Trzy strategie wywoływania neurotroficznego zapalenia rogówki i regeneracji nerwów w rogówce myszy
8 grudnia 2023
Tutaj proponujemy trzy różne metody uszkadzania włókien czuciowych unerwiających rogówkę. Metody te ułatwiają badanie regeneracji aksonów u myszy. Te trzy metody, które można dostosować do innych modeli zwierzęcych, są idealne do badania fizjologii i regeneracji unerwienia rogówki.
Rogówka, która jest przezroczystą tkanką pokrywającą oko, wymaga zrównoważonego mikrośrodowiska, aby zachować swoją integralność. Gęste unerwienie rogówki uczestniczy w tym mikrośrodowisku. Jeśli dochodzi do utraty, która może być częściowa lub całkowita, tego unerwienia, powstaje specyficzny stan, który nazywa się neurotroficznym zapaleniem rogówki.
Aby znaleźć nowe leki i skuteczne lekarstwa na tę chorobę, musimy dysponować konkretnymi modelami. Rozszerzenie zastosowania transgenicznych reporterów fluorescencyjnych zawierających łożyska zwierzęce oraz postępy mikroskopowe otworzyły nowe możliwości w wizualizacji generacji aksonów. Obrazowanie in vivo stało się bardziej dostępne dla każdego laboratorium badawczego, które chce śledzić proces reneracji nerwu.
Różne przyczyny wywołujące neurotroficzne zapalenie rogówki leżą u podstaw trudności związanych z posiadaniem tylko jednego modelu do testowania terapii regeneracji nerwów. Te trzy modele odtwarzają różne sytuacje obserwowane w klinikach, a dzielenie się tymi metodami pozwoli innym laboratoriom odkryć nowe aspekty unerwienia rogówki, na podstawie których zostaną zaprojektowane innowacyjne metody leczenia. Aby rozpocząć ścieranie rogówki, połóż znieczuloną mysz na stole.
Nałóż kroplę sztucznej łzy na oko poddawane zabiegowi. Nałóż kroplę żelu do oczu na oko po przeciwnej stronie. Następnie połóż mysz na boku na rozgrzanej płycie.
Delikatnie użyj bawełnianego wacika, aby wchłonąć sztuczną łzę i odsuń rzęsy myszy bez kontaktu z okiem. Włącz zadzior oczny i ostrożnie otwórz powiekę myszy dwoma palcami. Jednocześnie osłoń wibrysy, aby zapobiec ich zaplątaniu się w zadziory.
Zlokalizuj źrenicę lub środek oka i delikatnie przyłóż zadzior do powierzchni oka okrężnymi ruchami, aż nabłonek zostanie usunięty. Alternatywnie wykonaj około 20 okrężnych ruchów na rogówce. Teraz nałóż kroplę fluorescencyjnego roztworu barwiącego na starte oko.
Po 20 sekundach przetrzyj oko chusteczką, aby wchłonąć roztwór, a następnie spłucz je kroplą sztucznej łzy. Na koniec zaabsorbuj sztuczną łzę chusteczką i oświetl oko za pomocą niebieskiej lampy kobaltowej. Przed operacją nabłonek podstawy był nienaruszony, a włókna nerwowe w splocie podpodstawnym utworzyły wir.
Końcówka zadzioru usunęła zewnętrzną warstwę rogówki, pozostawiając nienaruszone zrąb i śródbłonek, z widoczną szczeliną na nabłonku podstawy i splocie podpodstawnym. Regeneracja nabłonka nastąpiła w ciągu tygodnia po operacji, jednak wir pozostał nieobecny w ośrodku rogówki. Aby rozpocząć aksotomię nerwu rogówki, połóż znieczuloną mysz na stole.
Nałóż kroplę sztucznej łzy na oko poddawane zabiegowi. Nałóż kroplę żelu do oczu na oko po przeciwnej stronie. Umieść mysz pod lupą lornetkową, aby ocenić operowane oko.
Umieść spód szalki Petriego pod głową myszy, aby utrzymać oko poziomo. Za pomocą bawełnianego wacika ostrożnie zetrzyj sztuczną łzę z oka i usuń rzęsy bez dotykania oka. Umieść parę gładkich, zakrzywionych filarów pod okiem zwierzęcia i delikatnie wysuń je z orbity.
Delikatnie przyłóż stempel do biopsji pionowo do powierzchni rogówki, dociśnij i kilkakrotnie przekręć stempel. Następnie usuń stempel do biopsji, a na rogówce powinien być widoczny okrągły ślad. W miejscu, w którym zastosowano stempel biopsyjny, widoczny był cienki pierścień obwodowy, który uszkodził nabłonek podstawny.
Nerwy obwodowe wydawały się być pocięte, co wywołało zwyrodnienie aksonu wallera. Zaobserwowano ciężkie zwyrodnienie, prowadzące do całkowitej utraty unerwienia w środku rogówki. Spowodowało to rozpad warstwy nabłonkowej, tworząc wrzód.
Na początek połóż znieczuloną mysz na stole. Nałóż kroplę żelu do oczu na oba oczy. Umieść zwierzę w uchwycie na głowę, aby zabezpieczyć jego pozycję.
Obróć zwierzę o 90 stopni, tak aby operowane oko było skierowane w stronę sufitu. Zabezpiecz wibrysy zwierzęcia, aby oczyścić obszar wokół oka. Zabezpiecz ciało zwierzęcia, aby zminimalizować ruchy głowy spowodowane oddychaniem.
Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe poziomo na oku na wierzchu żelu do oczu. W razie potrzeby wyreguluj głowę zwierzęcia, aby prawidłowo ustawić szkiełko nakrywkowe. Dodaj kroplę PBS na wierzch szkiełka nakrywkowego.
Następnie ostrożnie umieść zwierzę na stoliku mikroskopowym. Ustaw wieżyczkę obiektywu mikroskopu na odpowiednią odległość do obserwacji. Aktywuj lasery, aby wywołać ablację nerwu rogówki.
Po zakończeniu ablacji nerwów wyjmij zwierzę z uchwytu na głowę i umieść je w klatce na podgrzewanej płycie. Wir był widocznie nieobecny tydzień po ablacji laserowej. Zaobserwowano, że grupa komórek odpornościowych migrowała do miejsca oświetlenia.
Wyglądało na to, że wiązki włókien zrębu przerzedziły się.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia trzy odrębne metody uszkadzania włókien sensorycznych w rogówce myszy, co ułatwia badanie regeneracji aksonów. Metody te można dostosować do zastosowania w różnych modelach zwierzęcych, a dostarczone wyniki pozwalają lepiej zrozumieć fizjologię unerwienia rogówki oraz techniki regeneracyjne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Oftalmologia
- Medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Rogówka jest silnie unerwiona i wymaga stabilnego mikrośrodowiska dla zachowania swojej integralności.
- Utrata unerwienia rogówki może prowadzić do zapalenia rogówki o podłożu neurotroficznym, stanu wyniszczającego organizm.
- Obecne metody badania regeneracji nerwów są ograniczone, co stwarza potrzebę opracowania innowacyjnych modeli.
- Nowe techniki obrazowania umożliwiają wizualizację regeneracji nerwów w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Opracowanie i opisanie metod odtwarzających kliniczne modele neurotroficznego zapalenia rogówki.
- Pogłębienie zrozumienia unerwienia rogówki oraz zidentyfikowanie potencjalnych podejść terapeutycznych.
- Udostępnienie tych metod w celu ich szerszego zastosowania w innych laboratoriach badawczych.
Zastosowane metody
- W celu ablacji lub uszkodzenia włókien nerwowych rogówki u znieczulonych myszy zastosowano techniki chirurgiczne.
- Metody obejmowały abrazję rogówki, aksonotomię nerwów oraz ablację indukowaną laserem.
- W celu wizualizacji regeneracji nerwów przeprowadzono barwienie fluorescencyjne oraz obrazowanie in vivo.
- Procesy te wymagały precyzyjnej manipulacji rogówką przy jednoczesnym monitorowaniu stanu zdrowia zwierząt.
- Każdą z metod oceniono pod kątem skuteczności w indukowaniu regeneracji nerwów.
Główne wyniki
- Wszystkie trzy metody doprowadziły do uszkodzeń nerwów w różnym stopniu oraz do ich późniejszej regeneracji.
- W szczególności całkowita utrata nerwu wywołała silną degenerację, co wpłynęło na integralność nabłonka.
- Regeneracja była obserwowalna w ciągu tygodnia, choć niektóre struktury nerwowe zostały trwale zmienione.
- Innowacyjne techniki obrazowania dostarczyły kluczowych informacji na temat procesu regeneracji.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia solidne metodologie badania uszkodzeń i regeneracji nerwów rogówki.
- Wyniki wnoszą znaczący wkład w zrozumienie zdrowia rogówki oraz metod leczenia zapalenia rogówki neurotroficznego.
- Adaptowalne metody torują drogę do dalszych badań nad mechanizmami neuronalnymi i strategiami terapeutycznymi.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Solidne przedkliniczne modele zapalenia rogówki o charakterze neurotroficznym są niezbędne do minimalizowania ryzyka w portfelach wczesnych etapów odkrywania leków okulistycznych oraz medycyny regeneracyjnej. Trzy opisane strategie uszkadzania rogówki mysiej umożliwiają precyzyjne badanie degeneracji i regeneracji nerwów, co zwiększa pewność prognostyczną w badaniach translacyjnych. Modele te ułatwiają ocenę nowych kandydatów na leki farmakologiczne i terapie genowe ukierunkowane na naprawę nerwów rogówki oraz modyfikację przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechaniczną analizę szlaków uszkodzenia i regeneracji nerwów rogówki.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów neurotroficznych w kontekście tkanki o znaczeniu klinicznym.
- Ułatwia biologiczną ocenę ryzyka dla potencjalnych terapii ukierunkowanych na naprawę nerwów.
- Stanowi platformę do weryfikacji hipotez dotyczących mechanizmów regeneracyjnych.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Ustanawia powtarzalne modele urazów do ilościowej oceny regeneracji nerwów.
- Umożliwia standaryzowaną ocenę skuteczności związków w przywracaniu unerwienia rogówki.
- Wspiera rozwój odczytów opartych na obrazowaniu dla wysokoprzepustowych procesów przesiewowych (high-content screening).
- Przygotowuje zwalidowane systemy do dalszych testów farmakologicznych i terapii genowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje modele przedkliniczne z obrazem klinicznym zapalenia rogówki o charakterze neurotroficznym.
- Umożliwia ocenę istotnych dla przebiegu choroby punktów końcowych, takich jak integralność nabłonka i odrost nerwów.
- Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie kandydatów do terapii regeneracyjnych w kierunku badań umożliwiających złożenie wniosku o IND.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do rozwoju biomarkerów translacyjnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Te modele uszkodzeń rogówki u myszy stanowią pomost między wczesną fazą odkryć a walidacją przedkliniczną, wspierając przepływy pracy od identyfikacji celu, poprzez optymalizację wiodącego związku, aż po badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez zerowych w odniesieniu do mechanizmów regeneracji nerwów i zaangażowania celu.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe modele uszkodzeń do oceny związków chemicznych i terapii genowych.
- Analityka: Umożliwia pomiary oparte na obrazowaniu w zakresie gęstości nerwów, integralności nabłonka oraz migracji komórek odpornościowych.
- Badania translacyjne: Dostosowuje przedkliniczne punkty końcowe do klinicznego przebiegu choroby i wyników naprawy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje adaptowalne protokoły dla różnorodnych modalności terapeutycznych i standaryzację międzyprogramową.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad regeneracją nerwów i walidacją celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły indukowania urazów i obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfelach okulistycznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów regeneracyjnych i neuroprotekcyjnych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrochirurgicznych i obrazowaniu in vivo.
- Wymaga dostępu do mikroskopii wielofotonowej i modeli z fluorescencyjnymi reporterami w przypadku zaawansowanych protokołów.
- Konieczna jest standaryzacja indukcji urazu i pomiaru wyników pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych linii myszy transgenicznych i różnego stopnia nasilenia urazu w celu zapewnienia elastyczności modelu.
- Kluczowe dla integralności danych są staranna obsługa zwierząt oraz monitorowanie po zabiegu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:30
Murine Corneal Nerve Abrasion for the Induction of Neurotrophic Keratitis
3:17
Murine Corneal Nerve Axotomy for the Induction of Neurotrophic Keratitis
4:39
Localized Laser Ablation of Murine Corneal Nerves for the Induction of Neurotrophic Keratitis
