Name: Produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej serca z fibroblastów dorosłego człowieka do powlekania naczyń hodowlanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj metodę produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej serca z fibroblastów dorosłego człowieka do powlekania naczyń hodowlanych. Technika ta umożliwia badanie interakcji komórkowych w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tkanki serca zostały pobrane od pacjentów ze schyłkową niewydolnością serca spowodowaną kardiopatią niedokrwienną, którzy przechodzili przeszczep serca. Wszystkie próbki użyte do eksperymentów zostały pobrane za zgodą pacjenta i bez identyfikatorów pacjenta, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez komisję etyczną Uniwersytetu Neapolitańskiego Fryderyka II i zgodnie z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej. Szczegółowe informacje na temat wszystkich odczynników i sprzętu użytego do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie do eksperymentu
<ol>
	<li>Przygotuj sterylne narzędzia/aparaty: jedną dużą parę nożyczek chirurgicznych, dwa zestawy cienkich kleszczy, dwie pary nożyczek do mikropreparacji, sterylną butelkę o pojemności 1 l, sterylną butelkę o pojemności 500 ml i sterylną butelkę o pojemności 250 ml.</li>
	<li>Dezynfekuj okulary nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm 70% etanolem przez kilka sekund. Odessać etanol za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, pozostawić szklanki nakrywkowe do wyschnięcia w suszarce w temperaturze 37 °C i wysterylizować je w autoklawie.</li>
	<li>Rozpuść dostępne w handlu sproszkowane sole w sterylnej, podwójnie destylowanej wodzie. W sterylnej butelce o pojemności 1 l dodaj 0,35 g wodorowęglanu sodu w proszku, aby przygotować 1 l zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) o pH 7,4. Wysterylizować roztwór za pomocą membran filtracyjnych 0,22 μm pod sterylnym kapturem i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Odważyć 0,1 g jednozasadowego fosforanu potasu, 4,0 g chlorku sodu, 0,1 g chlorku potasu i 0,575 g dwuzasadowego fosforanu sodu, aby przygotować 500 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Rozpuścić składniki w sterylnej, podwójnie destylowanej wodzie, a następnie sprawdzić wartość pH (7.4). Sterylizować pod sterylnym kapturem przez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Dodać 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 45 ml HBSS, aby przygotować końcową objętość 50 ml roztworu zatrzymującego trypsynę (TSS). Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Odmierz 223,75 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 25 ml FBS (stężenie końcowe, 10%) i dodaj 1,25 ml roztworu penicyliny i streptomycyny (długopis/paciorkowiec, stężenie końcowe, 0,5%), aby przygotować DMEM do izolacji fibroblastów i hodowli. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotować 0,2% (w/v) roztwór żelatyny, dodając 0,2 g żelatyny ze skóry świń w proszku do 100 ml PBS. 
	UWAGA: Składniki i odpowiednie stężenia dla każdego roztworu użytego w badaniu podano w Tabeli 1.</li>
</ol>
2. Prymitywna hodowla ludzkich fibroblastów serca przez wyrostek z fragmentów mięśnia sercowego przedsionków
UWAGI: Kroki 2.2-2.3 powinny być wykonywane w sterylnych warunkach. Protokół jest walidowany dla próbek przedsionków o średnicy około 0,3 cm, co jest typowym wymiarem dla próbek biopsyjnych i pozwala na izolację około 2 x 106 fibroblastów.
<ol>
	<li>Świeżo uzyskaną próbkę przedsionka umyć w szklanej płytce o średnicy 100 mm sterylnym HBSS, delikatnie potrząsając nią w celu usunięcia krwi. Powtórz ten krok trzy razy, zmieniając HBSS i płytkę przy każdym praniu.</li>
	<li>Umieścić próbkę na płytce o średnicy 100 mm, uprzednio zwilżonej niewielką objętością HBSS i drobno posiekać skrzyżowanymi skalpelami w kostkę o średnicy około 2 mm.</li>
	<li>Umieść cztery małe fragmenty mięśnia sercowego na płytce o średnicy 35 mm, wystarczająco blisko, aby leżały w przybliżeniu pod kątami szkła nakrywkowego o wymiarach 22 mm x 22 mm, umieść sterylne szkło nakrywkowe na fragmentach, delikatnie dociśnij i dodaj 1,5 ml DMEM.</li>
	<li>Inkubować płytki hodowlane w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez około 15 dni lub do momentu, gdy komórki osiągną 85% konfluencji, codziennie sprawdzając wzrost komórek pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym i zmieniając pożywkę co 3 dni.</li>
</ol>
3. Subkultura ludzkich fibroblastów sercowych przez ciepłą trypsynizację
UWAGI: Opisane poniżej kroki muszą być wykonywane w sterylnych warunkach. Ponieważ fibroblasty mogą migrować z eksplantowanej tkanki wzdłuż powierzchni szkła nakrywkowego i płytki hodowlanej, zaleca się przetworzenie obu tych elementów w przypadku pierwszej subkultury.
<ol>
	<li>Podnieś szklankę nakrywkową za pomocą cienkich, sterylnych szczypiec, umieść ją do góry nogami na nowej płytce 35 mm i spłucz sterylnym PBS.</li>
	<li>Usunąć fragmenty mięśnia sercowego, wyrzucić je i przepłukać płytkę o średnicy 35 mm z wyrosłymi komórkami sterylnym PBS.</li>
	<li>Wyrzuć płukankę i dodaj 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) do każdej płytki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Potwierdź odłączenie komórek pod mikroskopem. Komórki powinny być całkowicie zaokrąglone i oderwane, tworząc małe grudki.</li>
	<li>Zablokować trypsynizację przez dodanie 2 ml TSS do każdej płytki o średnicy 35 mm i zebrać zawiesinę do sterylnej probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, ponownie zawiesić osad w 3 ml DMEM i umieścić zawiesinę komórek na płytce o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Tak uzyskane komórki inkubować w subkulturze 1 (lub pasażu 1) w 3 ml DMEM w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , zmieniając pożywkę co trzy dni, aż komórki osiągną 75% konfluencji.</li>
	<li>Subkulturuj fibroblasty, które osiągnęły 75% konfluencji, powtarzając ciepłą trypsynizację i dzieląc komórki 1:3 na nowe płytki o średnicy 60 mm do dwóch razy (pasaże 2 i 3).</li>
</ol>
4. Osadzanie się macierzy zewnątrzkomórkowej
<ol>
	<li>Przygotować naczynia pokryte żelatyną, dodając 3 ml sterylnego 0,2% roztworu żelatyny do każdej płytki o średnicy 60 mm i inkubując w temperaturze 37 °C przez 2 godziny; następnie odessać roztwór i dodać 3 ml sterylnego PBS do czasu użycia.</li>
	<li>Oderwij fibroblasty serca przez ciepłą trypsynizację i posadź je w dużej gęstości (15 x 10,3 komórki nacm2) na płytkach pokrytych żelatyną o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Hodowla fibroblastów w stanie zlewania się przez okres do 21 dni, co pozwala na syntezę i odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej. Zastępuj 50% pożywki świeżą pożywką co 3 dni.</li>
</ol>
5. Decelularyzacja macierzy zewnątrzkomórkowej
UWAGA: Kroki 5.3-5.4 powinny być wykonywane z delikatnym potrząsaniem, aby usunąć tylko komórki, bez odłączania macierzy zewnątrzkomórkowej.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór decelularyczny zawierający 0,25% Triton X-100 i 10 mM NH4OH w PBS (obliczyć końcową objętość, biorąc pod uwagę 1 ml na każdą płytkę 60 mm).</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i przepłukać płytki PBS. Wyrzuć płukanie.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu do decelularyzacji i obserwować płytki pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym; po 1-2 minutach, gdy komórki nie są już dostrzegalne, delikatnie dodać 4 ml PBS, aby rozcieńczyć roztwór decelularyzacyjny.</li>
	<li>Usunąć rozcieńczony roztwór i delikatnie przepłukać płytki PBS; wyrzucić płukanie.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS i przechowywać płytki pokryte ECM w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>

Generation of Myocardium-Mimicking Extra Cellular Matrix for Cell Culture

<ol><li>Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+A+dynamic+microenvironment+for+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+extracellular+matrix+coatings+for+the+promotion+of+cell+proliferation+and+maintenance+of+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype.</a> Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).</li>
<li>Xing, H., Lee, H., Luo, L., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-derived+biomaterials+in+engineering+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-derived biomaterials in engineering cell function.</a> Biotechnol Adv. 42, 107421(2020).</li>
<li>Andrés-Delgado, L., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+cardiac+function+and+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Interplay between cardiac function and heart development.</a> Biochim Biophys Acta. 1863 (7), Pt B 1707-1716 (2016).</li>
<li>Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+relationship+between+cardiac+fibroblasts+and+cardiomyocytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease.</a> J Am Heart Assoc. 10 (5), e019338(2021).</li>
<li>Castaldo, C., Chimenti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cells%3A+The+matrix+has+you%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cells: The matrix has you.</a> Stem Cells Transl Med. 7, 506-510 (2018).</li>
<li>Nurzynska, D., Iruegas, M. E., Castaldo, C., Müller-Best, P., Di Meglio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+biotechnology+in+myocardial+regeneration-tissue+engineering+triad%3A+cells%2C+scaffolds%2C+and+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Application of biotechnology in myocardial regeneration-tissue engineering triad: cells, scaffolds, and signaling molecules.</a> Biomed Res Int. 2013, 236893(2013).</li>
<li>Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration+after+myocardial+infarction%3A+An+approachable+goal%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Cardiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration after myocardial infarction: An approachable goal.</a> Curr Cardiol Rep. 22 (10), 122(2020).</li>
<li>Spedicati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+design+of+bioartificial+scaffolds+for+the+in+vitro+modeling+of+human+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biomimetic design of bioartificial scaffolds for the in vitro modeling of human cardiac fibrosis.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 983782(2022).</li>
<li>Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblast%3A+The+renaissance+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblast: The renaissance cell.</a> Circ Res. 105 (12), 1164-1176 (2009).</li>
<li>Castaldo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblast-derived+extracellular+matrix+%28biomatrix%29+as+a+model+for+the+studies+of+cardiac+primitive+cell+biological+properties+in+normal+and+pathological+adult+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblast-derived extracellular matrix (biomatrix) as a model for the studies of cardiac primitive cell biological properties in normal and pathological adult human heart.</a> Biomed Res Int. 2013, 352370(2013).</li>
<li>Nurzynska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+produced+cardiac+extracellular+matrix+for+studies+of+myocardium+regeneration+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vitro produced cardiac extracellular matrix for studies of myocardium regeneration potential.</a> Tissue Eng Part A. 21, 77(2015).</li>
<li>VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+ECM%3A+A+biosynthetic+extracellular+matrix+for+cardiomyocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Cardiac ECM: A biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 478-485 (1996).</li>
<li>Santhakumar, R., Vidyasekar, P., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+ECM%3A+A+nano-matrix+scaffold+with+potential+application+in+cardiac+regeneration+using+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac ECM: A nano-matrix scaffold with potential application in cardiac regeneration using mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 9 (12), e114697(2014).</li>
<li>Gopal, S., Multhaupt, H. A. B., Couchman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+cell-extracellular+matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium in cell-extracellular matrix interactions.</a> Adv Exp Med Biol. 1131, 1079-1102 (2020).</li>
<li>Hellewell, A. L., Rosini, S., Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid%2C+scalable+method+for+the+isolation%2C+functional+study%2C+and+analysis+of+cell-derived+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Rapid, scalable method for the isolation, functional study, and analysis of cell-derived extracellular matrix.</a> J Vis Exp. (119), e55051(2017).</li>
<li>Nurzynska, D., Di Meglio, F., Montagnani, S., Castaldo, C. Cardiac stem cells derived from epithelial-mesenchymal transition of epicardial cells: role in heart regeneration (method). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNurzynska%2C+D+%22Stem+Cells+and+Cancer+Stem+Cells%2C+vol.+5%3A+Therapeutic+Applications+in+Disease+and+Injury%22">Stem Cells and Cancer Stem Cells, vol. 5: Therapeutic Applications in Disease and Injury</a>. Hayat, M. A. , Springer. New York. 109-115 (2012).</li>
<li>Pagano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+versus+pathological+cardiac+fibroblast-derived+extracellular+matrix+differentially+modulates+cardiosphere-derived+cell+paracrine+properties+and+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Normal versus pathological cardiac fibroblast-derived extracellular matrix differentially modulates cardiosphere-derived cell paracrine properties and commitment.</a> Stem Cells Int. 2017, 7396462(2017).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+regulates+the+profibrotic+activity+of+fibroblasts+in+in+vitro+replica+settings+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Vitamin C regulates the profibrotic activity of fibroblasts in in vitro replica settings of myocardial infarction.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 8379(2023).</li>
<li>Jaffré, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+and+angiotensin+receptors+in+cardiac+fibroblasts+coregulate+adrenergic-dependent+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Serotonin and angiotensin receptors in cardiac fibroblasts coregulate adrenergic-dependent cardiac hypertrophy.</a> Circ Res. 104 (1), 113-123 (2009).</li>
<li>Błyszczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+cardiac+fibroblasts+control+contraction+of+human+fibrotic+cardiac+microtissues+by+a+%CE%B2-adrenoreceptor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Activated cardiac fibroblasts control contraction of human fibrotic cardiac microtissues by a β-adrenoreceptor-dependent mechanism.</a> Cells. 9 (5), 1270(2020).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiol. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Ungerleider, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+characterization+of+injectable+hydrogels+derived+from+decellularized+skeletal+and+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle.</a> Methods. 84, 53-59 (2015).</li>
<li>Seo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+heart+ECM+hydrogel+using+supercritical+carbon+dioxide+for+improved+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Decellularized heart ECM hydrogel using supercritical carbon dioxide for improved angiogenesis.</a> Acta Biomater. 67, 270-281 (2018).</li>
<li>Liguori, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biomechanical+clues+from+cardiac+tissue+decellularized+extracellular+matrix+drive+stromal+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Molecular and biomechanical clues from cardiac tissue decellularized extracellular matrix drive stromal cell plasticity.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 520(2020).</li>
<li>Silva, A. C., Pereira, C., Fonseca, A. C. R. G., Pinto-do-Ó, P., Nascimento, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bearing+my+heart%3A+The+role+of+extracellular+matrix+on+cardiac+development%2C+homeostasis%2C+and+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Bearing my heart: The role of extracellular matrix on cardiac development, homeostasis, and injury response.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 621644(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Fibroblasty wyizolowane z próbek ludzkiego serca hodowano do konfluencji przez 21 dni w celu syntezy i zdeponowania macierzy zewnątrzkomórkowej, tworząc spójną warstwę mocno przylegającą do powierzchni płytki hodowlanej. Późniejsze usunięcie fibroblastów serca, przy jednoczesnym zachowaniu zdeponowanego ECM serca, stworzyło substrat do badania wpływu macierzy zewnątrzkomórkowej specyficznej dla mięśnia sercowego na inne komórki w tkance serca.
Koncepcja wykorzystania naturalnego i specyficznego tkankowo substratu do hodowli komórek in vitro wzbudziła zainteresowanie biologów, co doprowadziło do kilku prób opracowania takiego substratu przy użyciu fibroblastów wyizolowanych z serc noworodków. Już w 1996 roku Vanwinkle i wsp.13 wykorzystali fibroblasty serca nowonarodzonych szczurów do wytworzenia powłoki macierzy zewnątrzkomórkowej na szklanych szkiełkach nakrywkowych przy użyciu EDTA, czynnika chelatującego wapń, do separacji komórek. Ostatnio EDTA został zastosowany w połączeniu z podstawowym roztworem Triton X-100 w niższych stężeniach14. Jony wapnia pośredniczą w interakcjach między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową, a także między różnymi cząsteczkami macierzy zewnątrzkomórkowej15. Jednak stosowanie takich czynników chelatujących może prowadzić do rozwijania się białka macierzy i utraty interakcji między jego różnymi składnikami fibrylarnymi i amorficznymi, nieuchronnie modyfikując ECM serca uzyskane in vitro. Z naszego doświadczenia wynika, że inkubacja z 0,5 mM EDTA wymagała długiego czasu, a pierwsze oznaki oderwania komórek obserwowane w mikroskopie z odwróconym kontrastem fazowym pojawiły się dopiero po 2 godzinach.
Podobna metoda decelularyzacji in vitro została opublikowana przez Hellewell i wsp.16 Jednak w niniejszym protokole zastosowano niższe stężenie wodorotlenku amonu (10 mM zamiast 20 mM), a jako środek decelularyczny dodano Triton X-100. Podczas gdy autorzy wspomnianego protokołu przetestowali jego zastosowanie w trzech dostępnych na rynku typach komórek, prymitywne fibroblasty serca nie zostały uwzględnione. Biorąc pod uwagę długotrwałe trudności w uzyskaniu i hodowli dorosłych ludzkich kardiomiocytów lub fibroblastów serca in vitro, skupiono się tutaj na tkance i komórkach serca, które są głównym przedmiotem zainteresowania grup badawczych zajmujących się układem sercowo-naczyniowym i ogólnie medycyną regeneracyjną układu krążenia. Możliwe, że to rozwiązanie może być odpowiednie również dla innych typów komórek.
Podczas gdy denaturacja jest niezbędna do solubilizacji białek, zastosowanie niedenaturującego środka decelularyzacyjnego jest niezbędne do ilościowego i jakościowego zachowania składników macierzy zewnątrzkomórkowej do dalszego wykorzystania in vitro . Dlatego Triton X-100 został użyty zamiast SDS do usunięcia fibroblastów, pozostawiając nienaruszoną powłokę ECM serca na powierzchni szalki Petriego. Inkubacja z podstawowym roztworem Triton X-100 indukuje przepuszczalność błony i lizę komórek, w wyniku czego dochodzi do usunięcia fibroblastów. Jeśli problemem są szczątki jądrowe (na przykład, gdy kolejne eksperymenty wymagają transfekcji komórek lub analizy molekularnej kwasów nukleinowych), możliwe jest zminimalizowanie zawartości DNA za pomocą DNazy I przed wysiewem innych typów komórek na ECM serca.
Najważniejszą zaletą opisanej tu metody jest możliwość uzyskania ECM serca typowego dla różnych schorzeń związanych ze strukturą i funkcją ludzkiego serca, ponieważ te same fibroblasty pod wpływem tych zmieniających się warunków in vivo deponują macierz zewnątrzkomórkową in vitro. W ten sposób skład powłoki pochodzącej z fibroblastów szalki hodowlanej zmienia się w zależności od aktywności in vivo fibroblastów wyizolowanych z serca, co pozwala na późniejsze badania interakcji funkcjonalnych komórka-macierz w różnych normalnych i patologicznych warunkach17,18.
Chociaż kuszące może być stymulowanie aktywności fibroblastów in vitro poprzez dodanie kwasu askorbinowego, o którym wiadomo, że stymuluje produkcję kolagenu i glikozaminoglikanów, taka selektywna stymulacja jest odradzana, ponieważ może potencjalnie zmodyfikować skład uzyskanego ECM serca w kierunku fenotypu zwłóknieniowego19. Zamiast tego, w zależności od celu badania, na skład ECM serca może wpływać in vitro poprzez dodanie takich czynników, jak peptydy angiotensyny lub adrenalina20,21, o których wiadomo, że odgrywają kluczową rolę w patogenezie i patofizjologii określonych zaburzeń sercowo-naczyniowych.
Krytycznym etapem procesu osadzania macierzy zewnątrzkomórkowej, po którym następuje usunięcie warstwy fibroblastów z hodowli, jest adhezja i zachowanie macierzy pochodzącej z fibroblastów osadzonej na powierzchni naczynia. W przeciwieństwie do wcześniej omówionych badań, w których fibroblasty noworodków były hodowane tylko przez kilka dni, fibroblasty serca dorosłego człowieka przeżywają w hodowli w stanie zlewania się nawet przez 21 dni, stale syntetyzując i wydzielając macierz zewnątrzkomórkową. Niezbędne jest stosowanie naczyń hodowlanych pokrytych żelatyną i wizualna kontrola odrywania fibroblastów, skracając czas inkubacji w roztworze decelularyzacyjnym do niezbędnego minimum.
W niniejszym protokole opisano wykonalną metodę otrzymywania macierzy zewnątrzkomórkowej serca in vitro. System monowarstwowy 2D odzwierciedla mikrośrodowisko in vivo dzięki obecności natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej wytwarzanej przez te same komórki, które są odpowiedzialne za syntezę i utrzymanie macierzy zewnątrzkomórkowej, a mianowicie fibroblasty, których skład zależy od sygnałów biologicznych obecnych in vivo. Inne biomimetyczne i trójwymiarowe substraty lub systemy hodowli komórkowych, takie jak hydrożele, sferoidy, organoidy i metody biodruku 3D, przyciągnęły znaczną uwagę jako strategia naśladowania warunków in vivo, umożliwiając badanie złożonych przestrzennych interakcji komórka-komórka i komórka-ECM22,23. Podejścia te odnoszą się do przestrzennych i biomechanicznych wskazówek dotyczących wzrostu i różnicowania komórek in vitro 24,25, ale mają silne ograniczenia w odniesieniu do składu i cech wytworzonych substratów, które prawie nie przypominają tych z tkanki natywnej. W zależności od zakresu badania i jego zastosowań można zastosować rusztowania biomimetyczne 2D cardiac ECM lub biomimetyczne 3D, które razem stanowią komplementarną metodę poszerzania obecnej wiedzy z zakresu biologii komórki i możliwości regeneracji tkanek.
Ograniczenia Opisana metoda podlega pewnym ograniczeniom, w szczególności dotyczącym procesu decelularyzacji mającego na celu eliminację elementów komórkowych. Proces ten mógłby nieumyślnie zakłócić naturalną architekturę lub skład ECM. Jednak ECM uzyskany z prawidłowych i patologicznych fibroblastów pochodzących z serca w różny sposób wpływa na proliferację, apoptozę i migrację hodowanych komórek11,18, co wskazuje, że opisana metoda zachowuje przynajmniej główne determinanty tych procesów biologicznych.
Podobnie ECM serca uzyskane od różnych dawców może mieć różny skład, nawet jeśli główna patologia serca jest taka sama. Podobnie jak w przypadku wszystkich próbek pobranych od ludzi, istnieje duża zmienność wynikająca m.in. z czynników środowiskowych, uwarunkowań genetycznych, terapii farmakologicznych lub innych26. Nie zawsze należy oczekiwać, że ECM serca uzyskany opisaną metodą będzie miał taki sam skład i charakterystykę. Jeśli odtwarzalność jakościowa jest niezbędna, warto rozważyć dwukrotne rozszerzenie izolowanych fibroblastów (zgodnie z opisem w niniejszym protokole) w celu wytworzenia ECM na wielu szalkach Petriego lub wykorzystanie fibroblastów uzyskanych od różnych dawców na tej samej szalce Petriego do produkcji ECM.

Wszystkie komórki znajdują się in vivo w wyspecjalizowanym mikrośrodowisku, w którym mogą przetrwać i realizować swoje specyficzne funkcje. W obrębie danej tkanki komórki są otoczone macierzą zewnątrzkomórkową złożoną z białek fibrylarnych i niefibrylarnych oraz podstawowych substancji bogatych w glikozaminoglikany1. Jakościowe i ilościowe zmiany w zawartości matrycy wpływają na biologię komórki, kontrolując procesy takie jak proliferacja komórek, apoptoza, migracja czy różnicowanie. W związku z tym podejmowane są wysiłki na rzecz odtworzenia tego mikrośrodowiska do badań in vitro komórek z różnych tkanek2,3.
Mięsień sercowy składa się z kardiomiocytów i jeszcze większej ilości fibroblastów, które odgrywają kluczową rolę w produkcji i utrzymaniu macierzy zewnątrzkomórkowej w mięśniu sercowym4. Przez całe życie skład macierzy zewnątrzkomórkowej może się zmieniać w odpowiedzi na różne normalne i patologiczne czynniki. Te modyfikacje w składzie macierzy zewnątrzkomórkowej mają znaczący wpływ na strukturę i charakterystykę biomechaniczną mięśnia sercowego5. W związku z tym korzystne dla zrozumienia interakcji komórka-macierz w ludzkim mięśniu sercowym powinno być odtworzenie mikrośrodowiska specyficznego dla różnych grup wiekowych lub stanów patologicznych in vitro6,7.
Opisana tutaj metoda ma na celu uzyskanie substratu do hodowli komórek serca in vitro (określanego jako ECM serca), naśladując macierz zewnątrzkomórkową mięśnia sercowego in vivo.
Badania sercowo-naczyniowe stawiają szczególne wyzwania, w tym trudności w pozyskiwaniu próbek od żywych dawców lub pacjentów oraz hodowli ludzkich komórek serca8. Przedstawiona metoda odpowiada na te wyzwania, umożliwiając pozyskiwanie fibroblastów serca nawet z małych bioptycznych fragmentów ludzkiego mięśnia sercowego i hodowlę izolowanych komórek serca in vitro na ich natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej typowej dla ludzkiego mięśnia sercowego.
Podczas gdy obecne wysiłki skupiają się na tworzeniu rusztowań 3D z biosztucznych syntetycznych lub naturalnych polimerów, które naśladują biomechaniczne właściwości normalnego mięśnia sercowego9, pomijają interakcje komórka-matryca i sygnalizację, które występują zarówno w normalnych, jak i patologicznych warunkach. Ponieważ ECM serca jest syntetyzowany przez fibroblasty serca pochodzące z ludzkiego serca, jego skład jest determinowany przez aktywność tych komórek, która zmienia się w odpowiedzi na różne stany fizjologiczne i patologiczne, co pozwala na badanie jego specyficznego wpływu na biologię komórki serca10.
Obecny protokół został specjalnie zaprojektowany dla ludzkiej tkanki sercowej, ale jego naukowe podstawy powinny również dotyczyć innych narządów, zwłaszcza tych o niskim potencjale regeneracji, intensywnym zwłóknieniu i bliznowaceniu wpływającym na ogólną strukturę i funkcję, a także ograniczonej liczbie i rozmiarach próbek.

<table><tbody><tr><td>Butelka laboratoryjna 1 L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td>Wyczyść i autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>10 ml pipety serologicznej</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>Sterylne,&nbsp; polistyren</td></tr><tr><td>100 mm szklana płyta&nbsp;</td><td>VWR</td><td>391-0578</td><td>Wyczyść i autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Płytki 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Traktowane, sterylne naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>15 ml sterylne probówki</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Wirówka sterylna, polipropylen</td></tr><tr><td>22 mm x 22 mm szkła nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>631-1570</td><td>Autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Falcon</td><td>357525</td><td>sterylna, &nbsp; </td></tr><tr><td>butelka laboratoryjna z polistyrenu 250 ml&nbsp;</td><td>VWR</td><td>215-1593</td><td>Wyczyść i autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Płytki 35 mm</td><td></td><td></td><td>Falcon 353001 Przetworzone, sterylne naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Pipta serologiczna 5 ml</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td>Sterylne, polistyrenowe</td></tr><tr><td>sterylne probówki 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>Sterylne probówki do wirówek, polipropylen</td></tr><tr><td>500 ml butelka laboratoryjna</td><td>VWR</td><td>215-1594</td><td>Czyste i autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Płytki 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>Poddane obróbce, sterylne naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu (NH4OH)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>338818</td><td>Liquid</td></tr><tr><td>Jednorazowe skalpele</td><td>VWR</td><td>233-5526</td><td>Sterylne i jednorazowe</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>D6429-500ml</td><td>Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C; unikać ekspozycji na światło</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>F9665-500ml</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Surowicę należy podzielić na mniejsze objętości robocze</td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>VWR</td><td>232-1317</td><td>Oczyść i autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Komercyjny proszek</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1387-1L</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Duże nożyczki chirurgiczne</td><td>VWR</td><td>233-1211</td><td>Czysty i autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikroanalizacji&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S3146</td><td>Oczyść i autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4333-100ml</td><td>Przechowywać w temperaturze -20& stopni C. Rozwiązanie&nbsp; należy podzielić na mniejsze objętości robocze</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P9333</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Fosforan potasu Monobasic</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P5665</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu w proszku&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dwuzasadowy fosforan sodu</td><td>w proszku Sigma- Aldrich</td><td>94046</td><td></td></tr><tr><td>Filtry stericup</td> w proszku <td>Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td>Sterylne i jednorazowe membrany filtracyjne 0,22 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Płynna</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T4049-100ml</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Powinien być podzielony na mniejsze objętości robocze</td></tr></tbody></table>

produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej serca z fibroblastów dorosłego człowieka do powlekania naczyń hodowlanych

Production of Cardiac Extracellular Matrix from Adult Human Fibroblasts for Culture Dish Coating

Mięsień sercowy składa się z kardiomiocytów i jeszcze większej liczby fibroblastów, które są odpowiedzialne za produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej. Od wczesnych etapów rozwoju serca przez całe życie, zarówno w warunkach normalnych, jak i patologicznych, skład macierzy zewnątrzkomórkowej zmienia się i wpływa na strukturę i funkcję mięśnia sercowego. Celem opisanej metody jest uzyskanie substratu do hodowli komórek serca in vitro (określanej jako ECM serca), naśladującego macierz zewnątrzkomórkową mięśnia sercowego in vivo. W tym celu fibroblasty wyizolowane z serca dorosłego człowieka wyhodowano tak, aby zbiegały się na naczyniach pokrytych żelatyną, aby wytworzyć specyficzną dla mięśnia sercowego macierz zewnątrzkomórkową. Późniejsze usunięcie fibroblastów serca, przy jednoczesnym zachowaniu zdeponowanego ECM serca, wytworzyło substrat do badania wpływu macierzy zewnątrzkomórkowej specyficznej dla mięśnia sercowego na inne komórki. Co ważne, skład powłoki pochodzącej z fibroblastów szalki hodowlanej zmienia się w zależności od aktywności in vivo fibroblastów wyizolowanych z serca, co pozwala na późniejsze badania interakcji komórka-macierz w różnych normalnych i patologicznych warunkach.

Wzrost fibroblastów z małych fragmentów natywnego mięśnia sercowego umieszczonych w hodowli zaobserwowano w ciągu 3-5 dni (Rysunek 1).
W kolejnych dniach liczba fibroblastów nadal rosła, co prawdopodobnie wynikało z utrzymującego się wypływu komórek z próbki tkanki serca oraz proliferacji zmigrowanych fibroblastów na powierzchni naczynia. Nie należy oczekiwać, że wszystkie fragmenty mięśnia sercowego uzyskane poprzez mechaniczną dysaggregację skalpelem dostarczą tej samej liczby fibroblastów w tym samym czasie, ponieważ powstałe fragmenty tkanki mogą mieć nieco różną objętość i różny stopień przeżywalności komórek. Co istotne, fragmenty mięśnia sercowego z potwierdzoną aktywnością wypływu komórek mogą zostać zachowane i ponownie wysiane, co pozwala na co najmniej dwukrotne wykorzystanie ich do izolacji fibroblastów.
Fibroblasty można poddawać subkulturacji przez kilka pasaży, aby zwiększyć liczbę komórek dostępnych do dalszych eksperymentów. Jednak po osiągnięciu konfluencji fibroblasty przestają proliferować in vitro i przechodzą w fazę aktywności syntetycznej i wydzielniczej, odkładając macierz zewnątrzkomórkową. Następcza decelularyzacja pozostawia powierzchnię płytki pokrytą siatką ECM serca (Rysunek 2). Podczas usuwania fibroblastów niezbędna jest obserwacja szalki hodowlanej gołym okiem oraz za pomocą odwróconego mikroskopu fazokontrastowego, aby zminimalizować czas inkubacji w roztworze do decelularyzacji do niezbędnego i wystarczającego minimum. Pojawienie się pływającej błony podczas inkubacji wskazuje na permeabilizację i odrywanie się monowarstwy fibroblastów; w takim przypadku roztwór do decelularyzacji należy rozcieńczyć i niezwłocznie usunąć.
Skład pochodzącej z fibroblastów macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) serca zależy od źródła fibroblastów. W naszych eksperymentach ECM serca produkowana przez fibroblasty wyizolowane z prawidłowych ludzkich serc oraz z ludzkich serc z kardiopatią niedokrwienną posiadała różną zawartość białek i wywierała odmienny wpływ na proliferację, apoptozę i migrację prymitywnych komórek serca11,12. Chociaż utrata białek ECM jest nieunikniona podczas procesu decelularyzacji, metoda zastosowana w niniejszym protokole w dużym stopniu zachowała skład i architekturę ECM serca wytworzonej in vitro (Rysunek 3).
W niniejszym protokole wykorzystano tkankę przedsionkową, ponieważ można ją pozyskać zarówno z serc zdrowych (dawcy), jak i patologicznych (biorcy). Choć całe serce patologiczne (biorcy) można pociąć na sekcje i wykorzystać do badań (zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej i za zgodą lokalnej komisji etycznej), w momencie transplantacji nie ma możliwości pobrania próbek komór z serca dawcy. Z tego powodu, jeśli celem badania jest analiza różnic między tkanką serca w warunkach prawidłowych i patologicznych, najlepszym źródłem próbek jest ściana przedsionka. W zależności od dostępności innych żywotnych źródeł tkanki serca, do powlekania szalek macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) serca można, stosując ten sam protokół, wykorzystać próbki ze ścian przedsionków lub komór serc zdrowych lub patologicznych.
<img alt="Fazy wzrostu hodowli komórkowych pod mikroskopem; skala 200 μm; analiza mikroskopowa; wyniki eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Izolacja fibroblastów serca. Wzrost fibroblastów z fragmentów mięśnia sercowego po 4 dniach (A), 8 dniach (B) i 12 dniach (C) hodowli. Paski skali: 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zmiany morfologii komórek, obrazy mikroskopowe, badanie hodowli, skala 200μm, analiza eksperymentalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Decelularyzacja macierzy zewnątrzkomórkowej. Fibroblasty po około 10 s (A), 20 s (B), 30 s (C), 40 s (D), 50 s (E) i 60 s (F) inkubacji w roztworze do decelularyzacji. Paski skali: 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej struktur komórkowych wykazujące filamenty aktynowe; barwienie czerwone i niebieskie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Skład macierzy pozakomórkowej przed i po decelularyzacji. Pośrednie barwienie immunofluorescencyjne reprezentatywnych białek macierzy pozakomórkowej serca, w tym kolagenu typu III (A,E) i typu IV (B,F), lamininy (C,G) oraz fibronektyny (D,H), przed (A-D) i po (E-H) usunięciu fibroblastów. Jądra komórkowe zabarwiono DAPI (niebieski). Paski skali: (A-C,E-G) 50 µm; (D,H) 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwory</td>
			<td colspan="2">Skład roztworów </td>
			<td>Objętość końcowa</td>
			<td>Komentarze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td>
			<td colspan="2">Sole dostępne w handlu + sterylna woda dwukrotnie destylowana + 0,35 g wodorowęglanu sodu</td>
			<td>1 L</td>
			<td>Sterylizowane przez filtrację/przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór do decelularyzacji</td>
			<td colspan="2">0,25% Triton X-100 + 10 mM NH4Cl4PBS z dodatkiem OH+</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>Sterylizowane przez filtrację/przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td>
			<td colspan="2">223,75 mL DMEM + 25 mL płodowej surowicy bydlęcej + 1,25 mL roztworu penicyliny/streptomycyny</td>
			<td>250 ml</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór żelatyny </td>
			<td colspan="2">0,2 g żelatyny w proszku + 100 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) </td>
			<td>100 ml</td>
			<td>Sterylizowano przez filtrację/przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor fosforanowo-solny (1x PBS)</td>
			<td colspan="2">0,1 g fosforanu potasu(I) jednowodnego + 0,1 g chlorku potasu + 4,0 g chlorku sodu + 0,575 g fosforanu sodu(II) dwuwodnego + sterylna woda dwukrotnie destylowana</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>Sterylizować przez filtrację/przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór hamujący trypsynę (TSS)</td>
			<td colspan="2">5 ml płodowej surowicy bydlęcej + 45 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Składniki i odpowiednie stężenia dla każdego roztworu wykorzystanego w badaniu.

Fibroblasty wyizolowane z serca dorosłego człowieka zostały wyhodowane do zbiegu na naczyniach pokrytych żelatyną, aby wytworzyć specyficzną dla mięśnia sercowego matrycę zewnątrzkomórkową. Po decelularyzacji substrat ten może być wykorzystany do hodowli i badania innych komórek serca oraz interakcji komórka-macierz.

Produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej serca z fibroblastów dorosłego człowieka do powlekania naczyń hodowlanych

The myocardium is composed of cardiomyocytes and an even greater number of fibroblasts, the latter being responsible for extracellular matrix production. ...

W protokole opisujemy wykonalną metodę uzyskania macierzy zewnątrzkomórkowej serca in vitro jako substratu do badania tych samych interakcji macierzowych i wpływu macierzy zewnątrzkomórkowej specyficznej dla mięśnia sercowego na komórki serca. Obecne badania sojuszu koncentrują się na rozwoju bioinżynieryjnych trójwymiarowych podpór wykonanych z materiałów biomimetycznych, które mogą być wysiewane z komórek. Wydaje się, że materiał ten dostarcza biomechanicznych i specjalnych wskazówek dla komórek.Skład macierzy zewnątrzkomórkowej ma głęboki wpływ na komórki, ponieważ zachodzi dwukierunkowe połączenie znakowe, co prowadzi do ciągłych modyfikacji zarówno składu macierzy, jak i zachowania komórek. Brakuje modeli in vitro odtwarzających mikrośrodowisko serca typowe dla stanów fizjologicznych lub patologicznych. Lepsze zrozumienie interakcji macierzy komórkowej dzięki możliwości ich odtworzenia in vitro może znacznie poprawić projektowanie rusztowań biomimetycznych do inżynierii tkankowej i regeneracji.Na początek umyj świeżą próbkę ludzkiego przedsionka na 100-milimetrowej szklanej płytce zawierającej sterylny HBSS. Delikatnie wstrząsnąć próbkami w płytce, aby usunąć resztki krwi. Przenieść próbkę na 100-milimetrową płytkę zwilżoną niewielką objętością HBSS.Za pomocą skrzyżowanych skalpeli posiekaj próbkę w dwumilimetrową kostkę. Następnie przenieś cztery małe fragmenty mięśnia sercowego na 35-milimetrową płytkę. Umieść sterylną szklankę nakrywkową na fragmentach i delikatnie dociśnij.Odpipetować 1,5 mililitra DMEM do płytki. Następnie inkubuj płytki hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenkiem węgla. Gdy kultury osiągną 85% zbieżności, wyjmij płytkę z inkubatora i użyj sterylnych kleszczy, aby podnieść szkło nakrywkowe.Następnie połóż go do góry nogami na nowej 35-milimetrowej płytce. Następnie dodaj sterylny PBS, aby go wypłukać. Teraz usuń fragmenty mięśnia sercowego, a następnie odpipetuj DMEM z płytki.Użyć sterylnego PBS, aby przepłukać płytkę zawierającą wyrośnięte komórki. Po wyrzuceniu płukania dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny-EDTA do każdej płytki i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez pięć minut. Po inkubacji wyjąć płytki z inkubatora i za pomocą mikroskopu potwierdzić oderwanie komórek.Następnie dodaj dwa mililitry roztworu zatrzymującego trypsynę lub TSS do każdej płytki, aby zablokować trypsynizację. Przenieś zawiesinę komórek do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować w temperaturze 400 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odessać supernatant za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej. Następnie dodaj trzy mililitry DMEM do palety i ponownie ją zawiesij. Umieść zawiesinę komórek na 60-milimetrowej płytce.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenkiem węgla. Następnie odpipetuj trzy mililitry sterylnego 0,2% roztworu żelatyny na każdą 60-milimetrową płytkę. Po inkubacji odessać roztwór i dodać trzy mililitry sterylnego PBS do dalszego użycia.Wyjąć z inkubatora płytkę zawierającą fibroblasty serca. Usunąć DMEM z płytki i spłukać sterylnym PBS. Po wyrzuceniu płukania dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny-EDTA do każdej płytki.Użyj mikroskopu, aby potwierdzić odłączenie komórki. Następnie dodaj dwa mililitry TSS do każdej płytki, aby zablokować trypsynizację, przenieś zawiesinę komórek do sterylnej 15-mililitrowej probówki. Odwirować w temperaturze 400 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odessać supernatant za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej. Następnie dodaj trzy mililitry DMEM do palety i ponownie ją zawiesij. Usunąć PBS z 60-milimetrowej płytki pokrytej żelatyną i umieścić w niej zawiesinę komórek.Hoduj fibroblasty w stanie konfluencji przez okres do 21 dni. Po 21 dniach hodowli odessać pożywkę hodowlaną. Następnie opłucz płytki trzema mililitrami PBS.Po zaessaniu PBS i dodaniu jednego mililitra roztworu decelularyzacyjnego obserwuj płytkę pod odwróconym mikroskopem kontrastowym. Po dwóch minutach delikatnie odpipetować cztery mililitry PBS, aby rozcieńczyć roztwór decelularyczny w płytkach. Odessać rozcieńczony roztwór, a następnie delikatnie spłukać płytki PBS.Na koniec dodaj jeden mililitr PBS do talerzy. Płytki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Wyrastanie fibroblastów z małych fragmentów rodzimego mięśnia sercowego umieszczonych w hodowli obserwowano w ciągu trzech do pięciu dni.Decelularyzacja spowodowała powstanie powłoki macierzy zewnątrzkomórkowej na powierzchni płytki. Skład i architektura wytworzonej in vitro macierzy zewnątrzkomórkowej serca została zachowana dzięki decelularyzacji.

production-cardiac-extracellular-matrix-from-adult-human-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pierwotne hodowle kardiomiocytów myszy są jednym z kluczowych narzędzi do badania organizacji i funkcji miofibrylarów. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę pierwotnych kardiomiocytów z serca noworodków myszy. Uzyskane w ten sposób kultury kardiomiocytów mogą być następnie wykorzystane do różnych testów biomechanicznych, biochemicznych i biologicznych.

Izolacja i hodowla nowonarodzonych kardiomiocytów myszy

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

W tych badaniach podajemy metodologię nowatorskich, noworodkowych, mysich rusztowań serca do wykorzystania w badaniach regeneracyjnych.

Rusztowania serca noworodków: nowe matryce do badań regeneracyjnych

Ten protokół opisuje całkowitą decelularyzację ludzkiego mięśnia sercowego przy jednoczesnym zachowaniu jego składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Dalsze przetwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej powoduje produkcję mikrocząstek i cytoprotekcyjnego hydrożelu samoorganizującego się.

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Macierz zewnątrzkomórkowa serca (ECM) to złożona sieć molekuł, które zarządzają kluczowymi procesami w tkankach i organach, jednocześnie znosząc fizjologiczną przebudowę przez całe życie. Standaryzowana decelularyzacja serc płodów i dorosłych pozwala na porównawcze badania eksperymentalne obu tkanek w kontekście 3D poprzez uchwycenie natywnej architektury i właściwości biomechanicznych.

Porównywalna decelularyzacja eksplantatów tkanek serca płodu i dorosłych jako platformy podobne do 3D do badań in vitro

Ten protokół opisuje metodę opartą na pleśni sieciowej do tworzenia trójwymiarowych, wolnych od rusztowań tkanek serca o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia.

Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

Celem tego protokołu jest produkcja całych włókien macierzy zewnątrzkomórkowej przeznaczonych do gojenia ran, które są odpowiednie do oceny przedklinicznej jako część regeneracyjnego implantu rusztowania. Włókna te są wytwarzane przez hodowlę fibroblastów na membranach z pustych włókien i ekstrahowane przez rozpuszczenie błon.

Produkcja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez protektorową hodowlę komórek z pustych włókien

Celem tej metody jest uzyskanie matryc 3D pochodzących z fibroblastów jako naturalnego rusztowania dla kolejnych testów komórkowych. Fibroblasty wysiewa się na wstępnie poddanej obróbce płytce hodowlanej i stymuluje kwasem askorbinowym w celu wytworzenia matrycy. Matryce są decellularizowane i blokowane w celu hodowli odpowiednich komórek (np. komórek śródbłonka).

System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Poznaj metodę produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej serca z fibroblastów dorosłego człowieka do powlekania naczyń hodowlanych. Technika ta umożliwia badanie interakcji komórkowych w inżynierii tkankowej.

Produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej serca z fibroblastów dorosłego człowieka do powlekania naczyń hodowlanych

Przeglądaj więcej filmów