Name: Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj metodę jednocząsteczkowej mikroskopii do badania dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach ludzkich. Technika ta pozwala ilościowo określić czas rezydencji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach grantu nr. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), Mallinckrodt Research Grant (S.C.) oraz Margaret E. Grant Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. jest również wspierany przez NIH/NCI w ramach nagrody numer P30CA016042.

1. Znakowanie białek w komórkach
<ol>
	<li>Wyrazić białko docelowe połączone z HaloTag w pożądanej linii komórkowej.</li>
	<li>Stabilnie wyrazić H2B z tagiem Halo w tym samym typie komórek co w punkcie 1.1, wykorzystując transpozony lub transdukcję wirusową.</li>
</ol>
2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Przed użyciem szkiełek nakrywkowych do hodowli komórkowych należy je oczyścić w celu usunięcia zanieczyszczeń autofluorescencyjnych.
	<ol>
		<li>Zamocuj szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm, nr 1.5, na ceramicznej kasetce do barwienia i umieść w pojemniku z polipropylenu.</li>
		<li>Całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w 1 M roztworze KOH i poddaj sonikacji przez 1 h.</li>
		<li>Przepłucz szkiełka nakrywkowe trzykrotnie wodą dwukrotnie destylowaną (ddH2O).</li>
		<li>Całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w 100% etanolu i poddaj sonikacji przez 1 h.</li>
		<li>Całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w 20% etanolu rozcieńczonym ddH2O i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do mikroskopii
UWAGA: Kroki z tej sekcji należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zapobiec kontaminacji komórek.
<ol>
	<li>Wysiej komórki na oczyszczonych szkiełkach dekrywacyjnych. Wykonaj tę czynność 2 dni przed obrazowaniem, jeśli białko z tagiem Halo ma być wyrażone przejściowo. Wykonaj tę czynność 1 dzień przed obrazowaniem, jeśli białko z tagiem Halo jest wyrażane stabilnie lub endogennie.
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnej pęsety umieść szkiełka dekrywacyjne w płytce 6-dołkowej (jedno szkiełko na dołek dla każdej próbki komórek) i poczekaj, aż resztki etanolu odparują.</li>
		<li>W każdym dołku wysiej odpowiednią liczbę komórek, aby osiągnąć 70% konfluencji w momencie obrazowania. W dodatkowym dołku wysiej komórki stabilnie wyrażające H2B-Halo z docelowo taką samą konfluencją.</li>
		<li>Wykonaj ten krok tylko w przypadku przejściowej ekspresji białka z tagiem Halo. Inkubuj komórki przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnie przetransfekuj komórki plazmidem kodującym białko z tagiem, używając odpowiednich odczynników do transfekcji i zgodnie z wytycznymi producenta.</li>
		<li>Inkubuj komórki przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbarw komórki wyrażające białko z tagiem Halo zarówno ligandem Halo niepodatnym na fotoaktywację (np. JFX549), jak i ligandem Halo podatnym na fotoaktywację (np. PA-JF646). Komórki wyrażające H2B-Halo zbarw wyłącznie ligandem Halo podatnym na fotoaktywację. 
	UWAGA: Podane tutaj stężenia ligandów Halo powinny służyć jako punkt wyjścia; optymalne stężenie będzie zależeć od poziomu ekspresji oraz lokalnego stężenia białka wewnątrz kondensatu.
	<ol>
		<li>Dla każdej próbki komórek wyrażających białko z tagiem Halo rozcieńcz 100 nM ligandu Halo JFX54935 oraz 20 nM ligandu Halo PA-JF64636 w 500 µL odpowiedniej pożywki komórkowej. Dla każdej próbki wyrażającej H2B-Halo rozcieńcz tylko 20 nM ligandu Halo PA-JF646 w 500 µL odpowiedniej pożywki komórkowej.</li>
		<li>W każdym dołku odessaj istniejącą pożywkę, dodaj 2 mL 1x PBS, następnie odessaj PBS (czynność ta jest w dalszej części protokołu określana jako „płukanie”) i zastąp ją pożywką zawierającą odpowiednie ligandy Halo.</li>
		<li>Inkubuj przez 1 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
		<li>Przepłucz PBS cztery razy i zastąp go świeżą pożywką niezawierającą ligandów Halo.</li>
		<li>Inkubuj przez 15 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.2.4 i 3.2.5 trzy razy (łącznie cztery cykle płukania i inkubacji).</li>
		<li>Za pomocą sterylnej pęsety przenieś szkiełko z komórkami do komory do szkiełek dekrywacyjnych do hodowli komórkowych, kompatybilnej z zespołem mikroskopowym.</li>
		<li>Dodaj do komory pożywkę bez czerwieni fenolowej i przystąp do obrazowania. Próbki, które nie będą obrazowane natychmiast, inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu ich użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek
UWAGA: Niezależne eksperymenty mierzące czasy rezydencji zarówno H2B, jak i białka zainteresowania powinny być prowadzone przez kilka (≥3) dni, aby uzyskać statystycznie istotne wyniki. Przed obrazowaniem próbek komórkowych pod mikroskopem należy wyrównać obie kamery, używając barwionych mikrosfer o średnicy 0,1 µm (Tabela materiałów) lub podobnego wzorca kalibracyjnego.
<ol>
	<li>Przygotowanie mikroskopu.
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop oraz komputer sterujący mikroskopem.</li>
		<li>Włącz komponenty inkubacyjne do żywych komórek (grzałkę i CO2) w mikroskopie i ustaw je na 37 °C oraz 5% CO2. Odczekaj do ustabilizowania się systemu.</li>
		<li>Nałóż kroplę odpowiedniego olejku na obiektyw TIRF z imersją olejową 100x w mikroskopie i umieść próbkę komórek na stoliku mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybór komórki do obrazowania.
	<ol>
		<li>Obrazuj próbkę komórek w oświetleniu w jasnym polu i reguluj pozycję z, aż komórki znajdą się w ognisku.</li>
		<li>Zidentyfikuj komórkę wykazującą cechy morfologiczne komórek zdrowych.</li>
		<li>Wykadruj pole widzenia (FOV) tak, aby obejmowało ono tylko jądro docelowej komórki.</li>
		<li>Użyj oświetlenia laserowego i reguluj kąt TIRF, aż zostanie osiągnięte oświetlenie HILO41 z optymalnym stosunkiem sygnału do szumu dla pojedynczych cząsteczek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie H2B-Halo w żywych komórkach. 
	UWAGA: Moce laserów użyte w tej sekcji są specyficzne dla tego eksperymentu i podano je jako przykład. Odpowiednie moce laserów należy dobrać zgodnie z kryteriami opisanymi w dyskusji.
	<ol>
		<li>Skonfiguruj parametry akwizycji w następujący sposób. Ustaw czas ekspozycji na 500 ms. Podczas każdej 500 ms ekspozycji wzbudzaj cząsteczki H2B-Halo znakowane PA-JF646 wiązką 9,1 mW o długości fali 640 nm. W czasie martwym między klatkami (158,01 µs w używanym tutaj systemie obrazowania) fotoaktywuj cząsteczki wiązką 111 µW o długości fali 405 nm.</li>
		<li>Przechwyć w sposób ciągły 2000 klatek przy tych ustawieniach. Stopniowo zwiększaj moc wiązki 405 nm w trakcie akwizycji, gdy liczba fotoaktywowanych cząsteczek stanie się niewystarczająca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie białka docelowego z tagiem Halo w żywych komórkach.
	<ol>
		<li>Użyj dichroicznego lustra długoprzepustowego, aby rozdzielić długości fal emisji pomiędzy dwie kamery: jedną do detekcji PA-JF646 i drugą do detekcji JFX549. Przed kamerami zastosuj odpowiednie filtry emisyjne.</li>
		<li>Użyj tej samej konfiguracji akwizycji opisanej w punkcie 4.3.1 z następującą modyfikacją. Dodaj dodatkowy kanał JFX549, aby śledzić lokalizację kondensatów białka z tagiem Halo w czasie. Co 10 s przejmij jedną klatkę (500 ms, 2,1 mW, wzbudzenie 561 nm) w kanale JFX549, kontynuując jednocześnie akwizycję w kanale PA-JF646. Spowoduje to przenikanie sygnału (bleedthrough) do kanału PA-JF646, co zostanie uwzględnione podczas analizy danych po akwizycji.</li>
		<li>Przechwyć w sposób ciągły 2000 klatek przy tych ustawieniach. Stopniowo zwiększaj moc wiązki 405 nm w trakcie akwizycji, gdy liczba fotoaktywowanych cząsteczek stanie się niewystarczająca.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek
UWAGA: Parametry stosowane w sekcji 5 są specyficzne dla tego eksperymentu i zostały podane jako przykład. Odpowiednie parametry należy dobrać zgodnie z kryteriami wymienionymi w dyskusji.
<ol>
	<li>Przygotowanie surowych danych obrazowych do przetwarzania.
	<ol>
		<li>W przypadku danych dotyczących białka zainteresowania, przekonwertuj każdy kanał z pliku surowych danych obrazowych na niezależny plik .tif przy użyciu ImageJ lub podobnego oprogramowania do przetwarzania obrazów. Dla danych H2B w ten sam sposób przekonwertuj pojedynczy kanał z pliku surowych danych obrazowych na plik .tif. 
		UWAGA: W zależności od używanego oprogramowania do akwizycji, w filmie z kondensatami mogą występować puste klatki, ponieważ klatka śledząca kondensat jest pobierana tylko raz na 10 s. Puste klatki należy uzupełnić najnowszą klatką kondensatu (niektóre oprogramowania do akwizycji robią to automatycznie). Ponadto, jeśli podczas tych klatek śledzenia kondensatów występuje znaczny przesłuch (bleedthrough) z kanału kondensatu (JFX549) do kanału pojedynczych cząsteczek (PA-JF646), odpowiadające im klatki pojedynczych cząsteczek należy zastąpić najnowszą klatką pojedynczych cząsteczek.</li>
		<li>Jeśli w którymkolwiek z filmów istnieją klatki wymagające zastąpienia z powyższych powodów, zastąp je najnowszą klatką z tego filmu, modyfikując (jeśli to konieczne) i uruchamiając pretracking_comb.txt, makro ImageJ dostępne w Chong et al.1, a następnie postępując zgodnie z instrukcjami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie trajektorii pojedynczych cząsteczek przy użyciu oprogramowania SPT, np. SLIMfast39, implementacji GUI algorytmu MTT38 dostępnej w Teves et al.42.
	<ol>
		<li>Załaduj plik z punktu 5.1.2 zawierający film z pojedynczymi cząsteczkami do SLIMfast, klikając Load &gt; Imagestack.</li>
		<li>Ustaw parametry lokalizacji (localization error rate: 10-6; deflation loops: 3), klikając OPT &gt; Sheet: Localization.</li>
		<li>Ustaw parametry akwizycji (peak emission: 664 nm; lag time: 500 ms), klikając OPT &gt; Sheet: Acquisition.</li>
		<li>Zwizualizuj lokalizacje wszystkich cząsteczek w pojedynczej klatce, aby upewnić się, że wybrane parametry są odpowiednie (TEST LOC). Jeśli są niewłaściwe, zmodyfikuj parametry w krokach 5.2.2 i 5.2.3 i powtórz ten krok.</li>
		<li>Wygeneruj plik zawierający lokalizacje wszystkich cząsteczek w każdej klatce (LOC ALL).</li>
		<li>Załaduj plik z punktu 5.2.5 do SLIMfast, klikając Load &gt; Particle Data &gt; SLIMfast.</li>
		<li>Ustaw parametry generowania trajektorii (maximum expected diffusion coefficient: 0.1 µm2/s; maximum number of competitors: 5), klikając OPT &gt; Sheet: Tracking.</li>
		<li>Wygeneruj plik zawierający trajektorie wszystkich cząsteczek (GEN TRAJ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odfiltrowanie trajektorii krótszych niż tmin, 2.5 s, przy użyciu evalSPT39, dostępnego w Drosopoulos et al.43, aby uwzględnić błędy śledzenia skutkujące sztucznie krótkimi trajektoriami.
	<ol>
		<li>Załaduj plik z punktu 5.2.8 do evalSPT (+ &gt; plik z 5.2.8 &gt; OK).</li>
		<li>Ustaw parametry (min: 5 klatek; max: maksymalna długość trajektorii dla pliku z 5.2.8), aby odfiltrować trajektorie krótsze niż 2.5 s.</li>
		<li>Wygeneruj plik ze wszystkimi odfiltrowanymi trajektoriami (EXPORT DATA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj ten krok tylko dla trajektorii białka zainteresowania. Podziel trajektorie na te znajdujące się w kondensatach i poza kondensatami, a następnie wyznacz średni czas rezydencji w kondensacie. 
	UWAGA: Wszystkie kody dla tej sekcji są dostępne w Chong et al.1.
	<ol>
		<li>Zastosuj progowanie (threshold) do wszystkich klatek filmu zarejestrowanego w kanale JFX549, aby wygenerować film time-lapse z ewoluującą w czasie maską binarną zaznaczającą lokalizacje kondensatów, uruchamiając makro ImageJ dla jądra i klastrów mask_v2.txt i postępując zgodnie z instrukcjami.</li>
		<li>Zmień format trajektorii pojedynczych cząsteczek wygenerowanych w punkcie 5.3.3 przy użyciu skryptu MATLAB ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, dostosowując nazwy plików, ścieżki i parametry zgodnie z potrzebą. (Parametry: Exposure, 0.5 s; Resolution, 0.16 µm/pixel).</li>
		<li>Posortuj trajektorie na podstawie frakcji czasu życia, którą dana cząsteczka spędza w kondensacie (F), używając skryptu MATLAB categorization_v4.m i dostosowując nazwy plików oraz ścieżki zgodnie z potrzebą.</li>
		<li>Kontynuuj, używając wyłącznie trajektorii w obrębie kondensatów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznacz kobs,s oraz kpb i oblicz skorygowany średni czas rezydencji, <img alt="równowaga statyczna, wzór ΣFx=0, ΣFy=0, schemat, analiza sił, bilans, koncepcja inżynieryjna" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 6">.
	<ol>
		<li>Wyznacz kobs,s z trajektorii białka zainteresowania w kondensatach przy użyciu skryptu MATLAB PLOT_ResidenceHist_css.m, dostosowując nazwy plików, ścieżki i parametry zgodnie z potrzebą. 
		(Parametry: Exposure, 0.5 s; StartFrameForFit, 5 klatek).</li>
		<li>Wyznacz kpb z trajektorii H2B przy użyciu skryptu MATLAB PLOT_ResidenceHist_css.m, dostosowując nazwy plików, ścieżki i parametry zgodnie z potrzebą. 
		(Parametry: Exposure, 0.5 s; StartFrameForFit, 5 klatek).</li>
		<li>Oblicz skorygowany średni czas rezydencji białka zainteresowania specyficznie związanego z jego kondensatami, <img alt="równowaga statyczna, wzór ΣFx=0, ΣFy=0, schemat, analiza sił, bilans, koncepcja inżynieryjna" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 6">, jako 
		<img alt="Równanie równowagi statycznej τ̅ₛ=1/(kₒᵦₛ,ₛ−kₚb); wzór, analiza kinetyczna, schemat." src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 7"> 
		UWAGA: Należy przeprowadzić kontrole w celu weryfikacji, czy różne czasy ekspozycji wystarczająco długie, aby rozmyć ruchome cząsteczki, na przykład 300 ms i 800 ms, nadal dają ten sam średni czas rezydencji białka zainteresowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Live Cell Single-Molecule Imaging-Based Quantification of Protein Interactions

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół przedstawiony w niniejszej formie został opracowany dla systemów podobnych do tych badanych przez Irgen-Gioro i współpracowników40. W zależności od zastosowania niektóre elementy protokołu mogą zostać zmodyfikowane, np. metoda generowania linii komórkowych znakowanych fluorescencyjnie, system znakowania fluorescencyjnego oraz rodzaj zastosowanego szkiełka nakrywkowego. Znakowanie białka w komórce za pomocą Halo-tagu można przeprowadzić dwiema strategiami, w zależności od tego, która jest bardziej odpowiednia dla danego eksperymentu. 1) Ekspresja egzogenna: fuzja białka zainteresowania z HaloTagiem i ekspresja białka fuzyjnego w docelowej linii komórkowej, albo przejściowo za pomocą transfekcji, albo stabilnie przy użyciu transposonów lub transdukcji wirusowej. 2) Edycja genomu: wprowadzenie HaloTagu w locus genu kodującego endogenne białko zainteresowania w docelowej linii komórkowej przy użyciu technik edycji genomu, np. CRISPR44. Zalety i wady każdej z tych metod są omawiane w innym miejscu45, jednak w skrócie: strategia ekspresji egzogennej jest mniej czasochłonna, ale prowadzi do powstania populacji komórek o szerokim zakresie poziomów ekspresji, które często są niefizjologiczne. Strategia edycji genomu trwa znacznie dłużej, ale pozwala na znakowanie endogennie eksponowanych białek zainteresowania na ich natywnych poziomach ekspresji.
Ponadto protokół ten nie wymaga specyficznie zastosowania HaloTag; jest on natomiast kompatybilny z każdym tagiem umożliwiającym jednoczesne znakowanie pojedynczych cząsteczek oraz zespołów tej samej białka w komórce. W związku z tym protokół może zostać zmodyfikowany w celu zastosowania innych tagów samoznakujących, takich jak SNAP-tag46. Wreszcie, zamiast komór z szkiełkami nakrywkowymi można użyć wstępnie oczyszczonych, komercyjnych naczyń do hodowli komórkowych z szklanym dnem, takich jak naczynia MatTek (MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C), pod warunkiem, że są one kompatybilne z obiektywem mikroskopu i olejem imersyjnym; jednak szkiełka nakrywkowe można dokładniej oczyścić bezpośrednio przed użyciem, dlatego są one preferowane.
Choć powyższe modyfikacje protokołu są opcjonalne, istnieją parametry eksperymentalne i analityczne, które muszą zostać zoptymalizowane, a mianowicie: stężenia ligandów HaloTag, moc laserów, parametry lokalizacji i śledzenia oraz tmin. Stężenie niefotoaktywnego ligandu HaloTag powinno być dobrane tak, aby kondensat był oznakowany wystarczająco gęsto, co umożliwi wygenerowanie maski. Stężenie fotoaktywnego ligandu HaloTag oraz moc lasera do fotoaktywacji powinny być dobrane tak, aby cząsteczki białek były oznakowane i fotoaktywowane na tyle rzadko, by możliwe było wygenerowanie wysokiej jakości trajektorii pojedynczych cząsteczek, ponieważ nadmiar lokalizacji w każdej klatce spowoduje nieprawidłowe generowanie trajektorii. W eksperymentach przedstawionych w reprezentatywnych wynikach zazwyczaj występowało mniej niż pięć lokalizacji na klatkę. Moc lasera wzbudzającego powinna być utrzymywana na poziomie na tyle niskim, aby zminimalizować szybki fotobleaching, ale na tyle wysokim, aby precyzyjnie lokalizować pojedyncze cząsteczki. Parametry lokalizacji i śledzenia pojedynczych cząsteczek powinny być dostosowane w zależności od gęstości wzbudzeń i oczekiwanej dynamiki dyfuzji badanego białka. Na koniec wartości <img alt="równowaga statyczna, wzór ΣFx=0, ΣFy=0, schemat, analiza sił, bilans, koncepcja inżynieryjna" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 6"> powinny zostać obliczone dla zakresu tmin (zaczynając od 0 s i zwiększając w interwałach czasu ekspozycji). Wartości <img alt="równowaga statyczna, wzór ΣFx=0, ΣFy=0, schemat, analiza sił, bilans, koncepcja inżynieryjna" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 6"> powinny zbiegać się powyżej pewnego progu tmin; to tmin należy zastosować w kroku 5.3.
Opisana tutaj metoda pozwala na ilościowe określenie dynamiki oddziaływań białek wewnątrz kondensatów z precyzją nieosiągalną dla konwencjonalnych technik. Dodatkowo może być ona stosowana w żywych komórkach przy minimalnym zaburzeniu próbek. Jest to kluczowe, ponieważ zachowania interakcyjne IDR, w tym tworzenie kondensatów, są w wysokim stopniu zależne od ich lokalnego środowiska40.
Reprezentatywne wyniki uzyskane przez Irgen-Gioro i wsp.40 demonstrują zdolność tej metody do wyznaczania czasów rezydencji białek wiążących się z ich własnymi kondensatami LLPS. Co istotne, metoda ta może być łatwo rozszerzona na dowolne białko wiążące się z dowolnym typem kondensatów poprzez oddziaływania homotypowe lub heterotypowe. Ponadto nie ogranicza się ona jedynie do pomiaru dynamiki oddziaływań białek ulegających LLPS. Wykazano, że onkoprotein fuzyjny EWS::FLI1, który powoduje mięsak Ewinga, tworzy lokalne centra o wysokim stężeniu, odgrywające kluczową rolę w jego aktywacji transkrypcyjnej i funkcjach transformacji onkogennej1,2. Chociaż tworzenie tych centrów jest napędzane przez przejściowe, selektywne i wielowartościowe oddziaływania IDR-IDR białka EWS::FLI1, do tej pory nie dostarczono przekonujących dowodów na to, że są one właściwymi kondensatami LLPS1,2. Mimo to, wykorzystaliśmy przedstawioną tutaj metodę do pomiaru średniego czasu rezydencji EWS::FLI1 w jego centrach i wykazaliśmy, że mutacja specyficznych reszt oraz delecja jego IDR znacząco destabilizują wiązanie EWS::FLI1 z tymi centrami1.
Pomimo wszechstronności tej metody w charakteryzowaniu dynamiki wiązania białek wewnątrz kondensatów, przy wyborze modelu wiązania białek w konkretnych kontekstach należy zachować ostrożność. Istniejące dane biochemiczne wspierają tezę, że dwuskładnikowy rozkład wykładniczy jest często odpowiednim modelem dla wielu układów1,37,40,42, jednak wykazano również, że ten sam rozkład jest niewłaściwą reprezentacją wiązania białek w innych układach, w których obserwacje eksperymentalne lepiej odpowiadają modelom alternatywnym, takim jak rozkłady trzyskładnikowe wykładnicze47,48,49 oraz rozkłady potęgowe50. Aby uniknąć wyciągnięcia błędnych wniosków, należy starannie dobrać i uzasadnić model, zweryfikować, czy jakość dopasowania wspiera zastosowanie danego modelu, oraz rozważnie interpretować wyniki.

Coraz więcej doniesień sugeruje, że kondensaty biomolekularne odgrywają istotną rolę w organizacji komórkowej i licznych funkcjach komórki, np. w regulacji transkrypcyjnej1,2,3,4,5, naprawie uszkodzeń DNA6,7,8, organizacji chromatyny9,10,11,12, inaktywacji chromosomu X13,14,15 oraz w przekaźnictwie wewnątrzkomórkowym16,17,18. Ponadto dysregulacja kondensatów biomolekularnych jest powiązana z wieloma chorobami, w tym z nowotworami19,20,21 i schorzeniami neurodegeneracyjnymi22,23,24,25,26. Tworzenie kondensatów jest często napędzane przez przejściowe, selektywne i wielowartościowe oddziaływania białko-białko, białko-kwas nukleinowy lub kwas nukleinowy-kwas nukleinowy27. W określonych warunkach oddziaływania te mogą prowadzić do separacji faz ciecz-ciecz (LLPS), czyli przejścia gęstościowego, które lokalnie wzbogaca konkretne biomolekuły w bezmembranowych kropelkach. Takie wielowartościowe oddziaływania są często pośredniczone przez regiony nieustrukturyzowane (IDRs) białek1,28,29. Biofizyczna charakterystyka tych oddziaływań na poziomie molekularnym jest kluczowa dla zrozumienia licznych prawidłowych i zaburzonych funkcji komórkowych, biorąc pod uwagę powszechność kondensatów w tych procesach. Chociaż techniki oparte na konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, np. fluorescencyjny powrót po fotobleachingu (FRAP)30,31,32, były szeroko stosowane do jakościowego wykazania, że wymiana molekularna między kondensatami a otaczającym środowiskiem komórkowym jest dynamiczna, kwantyfikacja dynamiki oddziaływań konkretnych biomolekuł wewnątrz kondensatów nie jest zazwyczaj możliwa przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii pojedynczych cząsteczek bez specjalistycznych metod analizy danych. Technika śledzenia pojedynczych cząsteczek (SPT) opisana w niniejszym protokole opiera się na mikroskopii pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach33 i stanowi wyjątkowo potężne narzędzie do kwantyfikacji dynamiki oddziaływań między konkretnymi białkami wewnątrz kondensatów. Wynikiem pomiaru SPT w takim przypadku jest średni czas przebywania białka zainteresowania w kondensatach.
Protokół można podzielić na dwie części: akwizycję danych oraz analizę danych. Pierwszym krokiem akwizycji danych obrazowych jest ekspresja w komórkach białka zainteresowania połączonego z HaloTag34. Umożliwia to znakowanie białka zainteresowania dwoma fluoroforami, z czego większość cząsteczek białka ma zostać oznakowana fluoroforem niefotoaktywnym (np. ligandem Halo JFX54935), a niewielka ich część fluoroforem fotoaktywnym o odmiennym widmie (np. ligandem Halo PA-JF64636). Pozwala to na jednoczesne obrazowanie wszystkich lokalizacji kondensatów w komórce oraz rejestrację filmów pojedynczych cząsteczek białka zainteresowania wiążących się i odwiązujących od kondensatów. Równocześnie ten sam typ komórek jest modyfikowany w celu stabilnej ekspresji H2B z tagiem Halo, histony tego typu są w dużej mierze nieruchome na chromatynie. Komórki są następnie barwione ligandem Halo PA-JF646, aby umożliwić obrazowanie pojedynczych cząsteczek H2B. Jak zostanie szczegółowo omówione poniżej, eksperyment ten uwzględnia wpływ fotobleachingu, co pozwala na precyzyjną kwantyfikację dynamiki oddziaływań białka zainteresowania. Komórki do eksperymentów obrazowych muszą następnie zostać wyhodowane na czystych szkiełkach nakrywkowych, zabarwione ligandem (ligandami) HaloTag i umieszczone w komorze do obrazowania żywych komórek. Następnie próbka jest obrazowana przy użyciu oświetlenia warstwą optyczną o dużym nachyleniu i laminacji (HILO) na mikroskopie fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF), zdolnym do obrazowania dwukanałowego i detekcji pojedynczych cząsteczek. Emisja jest następnie rozdzielana na dwie kamery: jedna śledzi pozycje kondensatów, a druga śledzi pojedyncze cząsteczki. Akwizycja jest przeprowadzana z długim czasem integracji (rzędu setek ms), aby rozmyć białka swobodnie dyfundujące i zarejestrować jedynie białka o mniejszej mobilności z powodu wiązania ze stabilnymi strukturami w komórce37.
Pierwszym krokiem analizy danych jest zastosowanie uznanego algorytmu śledzenia pojedynczych cząsteczek (SPT)38,39 w celu lokalizacji poszczególnych cząsteczek białek w każdej klatce filmu i zestawienia tych lokalizacji w trajektorię dla każdej cząsteczki w czasie jej wykrywalności. Trajektorie są następnie dzielone na te reprezentujące cząsteczki wewnątrz i te reprezentujące cząsteczki na zewnątrz kondensatów poprzez porównanie lokalizacji cząsteczek w trakcie ich trajektorii z lokalizacjami wszystkich kondensatów w odpowiadających im punktach czasowych1.
Następnie, wykorzystując długości wszystkich trajektorii w kondensacie, generowana jest krzywa przeżycia (1 - CDF). Pozorny średni czas przebywania cząsteczek jest następnie wyznaczany poprzez dopasowanie krzywej przeżycia do następującego dwuskładnikowego modelu wykładniczego wiązania białek,
<img align="center" alt="Równanie wykładniczego zaniku dla kinetyki zwijania białek; wzór ze stałymi zaniku kobsns, kobss." src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">,
gdzie A jest frakcją cząsteczek związanych nieswoiście, a kobs,ns i kobs,s to odpowiednio obserwowane stałe szybkości dysocjacji cząsteczek związanych nieswoiście i swoiście. W dalszej części analizy uwzględniono jedynie kobs,s. Dynamika zarówno dysocjacji białka, ktrue,s, jak i fotoblaknięcia fluoroforu, kpb, wpływają na kobs,s w następujący sposób:
<img alt="Schemat równania kinetycznego dla obserwowanej stałej szybkości, k_obs = k_true + k_pb." src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">;
Zatem, aby wyizolować efekty dysocjacji białka, zmierzono specyficzną szybkość dysocjacji H2B-Halo w linii komórkowej wspomnianej wcześniej.
<img alt="Równanie wykładniczego zaniku, P(t), dla analizy kinetycznej w dopasowywaniu danych spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3">
H2B jest białkiem, które stabilnie integruje się z chromatyną i wykazuje minimalną dysocjację w skali czasowej akwizycji filmu z pojedynczych cząsteczek37. Jego specyficzna szybkość dysocjacji jest zatem równa szybkości fotowybielania liganda PA-JF646 Halo, czyli
<img alt="Równanie kinetyki chemicznej, przedstawiające porównanie stałych szybkości, \(k_{pb} = k_{H2B,s}\)." src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 4">.
Średni czas przebywania białka docelowego w kondensacie, <img alt="równowaga statyczna, wzór ΣFx=0, ΣFy=0, schemat, analiza sił, bilans, koncepcja inżynieryjna" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 5">, wynosi zatem
<img alt="Wzór na stałą czasową τs=1/k_true,s=1/(k_obs,s-k_pb), równanie dla analizy kinetycznej." src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 6">.
Przedstawiono reprezentatywne wyniki z pracy Irgen-Gioro i wsp.40, w której protokół ten zastosowano, aby wykazać, że połączenie domeny oligomeryzacyjnej z IDR skutkuje dłuższym czasem przebywania IDR w kondensatach. Wynik ten sugeruje, że dodana domena oligomeryzacyjna stabilizuje homotypowe oddziaływania IDR, które napędzają LLPS. W zasadzie tę samą metodę z lekko zmodyfikowanymi protokołami można zastosować do charakteryzacji oddziaływań homotypowych lub heterotypowych każdego białka uczestniczącego w tworzeniu dowolnych rodzajów kondensatów.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mikro; m TetraSpeck mikrosfera</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek</td></tr> o <tr><td>średnicy 25 mm, #1,5 Szkiełka nakrywkowe</td><td>Marienfeld Superior</td><td>111650</td><td>Przygotowanie szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy 593/40 nm</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek</td></tr><tr><td>Filtr pasmowoprzepustowy 676/37 nm</td><td>Semrock</td><td>FF01-676/37-25</td><td>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek</td></tr><tr><td>6-dołkowe Płytka TC</td><td>Genesee</td><td>25-105MP</td><td>Przygotowanie komórek do mikroskopii</td></tr><tr><td>Linia komórkowa: U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Znakowanie białek w komórkach</td></tr><tr><td>ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m</td><td></td><td></td><td>Analiza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Chong et al., 2018</td></tr><tr><td>Stojak do barwienia szkła nakrywkowego</td><td>Thomas</td><td>24957</td><td>Przygotowanie szkiełek</td></tr> <tr><td>nakrywkowychDeuterowana Janelia Fluor 549 (JFX549)</td>Kampus <td></td><td>Badawczy Janelia</td><td>Przygotowanie komórek do mikroskopii</td></tr><tr><td>DMEM, Niska glukoza</td><td>Gibco</td><td>10-567-022</td><td>Znakowanie białek w komórkach: Zastosowane pożywki wzrostowe: DMEM z 5% płodową surowicą bydlęcą, 1% penstrep</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Eclipse Ti2-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek</td></tr><tr><td>Etanol 200 Proof</td><td>Lab Alley</td><td>EAP200-1GAL</td><td>Przygotowanie szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>evalSPT</td><td></td><td></td><td>Analiza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Drosopoulos i wsp., 2020</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Cytiva</td><td>SH30396.03</td><td>Znakowanie białek w komórkach: Zastosowane pożywki wzrostowe: DMEM z 5% płodową surowicą bydlęcą, 1% penstrep</td></tr><tr><td>Fidżi</td><td></td><td></td><td>Analiza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek</td></tr><tr><td>Ikon Ultra CCD Camera</td><td>Andor</td><td>X-13723</td><td>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek</td></tr><tr><td>Longpass dichroiczny beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>Di02-R635-25x36</td><td>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek: rozdzielacz wiązki czerwonej/dalekiej czerwieni</td></tr><tr><td>Jednostka laserowa LUN-F</td><td>Nikon</td><td></td><td>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek: 405/488/561/640</td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem MatTek</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Przygotowanie komórek do mikroskopii: 35 mm, #1,5 nasadka do hodowli komórek.</td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek: Oprogramowanie do akwizycji mikroskopu,</td></tr><tr><td>jądro i mask_v2.txt</td><td></td><td></td><td>klastra Analiza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Chong et al., 2018</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Znakowanie białek w komórkach: Zastosowane pożywki wzrostowe: DMEM z 5% płodową surowicą bydlęcą, 1% penstrep</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td> <td>buforowana fosforanemThermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td>Znakowanie białek w komórkach</td></tr><tr><td>Fotoaktywowany Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>Przygotowanie komórek do mikroskopii</td></tr><tr><td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td><td></td><td></td><td>Analiza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Chong et al., 2018</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6984-06</td><td>Przygotowanie szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>pretracking_comb.txt</td><td></td><td></td><td>Analiza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Chong et al., 2018</td></tr><tr><td>SLIMfast</td><td></td><td></td><td>Analiza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Teves et al., 2016</td></tr><tr><td>System inkubacji Stage-top</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek: Do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Rozdzielacz obrazu z podwójną emisją TwinCam</td><td>Cairn Research</td><td></td><td>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek</td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>Branson</td><td>5800</td><td>Przygotowanie szkiełek nakrywkowych</td></tr></tbody></table>

jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Kondensaty biomolekularne powstałe w wyniku separacji fazy ciecz-ciecz (LLPS) zostały uznane za kluczowe dla organizacji komórkowej i rosnącej liczby funkcji komórkowych. Scharakteryzowanie LLPS w żywych komórkach jest również ważne, ponieważ nieprawidłowa kondensacja jest powiązana z wieloma chorobami, w tym nowotworami i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. LLPS jest często napędzany przez selektywne, przejściowe i wielowartościowe interakcje między wewnętrznie nieuporządkowanymi białkami. Dużym zainteresowaniem cieszy się dynamika oddziaływań białek uczestniczących w LLPS, którą dobrze podsumowują pomiary ich czasu przebywania w wiązaniu (RT), czyli czasu, jaki spędzają związane w kondensatach. W tym miejscu przedstawiamy metodę opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek żywych komórek, która pozwala na pomiar średniej RT określonego białka w kondensatach. Jednocześnie wizualizujemy poszczególne cząsteczki białka i kondensaty, z którymi się łączą, używamy śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) do wykreślania trajektorii pojedynczych cząsteczek, a następnie dopasowujemy trajektorie do modelu wiązania białka z kropelką, aby wyodrębnić średnią RT białka. Na koniec pokazujemy reprezentatywne wyniki, w których zastosowano tę metodę obrazowania pojedynczej cząsteczki w celu porównania średnich RT białka w jego kondensatach LLPS po fuzji i niefuzji z domeną oligomeryzującą. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do pomiaru dynamiki interakcji dowolnego białka, które uczestniczy w LLPS.

W niniejszym pracy przedstawiamy reprezentatywne wyniki z badania Irgen-Gioro i wsp.40, w którym zastosowano ten protokół SPT w celu porównania dynamiki oddziaływań dwóch białek w ich odpowiednich kondensatach LLPS powstałych w wyniku samoorganizacji. TAF15 (czynnik 15 związany z białkiem wiążącym sekwencję TATA-box) zawiera IDR, który może ulegać LLPS po nadekspresji w komórkach ludzkich. Postawiliśmy hipotezę, że połączenie TAF15(IDR) z FTH1 (ciężki łańcuch ferrytyny 1), który tworzy oligomer składający się z 24 podjednostek, doprowadzi do bardziej stabilnych homotypowych oddziaływań białko-białko napędzających LLPS. Aby sprawdzić tę hipotezę, w komórkach U2OS transientnie wyeksprymowano albo Halo-TAF15(IDR), albo fuzję TAF15(IDR)-Halo-FTH1, a następnie przeprowadzono dwukolorową obrazowanie pojedynczych cząsteczek każdego białka zgodnie z powyższym protokołem. Reprezentatywna klatka z filmu TAF15(IDR)-Halo-FTH1 została przedstawiona na Rysunku 1A. Cząsteczki wykryte w kanale PA-JF646 zostały zlokalizowane, a następnie lokalizacje te zostały zgrupowane w trajektorie. Powstałe trajektorie podzielono na populacje wewnątrz kondensatu i poza kondensatem poprzez porównanie ich z maską binarną wskazującą lokalizację kondensatów (Rysunek 1B). Choć dla lepszej widoczności pokazujemy tylko niewielką część trajektorii, istnieje wyraźna różnica między trajektoriami cząsteczek związanych z kondensatami a tych związanych poza nimi. Następnie krzywą przeżycia długości trajektorii wewnątrz kondensatu dopasowano do dwuskładnikowego modelu wykładniczego (Rysunek 1C). Na koniec wyznaczono i wykreślono średnie czasy przebywania po korekcie o fotoblaknięcie dla obu białek (Rysunek 1D). Stwierdzono, że średni czas przebywania Halo-TAF15(IDR) w kondensatach LLPS wynosił 10,23 s ± 1,10 s, podczas gdy dla TAF15(IDR)-Halo-FTH1 wynosił on 64,15 s ± 11,65 s. Wynik ten sugeruje, że dodanie domeny oligomeryzującej do TAF15(IDR) rzeczywiście stabilizuje wiązanie białka z kondensatem.
<img alt="Analiza interakcji białek, obrazy mikroskopowe z etykietowaniem fluorescencyjnym, wykres krzywej przeżycia, wykres danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66169/66169fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Metoda oparta na SPT rozróżnia różnice w czasie rezydencji białek w ich kondensatach. A. Reprezentatywne klatki z dwukolorowego filmu pojedynczych cząsteczek TAF15(IDR)-Halo-FTH1. Białka zostały oznakowane kombinacją wyższego stężenia barwnika nieaktywnego fotochemicznie (100 nM JFX549, żółty) w celu wizualizacji lokalizacji kondensatów oraz niższego stężenia barwnika aktywnego fotochemicznie (20 nM PA-JF646, magenta) w celu wizualizacji pojedynczych białek, co umożliwiło zastosowanie SPT. Filmy w tych samych warunkach obrazowania zarejestrowano dla Halo-TAF15(IDR), a filmy jednokanałowe PA-JF646 zarejestrowano dla H2B-Halo. Biała przerywana linia obrysowuje jądro komórkowe. B. Reprezentatywny obraz scalony z nałożoną binarną maską pozycji kondensatu (szary) i trajektoriami (wielokolorowe). C. Reprezentatywna krzywa przeżycia TAF15(IDR)-Halo-FTH1 dopasowana do dwuskładnikowego modelu wykładniczego. D. Średni czas rezydencji Halo-TAF15 był znacząco krótszy niż czas rezydencji TAF15(IDR)-Halo-FTH1 w ich odpowiednich kondensatach. Wartość dla każdego białka uśredniono z 20 komórek zmierzonych w niezależnych eksperymentach przeprowadzonych w ciągu trzech dni. Błąd obliczono jako standardowy błąd średniej, a gwiazdka oznacza istotną różnicę w czasie rezydencji dwóch białek (p&lt;0.05, test suma rang Wilcoxona). Rysunek został zaadaptowany za zgodą Irgen-Gioro i współpracowników40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66169/66169fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

Nasze laboratorium ma na celu zrozumienie zachowań interakcyjnych wewnętrznie nieuporządkowanych regionów białkowych oraz ich roli w regulacji transkrypcji w zdrowych i chorych komórkach ludzkich. W naszym laboratorium opracowujemy i wykorzystujemy nowatorskie techniki mikroskopii jednocząsteczkowej w połączeniu z biologią molekularną, biochemicznym i proteomicznymi podejściami do badania kondensatów biomolekularnych. Protokół ten umożliwia ilościowe określenie dynamiki, w wyniku której określone białko wiąże się z określonym typem kondensatu w żywych komórkach ludzkich i ma szerokie zastosowanie do pomiaru dynamiki interakcji dowolnego białka, które uczestniczy w separacji ciekłej fazy ciekłej.Po utworzeniu linii komórkowych wyrażających interesujące nas białko znakowane Halo i Halo-H2B, przygotuj odczynnik do barwienia ligandów Halo osobno dla obu z nich. Przepłucz komórki dwoma mililitrami PBS. Dodaj ligand zawierający Halo i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę.Po usunięciu podłoża barwiącego przepłukać komórki czterokrotnie PBS i inkubować je ze świeżą pożywką pozbawioną ligandów Halo. Po czterech takich cyklach inkubacji płukania przenieś szkiełko nakrywkowe z komórkami do komory kompatybilnej ze stolikiem mikroskopowym ze sterylnymi kleszkami. Dodaj pożywkę wolną od czerwieni fenolowej do komory przed obrazowaniem.Na początek uzyskaj komórki barwiące ligand wyrażające białko znakowane Halo i Halo-H2B. Po włączeniu systemu mikroskopu należy ustawić parametry inkubacji żywych komórek i pozwolić systemowi się zrównoważyć. Umieść kroplę oleju na obiektywie TIRF 100x w mikroskopie i załaduj próbkę komórki na stolik mikroskopu.Aby zidentyfikować morfologicznie zdrową komórkę, dostosuj pozycję Z i zobrazuj próbkę komórki w jasnym oświetleniu pola. Przytnij pole widzenia, aby uchwycić docelowe jądro komórki. Korzystając z oświetlenia laserowego, dostosuj kąt TIRF, aby uzyskać oświetlenie Hilo z optymalnym stosunkiem sygnału do szumu pojedynczej cząsteczki.Następnie ustaw czas naświetlania na 500 milisekund. W martwym czasie między klatkami foto aktywuje cząsteczki wiązką o mocy 111 mikrowatów i długości 405 nanometrów. A podczas każdej ekspozycji wzbudzaj cząsteczki H2B-Halo wiązką o mocy 9,1 miliwata i długości nanometra 640 nanometrów.Rozpocznij przechwytywanie obrazu przez 2000 klatek w sposób ciągły i stopniowo zwiększaj moc wiązki 405 nanometrów po redukcji cząsteczek aktywowanych zdjęciem. W przypadku interesującego nas białka oznaczonego halo, należy rozdzielić długości fal emisji między dwie kamery za pomocą długoprzepustowego zwierciadła dichroicznego. Do tych samych parametrów akwizycji, które pokazano wcześniej, dodaj kanał JFX549, aby rejestrować jedną klatkę co 10 sekund i przechwytywać 2000 klatek w sposób ciągły.Na początek wykonaj obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów białkowych oznaczonych Halo na żywych komórkach. Korzystając z obrazu J, przekonwertuj każdy kanał z pliku surowych danych obrazowania na niezależny plik TIFF. W razie potrzeby uruchom grzebień do wstępnego śledzenia.i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zastąpić wszystkie ramki najnowszymi ramkami. Aby szybko załadować plik filmowy z pojedynczą cząsteczką, kliknij przycisk Załaduj, a następnie stos obrazów. Ustaw parametry lokalizacji i akwizycji w odpowiednich arkuszach opcji.Wizualizuj lokalizacje wszystkich cząsteczek i za pomocą zablokuj wszystko, wygeneruj plik zawierający lokalizacje wszystkich cząsteczek w każdej klatce. Następnie przejdź do załaduj, danych cząstek i wybierz slim fast, aby załadować plik z lokalizacją w ustawieniach akwizycji. Korzystając ze śledzenia opcji i arkuszy, dostosuj parametry generowania trajektorii.Kliknij gen traj, aby wygenerować plik zawierający trajektorie wszystkich cząsteczek. Załaduj plik śledzony arkusza do eval SPT i ustaw parametry, aby odfiltrować trajektorie krótsze niż 2,5 sekundy. Korzystając z eksportu danych, wygeneruj plik ze wszystkimi przefiltrowanymi trajektoriami.Uruchamiając imageJmacronucleusnclustermaskv2.0. txt, proguj wszystkie klatki filmu zarejestrowane w kanale JFX549, aby wygenerować film poklatkowy wypełniony maską binarną ewoluującą w czasie podświetlającą lokalizacje kondensatu. Korzystając z konwersji CSS 3.3 z wolnym śledzeniem ASCII, ponownie sformatuj trajektorie i uruchom kategoryzację w wersji 4.m, aby posortować je na podstawie czasu życia, jaki cząsteczka spędza w kondensacie. Następnie, za pomocą plotresidencehistcss. m, wyodrębnij obserwowaną szybkość dysocjacji specyficznie związanych cząsteczek i szybkość fotowybielania z interesującego białka w kondensacie i trajektorii H2B.Na koniec należy obliczyć skorygowany średni czas przebywania białka będącego przedmiotem zainteresowania, specyficznie związanego z jego kondensatami. Klatka z dwukolorowego filmu z pojedynczą cząsteczką TAF15-IDR-Halo-FTH1 pokazuje sygnały z jądra w obu kanałach PA-JF646 i JFX549. Po złożeniu i sortowaniu zaobserwowano wyraźne rozróżnienie trajektorii wykrytych przez PA-JF646 cząsteczek związanych z kondensatami.Obliczony średni czas przebywania po korekcie do fotowybielania był większy dla TAF15-Halo-FTH1 niż Halo-TAF15.

single-molecule-measurement-protein-interaction-dynamics-within

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje bezkalibracyjne podejście do ilościowego określania homo-oligomeryzacji białek in vitro na podstawie spektroskopii fluktuacji fluorescencji przy użyciu komercyjnej mikroskopii skaningowej światła. Wyświetlane są prawidłowe ustawienia akwizycji i metody analizy.

Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i oczyszczania białek znakowanych stabilnymi izotopami, a następnie charakteryzację oddziaływań białko-białko za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i eksperymentów termoforezy w mikroskali (MST).

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Ten protokół łączy masową fotometrię z nowatorskim systemem mikroprzepływowym do badania interakcji białko-białko o niskim powinowactwie. Podejście to opiera się na szybkim rozcieńczaniu silnie skoncentrowanych kompleksów w roztworze, co umożliwia pomiary o niskim powinowactwie i rozszerza zastosowanie fotometrii masowej.

Analiza tworzenia kompleksów białkowych w stężeniach mikromolowych poprzez sprzężenie mikrofluidyki z fotometrią masową

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Przedstawiamy protokoły dla metodologii NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) oraz CONdensate DEtectioN za pomocą SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT), które umożliwiają bezoznakową, ilościową charakterystykę kondensatów biomolekularnych w warunkach bifazowych, ujawniając podział molekularny, dynamikę wymiany, hydratację kondensatu oraz strukturę kropli bez osadu czy oznakowania.

Wykorzystanie roztworu NMR do charakteryzacji kondensatów biomolekularnych w warunkach bifazowych

Poznaj metodę jednocząsteczkowej mikroskopii do badania dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach ludzkich. Technika ta pozwala ilościowo określić czas rezydencji białek.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Przeglądaj więcej filmów