandardowy program LabVIEW. Przepływ odczynników w urządzeniu odbywa się za pomocą dostępnych na rynku pomp ciśnieniowych. Przedstawiono prototyp z ośmioma wlotami, w którym zawartość trzech wlotów, z których każdy zawiera odczynnik wodny, tworzy czop. Faza wodna spotyka się z ciągłą fazą olejową, a świece są wytwarzane na skrzyżowaniu T o częstotliwości 0,33 Hz. Działanie systemu zostało zademonstrowane poprzez stworzenie biblioteki ilościowej zawierającej trzy odrębne populacje wtyczek fluorescencyjnych. Ta technologia i zestaw protokołów pomogą przyspieszyć tworzenie bibliotek kombinatorycznych do celów badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.

<table><tbody><tr><td>1,1,3,3 tetrametylodiloksan</td><td>Merck Life Science NV</td><td>MFCD00008256</td><td></td></tr><tr><td>4-kanałowy cyfrowy moduł wejść/wyjść</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-504</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Boom Labs</td><td>BOOMSKEUZW3</td><td></td></tr><tr><td>Analysis Software</td><td>Uniwersytet Techniczny w Eindhoven</td><td>https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE</td><td></td></tr><tr><td>AZ 40XT 11D</td><td>Merck Life Science NV&nbsp;</td><td>212299</td><td>&nbsp; Dodatni fotorezystor&nbsp;</td></tr><tr><td>Deweloper AZ 726 MIF</td><td>Merck Life Science NV</td><td>10055824960</td><td>Twórca dodatniego stempla do biopsji fotorezystu</td></tr><tr><td>, Rapid Core</td><td>World Precision Instruments Germany, GMBH</td><td>504529</td><td>0,75 mm ID, z</td></tr><tr><td>niebieskim barwnikiem spożywczym</td><td>PME</td><td>FC1036</td><td></td></tr><tr><td>Moduł końcowy kontrolera&nbsp;</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH&nbsp;</td>Kontroler Ethernet <td>750-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH&nbsp;</td><td>750-881</td><td></td></tr><tr><td>FC-40</td><td>Merck Millipore</td><td>F9755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fluigent Jednostka przepływu</td><td>Fluigent</td><td>FLU-S-D</td><td></td></tr><tr><td>Fluigent system ciśnieniowy&nbsp;</td><td>Płynny&nbsp;</td><td>MFCS-EZ&nbsp;</td><td>0 - 2 bary</td></tr><tr><td>Fluoresceina</td><td>Merck Life Science NV</td><td>MFCD00005050</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza&nbsp;</td><td>Naukowy Torrey Pines&nbsp;</td>Mikroskop odwrócony <td>HP61</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Instrumenty firmy Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Boom Labs</td><td>BOOMSKEUZE3</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW (wersja oprogramowania 20)</td><td>Uniwersytet Techniczny w Eindhoven</td><td>https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_ VERSION_1</td><td>Wszystkie pliki zostały zapisane dla LabVIEW w wersji 20. Zaleca się korzystanie z tej wersji lub nowszej do otwierania plików.</td></tr><tr><td>Odgałęzienia Luer&nbsp;</td><td>Instech Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>LS23</td><td>23 ga, 0,5"</td></tr><tr><td>męskie złącza Luer do zadziorów&nbsp;</td><td>Cole Parmer&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 45505-32&nbsp;</td><td>3/32" ID</td></tr><tr><td>Rurki PTFE</td><td>MasterFlex Avator/VWR</td><td>48634</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>470150-480</td><td></td></tr>,<tr><td>&nbsp; Plain</td><td>Corning</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Merck Millipore</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>mr DEV 600</td><td>Technologia mikrorezystu</td><td>R815100</td><td>Deweloper do ujemnego fotorezystu</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp; Heraeus T6P 50045757</td><td></td></tr><tr><td>plazma tlenowa asher</td><td>Quorum Technologies</td><td>K1050X</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>CAD/Art Services, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Projekt fotomaski</td><td>Uniwersytet Techniczny w Eindhoven (na podstawie Merten Lab, EPFL)</td><td>https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczny układ zaworów</td><td>FESTO</td><td></td><td>1x 8, Zawory normalnie zamknięte</td></tr><tr><td>Wafle</td><td>krzemowe Materiały</td><td></td> <td>krzemowe< 1-0-0>, średnica 100 mm, 525 &mu; m grubość</td></tr><tr><td>Ostrza jednoostrzowe&nbsp;</td><td>GEM Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miękkie rurki</td><td>Fluigent</td><td></td><td>1 mm ID, 3 mm OD</td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa&nbsp;</td><td>Korporacja Laurell Technologies&nbsp;</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy&nbsp;</td><td>Korporacja Olympus&nbsp;</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Kayakli Advanced Materials</td><td>Y311075 1000L1GL</td><td>Ujemny fotorezystor</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych (PDMS)</td><td></td>Strzykawka <td>Dow</td> 1317318 <td></td></tr><tr><td></td><td>B Braun Injekt - F Strzykawka do precyzyjnego dozowania</td><td>10303002</td><td></td></tr><tr><td>system naświetlania UV-LED</td><td>Idonus</td><td>UV-EXP150S-SYS Pompa próżniowa</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Vacuumbrand GmbH&nbsp;</td><td>Wagi MD1C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sartorius&nbsp;</td><td>M-prove (M dowod)</td><td></td></tr></tbody></table>

dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Mikrofluidyka kropelkowa to wszechstronne narzędzie, które pozwala na przeprowadzanie dużej liczby reakcji w chemicznie odrębnych nanolitrowych komorach. Takie systemy są wykorzystywane do hermetyzacji różnych reakcji biochemicznych - od inkubacji pojedynczych komórek po realizację reakcji PCR, od genomiki po syntezę chemiczną. Sprzężenie kanałów mikroprzepływowych z zaworami regulacyjnymi umożliwia kontrolę nad ich otwieraniem i zamykaniem, umożliwiając w ten sposób szybką produkcję wielkoskalowych bibliotek kombinatorycznych składających się z populacji kropel o unikalnym składzie. W artykule przedstawiono protokoły wytwarzania i działania dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego opartego na ciśnieniu, opartego na PDMS, które można wykorzystać do generowania kombinatorycznych bibliotek emulsji typu woda w oleju zwanych korkami. Dzięki zastosowaniu programów programowych i sprzętu mikroprzepływowego, przepływ pożądanych płynów w urządzeniu może być kontrolowany i manipulowany w celu generowania kombinatorycznych bibliotek zatyczek oraz kontrolowania składu i ilości populacji zatyczek składowych. Protokoły te przyspieszą proces generowania kombinatorycznych badań przesiewowych, w szczególności w celu zbadania odpowiedzi na leki w komórkach z biopsji pacjentów z rakiem.

Prezentacja dwuwarstwowego urządzenia opartego na polidimetylosiloksanie (PDMS) do produkcji bibliotek kombinatorycznych w emulsjach (korkach) typu woda w oleju jest przedstawiona. Niezbędny sprzęt i oprogramowanie wymagane do automatyzacji produkcji zatyczek jest szczegółowo opisane w protokole, a także pokazano produkcję ilościowej biblioteki zatyczek fluorescencyjnych.

Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...

W Grupie Biologii Systemów dla Onkologii stosujemy połączone podejście obliczeniowe i eksperymentalne, aby rozwikłać skomplikowane mechanizmy kształtujące mikrośrodowisko guza. Wykorzystujemy modele matematyczne oparte na danych klinicznych i biologii nowotworów, aby zidentyfikować czynniki wpływające na indywidualną odpowiedź na terapię, a ostatecznym celem jest poprawa onkologii precyzyjnej. Biorąc pod uwagę niejednorodny i dynamiczny charakter odpowiedzi guza na terapię, biologia perturbacji wykazała potencjał do przezwyciężenia ograniczeń biomarkerów genomowych.Nasze podejście polega na poddaniu receptywnych komórek nowotworowych szeroko zakrojonemu badaniu przesiewowemu leków przeciwnowotworowych w celu zidentyfikowania fenotypowych właściwości nowotworów w celu określenia skuteczniejszych terapii przeciwnowotworowych. Mikrofluidyka to cenna technologia, która pomaga w analizie niewielkiej ilości próbki, takiej jak biopsje guza, poprzez rozprowadzanie jej do poszczególnych przedziałów, takich jak kropelki lub czopy. Pozwala również na kontrolę składu każdej wtyczki, tworząc w ten sposób wiele populacji chemicznie odrębnych zatyczek.Prezentujemy tutaj urządzenie w pełni oparte na PDMS, w którym przepływ płynu jest regulowany przez zawory Quake uruchamiane ciśnieniem, które pozwalają na szybką, kontrolowaną i programowalną produkcję różnych populacji grzybów. Co więcej, ponieważ zawory Quake są również oparte na PDMS, można je bezproblemowo zintegrować z produkcją urządzeń. Połączenie danych uzyskanych z wysokoprzepustowych kombinatorycznych badań przesiewowych komórek nowotworowych z modelami matematycznymi pozwoli nam na badanie szlaków sygnałowych regulujących zachowanie mikrośrodowiska guza.Badania te utorują drogę nowym strategiom w onkologii precyzyjnej, dostarczając uzasadnienia do personalizacji leczenia dla poszczególnych pacjentów. Aby rozpocząć, wytnij odcinek rurki PTFE dla każdego kanału sterującego urządzenia mikroprzepływowego. Włóż szpilkę króćca Luer o rozmiarze 23 i 0,5 cala na jednym końcu.Przymocuj króciec Luer do męskiego Luera. Następnie włóż łącznik do rurki poliuretanowej. Podłącz drugi koniec rurki poliuretanowej bezpośrednio do zaworu elektromagnetycznego.Następnie podłącz króciec Luer o rozmiarze 23 x 0,5 cala na końcu strzykawki. Napełnić strzykawkę wodą. Przymocować wolny koniec rurki PTFE do strzykawki.Wstrzyknąć wodę do mniej więcej połowy rurki. Teraz odłącz rurkę od strzykawki i włóż wolny koniec do wybitego otworu odpowiedniego kanału sterującego. Powtarzaj, aż każdy kanał sterujący zostanie podłączony do odpowiedniego zaworu elektromagnetycznego.Następnie uruchom główny program interfejsu. Naciśnij opcję zwiększania ciśnienia we wszystkich kanałach sterujących, aby otworzyć zawory. Spowoduje to wypchnięcie płynu z rurki do kanałów sterujących urządzenia mikroprzepływowego w celu jego napełnienia.Dla każdego z odczynników wodnych należy wyciąć odcinek rurki PTFE wystarczająco długi, aby połączyć pompy z wlotami urządzeń mikroprzepływowych. Podłącz króciec Luer o rozmiarze 23 x 0,5 cala do końca strzykawki. Napełnić strzykawkę wymaganym odczynnikiem.Wstrzyknąć odczynnik do rurki, aż rurka będzie pełna. Włóż wolny koniec rurki do odpowiedniego wlotu na chipie mikroprzepływowym. Za pomocą oprogramowania należy przyłożyć ciśnienie 400 milibarów do każdego z wlotowych odczynników wodnych.Sekwencyjnie rozhermetyzuj kanały sterujące indywidualnie za pomocą głównego programu interfejsu. Naciśnij odpowiednie ikony w programie w polu oznaczonym Kanały sterujące Ręczne zwiększanie ciśnienia"aby w razie potrzeby uruchomić poszczególne zawory. Po powtórzeniu zwiększania ciśnienia dla odczynników olejowych, kliknij przycisk Rozhermetyzuj wszystkie kanały kontrolne"aby jednocześnie obniżyć ciśnienie w kanałach.Teraz kliknij na Zwiększ ciśnienie we wszystkich kanałach sterujących"aby zwiększyć ciśnienie w kanałach sterujących. Zakoduj kompozycję, sekwencję i repliki każdej populacji wtyczek w pliku CSV, oznaczając niezbędne kanały sterujące symbolem 0", jeśli odpowiedni wlot musi być otwarty, lub 1", jeśli musi zostać zamknięty. Będzie to służyć jako dane wejściowe dla automatycznego eksperymentu w głównym programie interfejsu.Następnie kliknij ikonę folderu w zakładce Plik eksperymentalny, aby załadować plik CSV. Wprowadź odpowiednie pola, takie jak iteracje eksperymentu, czas obniżenia ciśnienia i czas zwiększania ciśnienia. Następnie wybierz kanały wlotowe odpowiadające produkcji kodów kreskowych w sekcji Wlot kodów kreskowych wraz z czasem, przez jaki muszą być otwarte.Alternatywnie kody kreskowe można zakodować na stałe w wejściowym pliku CSV. Teraz zmniejsz ciśnienie odczynników oleju wlotowego z 400 milibarów do 200 milibarów. Następnie podłącz rurkę PTFE do gniazdka, aby zebrać wtyczki.Użyj wstępnie napełnionych przewodów, aby zneutralizować różnicę ciśnień na wylocie. Na koniec naciśnij Uruchom eksperyment"aby uruchomić program i podłączyć produkcję. Zawory były w stanie regulować przepływ płynu do około 800 milibarów ciśnienia wejściowego.Przy ciśnieniu 1200 milibarów ciśnienie wejściowe było zbyt wysokie, aby można było regulować przepływ. Natężenie przepływu wody destylowanej, po wstrzyknięciu pod stałym ciśnieniem, spadło do zera. Po obniżeniu ciśnienia natężenie przepływu powróciło do poziomu sprzed uruchomienia.Jednak przy stałym natężeniu przepływu uruchomienie zaworu nie spowodowało całkowitego zamknięcia wlotu. Aby zademonstrować funkcjonalność urządzenia, wygenerowano ilościową bibliotekę kombinatoryczną wtyczek.

bilayer-microfluidic-device-for-combinatorial-plug-production

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Prezentujemy protokoły wytwarzania i automatyzacji macierzy mikrozaworów opartych na elastomerowym polidimetylosiloksanie (PDMS), które nie wymagają dodatkowej energii do zamknięcia i charakteryzują się precyzyjnymi objętościami zdefiniowanymi fotolitograficznie. Przedstawiono równoległy mieszalnik o objętości subnanolitrowej oraz zintegrowany mikrofluidyczny system perfuzyjny.

Chip mikrofluidyczny sterowany macierzami elastomerowych mikrozaworów

W niniejszym artykule przedstawiamy metodę ograniczania cząstek opartą na mikroprzepływach i przepływie hydrodynamicznym. Demonstrujemy stabilne pułapkowanie cząstek w punkcie stagnacji płynu przy użyciu mechanizmu sterowania sprzężeniem zwrotnym, co umożliwia ograniczanie i mikromanipulację dowolnymi cząstkami w zintegrowanym urządzeniu mikroprzepływowym.

Mikrofluidyczna pułapka hydrodynamiczna dla pojedynczych cząstek

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

W niniejszej pracy wyjaśniamy sposób wykonania i zastosowania mikropłynnego mieszalnika zdolnego do mieszania dwóch roztworów w czasie ~8 μs. Demonstrujemy również wykorzystanie tych mieszalników w detekcji spektroskopowej z użyciem fluorescencji UV oraz fluorescencyjnego transferu energii w rezonansie (FRET).

Miksery mikrofluidyczne do badania fałdowania białek

W tym artykule opisujemy różne techniki dla platform szybkiego prototypowania mikroprzepływów. Proponowane techniki opierają się na epoksydach wrażliwych na promieniowanie ultrafioletowe (UV) i utwardzanych temperaturowo, rurkach na bazie polidimetylosiloksanu (PDMS), łączeniu drutem i anizotropowych foliach adhezyjnych. Przedstawione procedury montażu zostały opracowane zarówno dla urządzeń jednorazowego użytku, jak i systemów mikroprzepływowych wielokrotnego użytku.

Wysokowydajne, mikroprzepływowe, szybkie i tanie metody prototypowania

Mikroprzepływowe wytwarzanie podwójnych emulsji zazwyczaj obejmuje urządzenia o wzorzystej zwilżalności lub specjalnie wykonane elementy szklane. W tym miejscu opisujemy wytwarzanie i testowanie generatora podwójnej emulsji z polidimetylosiloksanu (PDMS), który nie wymaga obróbki powierzchni ani skomplikowanych procesów produkcyjnych i jest w stanie wytwarzać podwójne emulsje do 14 μm.

Podwójne wytwarzanie emulsji przy użyciu współosiowego urządzenia do ustawiania ostrości przepływu z polidimetylosiloksanu (PDMS)

Wielowarstwowe urządzenia mikroprzepływowe często wiążą się z wytwarzaniem form wzorcowych o skomplikowanej geometrii dla funkcjonalności. W tym artykule przedstawiono kompletny protokół wieloetapowej fotolitografii z zaworami i funkcjami o zmiennej wysokości, które można dostosować do dowolnego zastosowania. W ramach demonstracji wytwarzamy mikroprzepływowy generator kropel zdolny do wytwarzania kulek hydrożelowych.

Wieloetapowa fotolitografia o zmiennej wysokości dla wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych z zaworami

Opisano protokół wytwarzania plastikowych urządzeń mikroprzepływowych z przezroczystymi otworami do obrazowania światłem widzialnym i podczerwonym.

Miękka procedura litograficzna do wytwarzania plastikowych urządzeń mikroprzepływowych z otworami widokowymi przezroczystymi dla światła widzialnego i podczerwonego

Kanał mikroprzepływowy z odkształcalnymi ściankami bocznymi oferuje kontrolę przepływu, obsługę cząstek, dostosowywanie wymiarów kanału i inne rekonfiguracje podczas użytkowania. Opisujemy metodę wytwarzania kanału mikroprzepływowego ze ściankami bocznymi wykonanymi z układu pinów, który umożliwia zmianę ich kształtu.

Rekonfigurowalny kanał mikroprzepływowy z dyskretnymi ściankami bocznymi

Krzywe przełomu (BTC) są skutecznymi narzędziami do badania transportu bakterii w porowatych mediach. Tutaj przedstawiamy narzędzia oparte na urządzeniach fluidycznych w połączeniu z mikroskopią i zliczaniem metodą cytometrii przepływowej w celu uzyskania BTC.

Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Poznaj metodę produkcji biblioteki kombinatorycznej korków w emulsjach woda-w-oleju przy użyciu dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego PDMS. To podejście wspiera badania nad mikrośrodowiskiem nowotworowym i precyzyjną onkologię.

Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

Przeglądaj więcej filmów