Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Nasze laboratorium ma na celu zrozumienie zachowań interakcyjnych wewnętrznie nieuporządkowanych regionów białkowych oraz ich roli w regulacji transkrypcji w zdrowych i chorych komórkach ludzkich. W naszym laboratorium opracowujemy i wykorzystujemy nowatorskie techniki mikroskopii jednocząsteczkowej w połączeniu z biologią molekularną, biochemicznym i proteomicznymi podejściami do badania kondensatów biomolekularnych. Protokół ten umożliwia ilościowe określenie dynamiki, w wyniku której określone białko wiąże się z określonym typem kondensatu w żywych komórkach ludzkich i ma szerokie zastosowanie do pomiaru dynamiki interakcji dowolnego białka, które uczestniczy w separacji ciekłej fazy ciekłej.

Po utworzeniu linii komórkowych wyrażających interesujące nas białko znakowane Halo i Halo-H2B, przygotuj odczynnik do barwienia ligandów Halo osobno dla obu z nich. Przepłucz komórki dwoma mililitrami PBS. Dodaj ligand zawierający Halo i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę.

Po usunięciu podłoża barwiącego przepłukać komórki czterokrotnie PBS i inkubować je ze świeżą pożywką pozbawioną ligandów Halo. Po czterech takich cyklach inkubacji płukania przenieś szkiełko nakrywkowe z komórkami do komory kompatybilnej ze stolikiem mikroskopowym ze sterylnymi kleszkami. Dodaj pożywkę wolną od czerwieni fenolowej do komory przed obrazowaniem.

Na początek uzyskaj komórki barwiące ligand wyrażające białko znakowane Halo i Halo-H2B. Po włączeniu systemu mikroskopu należy ustawić parametry inkubacji żywych komórek i pozwolić systemowi się zrównoważyć. Umieść kroplę oleju na obiektywie TIRF 100x w mikroskopie i załaduj próbkę komórki na stolik mikroskopu.

Aby zidentyfikować morfologicznie zdrową komórkę, dostosuj pozycję Z i zobrazuj próbkę komórki w jasnym oświetleniu pola. Przytnij pole widzenia, aby uchwycić docelowe jądro komórki. Korzystając z oświetlenia laserowego, dostosuj kąt TIRF, aby uzyskać oświetlenie Hilo z optymalnym stosunkiem sygnału do szumu pojedynczej cząsteczki.

Następnie ustaw czas naświetlania na 500 milisekund. W martwym czasie między klatkami foto aktywuje cząsteczki wiązką o mocy 111 mikrowatów i długości 405 nanometrów. A podczas każdej ekspozycji wzbudzaj cząsteczki H2B-Halo wiązką o mocy 9,1 miliwata i długości nanometra 640 nanometrów.

Rozpocznij przechwytywanie obrazu przez 2000 klatek w sposób ciągły i stopniowo zwiększaj moc wiązki 405 nanometrów po redukcji cząsteczek aktywowanych zdjęciem. W przypadku interesującego nas białka oznaczonego halo, należy rozdzielić długości fal emisji między dwie kamery za pomocą długoprzepustowego zwierciadła dichroicznego. Do tych samych parametrów akwizycji, które pokazano wcześniej, dodaj kanał JFX549, aby rejestrować jedną klatkę co 10 sekund i przechwytywać 2000 klatek w sposób ciągły.

Na początek wykonaj obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów białkowych oznaczonych Halo na żywych komórkach. Korzystając z obrazu J, przekonwertuj każdy kanał z pliku surowych danych obrazowania na niezależny plik TIFF. W razie potrzeby uruchom grzebień do wstępnego śledzenia.

i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zastąpić wszystkie ramki najnowszymi ramkami. Aby szybko załadować plik filmowy z pojedynczą cząsteczką, kliknij przycisk Załaduj, a następnie stos obrazów. Ustaw parametry lokalizacji i akwizycji w odpowiednich arkuszach opcji.

Wizualizuj lokalizacje wszystkich cząsteczek i za pomocą zablokuj wszystko, wygeneruj plik zawierający lokalizacje wszystkich cząsteczek w każdej klatce. Następnie przejdź do załaduj, danych cząstek i wybierz slim fast, aby załadować plik z lokalizacją w ustawieniach akwizycji. Korzystając ze śledzenia opcji i arkuszy, dostosuj parametry generowania trajektorii.

Kliknij gen traj, aby wygenerować plik zawierający trajektorie wszystkich cząsteczek. Załaduj plik śledzony arkusza do eval SPT i ustaw parametry, aby odfiltrować trajektorie krótsze niż 2,5 sekundy. Korzystając z eksportu danych, wygeneruj plik ze wszystkimi przefiltrowanymi trajektoriami.

Uruchamiając imageJmacronucleusnclustermaskv2.0. txt, proguj wszystkie klatki filmu zarejestrowane w kanale JFX549, aby wygenerować film poklatkowy wypełniony maską binarną ewoluującą w czasie podświetlającą lokalizacje kondensatu. Korzystając z konwersji CSS 3.3 z wolnym śledzeniem ASCII, ponownie sformatuj trajektorie i uruchom kategoryzację w wersji 4.

m, aby posortować je na podstawie czasu życia, jaki cząsteczka spędza w kondensacie. Następnie, za pomocą plotresidencehistcss. m, wyodrębnij obserwowaną szybkość dysocjacji specyficznie związanych cząsteczek i szybkość fotowybielania z interesującego białka w kondensacie i trajektorii H2B.

Na koniec należy obliczyć skorygowany średni czas przebywania białka będącego przedmiotem zainteresowania, specyficznie związanego z jego kondensatami. Klatka z dwukolorowego filmu z pojedynczą cząsteczką TAF15-IDR-Halo-FTH1 pokazuje sygnały z jądra w obu kanałach PA-JF646 i JFX549. Po złożeniu i sortowaniu zaobserwowano wyraźne rozróżnienie trajektorii wykrytych przez PA-JF646 cząsteczek związanych z kondensatami.

Obliczony średni czas przebywania po korekcie do fotowybielania był większy dla TAF15-Halo-FTH1 niż Halo-TAF15.