Name: Hodowle komórek neuronalnych z Aplysia do obrazowania stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-20T18:40:00.000+00:00
Duration: 16 min 29 s
Description: Poznaj hodowlę neuronów Aplysia californica do wysokorozdzielczego obrazowania stożków wzrostu. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki cytoszkieletu i motoryki neuronalnej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Ryanowi Maneriemu (Oystercatcher Productions, LLC) za nagranie naszej procedury oraz Rodneyowi McPhailowi (Department of Biological Sciences, Purdue University) za pomoc w montażu filmu z sekcji. Badania w laboratorium Suter są finansowane z grantów NIH (R01 NS049233) oraz Bindley Bioscience Center na Purdue University przyznanych dla D.M.S.

Roztwory
<ul>
<li>Pożywka do hodowli komórkowej L15-ASW (1 l) 
<ul>
<li>1 woreczek proszku L15</li>
<li>dodać 800 ml ultrapure H2O</li>
<li>NaCl 400 mM</li>
<li>MgSO4 27 mM</li>
<li>MgCl2 28 mM</li>
<li>L-Glutamina 4 mM</li>
<li>Gentamycyna 50 µg/ml</li>
<li>HEPES 5 mM</li>
<li>Dostosować do pH 7,9</li>
<li>Dodawać kroplami CaCl2 9,3 mM (przestrzegać, jeśli pojawią się osady)</li>
<li>Dopełnić ultrapure H2O do 1 l</li>
<li>Sprawdzić osmolarność (950-1000 mmol/kg) za pomocą osmometru (ciśnienia pary, Wescor # 5520)</li>
<li>Przefiltrować przez filtr 0,22 µm, używając jednostki filtracji pod ciśnieniem dodatnim (Filtry: Millipore SVGV010RS)</li>
<li>Przechowywać w 4°C do 1 miesiąca</li>
</ul>
</li>
<li>Poly-L-lizyna (70-150 kD) roztwór stokowy 200 µg/ml w sterylnej ultrapure H2O, przechowywany w -20oC</li>
<li>Roztwór MgCl2 0,5 M</li>
</ul>

Dzień 1: Disekcja zwoju brzusznego Aplysia
Przygotowanie roztworu do dysocjacji enzymatycznej
<ol>
<li>Odważyć 9-10 mg enzymu Dispase (Worthington, Cat: LS02111) do probówki Eppendorf</li>
<li>Dodać 900 µl pożywki hodowlanej L15-ASW oraz 100 µl sterylnej ultraczystej wody H2O</li>
<li>Wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej (RT)</li>
</ol>
Disekcja zwoju brzusznego
<ol>
<li>Napełnić strzykawkę 50 ml roztworem MgCl2 o stężeniu 0,5 M.</li>
<li>Wyjąć jedno zwierzę z akwarium, obchodzić je delikatnie, aby uniknąć obronnej reakcji wydzielania atramentu.</li>
<li>Położyć Aplysia na boku na podkładce do sekcji (płycie styropianowej), stroną rostralną w prawą, a stroną kaudalną w lewą.</li>
<li>Wprowadzić igłę do ciała zwierzęcia tuż za głową i wstrzyknąć cały roztwór MgCl2 do jamy ciała.</li>
<li>Delikatnie rozmasować zwierzę, aby rozprowadzić roztwór MgCl2 w całej jamie ciała; odczekać kilka minut do pełnego znieczulenia zwierzęcia.</li>
<li>Przymocować głowę i ogon zwierzęcia do podkładki do sekcji za pomocą dwóch igieł.</li>
<li>Używając pincety, unieść skórę, a następnie naciąć skórę i warstwę mięśniową dużymi nożyczkami w kierunku głowy i ogona, aby stworzyć szeroki otwór z boku ciała.</li>
<li>Zlokalizować zwoj abdominalny pod szczoteczkowatym jajnikiem. Używając pincety, uchwycić nerwy łączące około 1 cm przed zwojem abdominalnym, a następnie przeciąć nerwy nożyczkami do sekcji przed miejscem uchwytu pincetą i za zwojem abdominalnym.</li>
<li>Umieścić zwoj w roztworze Dispase i inkubować przez 15-16 h w temperaturze 22°C w łaźni wodnej z kontrolą temperatury.</li>
</ol>
Dzień 2: Wysiew komórek torby Aplysia
Przygotowanie szkiełek podstawowych pokrytych poli-lizyną
<ol>
<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotuj trzy szalki Petriego o średnicy 35 mm jako naczynia robocze do sekcji zwoju, napełniając każdą z nich 4 ml pożywki L15-ASW. Po 15,5 godzinach trawienia przenieś zwój brzuszny z roztworu dispazy do jednego z naczyń roboczych.</li>
<li>Za pomocą pęsety pobierz oczyszczone kwasem szkiełka nakrywki nr 1,5 (22x22 mm) przechowywane w etanolu, usuń alkohol i wysterylizuj szkiełka, krótko opalając je nad palnikiem Bunsena. Pozostaw je na chwilę do ochłonięcia przed umieszczeniem w naczyniach hodowlanych.</li>
<li>Przygotuj zakrzywioną końcówkę do nakładania, wyginając żółtą końcówkę nad palnikiem Bunsena (opalaj krótko, aby uniknąć stopienia plastiku!).</li>
<li>Przygotuj odpowiednią ilość roztworu poli-lizyny o stężeniu 20 µg/ml, rozcieńczając roztwór zapasowy 200 µg/ml sterylną wodą ultrapure H2O.</li>
<li>Pokryj każde szkiełko nakrywkowe 500 µl poli-lizyny (20 µg/ml) i inkubuj przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
<li>Umyj każde szkiełko nakrywkowe 3-5 razy, używając za każdym razem 500 µl sterylnej wody ultrapure H2O.</li>
<li>Usuń wodę ze szkiełek nakrywkowych; napełnij każdą szalkę 4 ml pożywki hodowlanej L15-ASW.</li>
</ol>
Dysocjacja komórek workowatych
<ol>
<li>Pod mikroskopem sekcyjnym przeciąć zwoje brzuszne na pół, używając nożyczek sekcyjnych i pincety uprzednio oczyszczonych 95% etanolem (Rysunek 1 linia 1).</li>
<li>W jednej połowie zwoju przeciąć obszar pomiędzy klastrem komórek workowatych a komórkami hemiganglionu (Rysunek 1 linia 2), a następnie odciąć pozostałe rozgałęzienia nerwowe po przeciwnej stronie komórek workowatych (Rysunek 1 linia 3). Pracować na jednej połowie zwoju na raz; drugą połowę pozostawić w naczyniu podczas wysiewania komórek z pierwszego klastra.</li>
<li>Używając dwóch pincet (lub jednej pincety i nożyczek sekcyjnych), uwolnić klaster komórek workowatych, odsuwając otaczającą go osłonkę tkanki łącznej. W razie potrzeby odciąć tkankę łączną nożyczkami sekcyjnymi. Należy uważać, aby nie ściskać i nie dotykać zbyt mocno klastra komórek workowatych podczas tego procesu.</li>
<li>Po usunięciu większości tkanki łącznej przenieść klaster komórek workowatych do nowego naczynia roboczego za pomocą przygotowanej wcześniej zgiętej żółtej końcówki. Należy uważać, aby klaster komórek workowatych nie został uwięziony wewnątrz żółtej końcówki ani nie przywarł do granicy fazy powietrze/medium.</li>
<li>Rozbić klaster za pomocą żółtej końcówki, aby wydzielić pojedyncze komórki workowate. Należy to zrobić poprzez wielokrotne pobieranie i wypuszczanie klastra z końcówki pipety. Zacząć od niskich sił ścinających i zwiększać siłę w razie potrzeby. Zawsze stosować najniższą możliwą siłę potrzebną do uwolnienia neuronów, aby nie zniszczyć zbyt wielu komórek.</li>
<li>Zebrać 3-5 zdrowych komórek workowatych i przenieść je na szkiełko nakrywkę pokrytą poli-lizyną. Unikać pobierania martwych komórek (są one czarne/przezroczyste w centrum) oraz fragmentów tkanki łącznej.</li>
<li>Powtórzyć krok 6 i umieścić około 15-25 żywych neuronów w centrum każdego szkiełka nakrywki. Jeśli przeniesione zostaną również martwe komórki lub zanieczyszczenia, usunąć niepożądany materiał poprzez jego pobranie lub wydmuchanie z obszaru zdrowych komórek. Proces ten trwa około 2-3 godzin dla obu klastrów.</li>
<li>Po zakończeniu pozostawić naczynia hodowlane na dygestorze przez co najmniej 2 godziny w RT, aby umożliwić adhezję komórek (wyłączyć nadmuch dygestora, aby uniknąć niepożądanych wibracji).</li>
<li>Umieścić naczynia w inkubatorze w temperaturze 14°C na noc lub do czasu dalszego wykorzystania. Stożki wzrostu mogą rozwinąć się w ciągu 4-10 godzin.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="Schemat anatomiczny komórek hemiganglionu i klastra komórek torbielowatych w szlaku neuronowym." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1. Schemat zwoju brzusznego Aplysia californica. Kolorowe linie wskazują miejsca nacięć w celu wyizolowania klastrów komórek torbielowatych. "> Rysunek 1. Schemat zwoju brzusznego Aplysia californica. Kolorowe linie wskazują miejsca nacięć w celu wyizolowania klastrów komórek torbielowatych.

Dzień 3: Przygotowanie komory do obrazowania na żywo komórek torbielowatych Aplysia
Montaż komory obrazowania
<ol>
<li>Przed użyciem komórek woreczkowych do eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek, należy zbadać komórki pod mikroskopem przy małym powiększeniu. Jeśli komórki nie wykształciły zdrowych stożków wzrostu, należy podać świeżą pożywkę i pozostawić w RT na 1-2 godziny.</li>
<li>Aby dostarczyć na płytki świeżą pożywkę L15-ASW, należy usunąć połowę (~2ml) starej pożywki za pomocą linii próżniowej, a następnie dodać 2 ml nowej pożywki L15-ASW na każdą płytkę Petriego. Ważne jest, aby nie usuwać całkowicie całej pożywki z płytki za jednym razem, ponieważ może to doprowadzić do oderwania komórek od szkiełka podstawowego.</li>
<li>Do obrazowania komórek woreczkowych montujemy dwa szkiełka podstawowe i dwa plastikowe dystansery w komorze obrazującej o budowie kanapkowej. Górne szkiełko w kanapce jest przycinane do krótszego rozmiaru, aby umożliwić łatką wymianę pożywki i odczynników. Podczas montażu szkiełka z przytwierdzonymi komórkami woreczkowymi powinny być przez cały czas zanurzone w pożywce L15-ASW, aby zapobiec odrywaniu się komórek.</li>
<li>Aby przygotować komorę, należy odciąć ~2mm z prawej strony szkiełka podstawowego nr 1 o wymiarach 22x22 mm za pomocą rysika diamentowego (noża do szkła) i linijki.</li>
<li>Używając strzykawki 1 ml, należy nanieść wysokopróżniowy smar na dwie strony krótszego szkiełka i przymocować plastikowe dystansery po każdej stronie. Nanieść smar próżniowy na górną część obu dystanserów.</li>
<li>Odwrócić zestaw szkiełka i dystanserów, a następnie umieścić go w płytce Petriego zawierającej komórki woreczkowe na szkiełku podstawowym. Wyrównać i delikatnie docisnąć, aby przykleić górne szkiełko do dolnego, używając do tego końcówki dwóch patyczków higienicznych.</li>
<li>Używając pęsety, należy delikatnie podnieść zestaw kanapkowy z płytki Petriego, uważając, aby pożywka nie wyciekła. W razie potrzeby wyrównać oba szkiełka i wytrzeć nadmiar pożywki chusteczką Kimwipe. Umieścić kanapkę w dolnej części uchwytu do preparatów mikroskopowych i ostrożnie przymocować pokrywę za pomocą klipsów.</li>
<li>Oczyścić środek górnej strony kanapki patyczkami higienicznymi zwilżonymi środkiem do mycia szyb (jako środek do mycia szyb stosowany jest Sparkle). Szybko osuszyć powierzchnię drugim, suchym patyczkiem, aby uniknąć smug. Postąpić tak samo z dolnym szkiełkiem. Czyste szkiełka, wolne od smug, są kluczowe dla uzyskania wysokiej jakości obrazowania.</li>
</ol>
Przygotowanie komórek w woreczku pod mikroskopem
Ponieważ hodowle neuronalne komórek torby Aplysia mają niską gęstość, najlepiej, aby konfiguracja mikroskopu posiadała funkcje pozycjonowania stolika, co ułatwia przełączanie się między komórkami. Komórki torby można bez problemu przechowywać w temperaturze RT przez kilka godzin na stoliku podczas eksperymentów obrazowania. Okresowo wymieniaj medium, aby zapobiec parowaniu.

<ol><li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li>
<li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule%2C+apCAM%2C+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li>
<li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li>
<li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li>
</ol>

Neurony komórek torby (bag cell neurons) ślimaka Aplysia stanowią wolną od surowicy hodowlę komórek neuronalnych z bardzo niewielką liczbą komórek nieneuronalnych. Neurony te tworzą bardzo duże stożki wzrostu, które nadają się do badania szeregu istotnych zagadnień z zakresu biologii komórki. Neurony komórek torby można łatwo manipulować i obrazować w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. Wykorzystując fluorescencyjną mikroskopię plamkową (Fluorescent Speckle Microscopy, FSM), można ilościowo analizować różne parame...

<table><tbody><tr><td>szkiełka podstawowe #1 22x22 mm</td><td>Narzędzie</td><td>VWR international</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka podstawowe #1.5 22x22 mm</td><td>Narzędzie</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 35 mm</td><td>Narzędzie</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>filtry do filtracji pożywki</td><td>Narzędzie</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGV010RS</td><td></td></tr><tr><td>smar wysokopróżniowy</td><td>Narzędzie</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>osmometr</td><td>Narzędzie</td><td>Wescor</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>podkładki plastikowe</td><td>Narzędzie</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>SHSP-200</td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>gentamicyna</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4030</td><td></td></tr><tr><td>pożywka L15</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>41300-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Odczynnik</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>siarczan magnezu</td><td>Odczynnik</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6070-12</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna (70-150 kD)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Odczynnik</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7581</td><td></td></tr><tr><td>neutralna proteaza (dispaza)</td><td>Odczynnik</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS02111</td><td></td></tr></tbody></table>

kultury komórek neuronalnych z aplysia do obrazowania stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Stożki wzrostu neuronów to wysoce ruchliwe struktury znajdujące się na końcach aksonów, które potrafią wykrywać sygnały kierujące w środowisku i przekształcać te informacje w ruch kierunkowy w stronę odpowiedniej komórki docelowej. Aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób informacje kierujące są przekazywane z powierzchni komórki do leżących u jej podstaw dynamicznych sieci cytoszkieletu, niezbędny jest system modelowy odpowiedni do obrazowania na żywo dynamiki białek z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Typowe stożki wzrostu kręgowców są zbyt małe, aby ilościowo analizować dynamikę aktyny F i mikrotubul. Neurony z zająca morskiego Aplysia californica są 5–10 razy większe od neuronów kręgowców, można je łatwo utrzymywać w temperaturze pokojowej i są to komórki bardzo odporne na mikromanipulacje oraz pomiary biofizyczne. Ich stożki wzrostu posiadają bardzo wyraźnie zdefiniowane obszary cytoplazmatyczne i dobrze opisany system cytoszkieletu. Do ciał komórek neuronalnych można mikroiniekować różnorodne sondy służące do badania ruchliwości i kierowania stożków wzrostu. W niniejszym protokole prezentujemy procedurę wyizolowania zwoju brzusznego, hodowli neuronów komórek torbielkowatych oraz przygotowania komory obrazowania do obserwacji na żywo stożków wzrostu.

Neurony *Aplysia californica* w hodowli tworzą duże stożki wzrostu, które doskonale nadają się do obrazowania wysokiej rozdzielczości w badaniu motywności i prowadzenia stożków wzrostu. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół sekcji i wysiewu neuronów komórek torby *Aplysia* oraz przygotowania komory do obrazowania żywych komórek.

Kultury komórek neuronalnych z Aplysia do obrazowania stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości

Stożki wzrostu neuronów to wysoce mobilne struktury znajdujące się na końcach aksonów, które potrafią wykrywać sygnały kierujące w środowisku i przekazywać te informacje...

W laboratorium wirtualnym hodujemy neurony komórek zstępujących mięczaka morskiego Plegia california. Neurony te emitują bardzo duże stożki wzrostu, co czyni je doskonałym systemem modelowym do wysokorozdzielczych badań nad ruchliwością i prowadzeniem stożków wzrostu, szczególnie w analizie dynamiki cytoszkieletu. W tym filmie demonstrujemy, jak przeprowadzić sekcję Plegia oraz hodowlę komórek zstępujących.Witajcie, jestem Daniel Suter z Departamentu Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Purdue. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wycięcia, hodowli i obrazowania neuronów z tylnego rogu rdzenia kręgowego. Neurony z C. herapia CAA były szeroko wykorzystywane w badaniach nad uczeniem się i pamięcią.Ponieważ Apia posiada prosty układ nerwowy oraz duże neurony odpowiednie do elektrofizjologii, w naszym laboratorium wykorzystujemy te neurony ze względu na ich duże stożki wzrostu, które są bardzo przydatne do obrazowania o wysokiej rozdzielczości dynamiki białek związanych z ruchliwością i kierowaniem stożków wzrostu. Cała procedura obejmuje następujące kroki.W pierwszym dniu zwierzę jest uśmiercane i poddawane sekcji w celu pobrania zwojów brzusznych. W drugim dniu przygotowuje się płytki hodowlane. Wycinane są skupiska komórek grzbietowych, a następnie pojedyncze neurony są wysiewane na płytki.W trzecim dniu konstruowana jest komora obrazująca do obrazowania poklatkowego komórek z wykorzystaniem mikroskopii kontrastowej DIC, co zostanie zaprezentowane i omówione. Dzisiejszą procedurę przeprowadzi iTune Lee, doktorantka w moim laboratorium. Pokaże ona teraz, jak przygotować neurony rdzenia kręgowego.Zacznijmy. Neurony komórek tylnych stanowią część zwoju brzusznego układu nerwowego plegi, dlatego wypreparujemy cały zwój brzuszny w celu trawienia enzymatycznego. Następnie oddzielimy dwa skupiska komórek torbielowatych od reszty zwoju.W tej fazie zwoje brzuszne będą trawione w roztworze numer dwa przez 15 do 16 godzin w celu rozluźnienia tkanek łącznych. Teraz musimy przygotować dużą strzykawkę o pojemności 60 ml wypełnioną 0,5 M chlorkiem magnezu do uśmiercenia zwierzęcia oraz czyste narzędzia do sekcji: jedną pęsetę anatomiczną, nożyczki oraz duże nożyczki. Używamy *plegia California car* z wybrzeża Kalifornii, o masie około 150 g.Zwierzęta utrzymujemy w akwarium dla homarów przez maksymalnie od trzech do czterech tygodni. W okolicy głowy, do jamy ciała, wstrzykujemy roztwór chlorku magnezu. Delikatne masowanie zwierzęcia pomaga w rozprowadzeniu roztworu i zapobiega kurczeniu się mięśni.Przytwierdź zwierzę za głowę i ogon do styropianowej podkładki, używając igieł od strzykawki. Unieś mięśnie ściany ciała jedną pęsetą i roznij jamę ciała dużymi nożyczkami. Następnie roztnij ścianę ciała wzdłuż boku od głowy do ogona i przypnij mięśnie do podkładki.Następnie należy zlokalizować zwoj abdominalny znajdujący się pod jajnikiem, który jest żółtawym organem przypominającym pędzel. Po odnalezieniu zwoju abdominalnego należy go oddzielić, przecinając nerwy nożyczkami sekcyjnymi po stronie przedniej i tylnej zwoju.Następnie przenieś zwoj do probówki zawierającej jeden mililitr roztworu wypornego i umieść go w kąpieli wodnej o temperaturze 22 °C na 15,5 godziny. Podczas tej inkubacji tkanka łączna rozluźni się do stopnia, który umożliwi łatwe usunięcie skupisk komórek grzbietowych. Przed rozpoczęciem hodowli komórek grzbietowych przygotujemy szkiełka nakrywki, na których będą hodowane neurony.Hodujemy neurony tylnej części rdzenia kręgowego na pokrywkach szkiełkowym pokrytych lamingą w 35 milimetrowych szalkach Petriego. Następnie są one zanurzone w medium L 15 A SW, które jest medium hodowlanym o wysokim zasoleniu. Dla tego typu komórek zazwyczaj przygotowujemy od ośmiu do 10 szalek Petriego z pokrywkami szkiełkowymi na jedno zwierzę.Przejdźmy teraz do omówienia narzędzi wykorzystywanych do wysiewania neuronów komórek torby. Do wyizolowania skupisk komórek torby potrzebne będą trzy szalki Petriego bez szkiełek podstawowych wypełnione medium L 15 A SW, precyzyjna pęseta i nożyczki wysterylizowane alkoholem oraz zagięty żółty końcówka do pipety P 20. Żółtą końcówkę wypala się, szybko przesuwając ją nad płomieniem palnika Bunsena, a następnie zagina za pomocą pęsety.Należy uważać, aby nie zmiażdżyć zgiętej części. W przeciwnym razie skupisko komórek woreczka plegii może utknąć w tym miejscu w późniejszym etapie. Disekcja i wysiew komórek woreczka plegii są przeprowadzane w temperaturze pokojowej przy użyciu stereomikroskopu.W tym momencie 15,5-godzinna inkubacja z enzymem dobiegła końca i możemy przenieść zwoje brzuszne z przestrzeni dyskowej do jednej z naczyń roboczych z pożywką L 15 A SW. Zanim pokażemy, w jaki sposób izoluje się komórki woreczkowe, przyjrzyjmy się najpierw schematowi. Aby zobrazować sposób preparowania zwojów brzusznych, najpierw przecinamy je przez środek.Jak widać na tej linii. Następnie wykonujemy dwa nacięcia z przodu i z tyłu tyłu. Zatem skupisko, jak tutaj widać.Patrząc teraz przez stereomikroskop, można zauważyć, że zwoj brzuszny został przecięty w centrum i widać, że dwa cięcia wykonano z przodu i z tyłu skupiska komórek woreczkowych. Następnie za pomocą pęsety odnajdujemy otwarcie w tkance łącznej i delikatnie odsuwamy w dół osłonkę z tkanki łącznej otaczającą skupisko komórek woreczkowych. Za pomocą nożyczek preparacyjnych usuwamy tkankę łączną ze skupiska, jeśli to możliwe, w jednym kawałku.Należy jednak uważać, aby nie uszkodzić skupiska komórek w woreczkach. Przy pomocy medium pobranego zakrzywionym końcem pipety, delikatnie przenieś skupisko komórek w woreczkach do innego naczynia roboczego. Delikatnie potraktuj skupisko komórek w woreczkach żółtym końcem pipety, aby oddzielić poszczególne komórki w woreczkach od skupiska.Aby to zrobić, należy pobrać skupisko do końcówki pipety i wypuścić je, nie powodując powstania pęcherzyków powietrza. Żywe komórki ze skupiska należy przenieść na szalki zawierające szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną. Martwe komórki są czarne w centrum, natomiast żywe są białe.Ważne jest, aby umieścić komórki w centrum szkiełka podstawowego do mikroskopii oraz jak najszybciej usunąć wszelkie szczątki komórkowe i martwe komórki. Poprzez usunięcie niepożądanego materiału lub wydmuchanie go, zdrowe komórki szybko przywrą do płytki z poliłyzyną. Należy umieścić około 15 do 25 komórek na każdym szkiełku.Po rozmieszczeniu wszystkich komórek z pierwszej grupy, usuwa się tkankę łączną z drugiej grupy i kontynuuje tę samą procedurę wysiewania komórek. Po zakończeniu wysiewu na wszystkich płytkach, należy pozostawić je w temperaturze pokojowej na blacie laboratoryjnym przez co najmniej dwie godziny, aby umożliwić prawidłowe przywieranie komórek, unikając przy tym jakichkolwiek wibracji. Następnie naczynia należy umieścić na styropianowej lub plastikowej tacy i przenieść do inkubatora w temperaturze 14 °C przed dalszym użyciem.Zazwyczaj obrazujemy stożki wzrostu neuronów jeden lub dwa dni po wysiewaniu. Do obrazowania dynamicznych zmian w stożkach wzrostu neuronów w czasie tworzymy niewielką komorę obrazującą z dwóch szkiełek podstawkowych oddzielonych plastikowymi dystansami. Do dolnego szkiełka podstawkowego przytwierdzone są neurony.Górne szkiełko zakrywyczne jest przycinane za pomocą rylca diamentowego, aby umożliwić łatwą wymianę medium. Następnie, na stole mikroskopu, kanapka ze szkiełek zakrywczych jest umieszczana w specjalnie wykonanym uchwycie w celu zamontowania w mikroskopie. Do utrzymania elementów komory bez wycieku medium stosuje się wysokopróżniowy smar do stołów mikroskopowych. Za pomocą małej strzykawki nakłada się smar wysokopróżniowy na górne szkiełko zakrywycze, następnie pęsetą ustawia się dystanse i nakłada na nie niewielką ilość smaru próżniowego.Następnie podnosimy cały zestaw, obracamy go i delikatnie dociskamy do szkiełka nakrywkowe z komórkami, które wciąż znajdują się w naczyniu. Za pomocą patyczków higienicznych wyrównujemy szkiełka nakrywkowe i dociskamy górne szkiełko, uważając, aby go nie stłuc. Następnie ostrożnie wyjmujemy tak przygotowaną „kanapkę” z naczynia, ocieramy nadmiar pożywki i umieszczamy ją w podstawie uchwytu.Umieść preparat w uchwycie, uważając, aby nie pękło szkiełko nakrywkowe pod wpływem nacisku. Oczyść oba szkiełka nakrywkowe za pomocą patyczka higienicznego nasączonego detergentem Sparkle; preferujemy Sparkle, ponieważ pozostawia on mniej smug na szkle. Czyść szkiełko nakrywkowe okrężnymi ruchami, zaczynając od środka, a następnie niezwłocznie przetrzyj je suchym patyczkiem higienicznym, aby uniknąć powstawania smug.Czyste szkło przykrywowe jest bardzo ważne dla uzyskania obrazowania wysokiej jakości, zwłaszcza przy zastosowaniu optyki DIC. Kultury neuronów z tylnej części rdzenia kręgowego są kulturami o niskiej gęstości, dlatego bardzo pomocne będą funkcje pozycjonowania stolika w mikroskopie, które ułatwiają przełączanie się między różnymi komórkami. Teraz możemy przystąpić do obserwacji morfologii wzrostu i motywności.Wizualizujemy wpływ wzrostu na morfologię i ruchliwość za pomocą wysokorozdzielczego obrazowania czasowego w technice różnicowego kontrastu fazowego (DIC). Obrazowanie DIC jest przydatne w tym zastosowaniu, ponieważ zapewnia widok powierzchniowy struktury stożka wzrostu w tym filmie przyspieszonym 60x DIC. Można wyraźnie dostrzec trzy domeny typowego stożka wzrostu.Domena peryferyjna, która składa się z filopodiów i lamellipodiów. Strefa przejścia, która charakteryzuje się aktywnością rufflingu, oraz domena centralna, zawierająca głównie mikrotubule i organelle. Aby zbadać mechanizmy sterowania stożkiem wzrostu, opracowaliśmy test interakcji z ograniczonymi koralikami (RBI assay).Mikrokulki powlekane białkami artesian są wykorzystywane do naśladowania komórkowych substratów docelowych. W filmie time-lapse w technice DIC mikrokulka jest umieszczana za pomocą mikroiły w domenie peryferyjnej stożka wzrostu. Można zaobserwować efekt i przepływ retrogradacyjny w postaci fal poruszających się wstecz w domenie centralnej.Organella poruszają się wzdłuż mikrotubul. Po początkowym okresie, w którym nie zachodzą istotne zmiany, można zaobserwować nagły ruch naprzód granicy domeny centralnej w kierunku unieruchomionej kuleczki. Towarzyszący temu wzrost krawędzi prowadzącej oraz wzrost naprężeń powodują dodatkowo osłabienie przepływu i wydłużenie mikrotubul, co można zaobserwować szczególnie wzdłuż osi oddziaływania z kuleczką.Aby przeanalizować dynamikę cytoszkieletu w stożkach wzrostu, stosujemy fluorescencyjną mikroskopię plamkową (fluorescent speckle microscopy). Do ciała komórki neuronu wstrzykujemy mikrostrzykawką sondy z fluorescencyjnie znakowaną tubuliną i aktyną, a następnie rejestrujemy filmy poklatkowe. W ramach dynamicznych ruchów cytoszkieletu aktyna, zaznaczona kolorem czerwonym, polimeryzuje wzdłuż krawędzi natarcia, jest przemieszczana wstecz przez przepływ retrogradowy i recyklingowana w strefie przejścia.Dynamiczne mikrotubule, przedstawione na zielono, badały wzrost obwodu stożka wzrostu poprzez kombinację procesów składania i translokacji. Niska intensywność znakowania skutkuje nakrapianym wzorem, co pozwala nam na ilościową analizę różnych parametrów dynamiki cytoszkieletu. Pokazaliśmy Państwu, jak przeprowadzić wypreparowanie komórek z zwojów grzbietowych, ich hodowlę oraz obrazowanie, jeśli chcieliby Państwo wykonać obrazowanie neuronalnych stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości.Jest to system szczególnie zalecany ze względu na duże rozmiary stożków wzrostu, wyraźnie zdefiniowane regiony cytoplazmy oraz dobrze opisany cytoszkielet. To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

neuronal-cell-cultures-from-aplysia-for-high-resolution-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kultury komórek nerwowych z Aplysia do wysokiej rozdzielczości obrazowania stożków wzrostowych

Pierwotne kultury neuronów czuciowo-ruchowych Aplysia stanowią modelowe przygotowanie do badania powstawania synaps i plastyczności synaps in vitro.  Film ten przedstawia identyfikację i mikrodysekcję neuronów czuciowych i ruchowych z Aplysia ganglia, a także metody tworzenia i utrzymywania neuronów czuciowo-ruchowych w hodowli.

Przygotowanie kultur czuciowo-ruchowych komórek neuronalnych Aplysia

W tym filmie demonstrujemy wizualizację translokacji PKC w żywych komórkach z wykorzystaniem PKC znakowanych fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo translokacji PKC w komórkach Sf9 oraz w neuronach sensorycznych Aplysia

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Hodowla eksplantów neuronalnych z wypreparowanych embrionów Xenopus laevis wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych umożliwia obrazowanie dynamiki cytoszkieletu stożka wzrostu.

Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Ten film pokazuje ocenę in vitro zapadania się stożka wzrostu neuronów przez agregaty amyloid-β (Aβ). Traktowanie neuronów agregatami Aβ powoduje destabilizację cytoszkieletu, prowadzącą do zapadnięcia się stożków wzrostu na końcach aksonów. Leczone komórki porównuje się z komórkami kontrolnymi w celu oceny stopnia zapadania się stożka wzrostu.

Ocena in vitro zagregowanego β amyloidu na zapadanie się stożka wzrostu neuronów

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Ślimak morski Aplysia californica był powszechnie używany jako model neurobiologiczny do badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami zachowania. Opisano metodologię badania układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów zidentyfikowanych obwodów neuronalnych.

Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

Ta procedura opisuje, jak szybko inicjować, rozszerzać i łączyć neuryty zorganizowane w komorach mikroprzepływowych za pomocą pokrytych poli-D-lizyną koralików przymocowanych do mikropipet, które kierują wydłużaniem neurytu.

Przeprogramowanie obwodów neuronalnych: nowa metoda szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego połączenia neuronalnego

Tutaj opisaliśmy protokół ilościowego badania montażu i struktury początkowych segmentów aksonów (AIS) neuronów hipokampa, które nie mają wstępnie zmontowanego AIS z powodu braku gigantycznej ankyryny-G.

Wykorzystanie pierwotnych hodowanych neuronów hipokampa do badania składania początkowych segmentów aksonów

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Poznaj hodowlę neuronów Aplysia californica do wysokorozdzielczego obrazowania stożków wzrostu. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki cytoszkieletu i motoryki neuronalnej w czasie rzeczywistym.

Kultury komórek neuronalnych z Aplysia do obrazowania stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów