Name: Bakterie do drukowania 3D do badania ruchliwości i wzrostu w złożonych porowatych ośrodkach 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Poznaj metodę druku 3D kolonii bakterii w porowatych matrycach hydrogelowych do badania ruchliwości i wzrostu Vibrio cholerae oraz E. coli. Technika ta umożliwia analizę zachowań mikroorganizmów w złożonych środowiskach trójwymiarowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.K.B. dziękuje za wsparcie ze strony Prezydenckiego Programu Stypendialnego dla Doktorantów Doktoranckich. Materiał ten jest również oparty na pracy wspieranej przez grant programu stypendialnego dla absolwentów NSF DGE-2039656 (dla A.M.H.). A.S.D.-M. i H.N.L. dziękują za wsparcie ze strony Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund na Uniwersytecie Princeton. Dziękujemy również laboratorium Bonnie Bassler za dostarczenie szczepów V. cholerae. S.S.D. dziękuje za wsparcie ze strony grantów NSF CBET-1941716, DMR-2011750 i EF-2124863, a także Funduszu Technologii Transformacyjnych Erica i Wendy Schmidtów, New Jersey Health Foundation, Pew Biomedical Scholars Program oraz Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program.

To podejście polega na przekształceniu komercyjnej drukarki do modelowania osadzania 3D w biodrukarkę 3D przy użyciu wcześniej ustalonego protokołu przez Tashman et al.34. Krótko mówiąc, Tashman i in. zastąpili komercyjną głowicę wytłaczarki wykonaną na zamówienie wytłaczarką z pompą strzykawkową. Ekstruder ten umożliwia drukowanie wysoko skoncentrowanych płynnych zawiesin komórek bakteryjnych w 3D, z wytłaczaną objętością i pozycją 3D kontrolowaną przez język programowania G-code. Wytłaczana objętość jest określana w oprogramowaniu przez krok wytłaczarki (E-step) i jest dodatkowo kalibrowana zgodnie z opisem poniżej. Te zawiesiny bakteryjne są w ten sposób drukowane bezpośrednio w ziarnistej matrycy hydrożelowej, która działa jako podpora 3D dla komórek. Poniżej w protokole opisano również, w jaki sposób przygotować matryce o różnych stężeniach polimerów, scharakteryzować wynikające z tego zmiany wielkości porów i właściwości reologicznych oraz scharakteryzować późniejszą ruchliwość i wzrost bakterii za pomocą obrazowania bezpośredniego.
1. Konwersja komercyjnej drukarki 3D na biodrukarkę 3D
<ol>
	<li>Wyjmij ekstruder i grzałkę z komercyjnej drukarki 3D (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Postępuj zgodnie z poprzednimi protokołami, aby wyprodukować wytłaczarkę z pompą strzykawkową34, z dodatkową modyfikacją, aby pomieścić jednorazową strzykawkę Luer lock. Zamontuj ekstruder pompy strzykawkowej na drukarce. 
	UWAGA: Pliki CAD wymagane do modyfikacji wytłaczarki pompy strzykawkowej do strzykawek plastikowych znajdują się w plikach uzupełniających 1-3.</li>
	<li>Zainstaluj i otwórz oprogramowanie drukarki 3D (patrz Spis materiałów) na komputerze. Podłącz drukarkę 3D do komputera.</li>
	<li>Załaduj jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą o odpowiednim rozmiarze do zacisków wydrukowanych w 3D, wyrównując górną i dolną połowę mechanizmu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Zabezpiecz zaciski wokół strzykawki za pomocą trzech z gniazdem M8 i cienkich stalowych nakrętek sześciokątnych (patrz Tabela materiałów). Tłok strzykawki łączy się ze śrubą pociągową w wytłaczarce pompy strzykawkowej. Ręcznie podnieść tłok, obracając pociągową, aby utworzyć 0,5 ml szczeliny powietrznej w strzykawce.</li>
	<li>Jeśli zanieczyszczenie stanowi problem w eksperymencie, przetransportuj kompleks strzykawka-zacisk do biokaptura i wysterylizuj 70% etanolem w sprayu po wejściu przed wykonaniem poniższych kroków.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej
<ol>
	<li>W przypadku V. cholerae i E. coli rosnąć przez noc na 2% płytce agarowej Lennox LB (Luria Broth, patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>W przypadku V. cholerae należy zaszczepić komórki w 3 ml płynnego LB za pomocą dziesięciu sterylnych szklanych kulek. Hodować komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 5-6 godzin do środkowej fazy wykładniczej do gęstości optycznej (OD) 600 ~0,9.</li>
		<li>W przypadku E. coli należy zaszczepić komórki w 3 ml płynnego LB. Hodować komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc. Innokulować 200 μl nocnej kultury w świeżym LB przez 3 godziny, aż OD osiągnie 0,6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść kulturę do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. Odwiruj kulturę przez 5 minut przy 5 000 x g w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić za pomocą ~10 μL cieczy LB, aby uzyskać gęstość komórek ~9 x10 10 komórek na ml.</li>
</ol>
3. Ładowanie zawiesiny bakteryjnej do strzykawki
UWAGA: Dostępne są dwie metody ładowania bakterii do strzykawki (krok 3.1 i krok 3.2). Krok 3.1 służy do ładowania małych objętości zawiesin bakteryjnych, <200 μL, a krok 3.2 działa do ładowania większych objętości zawiesin bakteryjnych, >200 μL. Krok 3.1 został wykorzystany do uzyskania reprezentatywnych wyników pokazanych tutaj.
<ol>
	<li>Załaduj pustą plastikową strzykawkę Luer lock o pojemności 1 ml do biodrukarki 3D. Połączyć tłok strzykawki ze śrubą pociągową. Ręcznie wycofaj strzykawkę, aby dodać 0,2 ml szczeliny powietrznej, aby zapewnić miejsce na ruch tłoka w strzykawce, ponieważ do każdej partii eksperymentów zużywa się niewielką objętość komórek ~ 20-50 μl.
	<ol>
		<li>Przymocować igłę do końcówki strzykawki o rozmiarze igły niezbędnym do wymaganego rozmiaru elementów drukowania. W tym przypadku używana jest 2-calowa igła 20 G.</li>
		<li>Załadować zawiesinę bakteryjną do strzykawki, umieszczając 10 ml probówki wirówkowej z inokulum bakteryjnym poniżej igły. Ręcznie obrócić, aby cofnąć tłok strzykawki i załadować komórki do strzykawki. Objętości komórek bakteryjnych są tak małe, że często komórki są ładowane tylko do igły.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć tłok z kompleksu strzykawka-zacisk i użyć innej strzykawki i igły, aby ostrożnie załadować kompleks strzykawka-zacisk pożądanymi zawiesinami bakteryjnymi, uważając, aby nie utknąć pęcherzyków powietrza. Kompleks strzykawka-zacisk powinien być wypełniony nieco po brzegi pożądaną zawiesiną bakteryjną, a następnie przeniesiony do biodrukarki.
	<ol>
		<li>Ostrożnie włóż kompleks zacisku strzykawkowego bez tłoka do odpowiedniego gniazda na głównym rdzeniu wytłaczarki do biodrukarki.</li>
		<li>Upewnij się, że karetka drukarki znajduje się mniej więcej w połowie pociągowej, a pod załadowaną strzykawką znajduje się naczynie zbiorcze. Następnie ostrożnie przełóż tłok zarówno przez wózek, jak i przez zespół strzykawka-zacisk, aż zaczepi się o karetkę. Powoli wciskać tłok w zawiesinę bakteryjną, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w strzykawce.</li>
		<li>Wsuń adapter clamp na karetkę przez tylną część tłoka, aby zabezpieczyć go na miejscu zarówno podczas manewrów wytłaczania, jak i wciągania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kalibracja kroku ekstrudera do objętości osadzanej
<ol>
	<li>Aby skalibrować krok ekstrudera (E-step) do zdeponowanej objętości, najpierw skonfiguruj biodrukarkę z dokładną strzykawką, igłą strzykawki i osadzającą się zawiesiną bakteryjną, która zostanie użyta w eksperymencie. W tym przypadku używana jest strzykawka Luer lock o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Określ szacowany zakres kroku E do kalibracji, wyciągając dowolny numer kroku E (~200) i zanotuj zmianę objętości tłoka za pomocą znaczników objętości strzykawki.</li>
	<li>Użyj tego zgrubnego stosunku kroku E do objętości, aby określić ustawienia kroku E, aby przeprowadzić kalibrację. Na przykład, jeśli krok E o pojemności 200 wytłacza około 20 μl za pomocą oględzin i chce się nanieść 10-200 μl, należy przetestować kroki E w zakresie 100-2000.</li>
	<li>Aby przeprowadzić kalibrację liniową, należy najpierw oznaczyć etykietą i zmierzyć suchą masę dwudziestu probówek do pobierania próbek o pojemności 1,5 ml na wadze analitycznej o czułości 0,1 mg.</li>
	<li>Wytłacz zawiesinę bakteryjną do wstępnie odmierzonych probówek o pojemności 1,5 ml. Dla każdego kroku E należy wykonać co najmniej 2 powtórzenia. Powtórz te czynności dla wszystkich kroków E w zakresie liniowym, w razie potrzeby wymieniając zawiesinę bakteryjną. Jeśli zanieczyszczenie stanowi problem w eksperymencie, po każdej próbce przetrzyj zewnętrzną część igły strzykawki niestrzępiącą się chusteczką nasączoną 70% etanolem.</li>
	<li>Zmierz masę wszystkich probówek o pojemności 1,5 ml za pomocą tej samej wagi analitycznej. Odejmij pierwszą wartość masy od drugiej, aby uzyskać masę netto zdeponowanej zawiesiny bakteryjnej.</li>
	<li>Przemień masę zawiesiny bakteryjnej na objętość o gęstości materiału. W przypadku wielu zawiesin bakteryjnych składających się głównie z wody, 1 g/ml jest odpowiednim przybliżeniem gęstości.</li>
	<li>Wykonaj dopasowanie liniowe między krokiem E a objętością wytłaczaną, aby zakończyć proces kalibracji.</li>
</ol>
5. Przygotowanie matrycy hydrożelowej granulowanej
<ol>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać suche granulki usieciowanych kopolimerów kwasu akrylowego/akrylanu alkilu (patrz Tabela materiałów) do 400 ml 2% Lennox Luria-Bertani (LB), aby utrzymać sterylność matrycy; jednak do pęcznienia matrycy hydrożelowej można również użyć innych płynnych pożywek do hodowli komórek. 
	UWAGA: Procent wagowy granulek dodanych do LB zależy od wielkości porów, do której dążysz. W niniejszym badaniu, w przypadku 0,9% granulowanej matrycy hydrożelowej, do LB dodaje się 3,6 g suchych granulek, a w przypadku 1,2% granulowanej matrycy hydrożelowej dodaje się 4,8 g suchych granulek do LB. Granulki hydrożelu są jednorodnie dyspergowane poprzez mieszanie ich w mikserze stojącym przez 2 minuty.</li>
	<li>Po wymieszaniu dostosuj pH do 7,4, dodając od 20 do 500 μl przyrostów 10 M wodorotlenku sodu (NaOH), aby zapewnić żywotność komórek. Po każdym dodaniu NaOH należy zmierzyć pH, zanurzając końcówkę pipety w mieszaninie, a następnie wycierając matrycę hydrożelową na bibułce do badania pH. 
	UWAGA: Po dodaniu NaOH lepkość mieszaniny wzrośnie, gdy granulki hydrożelu zaczną pęcznieć. Spęczniałe granulki hydrożelu mają średnicę od ~5 μm do 10 μm i są zakleszczone razem w matrycy hydrożelowej. Wewnętrzny rozmiar oczek granulek wynosi od ~40 nm do 100 nm, jak wcześniej ustalono32. Rozmiar oczek jest wystarczająco duży, aby małe cząsteczki (np. tlen i składniki odżywcze) mogły swobodnie dyfundować, ale wystarczająco mały, aby bakterie mogły zostać zamknięte między porami śródmiąższowymi.</li>
	<li>Następnie przenieś granulowaną matrycę hydrożelową do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej plastikowej strzykawki o pojemności 50 ml. Odwirować matrycę hydrożelową o sile 161 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków powstałych podczas procesu mieszania.</li>
	<li>Pozostaw matrycę hydrożelową na co najmniej 2 dni w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że nie doszło do zanieczyszczenia. Zanieczyszczenie pojawia się w postaci mikrokolonii zawieszonych w matrycy hydrożelowej. Po dwóch dniach odwirować matrycę hydrożelową o sile 161 x g przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie dodatkowe pęcherzyki, które się utworzyły. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać, przechowując matrycę hydrożelową w temperaturze pokojowej przez okres do tygodnia.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego, za pomocą sterylnej plastikowej strzykawki o pojemności 30 ml, przenieś żądaną ilość matrycy hydrożelowej do pojemnika, w którym nastąpi drukowanie (tutaj użyto ~20 ml dla 20 ml kolby do hodowli tkankowej lub 1 ml dla 1 ml plastikowych mikrokuwet).</li>
</ol>
6. Charakterystyka właściwości reologicznych matrycy hydrożelowej granulatu
<ol>
	<li>Załaduj ~ 3 ml matrycy hydrożelowej do reometru ścinającego (patrz Tabela materiałów) z odstępem 1 mm między szorstkimi równoległymi płytkami o średnicy 50 mm w celu zmierzenia właściwości reologicznych.</li>
	<li>Określ ilościowo zachowanie plastyczności za pomocą jednokierunkowych pomiarów ścinania na reometrze ścinania, mierząc naprężenie ścinające w funkcji logarytmicznego przemiatania szybkości ścinania od 10-4 s-1 do 102 s-1 (np. <silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: Przy niskich szybkościach ścinania matryca hydrożelowa będzie miała stałe naprężenie ścinające (granicę plastyczności), które jest niezależne od szybkości ścinania. Przy dużych szybkościach ścinania naprężenie ścinające będzie rosło wraz z zależnością prawa potęgowego od szybkości ścinania, co wskazuje na fluidyzację matrycy hydrożelowej. To zachowanie granicy plastyczności pozwala na drukowanie bakterii w 3D w ziarnistej matrycy hydrożelowej29.</li>
	<li>Zmierz moduły magazynowania i straty, odpowiednio G' i G'', w funkcji częstotliwości za pomocą reologii oscylacyjnej o małej amplitudzie z amplitudą odkształcenia 1% i częstotliwościami od 0,1 do 1 Hz (np. <silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Idealna granulowana matryca hydrożelowa do druku 3D powinna mieć moduł przechowywania większy niż moduł strat, co wskazuje, że medium działa jak zakleszczona elastyczna bryła29.</li>
</ol>
7. Charakterystyka wielkości porów śródmiąższowych matrycy granulowanego hydrożelu
<ol>
	<li>Sonizować 100 nm karboksylowane fluorescencyjne nanocząstki polistyrenu (~3,6 x 1013 cząstek/ml, patrz Tabela materiałów) w ich opakowaniu przez 15 minut w celu ponownego zawieszenia w celu rozbicia wszelkich agregacji/klastrów cząstek. Przenieś 50 μl nanocząstek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
	<ol>
		<li>Wirować przez 10 minut przy 9 500 x g w temperaturze pokojowej, aż utworzy się osad, a supernatant będzie klarowny. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml płynnej pożywki wzrostowej (tutaj LB) użytej do przygotowania granulowanej matrycy hydrożelowej. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać, przechowując zawieszone nanocząstki w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sonikować zawieszone nanocząstki przez 30 minut. Przenieść 1 ml granulowanej matrycy hydrożelowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 μl zawieszonych nanocząstek do granulowanej matrycy hydrożelowej i wymieszać je z końcówką pipety. Po wymieszaniu wirować przez 30 s przy 161 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść matrycę hydrożelową i mieszaninę nanocząstek na szalkę Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem o grubości 0,1 mm. Studnia ma średnicę 20 mm i głębokość 1 mm. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu i dociśnij, aby wyłączyć przepływ i parowanie podczas obrazowania. Alternatywą dla szklanego szkiełka nakrywkowego jest dodanie 1 ml oleju parafinowego na wierzch.</li>
	<li>Zobrazuj nanocząstki za pomocą mikroskopu konfokalnego z 40-krotnym obiektywem olejowym z 8-krotnym dodatkowym zoomem w oprogramowaniu do obrazowania (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Zamiast korzystania z dodatkowego zoomu cyfrowego w oprogramowaniu można użyć obiektywu o większym powiększeniu.
	<ol>
		<li>Wyobraź sobie pętlę czasową bez opóźnienia (najlepiej ~19 klatek/s) w jednej płaszczyźnie z 2 minutami z co najmniej czterema nanocząstkami w polu widzenia. Powtórz od 15 do 20 razy w różnych miejscach, aby zebrać wystarczającą ilość danych do statystyk (od 100 do 200 nanocząstek).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj oprogramowania do śledzenia cząstek, aby przeanalizować przemieszczenie cząstek. W tym przypadku używany jest specjalnie napisany skrypt oparty na klasycznym algorytmie Crockera-Griera do śledzenia środka masy nanocząstki35 (patrz plik uzupełniający 7).
	<ol>
		<li>Na podstawie śledzenia cząstek oblicz średnie przemieszczenie kwadratowe (MSD). MSD będzie wykazywać swobodną dyfuzję w przestrzeni porów na krótkich odcinkach i w krótkich skalach czasowych oraz przejście do skalowania subdyfuzyjnego na dużych długościach i skalach czasowych z powodu ograniczenia35.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj skalę długości, w której następuje przejście do skalowania subdyfuzyjnego, aby oszacować lokalną wielkość porów. Oblicz wielkość porów, dodając tę skalę długości do średnicy nanocząstek. Powtórz analizę wielkości porów dla każdej zmierzonej nanocząstki. W ten sposób uzyskamy rozkład wielkości porów, na podstawie którego można obliczyć średnią wielkość porów (np. Rysunek 3).</li>
</ol>
8. 3D proces drukowania
<ol>
	<li>Wykonane na zamówienie uchwyty do pojemników na próbki do druku 3D (patrz pliki uzupełniające 4-6 dla plików CAD). W tym przypadku stosuje się uchwyty do kolb do hodowli tkankowych i mikrokuwet. Uchwyty pozwalają zaprogramować drukarkę tak, aby drukowała wiele próbek w jednej sesji drukowania. Umieść pojemniki na próbki z pożywką hydrożelową w uchwytach na platformie roboczej.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do drukowania 3D. Załaduj wstępnie zaprogramowany kod g do oprogramowania. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, krok 3.1 służy do załadowania zawiesiny bakteryjnej do drukarki 3D. 
	UWAGA: Przykład kodu g do drukowania liniowych geometrii pionowych podano w tabeli 1.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania do drukowania 3D przesuń płaszczyzny x-y-z, aby wyśrodkować głowicę drukującą na płaszczyźnie x-y, aby była pierwszym kontenerem, a następnie ustaw oś z. Bazująca oś Z podniesie głowicę drukującą. Ręcznie powoli obracać, aby wcisnąć tłok strzykawki, aż na końcu igły będzie widoczna niewielka ilość zawiesiny bakteryjnej.
	<ol>
		<li>Delikatnie zetrzyj nadmiar zawiesiny bakteryjnej sterylną jednorazową chusteczką. W zależności od wysokości uchwytu próbki, igły i strzykawki, za pomocą oprogramowania do drukowania 3D, opuść głowicę drukującą na stałą odległość do podłoża hydrożelowego w wybranym pojemniku na próbkę. Rozpocznij proces drukowania, klikając przycisk Drukuj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu drukowania zamknij pojemniki na próbki. Przetrzyj drukarkę 70% etanolem. Strzykawkę i igłę należy usunąć w odpowiedni sposób.</li>
</ol>
9. Uprawa i obrazowanie V. cholerae
<ol>
	<li>W przypadku obrazowania o dużym polu widzenia użyj aparatu z nasadką obiektywu zmiennoogniskowego, aby zobrazować wzrost komórek za pomocą lightboxa. Próbki należy zobrazować zaraz po wydrukowaniu w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść je do inkubatora. Próbki należy utrzymywać w temperaturze 37 °C w stacjonarnym inkubatorze między sesjami obrazowania podczas eksperymentu.</li>
	<li>Rejestruj obrazy przez żądany okres czasu, aby obserwować zachowanie wzrostu w długich okresach w ziarnistej matrycy hydrożelowej.</li>
</ol>

Bioprinting Bacteria in Hydrogel Matrices for the Study of Motility and Growth

<ol><li>Persat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+world+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanical world of bacteria.</a> Cell. 161 (5), 988-997 (2015).</li>
<li>Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flowing+biofilms+as+a+transport+mechanism+for+biomass+through+porous+media+under+laminar+and+turbulent+conditions+in+a+laboratory+reactor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system.</a> Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).</li>
<li>Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+changes+in+the+bacterial+community+structure+along+a+vertical+oxygen+gradient+in+flooded+paddy+soil+cores%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).</li>
<li>Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+intestinal+bacteria+with+components+of+the+intestinal+mucus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387(2017).</li>
<li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The skin microbiome.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (4), 244-253 (2011).</li>
<li>Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+translocation%3A+Overview+of+mechanisms+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).</li>
<li>Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellum+in+bacterial+pathogens%3A+For+motility+and+a+whole+lot+more%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).</li>
<li>Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+in+the+gut+compress+the+colonic+mucus+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).</li>
<li>Harman, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneous+motility+of+the+Lyme+disease+spirochete+in+gelatin+mimics+dissemination+through+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).</li>
<li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li>
<li>Siitonen, A., Nurminen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility+is+a+colonization+factor+in+experimental+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection.</a> Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).</li>
<li>Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+and+chemotaxis+in+tissue+penetration+of+oral+epithelial+cell+layers+by+Treponema+denticola%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola.</a> Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).</li>
<li>O’Neil, H. S., Marquis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+flagella+are+used+for+motility%2C+not+as+adhesins%2C+to+increase+host+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion.</a> Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).</li>
<li>Gill, C. O., Penney, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+bacteria+into+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Penetration of bacteria into meat.</a> Applied and Environmental Microbiology. 33 (6), 1284-1286 (1977).</li>
<li>Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+aerobic+bacteria+into+meat%3A+A+mechanistic+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Engineering%22%5BJournal%5D)">Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding.</a> Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).</li>
<li>Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+enhancement+of+bacterial+motility+increases+tumor+penetration%3A+Motility+enhances+bacterial+tumor+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).</li>
<li>Toley, B. J., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+is+critical+for+effective+distribution+and+accumulation+of+bacteria+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue.</a> Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).</li>
<li>Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydration-controlled+bacterial+motility+and+dispersal+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).</li>
<li>de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+bacteria+as+inoculants+in+agricultural+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils.</a> Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).</li>
<li>Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+motility+in+the+survival+and+spread+of+Pseudomonas+fluorescens+in+soil+and+in+the+attachment+and+colonisation+of+wheat+roots%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots.</a> FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).</li>
<li>Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizosphere+biology+and+crop+productivity%E2%80%94a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Research%22%5BJournal%5D)">Rhizosphere biology and crop productivity—a review.</a> Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).</li>
<li>Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+Increases+the+Retention+of+Bacteria+in+Porous+Media+with+Residual+NAPL+Entrapment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment.</a> Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).</li>
<li>Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+Increases+the+Residence+Time+of+Bacteria+in+Granular+Media+Containing+Distributed+Contaminant+Sources%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources.</a> Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).</li>
<li>Ford, R. M., Harvey, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemotaxis+in+the+transport+of+bacteria+through+saturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media.</a> Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).</li>
<li>Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+effect+of+chemotaxis+and+growth+on+microbial+distributions+in+organic-amended+aquifer+sediments%3A+Observations+from+laboratory+and+field+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies.</a> Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).</li>
<li>Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+confinement+on+the+spreading+of+bacterial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of confinement on the spreading of bacterial populations.</a> PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063(2022).</li>
<li>Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biophysical+threshold+for+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A biophysical threshold for biofilm formation.</a> eLife. 11, e76380(2022).</li>
<li>Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+semi-solid+agar+for+the+detection+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility.</a> Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).</li>
<li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+scaling+laws+for+microgel+yielding+near+jamming%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming.</a> Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+and+activity+regulate+bacterial+motion+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media.</a> Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+hopping+and+trapping+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bacterial hopping and trapping in porous media.</a> Nature Communications. 10 (1), 2075(2019).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+migration+of+bacteria+in+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chemotactic migration of bacteria in porous media.</a> Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).</li>
<li>Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+smoothing+of+collective+migration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chemotactic smoothing of collective migration.</a> eLife. 11, e71226(2022).</li>
<li>Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+open-source+syringe+extruder+optimized+for+extrusion+and+retraction+during+FRESH+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting.</a> HardwareX. 9, e00170(2021).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
<li>Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+growth+kinetics+of+Vibrio+cholerae+in+presence+of+gold+nanoparticles%3A+Effect+of+size+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9671(2017).</li>
<li>Martínez-Calvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+instability+and+roughening+of+growing+3D+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119(2022).</li>
<li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Straightforward+approach+for+3D+bacterial+printing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Straightforward approach for 3D bacterial printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+cell+ordering+in+confined+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118(2021).</li>
</ol>

Eksperymentalna platforma używana do drukowania 3D i obrazowania społeczności bakteryjnych w tej publikacji jest przedmiotem wniosku patentowego złożonego przez Uniwersytet Princeton w imieniu Tapomoy Bhattacharjee i S.S.D. (numer wniosku PCT: PCT/US/2020/030213).

Krytyczne kroki w protokole Ważne jest, aby podczas przygotowywania każdej matrycy hydrożelowej matryca była wytwarzana w sterylnym środowisku. W przeciwnym razie może dojść do zanieczyszczenia, które po kilku dniach objawia się np. mikrokoloniami (małymi sferoidami) w matrycy. Podczas procesu mieszania ważne jest, aby wszystkie suche ziarniste cząstki hydrożelu zostały rozpuszczone. Dodatkowo, podczas regulacji pH każdej matrycy hydrożelowej za pomocą NaOH, granulki zaczną pęcznieć, co zwiększa lepkość matrycy hydrożelowej, co prowadzi do utrudnienia mieszania. Korzystanie z miksera stojącego pomoże upewnić się, że NaOH jest dobrze wymieszany z matrycą hydrożelową. Podczas ładowania każdej zawiesiny bakteryjnej w igle mogą tworzyć się kieszenie powietrzne. Aby uniknąć tego problemu, upewnij się, że końcówka igły zawsze znajduje się w zawiesinie bakteryjnej w probówce wirówkowej, a nie na dnie probówki lub w pobliżu górnej powierzchni. Innym sposobem na przezwyciężenie tego problemu jest hodowanie dużych ilości komórek, a tym samym posiadanie większych objętości zawiesiny bakteryjnej do drukowania.
Ograniczenia Obecnie, podczas drukowania, niska lepkość zawiesiny bakteryjnej ogranicza geometrie, które można wydrukować, i często prowadzi do tworzenia się i wzrostu biofilmu na powierzchni matrycy hydrożelowej z powodu komórek śladowych. Istnieje kilka potencjalnych metod przezwyciężenia tego ograniczenia, w tym zwiększenie lepkości zawiesiny bakteryjnej lub dalsza optymalizacja ustawień drukarki 3D. Aby zwiększyć lepkość zawiesiny bakteryjnej, można zmieszać zawiesinę bakteryjną z innym polimerem - na przykład alginianem, który był wcześniej używany do drukowania 3D bakterii na płaskich powierzchniach38. Ustawienia drukarki można dodatkowo zoptymalizować, aby umożliwić wycofanie tłoka strzykawki podczas wyjmowania igły z ziarnistej matrycy hydrożelowej, co mogłoby zapobiec osadzaniu się komórek podczas wyjmowania igły z matrycy hydrożelowej.
Znaczenie metody w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod Opisana tutaj metoda pozwala na drukowanie kolonii bakteryjnych w ziarnistych matrycach hydrożelowych. Granulowane matryce hydrożelowe pozwalają na badanie wpływu zewnętrznych czynników środowiskowych (np. wielkości porów, odkształcalności matrycy) na ruchliwość i rozwój bakterii. Dodatkowo, podczas gdy w tej pracy LB jest używany jako płynne podłoże wzrostowe do pęcznienia matrycy hydrożelowej, matryca hydrożelowa może być pęczniejąca innymi płynnymi pożywkami wzrostowymi, w tym pożywką z antybiotykami. Dotychczasowe metody badania bakterii w zamkniętych środowiskach były ograniczone długością czasu eksperymentu, rozmiarem siatki polimerowej i sztywnością otaczającej matrycy hydrożelowej37,38. Istnieją już protokoły wytwarzania granulowanych matryc hydrożelowych z różnych polimerów, więc potencjał badania wpływu różnych warunków środowiskowych na ruchliwość i wzrost bakterii jest ogromny. Metoda ta pozwala na badanie bakterii w środowiskach kontrolnych, które łatwiej podsumowują środowiska, w których bakterie zamieszkują w świecie rzeczywistym, takie jak śluz gospodarza lub gleba. Innym ograniczeniem wielu innych metod jest nieprzezroczystość otaczającej matrycy; jednak takie podejście wykorzystujące optycznie przezroczyste materiały daje możliwość eksploracji np. kontroli optogenetycznej i modelowania bakterii w 3D.
Poza badaniem ruchliwości i wzrostu, opisana tutaj metoda druku 3D pokonuje ograniczenia wielu innych metod biodrukowania, które wymagają osadzania biotuszu na podłożu, a zatem są ograniczone pod względem wysokości zaprojektowanego żywego materiału, który mogą wyprodukować. W przyszłości ten protokół biodrukowania może być dalej rozszerzany o wytwarzanie materiałów biohybrydowych poprzez mieszanie polimerów z komórkami tworzącymi biofilm. Granulowane matryce hydrożelowe zapewniają wsparcie dla drukowania 3D grubszych, większych materiałów inżynieryjnych i bardziej złożonych geometrii niż wiele innych obecnych metod biodrukowania bakterii. Podczas gdy w tej pracy wykorzystano tylko V. cholerae i E. coli, inne gatunki, takie jak Pseudomonas aeruginosa, również zostały z powodzeniem wydrukowane w3D 37. Poza drukowaniem drukarkę można przystosować do wykonywania kontrolowanych próbek bakterii po wzroście, aby sprawdzić, czy nie nastąpiły jakiekolwiek zmiany genetyczne.

Bakterie często zamieszkują różnorodne, złożone porowate środowiska 3D, począwszy od żeli śluzówkowych w jelitach i płucach, a skończywszy na glebie w ziemi1,2,<sup class="xref">3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, 
22,23,24,25. W takich warunkach przemieszczanie się bakterii poprzez ruchliwość lub wzrost może być utrudnione przez otaczające przeszkody, takie jak sieci polimerowe lub upakowania stałych ziaren mineralnych, co wpływa na zdolność komórek do rozprzestrzeniania się w ich środowisku26, dostęp do źródeł składników odżywczych, kolonizacja nowego terenu i tworzenie ochronnych społeczności biofilmu27. Jednak tradycyjne badania laboratoryjne zazwyczaj wykorzystują bardzo uproszczoną geometrię, koncentrując się na komórkach w płynnych kulturach lub na płaskich powierzchniach. Chociaż podejścia te dostarczają kluczowych informacji na temat mikrobiologii, nie oddają w pełni złożoności naturalnych siedlisk, co prowadzi do dramatycznych różnic w tempie wzrostu i ruchliwości w porównaniu z pomiarami wykonanymi w warunkach rzeczywistych. Dlatego niezwykle potrzebna jest metoda definiowania kolonii bakterii i badania ich ruchliwości i wzrostu w porowatych środowiskach 3D, bardziej zbliżonych do wielu ich naturalnych siedlisk.
Inokulacja komórek w żelu agarowym, a następnie wizualizacja ich makroskopowego rozprzestrzeniania się za pomocą oka lub za pomocą kamery dostarcza jednego z prostych sposobów osiągnięcia tego celu, jak to po raz pierwszy zaproponowali Tittsler i Sandholzer w 1936 roku28. Podejście to wiąże się jednak z szeregiem kluczowych wyzwań technicznych: (1) Podczas gdy rozmiary porów można zasadniczo zmieniać poprzez zmianę stężenia agarozy, struktura porów takich żeli jest słabo zdefiniowana; (2) Rozpraszanie światła powoduje, że żele te są mętne, co utrudnia wizualizację komórek w indywidualnej skali z wysoką rozdzielczością i wiernością, szczególnie w dużych próbkach; (3) Gdy stężenie agaru jest zbyt duże, migracja komórek jest ograniczona do górnej płaskiej powierzchni żelu; (4) Złożona reologia takich żeli sprawia, że trudno jest wprowadzić inokulum o dobrze zdefiniowanej geometrii.
Aby rozwiązać te ograniczenia, w poprzedniej pracy, laboratorium Datty opracowało alternatywne podejście przy użyciu granularnych matryc hydrożelowych - składających się z zakleszczonych, biokompatybilnych cząsteczek hydrożelu spęczniałych w płynnej kulturze bakteryjnej - jako "porowatych szalek Petriego" do uwięzienia komórek w 3D. Matryce te są miękkimi, samonaprawiającymi się ciałami stałymi o granicy plastyczności; w przeciwieństwie do usieciowanych żeli stosowanych w innych procesach biodruku, mikrodysza iniekcyjna może swobodnie poruszać się wewnątrz matrycy wzdłuż dowolnej zalecanej ścieżki 3D, lokalnie przestawiając cząsteczki hydrożelu29. Cząsteczki te następnie szybko ponownie się zagęszczają i samoleczą wokół wstrzykniętych bakterii, podtrzymując komórki na miejscu bez dodatkowego szkodliwego przetwarzania. Proces ten jest zatem formą druku 3D, która umożliwia ułożenie komórek bakteryjnych - w pożądaną strukturę 3D, o określonym składzie społeczności - w porowatej matrycy o przestrajalnych właściwościach fizykochemicznych. Co więcej, matryce hydrożelowe są całkowicie przezroczyste, co umożliwia bezpośrednią wizualizację komórek za pomocą obrazowania.
Użyteczność tego podejścia została wcześniej zademonstrowana na dwa sposoby. W jednym zestawie badań rozcieńczone komórki zostały rozproszone w matrycy hydrożelowej, co umożliwiło badanie ruchliwości poszczególnych bakterii30,31. W innym zestawie badań społeczności wielokomórkowe zostały wydrukowane w 3D w żelach w skali centymetrowej za pomocą dyszy iniekcyjnej zamontowanej na programowalnym stoliku mikroskopu, co umożliwiło badania rozprzestrzeniania się zbiorowości bakteryjnych w ich otoczeniu32,33. W obu przypadkach badania te ujawniły nieznane wcześniej różnice w charakterystyce rozprzestrzeniania się bakterii zamieszkujących porowate środowiska w porównaniu z tymi w kulturach płynnych/na płaskich powierzchniach. Biorąc jednak pod uwagę, że były one zamontowane na stoliku mikroskopowym, te poprzednie badania ograniczały się do małych objętości próbek (~1 ml), a zatem krótkich skal czasowych eksperymentu. Mieli również ograniczoną zdolność do definiowania geometrii inokulantów z wysoką rozdzielczością przestrzenną.
Tutaj opisana jest następna generacja tej eksperymentalnej platformy, która rozwiązuje oba ograniczenia. W szczególności zapewnione są protokoły, za pomocą których można użyć zmodyfikowanej drukarki 3D z dołączoną wytłaczarką strzykawkową do drukowania 3D i obrazowania kolonii bakterii na dużą skalę. Co więcej, reprezentatywne dane wskazują, w jaki sposób podejście to może być przydatne w badaniu ruchliwości i wzrostu bakterii, na przykładzie tworzącego biofilm Vibrio cholerae i planktonowego Escherichia coli. Takie podejście umożliwia utrzymywanie kolonii bakteryjnych przez długi czas i wizualizację przy użyciu różnych technik obrazowania. W związku z tym zdolność tego podejścia do badania społeczności bakteryjnych w porowatych siedliskach 3D ma ogromny potencjał badawczy i stosowany, wpływając na leczenie i badanie drobnoustrojów w jelitach, skórze, płucach i glebie. Co więcej, podejście to może być wykorzystane w przyszłości do drukowania 3D żywych materiałów inżynieryjnych na bazie bakterii w bardziej złożone, wolnostojące kształty.

<table><tbody><tr><td>Kuwety 1 ml</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Strzykawka Luer lock</td><td>BH Supplies</td><td>BH1LL</td><td></td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>100 nm karboksylowane fluorescencyjne nanocząstki polistyrenu (FluoSpheres)&nbsp;</td><td>&nbsp; Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)</td><td> F8803</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowe</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-237</td><td></td></tr><tr><td>igła 20 G</td><td>McMaster Carr</td><td>75165A252</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Kolby do hodowli tkankowych</td><td>VWR</td><td>10861-566</td><td></td></tr><tr><td>Drukarka 3D</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot Mini 2</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do druku 3D</td><td>Cura</td> Probówki wirówkowe <td>Cura-Lulzbot</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-239</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Karbomer Granulowane cząstki hydrożelu</td><td>Lubrizol&nbsp;</td><td>Carbopol 980NF</td><td>suche granulki usieciowanych kopolimerów kwasu akrylowego/akrylanu alkilu</td></tr><tr><td>Wirówka (pojemność probówki 2 ml)</td><td>VWR</td><td>2405-37</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka (pojemność probówki 50 ml)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75007200</td><td>Sorvall (marka) ST 8 (model)</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>A1R+ odwrócony skaning laserowy mikroskop</td><td></td>konfokalny</tr><tr><td>Szklane dno szalka Petriego</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB (Lubria Broth)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>M8 & razy; 1,25 mm, 150 mm długości, w pełni gwintowana nasadka nasadki</td><td>McMaster Carr</td><td>91290A478</td><td></td></tr><tr><td>M8 &; 1,25 mm, mosiężna cienka nakrętka sześciokątna</td><td>McMaster Carr</td><td>93187A300</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa o otwartym kodzie źródłowym</td><td>Replistruder 4</td><td></td> <td>na zamówieniehttps://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791</td></tr><tr><td>szalka Petriego (okrągła 60 mm)</td>Reometr ścinający <td>ThermoFischer Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Anton Paar</td><td>MCR 501</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>VWR</td><td>97043-992</td><td></td></tr></tbody></table>

bakterie do drukowania 3d do badania ruchliwości i wzrostu w złożonych porowatych ośrodkach 3d

3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media

Bakterie są wszechobecne w złożonych, trójwymiarowych (3D) porowatych środowiskach, takich jak biologiczne tkanki i żele oraz podpowierzchniowe gleby i osady. Jednak większość wcześniejszych prac koncentrowała się na badaniach komórek w płynach masowych lub na płaskich powierzchniach, które nie oddają w pełni złożoności wielu naturalnych siedlisk bakteryjnych. W tym miejscu ta luka w wiedzy została wypełniona poprzez opisanie opracowania metody drukowania 3D gęstych kolonii bakterii w zaciętych granulowanych matrycach hydrożelowych. Matryce te mają regulowane rozmiary porów i właściwości mechaniczne; fizycznie ograniczają komórki, wspierając je w ten sposób w 3D. Są one optycznie przezroczyste, co pozwala na bezpośrednią wizualizację rozprzestrzeniania się bakterii w ich otoczeniu za pomocą obrazowania. Jako dowód tej zasady, tutaj możliwości tego protokołu demonstruje się poprzez drukowanie 3D i obrazowanie nieruchliwych i ruchliwych Vibrocholerae, a także nieruchliwych Escherichia coli, w zakleszczonych granulowanych matrycach hydrożelowych o różnych rozmiarach porów śródmiąższowych.

Ten protokół opisuje procedurę trójwymiarowego (3D) drukowania kolonii bakteryjnych w celu zbadania ich ruchliwości i wzrostu w złożonych 3D porowatych matrycach hydrożelowych, które są bardziej zbliżone do ich naturalnych siedlisk niż konwencjonalne kultury płynów lub szalki Petriego.

Bakterie do drukowania 3D do badania ruchliwości i wzrostu w złożonych porowatych ośrodkach 3D

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. ...

Bakterie wszechobecne w złożonych, trójwymiarowych porowatych środowiskach, takich jak tkanki biologiczne i żele oraz podpowierzchniowe gleby i osady. Tutaj opracowujemy metodę drukowania 3D gęstych kolonii bakterii w zakleszczonych ziarnistych matrycach hydrożelowych w celu zbadania ich wzrostu i ruchliwości w złożonych środowiskach. Badania ujawniły nieznane wcześniej różnice w charakterystyce rozprzestrzeniania się bakterii zamieszkujących porowate środowiska w porównaniu z tymi w płynnych kulturach na płaskich powierzchniach.Opracowanie technologii wykorzystania granulowanych matryc hydrożelowych składających się z zakleszczonych biokompatybilnych cząstek hydrożelu spęczniających w płynnej kulturze bakteryjnej jako porowatych szalek Petriego w celu uwięzienia komórek w 3D. Wcześniejsze badania ograniczały się do małych objętości próbek około jednego ml, a zatem wymagały krótkiego czasu eksperymentu, a także były ograniczone pod względem możliwości definiowania geometrii w okularach z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Ustaliliśmy, że charakterystyka rozprzestrzeniania się komórek bakterii zależy od wielkości porów i ruchliwości komórki.Aby rozpocząć, podłącz drukarkę 3D do komputera. Załaduj jednorazową strzykawkę o pojemności jednego mililitra z igłą do zacisków wydrukowanych w 3D. Użyj dwóch z gniazdem M8, aby zabezpieczyć zaciski wokół strzykawki.Obrócić pociągową, aby ręcznie podnieść tłok, tworząc dwumililitrową szczelinę powietrzną w strzykawce. Aby przygotować kultury Vibrio cholerae, zaszczep komórki w trzech mililitrach bulionu Luria za pomocą 10 sterylnych szklanych kulek. Hoduj komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu godzin.Podobnie zaszczepij E. coli w trzech mililitrach płynnego bulionu Luria. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza zaszczepić 200 mikrolitrów kultury w świeżym bulionie Luria przez trzy godziny. Przenieś kulturę do 10-mililitrowej probówki wirówkowej.Następnie odwirować go przez pięć minut w temperaturze 644 g w temperaturze pokojowej. Teraz usuń supernatant i ponownie zawieś granulkę w 10 mikrolitrach płynnego bulionu Luria. Następnie załaduj pustą trzymililitrową plastikową strzykawkę Luer Lock do biodrukarki 3D.Połączyć tłok strzykawki ze śrubą pociągową. Wycofać strzykawkę ręcznie, aby przenieść szczelinę powietrzną i umożliwić lepszy ruch tłoka. Przymocować igłę o odpowiedniej wielkości do końcówki strzykawki.Ręcznie obrócić, aby cofnąć tłok strzykawki i załadować zawiesinę bakteryjną do strzykawki. Aby przygotować granulowaną mieszankę hydrożelową, wymieszaj suche granulki usieciowanego kwasu akrylowego z 400 mililitrami 2% bulionu Lennox Luria Bertani. Dostosuj pH do 7,4 z przyrostami co 500 mikrolitrów 10 molowego wodorotlenku sodu i przetestuj pH na pasku testowym.Użyj sterylnej plastikowej strzykawki o pojemności 50 mililitrów, aby przenieść mieszaninę hydrożelu do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować matrycę o masie 161 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie użyj 30-mililitrowej strzykawki, aby przenieść wymaganą objętość matrycy do pojemnika, w którym nastąpi drukowanie.Następnie umieść pojemniki na próbki z matrycą hydrożelową w uchwytach na platformie roboczej drukarki. Uruchom oprogramowanie do drukowania 3D. Kliknij Plik"następnie naciśnij, Otwórz plik"aby załadować wstępnie zaprogramowany gcode do oprogramowania.Wprowadź długość ruchu. Następnie przesuń płaszczyzny X, Y, Z, aby wyśrodkować głowice drukujące na płaszczyźnie X/Y. Naciśnij ikonę strony głównej, aby ponownie wyregulować oś Z.Ręcznie powoli obracać, aby wcisnąć tłok strzykawki, aż niewielka ilość zawiesiny bakteryjnej będzie widoczna na końcu igły. Nadmiar zawiesiny należy zetrzeć jałową chusteczką jednorazowego użytku. Teraz opuść głowicę drukującą w ustalonej odległości do nośnika hydrożelowego dowolnego pojemnika na próbkę.Kliknij Drukuj", aby rozpocząć drukowanie. Po zakończeniu drukowania zamknij pojemniki na próbki, odpowiednio wyrzuć strzykawkę i igłę, przetrzyj drukarkę 70% etanolem. Aby uzyskać obrazowanie o dużym polu widzenia, użyj aparatu z dołączonym obiektywem zmiennoogniskowym.Zobrazuj komórki zaraz po wydrukowaniu w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś próbki do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wydaje się, że różnice w wielkości porów macierzy nie wpływają na nieruchliwe rozprzestrzenianie się komórek. Jednak ruchliwe komórki rozprzestrzeniają się szybciej w macierzy z większymi porami w stosunku do mniejszych porów.Kolonia Vibrio cholerae w hydrożelowych matrycach z większymi porami rozprzestrzenionymi gładkimi, rozproszonymi pióropuszami. Rozproszone pióropusze były nieobecne w komórkach nieruchliwych. Matryce kolonii i hydrożelu z mniejszymi porami rozprzestrzeniają się tylko przez szorstkie, fraktalne pióropusze zarówno dla komórek ruchliwych, jak i nieruchliwych.Zaobserwowano, że obie komórki rozprzestrzeniają się w podobnym tempie przez pierwsze 150 godzin. Jednak w dłuższych okresach niektóre próbki wykazywały szybsze tempo rozprzestrzeniania się. Po doświadczeniu w hydrożelu zaobserwowano zmniejszenie granicy plastyczności, modułów spichrzeniowych i modułów strat.

3d-printing-bacteria-to-study-motility-growth-complex-3d-porous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Scheidweiler, D. i in. Łączenie urządzeń płynowych z mikroskopią i cytometrią przepływową do badania transportu mikroorganizmów w ośrodkach porowatych na skalach przestrzennych. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do ilościowego określania ruchliwości bakterii poprzez porowatą matrycę złożoną z losowo ułożonych filarów. Do urządzenia wprowadzane są fluorescencyjnie znakowane bakterie, obrazowane mikroskopią podczas przemieszczania się przez...

Ocena ruchliwości bakteryjnej za pomocą urządzenia mikrofluidycznego

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Ten artykuł opisuje metodę przekształcenia taniej komercyjnej drukarki 3D w bakteryjną drukarkę 3D, która może ułatwić drukowanie wzorzystych biofilmów. Opisano wszystkie niezbędne aspekty przygotowania biodrukarki i biotuszu, a także metody weryfikacji w celu oceny powstawania biofilmów.

Trójwymiarowe wzory biofilmów inżynieryjnych za pomocą biodrukarki zrób to sam

Przedstawiono protokół do generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych przez fotolizę w układach mikroprzepływowych i milifluidowych. Metodologia ta jest odpowiednia do badania różnych procesów biologicznych, w tym zachowania ruchliwego, pobierania składników odżywczych lub adaptacji mikroorganizmów do substancji chemicznych, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji.

Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

Krzywe przełomu (BTC) są skutecznymi narzędziami do badania transportu bakterii w porowatych mediach. Tutaj przedstawiamy narzędzia oparte na urządzeniach fluidycznych w połączeniu z mikroskopią i zliczaniem metodą cytometrii przepływowej w celu uzyskania BTC.

Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych

Wąskim gardłem dla komórkowej mikroskopii elektronowej 3D jest ekstrakcja cech (segmentacja) w bardzo złożonych mapach gęstości 3D. Opracowaliśmy zestaw kryteriów, które zawierają wskazówki dotyczące tego, które podejście do segmentacji (ręczne, półautomatyczne lub zautomatyzowane) najlepiej nadaje się do różnych typów danych, stanowiąc tym samym punkt wyjścia do skutecznej segmentacji.

Od wokseli do wiedzy: praktyczny przewodnik po segmentacji złożonych danych 3D z mikroskopii elektronowej

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Ten protokół opisuje, jak przygotować mieszaną matrycę 2D, składającą się z żelatyny i kolagenu I, oraz wtyczkę 3D kolagenu I do badania liniowych inwadosomów. Protokoły te pozwalają na badanie liniowego tworzenia inwadosomu, aktywności degradacji macierzy oraz zdolności inwazji komórek pierwotnych i linii komórek rakowych.

Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

Analogi chrząstki i skóry zostały wydrukowane biodrukiem za pomocą biotuszu na bazie nanocelulozy i alginianu. Biotusze zostały poddane celaryzacji przed drukowaniem za pomocą jednostopniowej pasywnej jednostki mieszającej. Wykazano, że konstrukty są jednolicie ukomórkowane, mają wysoką żywotność i wykazują korzystne markery różnicowania.

Bioprinting analogów chrząstki i tkanki skórnej z wykorzystaniem nowatorskiej techniki pasywnego mieszania do precelularyzacji biotuszu

Ten protokół opisuje produkcję filamentu polikaprolaktonu (PCL) z wbudowanymi mikrosferami kwasu polimlekowego (PLA), które zawierają matryce decelularyzowane (DM) do druku 3D strukturalnych konstrukcji inżynierii tkankowej.

Nowatorski proces druku 3D matryc bezkomórkowych

Poznaj metodę druku 3D kolonii bakterii w porowatych matrycach hydrogelowych do badania ruchliwości i wzrostu Vibrio cholerae oraz E. coli. Technika ta umożliwia analizę zachowań mikroorganizmów w złożonych środowiskach trójwymiarowych.

Bakterie do drukowania 3D do badania ruchliwości i wzrostu w złożonych porowatych ośrodkach 3D

Przeglądaj więcej filmów