Bakterie do drukowania 3D do badania ruchliwości i wzrostu w złożonych porowatych ośrodkach 3D
19 stycznia 2024
Ten protokół opisuje procedurę trójwymiarowego (3D) drukowania kolonii bakteryjnych w celu zbadania ich ruchliwości i wzrostu w złożonych 3D porowatych matrycach hydrożelowych, które są bardziej zbliżone do ich naturalnych siedlisk niż konwencjonalne kultury płynów lub szalki Petriego.
Bakterie wszechobecne w złożonych, trójwymiarowych porowatych środowiskach, takich jak tkanki biologiczne i żele oraz podpowierzchniowe gleby i osady. Tutaj opracowujemy metodę drukowania 3D gęstych kolonii bakterii w zakleszczonych ziarnistych matrycach hydrożelowych w celu zbadania ich wzrostu i ruchliwości w złożonych środowiskach. Badania ujawniły nieznane wcześniej różnice w charakterystyce rozprzestrzeniania się bakterii zamieszkujących porowate środowiska w porównaniu z tymi w płynnych kulturach na płaskich powierzchniach.
Opracowanie technologii wykorzystania granulowanych matryc hydrożelowych składających się z zakleszczonych biokompatybilnych cząstek hydrożelu spęczniających w płynnej kulturze bakteryjnej jako porowatych szalek Petriego w celu uwięzienia komórek w 3D. Wcześniejsze badania ograniczały się do małych objętości próbek około jednego ml, a zatem wymagały krótkiego czasu eksperymentu, a także były ograniczone pod względem możliwości definiowania geometrii w okularach z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Ustaliliśmy, że charakterystyka rozprzestrzeniania się komórek bakterii zależy od wielkości porów i ruchliwości komórki.
Aby rozpocząć, podłącz drukarkę 3D do komputera. Załaduj jednorazową strzykawkę o pojemności jednego mililitra z igłą do zacisków wydrukowanych w 3D. Użyj dwóch z gniazdem M8, aby zabezpieczyć zaciski wokół strzykawki.
Obrócić pociągową, aby ręcznie podnieść tłok, tworząc dwumililitrową szczelinę powietrzną w strzykawce. Aby przygotować kultury Vibrio cholerae, zaszczep komórki w trzech mililitrach bulionu Luria za pomocą 10 sterylnych szklanych kulek. Hoduj komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu godzin.
Podobnie zaszczepij E. coli w trzech mililitrach płynnego bulionu Luria. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza zaszczepić 200 mikrolitrów kultury w świeżym bulionie Luria przez trzy godziny. Przenieś kulturę do 10-mililitrowej probówki wirówkowej.
Następnie odwirować go przez pięć minut w temperaturze 644 g w temperaturze pokojowej. Teraz usuń supernatant i ponownie zawieś granulkę w 10 mikrolitrach płynnego bulionu Luria. Następnie załaduj pustą trzymililitrową plastikową strzykawkę Luer Lock do biodrukarki 3D.
Połączyć tłok strzykawki ze śrubą pociągową. Wycofać strzykawkę ręcznie, aby przenieść szczelinę powietrzną i umożliwić lepszy ruch tłoka. Przymocować igłę o odpowiedniej wielkości do końcówki strzykawki.
Ręcznie obrócić, aby cofnąć tłok strzykawki i załadować zawiesinę bakteryjną do strzykawki. Aby przygotować granulowaną mieszankę hydrożelową, wymieszaj suche granulki usieciowanego kwasu akrylowego z 400 mililitrami 2% bulionu Lennox Luria Bertani. Dostosuj pH do 7,4 z przyrostami co 500 mikrolitrów 10 molowego wodorotlenku sodu i przetestuj pH na pasku testowym.
Użyj sterylnej plastikowej strzykawki o pojemności 50 mililitrów, aby przenieść mieszaninę hydrożelu do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować matrycę o masie 161 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie użyj 30-mililitrowej strzykawki, aby przenieść wymaganą objętość matrycy do pojemnika, w którym nastąpi drukowanie.
Następnie umieść pojemniki na próbki z matrycą hydrożelową w uchwytach na platformie roboczej drukarki. Uruchom oprogramowanie do drukowania 3D. Kliknij Plik"następnie naciśnij, Otwórz plik"aby załadować wstępnie zaprogramowany gcode do oprogramowania.
Wprowadź długość ruchu. Następnie przesuń płaszczyzny X, Y, Z, aby wyśrodkować głowice drukujące na płaszczyźnie X/Y. Naciśnij ikonę strony głównej, aby ponownie wyregulować oś Z.
Ręcznie powoli obracać, aby wcisnąć tłok strzykawki, aż niewielka ilość zawiesiny bakteryjnej będzie widoczna na końcu igły. Nadmiar zawiesiny należy zetrzeć jałową chusteczką jednorazowego użytku. Teraz opuść głowicę drukującą w ustalonej odległości do nośnika hydrożelowego dowolnego pojemnika na próbkę.
Kliknij Drukuj", aby rozpocząć drukowanie. Po zakończeniu drukowania zamknij pojemniki na próbki, odpowiednio wyrzuć strzykawkę i igłę, przetrzyj drukarkę 70% etanolem. Aby uzyskać obrazowanie o dużym polu widzenia, użyj aparatu z dołączonym obiektywem zmiennoogniskowym.
Zobrazuj komórki zaraz po wydrukowaniu w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś próbki do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wydaje się, że różnice w wielkości porów macierzy nie wpływają na nieruchliwe rozprzestrzenianie się komórek. Jednak ruchliwe komórki rozprzestrzeniają się szybciej w macierzy z większymi porami w stosunku do mniejszych porów.
Kolonia Vibrio cholerae w hydrożelowych matrycach z większymi porami rozprzestrzenionymi gładkimi, rozproszonymi pióropuszami. Rozproszone pióropusze były nieobecne w komórkach nieruchliwych. Matryce kolonii i hydrożelu z mniejszymi porami rozprzestrzeniają się tylko przez szorstkie, fraktalne pióropusze zarówno dla komórek ruchliwych, jak i nieruchliwych.
Zaobserwowano, że obie komórki rozprzestrzeniają się w podobnym tempie przez pierwsze 150 godzin. Jednak w dłuższych okresach niektóre próbki wykazywały szybsze tempo rozprzestrzeniania się. Po doświadczeniu w hydrożelu zaobserwowano zmniejszenie granicy plastyczności, modułów spichrzeniowych i modułów strat
.Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę drukowania 3D kolonii bakteryjnych w porowatych macierzach hydrożelowych w celu zbadania ich ruchliwości i wzrostu w środowiskach naśladujących siedliska naturalne. Badanie podkreśla różnice w zachowaniu bakterii w złożonych środowiskach 3D w porównaniu z tradycyjnymi kulturami w cieczy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biodruk 3D
- Motywność komórek
Wstęp
- Bakterie rozwijają się w złożonych, trójwymiarowych środowiskach porowatych.
- W tradycyjnych badaniach często wykorzystuje się kultury w cieczy lub płaskie powierzchnie.
- Zrozumienie zachowania bakterii w macierzach 3D może dostarczyć nowych informacji.
- Poprzednie metody były ograniczone pod względem objętości próbki i rozdzielczości przestrzennej.
Cel badania
- Opracowanie techniki druku 3D kolonii bakteryjnych w matrycach hydrożelowych.
- Badanie wzrostu i ruchliwości bakterii w środowiskach symulujących ich naturalne siedliska.
- Porównanie charakterystyki rozprzestrzeniania się bakterii w zależności od różnych wielkości porów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie kultur bakteryjnych Vibrio cholerae oraz E. coli.
- Tworzenie granulowanych matryc hydrożelowych z wykorzystaniem materiałów biokompatybilnych.
- Druk 3D kolonii bakteryjnych w matrycach hydrożelowych.
- Obrazowanie i analiza zachowania rozprzestrzeniania się bakterii po druku.
Główne wyniki
- Bakterie ruchliwe rozprzestrzeniają się szybciej w większych porach w porównaniu do mniejszych.
- Komórki nieruchliwe wykazywały odmienne wzorce rozprzestrzeniania się w zależności od wielkości porów.
- Wstępne szybkości rozprzestrzeniania były podobne zarówno dla komórek ruchliwych, jak i nieruchliwych.
- Długofalowe obserwacje wykazały zmienność szybkości rozprzestrzeniania w czasie.
Wnioski
- Badanie przedstawia nowatorskie podejście do analizy zachowania bakterii w środowiskach 3D.
- Zrozumienie wpływu wielkości porów może dostarczyć cennych informacji dla przyszłych badań mikrobiologicznych.
- Metodę tę można zastosować do badania innych interakcji mikrobiologicznych w złożonych macierzach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie ruchliwości i wzrostu bakterii w fizjologicznie istotnych porowatych środowiskach 3D jest kluczowe dla mikrobiologii translacyjnej i modelowania infekcji. Niniejszy protokół druku 3D umożliwia precyzyjne ograniczenie przestrzenne i wizualizację kolonii bakteryjnych w regulowanych matrycach hydrożelowych, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć i zmniejsza ryzyko mechanistyczne. Podejście to wypełnia istotną lukę w modelowaniu złożonych mikrośrodowisk przypominających tkanki w procesach badawczo-rozwojowych sektora biofarmaceutycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie zachowania bakterii w 3D macierzach imitujących tkanki w celu mechanistycznej redukcji ryzyka.
- Wspiera walidację funkcjonalną fenotypów ruchliwości i wzrostu w warunkach fizjologicznych ograniczeń.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celu poprzez modelowanie rzeczywistych mikrośrodowisk.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane, reprodukowalne macierze 3D do ilościowej oceny rozprzestrzeniania się bakterii.
- Umożliwia opracowanie testów do oceny wpływu związków na ruchliwość i wzrost w złożonych układach.
- Wspiera skalowalne procesy obrazowania i analizy w celu przygotowania do dalszego screeningu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele in vitro do architektury tkanek istotnych dla danej choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka poprzez ujawnianie fenotypów zależnych od środowiska.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów poprzez korelację wzorców ruchliwości z właściwościami macierzy.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta stanowi pomost między wczesną fazą odkryć a badaniami przedklinicznymi, umożliwiając testowanie hipotez w środowiskach 3D, które naśladują warunki in vivo.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia badania mechanistyczne nad ruchliwością i wzrostem bakterii w kontrolowanych macierzach porowatych.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki służące do porównywania fenotypów bakterii w różnych warunkach macierzy.
- Analityka: Wspiera pomiary oparte na obrazowaniu w zakresie rozprzestrzeniania się kolonii oraz zachowań zależnych od macierzy.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od modelowania in vitro do przedklinicznych badań nad infekcjami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku dla różnych szczepów bakterii i konfiguracji macierzy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad zachowaniem bakterii.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje warunki hodowli 3D oraz protokoły obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wczesne modelowanie złożonych środowisk w procesie badawczym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli z uwzględnieniem ryzyka w celu dalszego rozwoju.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w biodruku 3D i przygotowaniu macierzy hydrożelowych.
- Wymagana jest infrastruktura obrazowania do wysokorozdzielczej wizualizacji kolonii bakteryjnych.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji składu macierzy i parametrów wielkości porów.
- Możliwość adaptacji do różnych szczepów bakteryjnych i składów chemicznych hydrożeli poprzez optymalizację protokołu.
- Ograniczenia wynikające z przezroczystości macierzy i głębokości obrazowania w niektórych zastosowaniach.
