Hodowle komórek neuronalnych z Aplysia do obrazowania stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości

W pseudolaboratorium hodujemy neurony komórkowe z samochodu Marine Mollusk Plegia California. Neurony te wykazują bardzo duże wady wzrostu, co czyni je bardzo dobrym systemem modelowym do badań o wysokiej rozdzielczości ruchliwości i wskazówek dotyczących wzrostu, szczególnie do analizy dynamiki cytoszkieletu. W tym filmie pokazujemy, jak przeprowadzić sekcję plegii i hodowlę komórek wstecznych.

Cześć, nazywam się Daniel Suter i pracuję na Wydziale Nauk Biologicznych Uniwersytetu Purdue. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę hodowli preparacyjnej i obrazowania neuronów tylnych komórek plegii. Neurony z C, jej apia CAA były szeroko wykorzystywane do badań nad uczeniem się i pamięcią.

Ponieważ Apia ma prosty układ nerwowy i duże neurony, które są odpowiednie do elektrofizjologii. W naszym laboratorium używamy tych neuronów, ponieważ ich stożki wzrostu są duże i bardzo dobrze nadają się do obrazowania w wysokiej rozdzielczości dynamiki białek związanej z ruchliwością i przewodnictwem wzrostu. Cała procedura obejmuje następujące kroki.

Pierwszego dnia zwierzę jest składane w ofierze i poddawane sekcji, aby uzyskać zwoje brzuszne. Drugiego dnia przygotowywane są płytki hodowlane. Skupiska komórek tylnych są preparowane, a poszczególne neurony są platerowane.

Trzeciego dnia konstruowana jest komora obrazowania do obrazowania poklatkowego komórek za pomocą mikroskopii kontrastowej z interferencją różnicową DIC, która demonstruje i opowiada o tym. Dzisiejszą procedurą będzie iTune Lee, doktorant w moim laboratorium. Teraz pokaże ci, jak przygotować neurony komórkowe.

Zacznijmy. Neurony tylnych komórek są częścią zwoju brzusznego układu nerwowego plegii, więc będziemy preparować cały ganglion brzuszny w celu trawienia enzymatycznego. Następnie oddzielimy dwa skupiska komórek workowych od reszty ganglionu.

Zwój brzuszny będzie trawiony w roztworze drugiej fazy przez 15 do 16 godzin, aby rozluźnić tkanki łączne. Teraz musimy przygotować dużą 60-mililitrową strzykawkę wypełnioną 0,5 molowym chlorkiem magnezu, aby złożyć zwierzę w ofierze i wyczyścić narzędzia do preparowania, jedną sekcję kleszczową, nożyczki i duże nożyczki. Jesteśmy dzikimi plegiami California car z kalifornijskiego wybrzeża, które ważą około 150 gramów.

Trzymamy zwierzęta w zbiorniku z homarami przez maksymalnie trzy do czterech tygodni. Zwierzęciu wstrzykuje się w pobliżu głowy do jamy ciała roztwór chlorku magnezu. Pocieranie zwierzęcia pomaga rozprowadzać roztwór i zapobiega jego skurczom.

Przypnij zwierzę za głowę i ogon do styropianowej deski za pomocą igieł strzykawkowych. Podnieś mięsień ściany ciała jednym kleszczem i rozetnij jamę ciała dużymi nożyczkami. Następnie rozetnij ścianę ciała wzdłuż boku od głowy do ogona i przypnij mięsień do deski.

Następnie zwój brzuszny musi znajdować się pod jajnikiem, który jest żółtawym narządem przypominającym szczotkę. Można znaleźć zwój brzuszny. Odłącz ganglion, przecinając nerwy nożyczkami do preparowania po przedniej i tylnej stronie zwoju.

Następnie przenieś ganglion do probówki z jednym mililitrem przemieszczonego roztworu i umieść go w łaźni wodnej o temperaturze 22 stopni na 15,5 godziny. Podczas tej inkubacji tkanka łączna rozluźni się do punktu, w którym można łatwo usunąć skupiska komórek tylnych. Przed rozpoczęciem hodowli komórek tylnych przygotujemy szkiełka nakrywkowe, na których hodowane są neurony.

Hodujemy neurony komórkowe na szkiełkach nakrywkowych pokrytych liiną na 35-milimetrowych szalkach Petriego. Następnie zanurza się je w pożywce L 15 A SW, która jest pożywką o wysokiej zawartości soli. W przypadku tego typu komórek zazwyczaj przygotowujemy od ośmiu do 10 szalek Petriego z szkiełkami nakrywkowymi na zwierzę.

Omówmy teraz narzędzia używane do powlekania neuronów komórek worka. Do wypreparowania skupisk komórek workowych potrzebowalibyśmy trzech brzoskwiniowych naczyń bez szkiełek nakrywkowych wypełnionych L 15 A SW, cienkich kleszczyków i nożyczek wysterylizowanych alkoholem oraz wygiętej żółtej końcówki przymocowanej do rurki P 20. Żółtą końcówkę pali się, szybko przesuwając ją nad płomieniem palnika benson i używając kleszczy do jej zgięcia.

Uważaj, aby nie zmiażdżyć części zgiętej. W przeciwnym razie klaster komórek worka może tam później utknąć. Sekcja i posiew komórek worka plegii odbywa się w temperaturze pokojowej pod zakresem sekcji.

Teraz 15,5-godzinna inkubacja enzymów dobiegła końca i możemy przenieść zwój brzuszny z przestrzeni dysku do jednej z szalek roboczych z pożywką L 15 A SW. Zanim pokażemy, jak izolowane są komórki workowe, spójrzmy najpierw na schemat. Aby zobrazować, w jaki sposób preparowany jest ganglion brzuszny, najpierw przecinamy zwój brzuszny przez środek.

Jak widać po tej linii. Następnie wykonujemy dwa cięcia z przodu i z tyłu tyłu. Więc klaster, jak widać tutaj.

Teraz, patrząc przez stereoskop, można zobaczyć, że zwój brzuszny jest przecięty przez środek, a teraz można zobaczyć, że dwa nacięcia są wykonane z przodu i z tyłu tylnego skupiska komórek. Następnie za pomocą kleszczy znajdujemy otwór w tkance łącznej i delikatnie dociskamy osłonkę tkanki łącznej otaczającą skupisko komórek worka. Jeśli to możliwe, usuń tkankę łączną z klastra jako jeden kawałek, używając nożyczek do preparowania.

Należy jednak uważać, aby nie uszkodzić klastra komórek worka. Po pobraniu pożywki do wygiętej końcówki, delikatnie przenieś klaster komórek worka do innego naczynia roboczego. Delikatnie przełóż grupę komórek workowych żółtą końcówką, aby usunąć pojedyncze komórki worka z klastra.

W tym celu należy umieścić aparat udojowy na końcówce pipety i wypchnąć go, nie powodując powstawania pęcherzyków powietrza. Przenieść żywe komórki z kina zbiorczego do szalek zawierających szkiełka nakrywkowe pokryte poliamidem. Martwe komórki są czarne w środku, podczas gdy żywe komórki są białe.

Ważne jest, aby umieścić komórki na środku szkiełka nakrywkowego do mikroskopii i jak najszybciej usunąć wszelkie resztki komórek i martwe komórki. Podnosząc niechciany materiał lub zdmuchując go, zdrowe komórki szybko przyczepią się do płytki polilizyny. Około 15 do 25 komórek na każdym szkiełku nakrywkowym.

Po umieszczeniu wszystkich komórek z pierwszego klastra tkanka łączna drugiego klastra jest usuwana i ta sama procedura posiewu komórek jest kontynuowana. Po zakończeniu wszystkich płytek pozostaw je w temperaturze pokojowej na ławce podłogowej przez co najmniej dwie godziny, aby umożliwić prawidłowe przymocowanie komórek, unikając wibracji. Następnie umieść naczynia na styropianie lub plastikowej tacce i przenieś je do inkubatora o temperaturze 14 stopni przed dalszym użyciem.

Zazwyczaj wyobrażamy sobie stożki wzrostu plegii jeden lub dwa dni po poszyciu. Do obrazowania dynamiki stożka wzrostu neuronów w stylu życia wykonujemy małą komorę obrazowania składającą się z dwóch szkiełek nakrywkowych oddzielonych plastikowymi przestrzeniami. Dolna szklana osłona ma przyczepione do nich neurony.

Górny szkiełko nakrywkowe jest skracany za pomocą pisaka diamentowego, aby umożliwić łatwą wymianę nośnika. Na stoliku mikroskopowym kanapka z szkiełkiem nakrywkowym jest następnie umieszczana w specjalnie wykonanym uchwycie do montażu na mikroskopie. Smar wysokopróżniowy Stage służy do utrzymywania elementów komory razem bez wycieku medium Za pomocą małej strzykawki smar wysokopróżniowy nakłada się na górną szybę pokrywy, a następnie za pomocą kleszczyków ustawiamy przestrzenie, a następnie nakładamy trochę smaru próżniowego na wierzch.

Następnie podnosimy cały zespół, odwracamy go i delikatnie dociskamy do pokrywy Slip z komórkami nadal zanurzonymi w naczyniu. Użyj końcówek Q, aby wyrównać szkiełka nakrywkowe i dociśnij górną szkiełko nakrywkowe, nie łamiąc go. Następnie ostrożnie wyjmujemy kanapkę z naczynia, wycieramy nadmiar podłoża i kładziemy go na dnie uchwytu.

Umieść kanapkę w uchwycie, nie rozbijając szkła nakrywkowego pod naciskiem. Wyczyść oba szkła nakrywkowe za pomocą błyszczącego środka do czyszczenia szkła na końcówce higienicznej i wolimy używać blasku, ponieważ pozostawia on mniej smug na szkle. Wyczyść zakrytą szklankę okrężnymi ruchami od środka i natychmiast po niej użyj suchej końcówki higienicznej, aby uniknąć smug.

Czyste pokryte szkło jest bardzo ważne dla wysokiej jakości obrazowania, zwłaszcza w przypadku optyki DIC. Hodowle neuronów komórek grzbietowych Plegia są kulturami o niskiej gęstości, więc będzie bardzo pomocne, jeśli Twój mikroskop będzie miał funkcje pozycjonowania stolika do łatwego przełączania między różnymi komórkami. Teraz jesteśmy gotowi do obserwacji wzrostu, morfologii i ruchliwości rdzenia.

Wizualizujemy wzrost na morfologii i ruchliwości za pomocą kontrastu interferencji różnicowej o wysokiej rozdzielczości, obrazowania poklatkowego DIC. Obrazowanie DIC jest przydatne w tym zastosowaniu, ponieważ zapewnia widok powierzchni struktury kon wzrostu w tym filmie poklatkowym 60 XDIC. Wyraźnie widać trzy domeny typowego stożka wzrostu.

Domena peryferyjna, która składa się z afektu, wzbogaca la podia i op podia. Strefa przejściowa, która charakteryzuje się aktywnością falowania i domeną centralną, która zawiera głównie mikrojajowody i organelle. Aby zbadać mechanizmy sterowania wzrostem, opracowaliśmy test RBI z ograniczoną interakcją kulek w tym teście.

Mikrogranulki pokryte białkami artezyjskimi są używane do naśladowania docelowych substratów komórkowych. Koralik jest umieszczany na peryferyjnej domenie koni wzrostu za pomocą mikroigły w filmie poklatkowym DIC. Można zobaczyć efekt wsteczny i przepływ poprzez ruch wsteczny fal w domenie centralnej.

Organelle poruszają się na mikrojajowodach. Po początkowym okresie, w którym nie zachodzą żadne znaczące zmiany, można zaobserwować nagły ruch do przodu granicy domeny centralnej w kierunku unieruchomionego koralika. Wzrost krawędzi natarcia i wzrost napięcia w połączeniu z efektem tłumienia przepływu i wydłużeniem mikrojajowodów można zaobserwować szczególnie wzdłuż osi interakcji kulki.

Do analizy dynamiki cytoszkieletu w stożkach wzrostu wykorzystujemy fluorescencyjną mikroskopię plamkową. Mikrowstrzykiwamy fluorescencyjnie znakowaną tubulinę i działające sondy do ciała komórki neuronalnej i nagrywamy filmy poklatkowe. Spośród dynamicznych ruchów cytoszkieletu, afekt pokazany na czerwono jest gromadzony wzdłuż krawędzi natarcia wstecznego ołowiu przemieszczonego przez przepływ wsteczny i zawracanego w strefie przejściowej.

Dynamiczne mikrojajowody pokazane na zielono badały obrzeża wzrostu poprzez połączenie zachowania związanego z montażem i translokacją. Niska ilość znakowania skutkuje nakrapianym wzorem, co pozwala nam na ilościową analizę różnych parametrów dynamiki cytoszkieletu. Pokazaliśmy Ci, jak przeprowadzić sekcję komórek plegii, hodowlę i obrazowanie, jeśli chcesz wykonać obrazowanie w wysokiej rozdzielczości stożków wzrostu neuronów.

Jest to naprawdę system do użycia ze względu na duży rozmiar stożków wzrostu, zdefiniowane regiony cytoplazmatyczne i dobrze opisany cytoszkielet. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.