Bakterie do drukowania 3D do badania ruchliwości i wzrostu w złożonych porowatych ośrodkach 3D

Bakterie wszechobecne w złożonych, trójwymiarowych porowatych środowiskach, takich jak tkanki biologiczne i żele oraz podpowierzchniowe gleby i osady. Tutaj opracowujemy metodę drukowania 3D gęstych kolonii bakterii w zakleszczonych ziarnistych matrycach hydrożelowych w celu zbadania ich wzrostu i ruchliwości w złożonych środowiskach. Badania ujawniły nieznane wcześniej różnice w charakterystyce rozprzestrzeniania się bakterii zamieszkujących porowate środowiska w porównaniu z tymi w płynnych kulturach na płaskich powierzchniach.

Opracowanie technologii wykorzystania granulowanych matryc hydrożelowych składających się z zakleszczonych biokompatybilnych cząstek hydrożelu spęczniających w płynnej kulturze bakteryjnej jako porowatych szalek Petriego w celu uwięzienia komórek w 3D. Wcześniejsze badania ograniczały się do małych objętości próbek około jednego ml, a zatem wymagały krótkiego czasu eksperymentu, a także były ograniczone pod względem możliwości definiowania geometrii w okularach z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Ustaliliśmy, że charakterystyka rozprzestrzeniania się komórek bakterii zależy od wielkości porów i ruchliwości komórki.

Aby rozpocząć, podłącz drukarkę 3D do komputera. Załaduj jednorazową strzykawkę o pojemności jednego mililitra z igłą do zacisków wydrukowanych w 3D. Użyj dwóch z gniazdem M8, aby zabezpieczyć zaciski wokół strzykawki.

Obrócić pociągową, aby ręcznie podnieść tłok, tworząc dwumililitrową szczelinę powietrzną w strzykawce. Aby przygotować kultury Vibrio cholerae, zaszczep komórki w trzech mililitrach bulionu Luria za pomocą 10 sterylnych szklanych kulek. Hoduj komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu godzin.

Podobnie zaszczepij E. coli w trzech mililitrach płynnego bulionu Luria. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza zaszczepić 200 mikrolitrów kultury w świeżym bulionie Luria przez trzy godziny. Przenieś kulturę do 10-mililitrowej probówki wirówkowej.

Następnie odwirować go przez pięć minut w temperaturze 644 g w temperaturze pokojowej. Teraz usuń supernatant i ponownie zawieś granulkę w 10 mikrolitrach płynnego bulionu Luria. Następnie załaduj pustą trzymililitrową plastikową strzykawkę Luer Lock do biodrukarki 3D.

Połączyć tłok strzykawki ze śrubą pociągową. Wycofać strzykawkę ręcznie, aby przenieść szczelinę powietrzną i umożliwić lepszy ruch tłoka. Przymocować igłę o odpowiedniej wielkości do końcówki strzykawki.

Ręcznie obrócić, aby cofnąć tłok strzykawki i załadować zawiesinę bakteryjną do strzykawki. Aby przygotować granulowaną mieszankę hydrożelową, wymieszaj suche granulki usieciowanego kwasu akrylowego z 400 mililitrami 2% bulionu Lennox Luria Bertani. Dostosuj pH do 7,4 z przyrostami co 500 mikrolitrów 10 molowego wodorotlenku sodu i przetestuj pH na pasku testowym.

Użyj sterylnej plastikowej strzykawki o pojemności 50 mililitrów, aby przenieść mieszaninę hydrożelu do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować matrycę o masie 161 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie użyj 30-mililitrowej strzykawki, aby przenieść wymaganą objętość matrycy do pojemnika, w którym nastąpi drukowanie.

Następnie umieść pojemniki na próbki z matrycą hydrożelową w uchwytach na platformie roboczej drukarki. Uruchom oprogramowanie do drukowania 3D. Kliknij Plik"następnie naciśnij, Otwórz plik"aby załadować wstępnie zaprogramowany gcode do oprogramowania.

Wprowadź długość ruchu. Następnie przesuń płaszczyzny X, Y, Z, aby wyśrodkować głowice drukujące na płaszczyźnie X/Y. Naciśnij ikonę strony głównej, aby ponownie wyregulować oś Z.

Ręcznie powoli obracać, aby wcisnąć tłok strzykawki, aż niewielka ilość zawiesiny bakteryjnej będzie widoczna na końcu igły. Nadmiar zawiesiny należy zetrzeć jałową chusteczką jednorazowego użytku. Teraz opuść głowicę drukującą w ustalonej odległości do nośnika hydrożelowego dowolnego pojemnika na próbkę.

Kliknij Drukuj", aby rozpocząć drukowanie. Po zakończeniu drukowania zamknij pojemniki na próbki, odpowiednio wyrzuć strzykawkę i igłę, przetrzyj drukarkę 70% etanolem. Aby uzyskać obrazowanie o dużym polu widzenia, użyj aparatu z dołączonym obiektywem zmiennoogniskowym.

Zobrazuj komórki zaraz po wydrukowaniu w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś próbki do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wydaje się, że różnice w wielkości porów macierzy nie wpływają na nieruchliwe rozprzestrzenianie się komórek. Jednak ruchliwe komórki rozprzestrzeniają się szybciej w macierzy z większymi porami w stosunku do mniejszych porów.

Kolonia Vibrio cholerae w hydrożelowych matrycach z większymi porami rozprzestrzenionymi gładkimi, rozproszonymi pióropuszami. Rozproszone pióropusze były nieobecne w komórkach nieruchliwych. Matryce kolonii i hydrożelu z mniejszymi porami rozprzestrzeniają się tylko przez szorstkie, fraktalne pióropusze zarówno dla komórek ruchliwych, jak i nieruchliwych.

Zaobserwowano, że obie komórki rozprzestrzeniają się w podobnym tempie przez pierwsze 150 godzin. Jednak w dłuższych okresach niektóre próbki wykazywały szybsze tempo rozprzestrzeniania się. Po doświadczeniu w hydrożelu zaobserwowano zmniejszenie granicy plastyczności, modułów spichrzeniowych i modułów strat