Produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej serca z fibroblastów dorosłego człowieka do powlekania naczyń hodowlanych
22 marca 2024
Fibroblasty wyizolowane z serca dorosłego człowieka zostały wyhodowane do zbiegu na naczyniach pokrytych żelatyną, aby wytworzyć specyficzną dla mięśnia sercowego matrycę zewnątrzkomórkową. Po decelularyzacji substrat ten może być wykorzystany do hodowli i badania innych komórek serca oraz interakcji komórka-macierz
.W protokole opisujemy wykonalną metodę uzyskania macierzy zewnątrzkomórkowej serca in vitro jako substratu do badania tych samych interakcji macierzowych i wpływu macierzy zewnątrzkomórkowej specyficznej dla mięśnia sercowego na komórki serca. Obecne badania sojuszu koncentrują się na rozwoju bioinżynieryjnych trójwymiarowych podpór wykonanych z materiałów biomimetycznych, które mogą być wysiewane z komórek. Wydaje się, że materiał ten dostarcza biomechanicznych i specjalnych wskazówek dla komórek.
Skład macierzy zewnątrzkomórkowej ma głęboki wpływ na komórki, ponieważ zachodzi dwukierunkowe połączenie znakowe, co prowadzi do ciągłych modyfikacji zarówno składu macierzy, jak i zachowania komórek. Brakuje modeli in vitro odtwarzających mikrośrodowisko serca typowe dla stanów fizjologicznych lub patologicznych. Lepsze zrozumienie interakcji macierzy komórkowej dzięki możliwości ich odtworzenia in vitro może znacznie poprawić projektowanie rusztowań biomimetycznych do inżynierii tkankowej i regeneracji.
Na początek umyj świeżą próbkę ludzkiego przedsionka na 100-milimetrowej szklanej płytce zawierającej sterylny HBSS. Delikatnie wstrząsnąć próbkami w płytce, aby usunąć resztki krwi. Przenieść próbkę na 100-milimetrową płytkę zwilżoną niewielką objętością HBSS.
Za pomocą skrzyżowanych skalpeli posiekaj próbkę w dwumilimetrową kostkę. Następnie przenieś cztery małe fragmenty mięśnia sercowego na 35-milimetrową płytkę. Umieść sterylną szklankę nakrywkową na fragmentach i delikatnie dociśnij.
Odpipetować 1,5 mililitra DMEM do płytki. Następnie inkubuj płytki hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenkiem węgla. Gdy kultury osiągną 85% zbieżności, wyjmij płytkę z inkubatora i użyj sterylnych kleszczy, aby podnieść szkło nakrywkowe.
Następnie połóż go do góry nogami na nowej 35-milimetrowej płytce. Następnie dodaj sterylny PBS, aby go wypłukać. Teraz usuń fragmenty mięśnia sercowego, a następnie odpipetuj DMEM z płytki.
Użyć sterylnego PBS, aby przepłukać płytkę zawierającą wyrośnięte komórki. Po wyrzuceniu płukania dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny-EDTA do każdej płytki i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez pięć minut. Po inkubacji wyjąć płytki z inkubatora i za pomocą mikroskopu potwierdzić oderwanie komórek.
Następnie dodaj dwa mililitry roztworu zatrzymującego trypsynę lub TSS do każdej płytki, aby zablokować trypsynizację. Przenieś zawiesinę komórek do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować w temperaturze 400 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odessać supernatant za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej. Następnie dodaj trzy mililitry DMEM do palety i ponownie ją zawiesij. Umieść zawiesinę komórek na 60-milimetrowej płytce.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenkiem węgla. Następnie odpipetuj trzy mililitry sterylnego 0,2% roztworu żelatyny na każdą 60-milimetrową płytkę. Po inkubacji odessać roztwór i dodać trzy mililitry sterylnego PBS do dalszego użycia.
Wyjąć z inkubatora płytkę zawierającą fibroblasty serca. Usunąć DMEM z płytki i spłukać sterylnym PBS. Po wyrzuceniu płukania dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny-EDTA do każdej płytki.
Użyj mikroskopu, aby potwierdzić odłączenie komórki. Następnie dodaj dwa mililitry TSS do każdej płytki, aby zablokować trypsynizację, przenieś zawiesinę komórek do sterylnej 15-mililitrowej probówki. Odwirować w temperaturze 400 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odessać supernatant za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej. Następnie dodaj trzy mililitry DMEM do palety i ponownie ją zawiesij. Usunąć PBS z 60-milimetrowej płytki pokrytej żelatyną i umieścić w niej zawiesinę komórek.
Hoduj fibroblasty w stanie konfluencji przez okres do 21 dni. Po 21 dniach hodowli odessać pożywkę hodowlaną. Następnie opłucz płytki trzema mililitrami PBS.
Po zaessaniu PBS i dodaniu jednego mililitra roztworu decelularyzacyjnego obserwuj płytkę pod odwróconym mikroskopem kontrastowym. Po dwóch minutach delikatnie odpipetować cztery mililitry PBS, aby rozcieńczyć roztwór decelularyczny w płytkach. Odessać rozcieńczony roztwór, a następnie delikatnie spłukać płytki PBS.
Na koniec dodaj jeden mililitr PBS do talerzy. Płytki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Wyrastanie fibroblastów z małych fragmentów rodzimego mięśnia sercowego umieszczonych w hodowli obserwowano w ciągu trzech do pięciu dni.
Decelularyzacja spowodowała powstanie powłoki macierzy zewnątrzkomórkowej na powierzchni płytki. Skład i architektura wytworzonej in vitro macierzy zewnątrzkomórkowej serca została zachowana dzięki decelularyzacji.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje generowanie specyficznej dla serca macierzy pozakomórkowej (ECM) in vitro z wykorzystaniem fibroblastów pochodzących z dorosłego ludzkiego serca. Otrzymana ECM może służyć jako podłoże do badania oddziaływań między komórkami serca a macierzą pozakomórkową, co ma znaczenie dla bioinżynierii trójwymiarowych modeli tkanek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Inżynieria tkanki serca
- Interakcje komórka-macierz
- Materiały biomimetyczne
Wstęp
- Badanie odnosi się do braku modeli in vitro dla mikrośrodowisk serca.
- Zrozumienie oddziaływań między komórkami a macierzą jest kluczowe dla inżynierii tkankowej.
- Skład ECM znacząco wpływa na zachowanie komórek.
Zastosowane metody
- Izolacja i hodowla fibroblastów serca z ludzkiego mięśnia sercowego
- Techniki decelularyzacji w celu stworzenia ECM
- Zastosowanie różnych pożywek i warunków hodowli
Główne wyniki
- Fibroblasty skutecznie wyrosły z fragmentów mięśnia sercowego w ciągu kilku dni.
- Decelularyzacja pozwoliła na uzyskanie żywotnej ECM serca, która zachowała natywną architekturę.
- Badanie pomyślnie demonstruje metody produkcji ECM odpowiedniej do dalszych badań.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia metodę tworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) serca in vitro, która jest niezbędna do badania zachowań komórek serca.
- Otrzymane wyniki mają istotne znaczenie dla rozwoju inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Powtarzalna produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) serca z ludzkich fibroblastów dorosłego człowieka umożliwia tworzenie istotnych dla przebiegu chorób modeli in vitro do badań nad oddziaływaniami między komórkami a macierzą serca. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej inżynierii tkanki serca i zmniejsza ryzyko w badaniach translacyjnych, zapewniając fizjologicznie istotne podłoża. Metoda ta pozwala zespołom badawczo-rozwojowym na badanie mechanizmów zależnych od ECM, które leżą u podłoża zarówno prawidłowych, jak i patologicznych stanów mięśnia sercowego.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie odpowiedzi komórek serca na podłoża ECM przypominające naturalne środowisko.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie fizjologicznych i patologicznych warunków macierzy.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w badaniach nad biologią serca.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Zapewnia standaryzowane naczynia hodowlane pokryte ECM w celu uzyskania powtarzalnych analiz komórkowych.
- Zwiększa istotność analiz poprzez naśladowanie środowisk mikrosercowych in vivo.
- Umożliwia ilościową ocenę oddziaływań komórka-macierz w celu ewaluacji związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uspójnia modele in vitro z istotną dla choroby macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) serca w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera dostosowane do ryzyka opracowywanie biomimetycznych projektów rusztowań do inżynierii tkankowej.
- Ułatwia przedkliniczną ocenę strategii regeneracyjnych w kontrolowanym kontekście macierzy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda produkcji ECM wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając prowadzenie badań nad zachowaniem komórek serca na fizjologicznie istotnych podłożach w oparciu o postawione hipotezy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących wpływu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na funkcje i patologię komórek serca.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, istotne dla danej jednostki chorobowej podłoża do testów w celu oceny związków chemicznych i biomateriałów.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty oddziaływań między komórkami a macierzą na potrzeby badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane in vitro z przedkliniczną pracą nad rusztowaniami i terapiami regeneracyjnymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do powtórnego wykorzystania w badaniach nad ECM serca w ramach wielu programów badawczo-rozwojowych (R&D).
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad odpowiedzią komórek serca i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie podłoża ECM dla skalowalnych i powtarzalnych procesów roboczych.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektów z zakresu inżynierii tkanki serca i medycyny regeneracyjnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na biomateriały i terapie sercowe z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie izolacji i hodowli pierwotnych komórek serca.
- Wymagany jest dostęp do sterylnej infrastruktury do przetwarzania tkanek i decelularyzacji.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów produkcji ECM pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych modeli chorób serca lub źródeł dawców.
- Skład macierzy może się różnić w zależności od źródła fibroblastów i stanu in vivo, co wpływa na powtarzalność.
