Kultury komórek neuronalnych z Aplysia do obrazowania stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości

W laboratorium wirtualnym hodujemy neurony komórek zstępujących mięczaka morskiego Plegia california. Neurony te emitują bardzo duże stożki wzrostu, co czyni je doskonałym systemem modelowym do wysokorozdzielczych badań nad ruchliwością i prowadzeniem stożków wzrostu, szczególnie w analizie dynamiki cytoszkieletu. W tym filmie demonstrujemy, jak przeprowadzić sekcję Plegia oraz hodowlę komórek zstępujących.

Witajcie, jestem Daniel Suter z Departamentu Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Purdue. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wycięcia, hodowli i obrazowania neuronów z tylnego rogu rdzenia kręgowego. Neurony z C. herapia CAA były szeroko wykorzystywane w badaniach nad uczeniem się i pamięcią.

Ponieważ Apia posiada prosty układ nerwowy oraz duże neurony odpowiednie do elektrofizjologii, w naszym laboratorium wykorzystujemy te neurony ze względu na ich duże stożki wzrostu, które są bardzo przydatne do obrazowania o wysokiej rozdzielczości dynamiki białek związanych z ruchliwością i kierowaniem stożków wzrostu. Cała procedura obejmuje następujące kroki.

W pierwszym dniu zwierzę jest uśmiercane i poddawane sekcji w celu pobrania zwojów brzusznych. W drugim dniu przygotowuje się płytki hodowlane. Wycinane są skupiska komórek grzbietowych, a następnie pojedyncze neurony są wysiewane na płytki.

W trzecim dniu konstruowana jest komora obrazująca do obrazowania poklatkowego komórek z wykorzystaniem mikroskopii kontrastowej DIC, co zostanie zaprezentowane i omówione. Dzisiejszą procedurę przeprowadzi iTune Lee, doktorantka w moim laboratorium. Pokaże ona teraz, jak przygotować neurony rdzenia kręgowego.

Zacznijmy. Neurony komórek tylnych stanowią część zwoju brzusznego układu nerwowego plegi, dlatego wypreparujemy cały zwój brzuszny w celu trawienia enzymatycznego. Następnie oddzielimy dwa skupiska komórek torbielowatych od reszty zwoju.

W tej fazie zwoje brzuszne będą trawione w roztworze numer dwa przez 15 do 16 godzin w celu rozluźnienia tkanek łącznych. Teraz musimy przygotować dużą strzykawkę o pojemności 60 ml wypełnioną 0,5 M chlorkiem magnezu do uśmiercenia zwierzęcia oraz czyste narzędzia do sekcji: jedną pęsetę anatomiczną, nożyczki oraz duże nożyczki. Używamy *plegia California car* z wybrzeża Kalifornii, o masie około 150 g.

Zwierzęta utrzymujemy w akwarium dla homarów przez maksymalnie od trzech do czterech tygodni. W okolicy głowy, do jamy ciała, wstrzykujemy roztwór chlorku magnezu. Delikatne masowanie zwierzęcia pomaga w rozprowadzeniu roztworu i zapobiega kurczeniu się mięśni.

Przytwierdź zwierzę za głowę i ogon do styropianowej podkładki, używając igieł od strzykawki. Unieś mięśnie ściany ciała jedną pęsetą i roznij jamę ciała dużymi nożyczkami. Następnie roztnij ścianę ciała wzdłuż boku od głowy do ogona i przypnij mięśnie do podkładki.

Następnie należy zlokalizować zwoj abdominalny znajdujący się pod jajnikiem, który jest żółtawym organem przypominającym pędzel. Po odnalezieniu zwoju abdominalnego należy go oddzielić, przecinając nerwy nożyczkami sekcyjnymi po stronie przedniej i tylnej zwoju.

Następnie przenieś zwoj do probówki zawierającej jeden mililitr roztworu wypornego i umieść go w kąpieli wodnej o temperaturze 22 °C na 15,5 godziny. Podczas tej inkubacji tkanka łączna rozluźni się do stopnia, który umożliwi łatwe usunięcie skupisk komórek grzbietowych. Przed rozpoczęciem hodowli komórek grzbietowych przygotujemy szkiełka nakrywki, na których będą hodowane neurony.

Hodujemy neurony tylnej części rdzenia kręgowego na pokrywkach szkiełkowym pokrytych lamingą w 35 milimetrowych szalkach Petriego. Następnie są one zanurzone w medium L 15 A SW, które jest medium hodowlanym o wysokim zasoleniu. Dla tego typu komórek zazwyczaj przygotowujemy od ośmiu do 10 szalek Petriego z pokrywkami szkiełkowymi na jedno zwierzę.

Przejdźmy teraz do omówienia narzędzi wykorzystywanych do wysiewania neuronów komórek torby. Do wyizolowania skupisk komórek torby potrzebne będą trzy szalki Petriego bez szkiełek podstawowych wypełnione medium L 15 A SW, precyzyjna pęseta i nożyczki wysterylizowane alkoholem oraz zagięty żółty końcówka do pipety P 20. Żółtą końcówkę wypala się, szybko przesuwając ją nad płomieniem palnika Bunsena, a następnie zagina za pomocą pęsety.

Należy uważać, aby nie zmiażdżyć zgiętej części. W przeciwnym razie skupisko komórek woreczka plegii może utknąć w tym miejscu w późniejszym etapie. Disekcja i wysiew komórek woreczka plegii są przeprowadzane w temperaturze pokojowej przy użyciu stereomikroskopu.

W tym momencie 15,5-godzinna inkubacja z enzymem dobiegła końca i możemy przenieść zwoje brzuszne z przestrzeni dyskowej do jednej z naczyń roboczych z pożywką L 15 A SW. Zanim pokażemy, w jaki sposób izoluje się komórki woreczkowe, przyjrzyjmy się najpierw schematowi. Aby zobrazować sposób preparowania zwojów brzusznych, najpierw przecinamy je przez środek.

Jak widać na tej linii. Następnie wykonujemy dwa nacięcia z przodu i z tyłu tyłu. Zatem skupisko, jak tutaj widać.

Patrząc teraz przez stereomikroskop, można zauważyć, że zwoj brzuszny został przecięty w centrum i widać, że dwa cięcia wykonano z przodu i z tyłu skupiska komórek woreczkowych. Następnie za pomocą pęsety odnajdujemy otwarcie w tkance łącznej i delikatnie odsuwamy w dół osłonkę z tkanki łącznej otaczającą skupisko komórek woreczkowych. Za pomocą nożyczek preparacyjnych usuwamy tkankę łączną ze skupiska, jeśli to możliwe, w jednym kawałku.

Należy jednak uważać, aby nie uszkodzić skupiska komórek w woreczkach. Przy pomocy medium pobranego zakrzywionym końcem pipety, delikatnie przenieś skupisko komórek w woreczkach do innego naczynia roboczego. Delikatnie potraktuj skupisko komórek w woreczkach żółtym końcem pipety, aby oddzielić poszczególne komórki w woreczkach od skupiska.

Aby to zrobić, należy pobrać skupisko do końcówki pipety i wypuścić je, nie powodując powstania pęcherzyków powietrza. Żywe komórki ze skupiska należy przenieść na szalki zawierające szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną. Martwe komórki są czarne w centrum, natomiast żywe są białe.

Ważne jest, aby umieścić komórki w centrum szkiełka podstawowego do mikroskopii oraz jak najszybciej usunąć wszelkie szczątki komórkowe i martwe komórki. Poprzez usunięcie niepożądanego materiału lub wydmuchanie go, zdrowe komórki szybko przywrą do płytki z poliłyzyną. Należy umieścić około 15 do 25 komórek na każdym szkiełku.

Po rozmieszczeniu wszystkich komórek z pierwszej grupy, usuwa się tkankę łączną z drugiej grupy i kontynuuje tę samą procedurę wysiewania komórek. Po zakończeniu wysiewu na wszystkich płytkach, należy pozostawić je w temperaturze pokojowej na blacie laboratoryjnym przez co najmniej dwie godziny, aby umożliwić prawidłowe przywieranie komórek, unikając przy tym jakichkolwiek wibracji. Następnie naczynia należy umieścić na styropianowej lub plastikowej tacy i przenieść do inkubatora w temperaturze 14 °C przed dalszym użyciem.

Zazwyczaj obrazujemy stożki wzrostu neuronów jeden lub dwa dni po wysiewaniu. Do obrazowania dynamicznych zmian w stożkach wzrostu neuronów w czasie tworzymy niewielką komorę obrazującą z dwóch szkiełek podstawkowych oddzielonych plastikowymi dystansami. Do dolnego szkiełka podstawkowego przytwierdzone są neurony.

Górne szkiełko zakrywyczne jest przycinane za pomocą rylca diamentowego, aby umożliwić łatwą wymianę medium. Następnie, na stole mikroskopu, kanapka ze szkiełek zakrywczych jest umieszczana w specjalnie wykonanym uchwycie w celu zamontowania w mikroskopie. Do utrzymania elementów komory bez wycieku medium stosuje się wysokopróżniowy smar do stołów mikroskopowych. Za pomocą małej strzykawki nakłada się smar wysokopróżniowy na górne szkiełko zakrywycze, następnie pęsetą ustawia się dystanse i nakłada na nie niewielką ilość smaru próżniowego.

Następnie podnosimy cały zestaw, obracamy go i delikatnie dociskamy do szkiełka nakrywkowe z komórkami, które wciąż znajdują się w naczyniu. Za pomocą patyczków higienicznych wyrównujemy szkiełka nakrywkowe i dociskamy górne szkiełko, uważając, aby go nie stłuc. Następnie ostrożnie wyjmujemy tak przygotowaną „kanapkę” z naczynia, ocieramy nadmiar pożywki i umieszczamy ją w podstawie uchwytu.

Umieść preparat w uchwycie, uważając, aby nie pękło szkiełko nakrywkowe pod wpływem nacisku. Oczyść oba szkiełka nakrywkowe za pomocą patyczka higienicznego nasączonego detergentem Sparkle; preferujemy Sparkle, ponieważ pozostawia on mniej smug na szkle. Czyść szkiełko nakrywkowe okrężnymi ruchami, zaczynając od środka, a następnie niezwłocznie przetrzyj je suchym patyczkiem higienicznym, aby uniknąć powstawania smug.

Czyste szkło przykrywowe jest bardzo ważne dla uzyskania obrazowania wysokiej jakości, zwłaszcza przy zastosowaniu optyki DIC. Kultury neuronów z tylnej części rdzenia kręgowego są kulturami o niskiej gęstości, dlatego bardzo pomocne będą funkcje pozycjonowania stolika w mikroskopie, które ułatwiają przełączanie się między różnymi komórkami. Teraz możemy przystąpić do obserwacji morfologii wzrostu i motywności.

Wizualizujemy wpływ wzrostu na morfologię i ruchliwość za pomocą wysokorozdzielczego obrazowania czasowego w technice różnicowego kontrastu fazowego (DIC). Obrazowanie DIC jest przydatne w tym zastosowaniu, ponieważ zapewnia widok powierzchniowy struktury stożka wzrostu w tym filmie przyspieszonym 60x DIC. Można wyraźnie dostrzec trzy domeny typowego stożka wzrostu.

Domena peryferyjna, która składa się z filopodiów i lamellipodiów. Strefa przejścia, która charakteryzuje się aktywnością rufflingu, oraz domena centralna, zawierająca głównie mikrotubule i organelle. Aby zbadać mechanizmy sterowania stożkiem wzrostu, opracowaliśmy test interakcji z ograniczonymi koralikami (RBI assay).

Mikrokulki powlekane białkami artesian są wykorzystywane do naśladowania komórkowych substratów docelowych. W filmie time-lapse w technice DIC mikrokulka jest umieszczana za pomocą mikroiły w domenie peryferyjnej stożka wzrostu. Można zaobserwować efekt i przepływ retrogradacyjny w postaci fal poruszających się wstecz w domenie centralnej.

Organella poruszają się wzdłuż mikrotubul. Po początkowym okresie, w którym nie zachodzą istotne zmiany, można zaobserwować nagły ruch naprzód granicy domeny centralnej w kierunku unieruchomionej kuleczki. Towarzyszący temu wzrost krawędzi prowadzącej oraz wzrost naprężeń powodują dodatkowo osłabienie przepływu i wydłużenie mikrotubul, co można zaobserwować szczególnie wzdłuż osi oddziaływania z kuleczką.

Aby przeanalizować dynamikę cytoszkieletu w stożkach wzrostu, stosujemy fluorescencyjną mikroskopię plamkową (fluorescent speckle microscopy). Do ciała komórki neuronu wstrzykujemy mikrostrzykawką sondy z fluorescencyjnie znakowaną tubuliną i aktyną, a następnie rejestrujemy filmy poklatkowe. W ramach dynamicznych ruchów cytoszkieletu aktyna, zaznaczona kolorem czerwonym, polimeryzuje wzdłuż krawędzi natarcia, jest przemieszczana wstecz przez przepływ retrogradowy i recyklingowana w strefie przejścia.

Dynamiczne mikrotubule, przedstawione na zielono, badały wzrost obwodu stożka wzrostu poprzez kombinację procesów składania i translokacji. Niska intensywność znakowania skutkuje nakrapianym wzorem, co pozwala nam na ilościową analizę różnych parametrów dynamiki cytoszkieletu. Pokazaliśmy Państwu, jak przeprowadzić wypreparowanie komórek z zwojów grzbietowych, ich hodowlę oraz obrazowanie, jeśli chcieliby Państwo wykonać obrazowanie neuronalnych stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości.

Jest to system szczególnie zalecany ze względu na duże rozmiary stożków wzrostu, wyraźnie zdefiniowane regiony cytoplazmy oraz dobrze opisany cytoszkielet. To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.