Name: Zielona synteza, charakterystyka, enkapsulacja i pomiar potencjału uwalniania nowych mikro-/submikronowych cząstek alkaliów ligniny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj zieloną syntezę mikro- i submikronowych cząstek ligniny oraz ich charakterystykę fizykochemiczną. Ta metoda umożliwia enkapsulację bioflawonoidów i badanie uwalniania w warunkach przewodu pokarmowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Bułgarski Fundusz Naukowy w ramach umowy nr KΠ-06 H59/3 oraz przez projekt naukowy nr 07/2023 FVM, Uniwersytet Trakia.

1. Synteza mikrocząstek ligniny
<ol>
	<li>Przygotować wodny roztwór ligniny alkalicznej o stężeniu 50 mg/ml, rozpuszczając 2,5 g ligniny alkalicznej w 50 ml wody ultrapurej przy użyciu mieszadła magnetycznego.</li>
	<li>Przygotuj 1% roztwór Tween 80, rozpuszczając 1 ml Tween 80 w 100 ml wody ultraczystej.</li>
	<li>Przygotować 2 M roztwór HNO33 poprzez rozcieńczenie 6,65 ml 67% HNO33 (gęstość = 1,413 g/ml) wodą ultraczystą do końcowej objętości 50 ml.</li>
	<li>Powoli dodaj 15 ml 1% roztworu Tween 80 do 50 ml roztworu ligniny alkalicznej o stężeniu 50 mg/ml.</li>
	<li>Mieszaninę należy mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego przy 500 obr./min przez 10 min, aby surfaktant został dobrze rozproszony.</li>
	<li>Dodać 20 mL 2 M HNO33 kroplami za pomocą strzykawki z szybkością przepływu wynoszącą około 150 µL/s do mieszaniny.</li>
	<li>Kontynuuj mieszanie zawiesiny przez 30 min, aż ciemnobrązowy roztwór przekształci się w jasnobrązową zawiesinę mikrocząsteczek.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę do probówek o pojemności 1,5–2 ml i wiruj przez 30 min przy 15 000 × g w ultrawirówce przy 10 °C.</li>
	<li>Należy zebrać nadsącz do dalszych analiz, a mikrocząstki wypłukać wodą ultrapurystyczną.</li>
	<li>Powtórzyć procedury płukania/ultrawirowania 3 razy.</li>
	<li>Przed homogenizacją ultradźwiękową zanurzyć pojemnik z mikrocząstkami w kąpieli lodowej.</li>
	<li>Homogenizować mikrocząstki przez 4 min przy intensywności 93% za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego.</li>
	<li>Liofilizować mikrocząstki w temperaturze -64 °C w liofilizatorze, a następnie przechowywać w eksykatorze do późniejszego użycia.</li>
</ol>
2. Synteza submikronowych cząstek ligniny
<ol>
	<li>Przygotować wodny roztwór ligniny alkalicznej o stężeniu 5 mg/mL, rozpuszczając 125 mg ligniny alkalicznej w 25 mL wody ultrapurej za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
	<li>Do roztworu ligniny alkalicznej powoli dodać 1 mL 96% EtOH.</li>
	<li>Mieszaninę mieszać na mieszadle magnetycznym przy 500 rpm przez 3 min.</li>
	<li>Przygotować 50 mL 1% roztworu kwasu cytrynowego, rozpuszczając 0,5 g kwasu cytrynowego w wodzie ultrapurej do uzyskania objętości końcowej 50 mL.</li>
	<li>Do mieszaniny dodać kroplowo za pomocą strzykawki 7 mL 1% kwasu cytrynowego z prędkością przepływu około 4 mL/min.</li>
	<li>Kontynuować mieszanie przez 10 min, aż brązowy przejrzysty roztwór przekształci się w mętną, jasnobrązową zawiesinę cząstek submikronowych.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do probówek i wirować przez 30 min przy 15,000 × g w ultrawirowarce w temperaturze 10 °C.</li>
	<li>Zebrać nadsącz do dalszych analiz i wypłukać mikrocząstki wodą ultrapurej.</li>
	<li>Powtórzyć procedurę płukania i ultrawirowania 3x.</li>
	<li>Przed homogenizacją ultradźwiękową umieścić pojemnik z mikrocząstkami w kąpieli lodowej.</li>
	<li>Homogenizować mikrocząstki ultradźwiękowo przez dwa cykle po 4 min każdy, przy intensywności 96% w homogenizatorze ultradźwiękowym.</li>
	<li>Po pierwszym cyklu schłodzić pojemniki przez 1 min.</li>
	<li>Liofilizować mikrocząstki w temperaturze -64 °C w liofilizatorze, a następnie przechowywać je w eksyكاته do dalszego użytku.</li>
</ol>
3. Synteza mikro- i submikronowych cząstek ligniny z enkapsulowanymi naturalnymi flawonoidami
<ol>
	<li>Powtórzyć kroki 1.1-1.5 dla mikrocząsteczek.</li>
	<li>Odważyć 0,08 g moryny, rozpuścić ją w 1 mL EtOH i dodać ten roztwór etanolowy do mieszaniny.</li>
	<li>Mieszać mieszaninę na mieszadle magnetycznym z prędkością 500 rpm przez 20 min.</li>
	<li>Do mieszaniny dodać kroplami za pomocą strzykawki 20 mL 2 N HNO3 z prędkością przepływu około 150 µL/s.</li>
	<li>Kontynuować mieszanie mieszaniny przez 60 min.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 1.8-1.13.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.1 dla cząsteczek submikronowych.</li>
	<li>Odważyć 0,04 g kwercetyny, rozpuścić ją w 1 mL EtOH i dodać ten roztwór etanolowy do wodnego roztworu ligniny alkalicznej.</li>
	<li>Mieszać mieszaninę na mieszadle magnetycznym z prędkością 500 rpm przez 10 min.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.4-2.13.</li>
</ol>
4. Wyznaczanie wydajności enkapsulacji mikro- i submikrocząstek ligniny
<ol>
	<li>Oblicz zawartość dodanej substancji bioaktywnej podczas procedury syntezy obu typów cząstek ligniny kapsułkujących flawonoidy.
	<ol>
		<li>Wyznacz spektrofotometrycznie absorbancję flawonoidu w supernatancie otrzymanym w krokach 1.9 i 2.8 po jego rozcieńczeniu 96% EtOH.</li>
		<li>Oblicz stężenie nieuwięzionego morinu/kwercetyny, korzystając z krzywych kalibracyjnych flawonoidów.</li>
		<li>Oblicz wydajność enkapsulacji (EE, %) mikrocząstek ligniny w odniesieniu do naturalnych flawonoidów, korzystając z równania (1): 
		<img alt="Wzór na wydajność enkapsulacji; narzędzie badawcze i edukacyjne, metoda obliczania EE" src="/files/ftp_upload/66216/66216eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">     (1) 
		Gdzie wo to całkowita ilość dodanej substancji bioaktywnej (mg), a wf to ilość wolnego, nieuwięzionego flawonoidu (mg).</li>
		<li>Oblicz pojemność załadunkową leku (DLC, %) – istotny parametr reprezentujący ilość leku w cząstkach na jednostkę masy systemu nośnika – korzystając z rów. (2): 
		<img alt="Wzór na pojemność załadunkową leku, równanie obliczania DLC dla analizy farmaceutycznej." src="/files/ftp_upload/66216/66216eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">     (2) 
		Gdzie wp to całkowita ilość (wydajność) otrzymanych po liofilizacji mikro- lub submikrocząstek ligniny (mg).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Charakterystyka mikro- i submikronowych cząstek ligniny
<ol>
	<li>Wyznaczanie liczby, wielkości i rozkładu wielkości cząstek
	<ol>
		<li>Ocenić wielkość i rozkład wielkości cząstek próbek za pomocą automatycznego licznika komórek z opcją liczenia kulek. Za pomocą mikropipety nanieść 1 µL zawiesiny mikro- i submikronowych cząstek ligniny/flawonoidów w wodzie ultraczystej do odpowiedniego dołka płytki licznikowej wymaganej do przeprowadzenia operacji.</li>
		<li>Odczekać, aż na wyświetlaczu automatycznego licznika komórek pojawi się liczba cząstek w 1 mL zawiesiny, a także ich liczba i rozkład według wielkości. 
		UWAGA: Aparatura umożliwia zapis danych na pamięci USB. Specjalistyczne oprogramowanie automatycznego licznika komórek pozwala na dalszą obróbkę zapisanych plików cyfrowych i zdjęć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczanie zawartości powierzchniowych grup kwasowych/zasadowych cząstek ligniny metodą miareczkowania potencjometrycznego
	<ol>
		<li>Odważyć 0,04 g niezaładowanych lub enkapsulowanych flawonoidami cząstek ligniny.</li>
		<li>Przenieść je do kolby Erlenmeyera, dodać 10 mL 0,1 M HCl i umieścić kolbę na mieszadle magnetycznym przy 250 rpm.</li>
		<li>Napełnić biuret o pojemności 50 mL 0,1 M roztworem wzorcowym titrantu NaOH.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem miareczkowania zmierzyć początkowe pH roztworu w kolbie Erlenmeyera za pomocą laboratoryjnego pH-metru.</li>
		<li>Rozpocząć miareczkowanie i mierzyć pH analizowanego roztworu po każdym dodaniu 0,5 mL titrantu.</li>
		<li>Zapisać dane eksperymentalne w tabeli zawierającej objętość dodanego titrantu i odpowiadającą jej wartość pH.</li>
		<li>Zakończyć miareczkowanie, gdy poprzez zwiększanie objętości roztworu titrantu osiągnięta zostanie w przybliżeniu stała wartość pH.</li>
		<li>Przedstawić dane eksperymentalne w formie krzywych miareczkowania różniczkowego zerowego, pierwszego i drugiego rzędu.</li>
		<li>Wyznaczyć punkty równoważności i odpowiadające im objętości równoważne użytych titrantów.</li>
		<li>Obliczyć zawartość grup kwasowych Aa i zasadowych Ab na powierzchni niezaładowanych oraz załadowanych flawonoidami cząstek ligniny, korzystając z równań (3) i (4): 
		<img alt="Wzór na równowagę statyczną Aa=Vequi×NT/m. Symbol równania do obliczeń fizycznych." src="/files/ftp_upload/66216/66216eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3"> mgeq/g     (3) 
		<img alt="Równanie miareczkowania, wzór obliczania A_b w analizie reakcji chemicznych." src="/files/ftp_upload/66216/66216eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 4"> mgeq/g     (4) 
		Gdzie Veqi to objętość równoważna (mL); NT normalność titrantu (mgeqv/mL); VT objętość titrantu użyta w procedurze wyznaczania (mL); m masa analizowanej próbki (g).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczanie punktu zerowego ładunku (pHPZC) cząstek na bazie ligniny metodą dodawania fazy stałej.
	<ol>
		<li>Przygotować 60 mL 0,1 M wodnego roztworu NaCl.</li>
		<li>Do każdej z pięciu zamkniętych kolb stożkowych dodać 9 mL 0,1 M roztworu NaCl i dostosować pH do wartości pHi = 2, 4, 7, 10 i 12 (gdzie i = 1-5 oznacza numer odpowiedniego roztworu), odpowiednio poprzez dodanie 0,1 M HCl lub 0,1 M NaOH. Doprowadzić całkowitą objętość roztworu w każdej kolbie dokładnie do 10 mL, dodając roztwór NaCl o tym samym stężeniu.</li>
		<li>Do każdej kolby dodać 40 mg suchych cząstek ligniny (niezaładowanych, załadowanych flawonoidami, mikro-/submikronowych) i szczelnie zamknąć kolby.</li>
		<li>Umieścić kolby w pozycji pionowej na wytrząsarce orbitalnej i wytrząsać przez 24 h.</li>
		<li>Pozostawić na 30 min w celu osiągnięcia równowagi, a następnie zmierzyć końcowe pH (pHf) nadosadów w każdej kolbie.</li>
		<li>Wykreślić wartości pHf w funkcji odpowiadających im początkowych wartości pH (pHi).</li>
		<li>Punkt zerowego ładunku (pHPZC) definiuje się jako wartość pH, przy której krzywa ΔpH w funkcji pHi przecina linię prostą o współrzędnych (pHi; pHi).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczanie całkowitej zawartości związków fenolowych (TPC) cząstek ligniny 
	UWAGA: Całkowita zawartość związków fenolowych (TPC) mikro- i submikronowych cząstek ligniny jest wyznaczana za pomocą zmodyfikowanej kolorymetrycznej metody Folina-Ciocalteu.
	<ol>
		<li>Zmieszać 200 µL wodnej zawiesiny cząstek o stężeniu 500 µg/mL z 600 µL wody ultraczystej i 200 µL odczynnika Folina-Ciocalteu (1:1, v/v).</li>
		<li>Po 5 min dodać do mieszaniny 1,0 mL 8% Na2CO3 oraz 1,0 mL wody Milli-Q i inkubować w ciemności w temperaturze 40 °C przez 30 min w łaźni wodnej z okresowym mieszaniem.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę przy 5 300 × g przez 2 min.</li>
		<li>Przygotować próbę ślepą bez zawartości cząstek.</li>
		<li>Przenieść 3,5 mL nadosadu do kwarcowej kuwety 10 mm i zmierzyć absorbancję spektrofotometrem UV/Vis w obszarze widzialnym przy 760 nm względem próby ślepej.</li>
		<li>Przygotować krzywą kalibracyjną dla wzorca kwasu galusowego zgodnie z krokami 5.3.1-5.3.5; jedynie zamiast 200 µL zawiesiny cząstek ligniny użyć etanolowego roztworu kwasu galusowego o stężeniach początkowych 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 i 200 µg/mL.</li>
		<li>Wyrazić dane eksperymentalne dla mikrocząstek jako mg ekwiwalentów kwasu galusowego w miligramach na gram suchej próbki (mg GAE/g).</li>
		<li>Obliczyć TPC korzystając z równania (5): 
		<img alt="Wzór na całkowitą zawartość związków fenolowych, TPC = CGA/CS×1000, równanie analizy chemicznej." src="/files/ftp_upload/66216/66216eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 5"> mg GAE/g     (5) 
		Gdzie CGA to stężenie próbki odpowiadające stężeniu wzorcowego kwasu galusowego uzyskane z wykresu kalibracyjnego kwasu (µg GA/mL); Cs to stężenie próbki, które jest równe masie suchej próbki podzielonej przez objętość rozpuszczalnika (µg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Oznaczenie zdolności do uwalniania cząsteczek ligniny in vitro
<ol>
	<li>Przygotuj 250 mL symulowanego ośrodka żołądkowego pozbawionego enzymów, dostosowując pH standardowego roztworu PBS za pomocą 0,1 M HCl do pH = 1,2.</li>
	<li>Przygotuj po 250 mL każdego z dwóch symulowanych roztworów płynu jelitowego, dostosowując pH standardowego roztworu PBS za pomocą 0,1 M NaOH/0,1 M HCl do pH = 6,8 i 7,4 odpowiednio.</li>
	<li>Dodaj 25 mg mikro-/submikronowych cząstek z enkapsulowanymi flawonoidami do 50 mL symulowanego ośrodka żołądkowego pozbawionego enzymów w szklanym reaktorze okresowym wyposażonym w mieszadło mechaniczne i umieść go w termostatycznej kąpieli wodnej w stałej temperaturze T = 37 ± 0,2 oC.</li>
	<li>Zanurz mieszadło na głębokość 2/3 objętości cieczy, aby zapewnić pełne wymieszanie fazy stałej i ciekłej oraz maksymalny transport masy bez tworzenia stref zastoju.</li>
	<li>Pobieraj 1 mL próbki z reaktora co 10 min aż do 90th minuty i natychmiast pipetuj 1 mL świeżego roztworu symulowanego płynu do reaktora, aby zapobiec zmianie całkowitej objętości i zapewnić warunki ujścia (sink conditions).</li>
	<li>Powtórz tę samą procedurę, w tym kroki 6.3-6.6, z obydwoma symulowanymi roztworami płynu jelitowego o pH = 6,8 i 7,4 odpowiednio, przez 200 min.</li>
	<li>Przeprowadź analogiczne doświadczenia z niezaładowanymi cząstkami ligniny w trzech symulowanych ośrodkach i wykorzystaj te próbki jako wzorce do zerowania spektrofotometru.</li>
	<li>Wyznacz spektrofotometrycznie absorbancję próbek po ich przefiltrowaniu i rozcieńczeniu 96% EtOH względem próbek ślepych z kroku 6.7, a następnie oblicz odpowiednie stężenie flawonoidów, korzystając z odpowiadających im krzywych kalibracyjnych moryny uzyskanych odpowiednio dla pH = 1,2, 6,8 i 7,4.</li>
	<li>Oblicz skumulowane uwalnianie (CR) bioflawonoidów w µg/mL za pomocą równania (6) oraz procent skumulowanego uwalniania (CRP) za pomocą równania (7): 
	<img alt="Równanie dla stosunku stężeń chemicznych, formuła CR=Ci+1+(Vs/V)·Ci, istotna w chromatografii." src="/files/ftp_upload/66216/66216eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 6">    (6) 
	Gdzie Ci i Ci+1 to stężenia moryny/kwercetyny w ith i (i+1)th próbce (µg/mL); Vs to objętość próbki pobranej z reaktora okresowego (mL); V to całkowita objętość symulowanych ośrodków (mL). 
	<img alt="Formuła obliczania CRP w kontekście naukowym; procent, stężenie, równanie." src="/files/ftp_upload/66216/66216eq07.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 7">    (7) 
	Gdzie Cmax to maksymalne stężenie związku biologicznie czynnego w nośniku (µg/mL).</li>
</ol>
7. Analizy statystyczne
<ol>
	<li>Przedstaw dane eksperymentalne jako średnie ± odchylenia standardowe (SD) z trzech niezależnych pomiarów.</li>
	<li>Określ istotność statystyczną wyników eksperymentalnych, przeprowadzając test ANOVA jako test post hoc. Wartość p &lt; 0,05 uznaj za statystycznie istotną.</li>
</ol>

Lignin Micro-/Submicron Particle Synthesis for Bioflavonoid Release

<ol><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+nanoparticles+with+high+phenolic+content+as+efficient+antioxidant+and+sun-blocker+for+food+and+cosmetics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sustainable+Chem.+Eng%22%5BJournal%5D)">Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics.</a> ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).</li>
<li>Boarino, A., Klok, H. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+lignin+valorization+in+food+packaging%2C+antimicrobial%2C+and+agricultural+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications.</a> Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).</li>
<li>Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+Acacia+lignin-gelatin+film+for+its+possible+application+in+food+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Bioprocess%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging.</a> Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valorization+of+lignin+into+nanoparticles+and+nanogel%3A+characterization+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol.+Reports%22%5BJournal%5D)">Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application.</a> Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041(2022).</li>
<li>Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+lignin+in+biopolymeric+packaging+films%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Utilization of lignin in biopolymeric packaging films.</a> ACS Omega. 3 (7), 7388-7398 (2018).</li>
<li>Beaucamp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+for+energy+applications+-+state+of+the+art%2C+life+cycle%2C+technoeconomic+analysis+and+future+trends+%28Critical+Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review).</a> Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).</li>
<li>Antunes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sugarcane+to+skin%3A+Lignin+as+a+multifunctional+ingredient+for+cosmetic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application.</a> Int J Biol Macromol. 234, 123592(2023).</li>
<li>Garg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+lignin+nanoparticles+for+cancer+drug+delivery%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Letters%22%5BJournal%5D)">Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update.</a> Materials Letters. 311, 131573(2022).</li>
<li>Anushikha, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+as+a+UV+blocking%2C+antioxidant%2C+and+antimicrobial+agent+for+food+packaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Conv.+Bioref%22%5BJournal%5D)">Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications.</a> Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).</li>
<li>Freitas, F. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((synthesis+of+lignin+nano-+and+micro-particles%3A+Physicochemical+characterization%2C+bioactive+properties+and+cytotoxicity+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment.</a> Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).</li>
<li>Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+lignin+nanoparticles+from+rice+straw+after+biosynthesis+using+Lactobacillus+bulgaricus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series.+9th+International+Seminar+on+New+Paradigm+and+Innovation+of+Natural+Sciences+and+its+Application%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus.</a> Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070(2020).</li>
<li>Worku, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+lignin+nanoparticles+from+Oxytenanthera+abyssinica+by+nanoprecipitation+method+followed+by+ultrasonication+for+the+nanocomposite+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+King+Saud+University+-+Science%22%5BJournal%5D)">Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application.</a> Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793(2023).</li>
<li>Gala Morena, A., Tzanov, T. z <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+lignin-based+nanoparticles+and+their+use+in+composite+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Adv%22%5BJournal%5D)">Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials.</a> Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).</li>
<li>Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+alkali+lignin+as+a+natural+radical+scavenger+and+anticancer+alternative%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative.</a> Int J Mol Sci. 24 (16), 12705(2023).</li>
<li>Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+synthesized+lignin+microparticles+as+bioinspired+oral+drug-delivery+vehicles%3A+Flavonoid-carrier+potential+and+in+vitro+radical-scavenging+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity.</a> Pharmaceutics. 15 (4), 1067(2023).</li>
<li>Yaneva, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+potential+of+conjugated+lignin%2Fmorin%2Fchitosan+combinations+as+a+function+of+system+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity.</a> Antibiotics. 11, 650(2022).</li>
<li>Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+trends+in+biodegradable+microcarriers+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications.</a> Polymers. 15 (6), 1487(2023).</li>
<li>Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+chemical+modifications+of+lignin%3A+Towards+lignin-based+nanomaterials+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications.</a> Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin-based+nanoparticles%3A+a+review+on+their+preparations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications.</a> Polymers. 12 (11), Basel. 2471(2020).</li>
<li>Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+lignin+association+to+nano-%2Fmicro-particle+preparation%3A+extracting+higher+value+of+lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chemistry%22%5BJournal%5D)">From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin.</a> Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).</li>
<li>Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacture+of+lignin+microparticles+by+anti-solvent+precipitation%3A+Effect+of+preparation+temperature+and+presence+of+sodium+dodecyl+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate.</a> Food Res Int. 66, 93-99 (2014).</li>
<li>Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+from+micro-+to+nanosize%3A+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lignin from micro- to nanosize: Applications.</a> Int. J. Mol. Sci. 18, 2367(2017).</li>
<li>Mishra, P. K., Ekielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+synthesize+lignin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Interfaces%22%5BJournal%5D)">A simple method to synthesize lignin nanoparticles.</a> Colloids Interfaces. 3, 52(2019).</li>
<li>Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+uniform+colloidal+spheres+from+lignin%2C+a+renewable+resource+recovered+from+pulping+spent+liquor%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor.</a> Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).</li>
<li>Tardy, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+nano-+and+microparticles+as+template+for+nanostructured+materials%3A+formation+of+hollow+metal-phenolic+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules.</a> Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).</li>
<li>Silva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraquat-loaded+alginate%2Fchitosan+nanoparticles%3A+preparation%2C+characterization+and+soil+sorption+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Haz+Mat%22%5BJournal%5D)">Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies.</a> J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).</li>
<li>Georgieva, N., Yaneva, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+natural+and+acid-modified+layered+mineral+materials+as+rimifon-carriers+using+UV%2FVIS%2C+FTIR%2C+and+equilibrium+sorption+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cogent+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study.</a> Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+reversal+nano-systems+for+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Charge reversal nano-systems for tumor therapy.</a> J Nanobiotechnol. 20, 31(2022).</li>
<li>Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+diazo+dye+from+the+aqueous+phase+by+biosorption+onto+ball-milled+maize+cob+%28BMMC%29+biomass+of+Zea+mays%5BTitle%5D)+AND+%22Maced.+J.+Chem.+Chem.+Eng%22%5BJournal%5D)">Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays.</a> Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).</li>
<li>Zatorska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-loading+capacity+of+polylactide-based+micro-+and+nanoparticles+-+Experimental+and+molecular+modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study.</a> Int J Pharmaceutics. 591, 120031(2020).</li>
<li>Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYaneva%2C+Z+%22Nanoscale+Fabrication%2C+Optimization%2C+Scale-Up+and+Biological+Aspects+of+Pharmaceutical+Nanotechnology%22">Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology</a>. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).</li>
<li>Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+d%2Cl-%CE%B1-tocopherol+acetate%2Fzeolite+carrier+system%3A+equilibrium+study%5BTitle%5D)+AND+%22Monatshefte+fur+Chemie+Chemical+Monthly%22%5BJournal%5D)">Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study.</a> Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).</li>
<li>Yaneva, Z., Georgieva, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+physical+chemistry%2C+equilibrium%2C+and+kinetic+mechanism+of+Azure+A+biosorption+by+Zea+mays+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dispersion+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass.</a> Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Jednym z głównych krytycznych zagadnień nowoczesnych metodologii syntezy przy projektowaniu formulacji lekowo-nośnikowych na bazie biopolimerów jest stosowanie niebezpiecznych odczynników organicznych - lotnych i łatwopalnych rozpuszczalników, takich jak tetrahydrofuran, aceton, metanol, a nawet DMSO w wysokich stężeniach - co ogranicza ich zastosowanie w biomedycynie, przemyśle farmaceutycznym i technologii żywności ze względu na przejawianie się możliwych skutków toksycznych20, 21,22,23,24. Kolejną istotną kwestią jest udział skomplikowanych reakcji chemicznych (np. estryfikacji, polimeryzacji) lub kosztownej aparatury podczas procesu syntezy. Obie techniki przedstawione w niniejszym manuskrypcie przezwyciężają te ostatnie ograniczenia poprzez zastosowanie alternatywnych rozpuszczalników (woda) i nietoksycznych związków, takich jak środki powierzchniowo czynne (Tween 80) i środki sieciujące (etanol, kwas cytrynowy), klasyfikując je jako "zielone" metody syntezy. Co więcej, metodologie te oferują rozwiązanie zaspokajające krytyczną potrzebę i potrzebę opracowania niedrogich, przyjaznych dla środowiska, zrównoważonych procedur projektowania cząsteczek ligniny, służących jako biodegradowalne, bioaktywne i biokompatybilne szablony nośników substancji fizjologicznie czynnych25.
Aby uzyskać cząstki ligniny o pożądanej wielkości, wybrano dwa warunki produkcji: jeden o wysokim stężeniu ligniny (50 g/L) i kwasie azotowym jako środku przeciwrozpuszczalnikowym, a drugi o niższym stężeniu ligniny (5 g/L), etanolu jako przeciwrozpuszczalniku oraz kwasie cytrynowym pełniącym jednocześnie podwójną rolę antyrozpuszczalnika i środka sieciującego, ponieważ były to dwie zmienne wpływające na wielkość cząsteczek ligniny. Natężenie przepływu podczas obu procedur było utrzymywane na niskim poziomie, aby zapewnić mniejsze cząstki i zapobiec ich agregacji. Istnieje kilka krytycznych punktów, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze kwasów nieorganicznych i organicznych do protokołów syntezy.
Kwas azotowy został wybrany, ponieważ jest to silny kwas nieorganiczny, który zapewnia wysoki stopień wytrącania ligniny alkalicznej, a kontrolując szybkość jej dodawania cząstek w pożądanym zakresie wielkości, można uzyskać. Ponadto oczekuje się, że dodanie HNO3 może zapewnić modyfikację cząstek heteropolimeru w wyniku prawdopodobnych zmian chemicznych struktury ligniny związanych z: procesami reakcji nitracji-podstawiania atomów H w pierścieniach benzenowych z grupami -NO2 ; estryfikacja grup alifatycznych -OH i tworzenie estrowych grup funkcyjnych; i/lub utlenianie grup fenolowych -OH i -OCH3 prowadzące do powstania struktur chinonowych. Jeśli chodzi o rolę stężenia środka strącającego i ligniny dla wielkości syntetyzowanych cząstek, z jednej strony wyższe początkowe stężenie ligniny w połączeniu z dodatkiem mocnego kwasu azotowego (pKa = -1,4) oraz ograniczona rozpuszczalność heteropolimeru alkalicznego w kwasie nieorganicznym doprowadziły do wytworzenia cząstek w zakresie mikrometrów. Z drugiej strony dodanie etanolu do wodnego roztworu ligniny alkalicznej o niższym stężeniu powoduje tworzenie się drobnej zawiesiny ze względu na częściową rozpuszczalność ligniny alkalicznej w alkoholu. Co więcej, późniejsze dodanie kwasu cytrynowego doprowadziło do wytworzenia cząstek w zakresie nanometrów, ponieważ kwas organiczny jest słabszy (pKa1 = 3,13) niż kwas azotowy, co w konsekwencji zapewnia mniejsze opady.
Niektóre podstawowe właściwości nanofarmaceutyków to krążenie leków, uwalnianie leków z postaci dawkowania w określonych miejscach oraz wchłanianie przez błony biologiczne. Na właściwości te znaczący wpływ mają niektóre właściwości fizyczne i chemiczne nośników nanocząstek oraz zamknięte w kapsułkach cząsteczki leków.
Charakterystyka fizykochemiczna nośników biopolimerowych: stężenie powierzchniowo czynnych grup kwasowych i zasadowych, punkt zerowego ładunku (pHPZC), wielkość, rozkład wielkości cząstek, a także charakterystyka widmowa cząstek przed i po włączeniu substancji bioaktywnej, są podstawowymi parametrami, które należy wziąć pod uwagę przy ocenie grup funkcyjnych, reaktywności, stabilność i jednorodność cząstek10.
Wielkość cząstek, rozkład wielkości cząstek, ładunek i morfologia to jedne z głównych czynników wpływających na te oceny. Wielkość cząstek wpływa na ich stabilność, reaktywność i zachowanie podczas uwalniania leku26. Mniejsze cząstki oferują większą powierzchnię przenoszenia masy, co prowadzi do szybszego uwalniania leku. W przeciwieństwie do tego, mniejsza powierzchnia przenoszenia masy większych cząstek powoduje mniejszą szybkość dyfuzji leków wewnątrz tych cząstek.
Zastosowanie metod miareczkowych jako podstawowych technik oznaczania miejsc kwaśnych i zasadowych oraz grup funkcyjnych obecnych na powierzchniach ciał stałych stale się rozwija. Do głównych zalet miareczkowania potencjometrycznego należy oszczędność czasu i pracy, wysoka precyzja oraz eliminacja wzorców referencyjnych i drogiej aparatury. Metoda ta została zastosowana w niniejszej pracy, ponieważ pozwala na scharakteryzowanie cząstek biopolimeru poprzez jakościowe i półilościowe określenie charakteru i liczby miejsc aktywnych obecnych na powierzchni załadowanych i nieobciążonych nośników biopolimerowych27.
Ładunek powierzchniowy biologicznych i medycznych mikro/nanonośników odgrywa ważną rolę w wychwytywaniu komórkowym28. pHPZC odpowiada zerowej gęstości ładunków powierzchniowych, to znaczy równoważnym ilościom ładunków ujemnych i dodatnich wytworzonych przez równowagę protonów. Wyznaczenie tych wartości dostarcza informacji na temat specyficzności adsorpcji29. Ponieważ jednak parametr punkt izoelektryczny reprezentuje tylko zewnętrzne ładunki powierzchniowe cząstek w zawiesinie, podczas gdy punkt zerowego ładunku zmienia się w odpowiedzi na całkowity ładunek powierzchniowy netto (zewnętrzny i wewnętrzny) cząstek, pHpzc Protokół został zastosowany po raz pierwszy w niniejszej pracy jako prosta i skuteczna metoda charakterystyki nośników leków biopolimerowych. Zgodnie z koncepcją pHpzc, przy pH powyżej pHpzc powierzchnia cząstek biopolimeru jest przeważnie naładowana ujemnie, podczas gdy ładunek dodatni netto obserwuje się, gdy pH zawiesiny jest poniżej pHpzc. Z danych doświadczalnych przedstawionych w tabeli 1 można wywnioskować, że mikro- i submikronowe, nieobciążone i obciążone flawonoidami cząstki ligniny są naładowane ujemnie, ponieważ ich pH > pHpzc.
Na skuteczność ładowania flawonoidami ma wpływ skuteczność kapsułkowania i zdolność ładowania leku. Skuteczność kapsułkowania (E, %) definiuje się jako stosunek ilości leku zawartego w cząsteczkach do całkowitej ilości w preparacie. Na skuteczność kapsułkowania ma wpływ charakterystyka leku, rozpuszczalnika i nośnika30.
Skuteczne dostarczenie substancji fizjologicznie czynnej zależy jednak od sposobu i zakresu, w jakim jej cząsteczki są uwalniane z matrycy nośnikowej. Dlatego bardzo ważne jest, aby wziąć pod uwagę mechanizm uwalniania leku i szybkość uwalniania 31,32,33. Wyjaśniając mechanizm uwalniania bioflawonoidów in vitro z ich biopolimerowych mikro/nanonośników, można symulować i przewidywać zachowanie flawonoidu i nośnika w rzeczywistym środowisku fizjologicznym oraz optymalizować projektowanie preparatów farmaceutycznych o zwiększonej biodostępności. Wyniki eksperymentu in vitro uzyskane w tym badaniu są przydatne w praktyce klinicznej, ponieważ dowodzą, że ze względu na mniejszy stopień uwalniania moriny/kwercetyny z ligniny submikronowej i mikrocząstek w środowisku żołądkowym, innowacyjne cząstki biopolimeru nadają się do podawania doustnego ze względu na mniejsze ryzyko podrażnienia żołądka w porównaniu z bezpośrednim doustnym podawaniem substancji bioaktywnych. Innowacyjne mikrocząsteczki biopolimeru nadają się do podawania doustnego ze względu na mniejsze ryzyko podrażnienia żołądka w porównaniu z bezpośrednim doustnym podawaniem substancji bioaktywnych. Co więcej, cząstki submikronowe, ze względu na ich mały rozmiar i znaczny potencjał uwalniania, mogą być stosowane jako preparaty do wstrzykiwań. Ponadto nowe nośniki ligniny mikro- i submikronowej dają możliwość przezwyciężenia ograniczeń zgłaszanych przez innych naukowców związanych z trudnościami związanymi z doustnym podawaniem dużych dawek niektórych bioflawonoidów, wynikającymi z ich tendencji do tworzenia nasyconych roztworów w przewodzie pokarmowym, co z kolei utrudnia proces rozpuszczania i ich efektywną resorpcję.
Łatwość syntezy, biokompatybilność otrzymanych cząstek, a także możliwość dostosowania obecnego protokołu to główne zalety przedstawionej metodologii. Wielkość cząstek jest optymalna dla ich zamierzonych zastosowań, oferując wystarczającą powierzchnię dostępną dla przyłączenia środków terapeutycznych i ugrupowań celujących, co z kolei nie wymaga podawania większej liczby cząstek, aby osiągnąć wymagania dotyczące dawki docelowej. Zastosowanie ligniny jako podstawowej matrycy heteropolimerowej do syntezy innowacyjnych cząstek pozwala na zwiększenie biokompatybilności i oferuje różne aktywne grupy funkcyjne, stwarzając możliwości dostosowania cząstek do różnych zastosowań.

Obecnie skłonność do biopolimerów, takich jak celuloza, chitozan, kolagen, dekstran, żelatyna i lignina jako prekursorów do projektowania nośników mikro-/submikronowych o dostosowywalnym rozmiarze, właściwościach fizykochemicznych i biofunkcjonalnościach, wzrosła w przemyśle biomedycznym, farmaceutycznym i technologii żywności ze względu na ich zastosowanie w inżynierii tkankowej, biodruku 3D, in vitro Między innymi platformy do modelowania chorób, przemysł opakowaniowy, przygotowanie emulsji i dostarczanie składników odżywczych1,2,3.
Nowatorskie badania podkreślają aspekty hydrożeli na bazie ligniny, jak również mikro- i nanopreparatów4 jako korzystne nośniki stosowane do materiałów do pakowania żywności5, magazynowanie energii6, cosmetics7, stabilizatory termiczne/świetlne, materiały wzmocnione i matryce nośników leków8 do dostarczania cząsteczek hydrofobowych, poprawa barier UV9, jako środki wzmacniające w nanokompozytach oraz jako alternatywa dla nieorganicznych nanocząstek ze względu na niedawne problemy z bezpieczeństwem10,11,12. Powodem tej tendencji jest biokompatybilność, biodegradowalność i nietoksyczność naturalnego biopolimeru hetero, a także jego udowodniona bioaktywność potencjału przeciwutleniającego ligniny oraz działania wymiatające rodniki, antyproliferacyjne i przeciwdrobnoustrojowe13,14,15,16,17.
Literatura naukowa donosi o różnych metodach syntezy (samoorganizacja, wytrącanie antyrozpuszczalnikowe, wytrącanie kwasów i zmiana rozpuszczalnika)18 oraz charakterystykę preparatów mikro- i nano-skalowych na bazie ligniny, w tym stosowanie drogich lub szkodliwych rozpuszczalników, takich jak tetrahydrofuran (THF), dimetylosulfotlenek (DMSO), N,N-dimetyloformamid (DMF) i aceton oraz skomplikowane, pośrednie i żmudne procesy, które zużywają dużo sprzętu i substancji toksycznych12,19,20.
Aby przezwyciężyć te ostatnie wady, następujące protokoły prezentują nowatorskie metodologie syntezy mikro-/submikronowych cząstek na bazie ligniny przy użyciu tanich i zielonych rozpuszczalników; łatwe, nieskomplikowane, szybkie i wrażliwe procesy wymagające niewielkiego sprzętu, nietoksycznych substancji i prostych metod ich charakterystyki oraz określania zdolności kapsułkowania w kierunku słabo rozpuszczalnych w wodzie związków bioaktywnych i in vitro potencjał uwalniania matryc ligniny. Przedstawione metody produkcji w skali laboratoryjnej są korzystne dla wytwarzania funkcjonalnych nośników ligniny o regulowanych rozmiarach, wysokiej zdolności kapsułkowania i zrównoważonym uwalnianiu in vitro przy użyciu prostych procedur charakteryzacji i przyjaznych dla środowiska chemikaliów, które mogą znaleźć zastosowanie w różnych dziedzinach nauk biomedycznych i technologii żywności. Jako cząsteczki docelowe zamknięte w cząsteczkach ligniny zastosowano dwie flawonoidy: morinę – do mikrocząstek i kwercetynę – do cząstek submikronowych. Różnica w budowie obu flawonoidów polega tylko na położeniu drugiej grupy -OH w pierścieniu B-aromatycznym: grupa -OH znajduje się na pozycji 2' w morinie i na pozycji 3' w kwercetynie, a więc oba związki organiczne są izomerami pozycyjnymi. Ten ostatni fakt zakłada podobne zachowanie się obu bioaktywnych związków naturalnych w procesach enkapsulacji i/lub uwalniania.

<table><tbody><tr><td>automatyczny licznik komórek</td><td>EVE, NanoEnTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>251275</td><td>&nbsp; odczynnik ACS, &ge; 99,5%</td></tr> <tr><td>cyfrowa kąpiel wodna</td><td>Probówki Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf, 1,5-2 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>34852-M</td><td>absolutny, odpowiedni do HPLC, &ge; 99.8%</td></tr><tr><td>Folin&ndash; Ciocalteu' s odczynnik fenolowy</td><td>Sigma</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; liofilizator</td><td>Biobase</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwas galusowy</td><td>Sigma-BCBW7577</td><td></td> <td>monohydrat</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>odczynnik ACS, 37%</td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Sigma</td><td>438073</td><td>&nbsp; Odczynnik ACS, 70%</td></tr> <tr><td>lignina, alkaliczny</td><td>Sigma</td><td>370959</td><td></td></tr><tr><td>morin</td><td>Sigma</td><td>PHL82601</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Odczynnik ACS, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>Proszek Na2CO3</td><td>Sigma</td><td>223530</td><td>proszek, &ge; 99,5%, odczynnik ACS</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td>klasa odczynnika, 97%,</td></tr><tr><td>wytrząsarka orbitalna</td> do proszku <td>IKA</td><td>KS 130 podstawowy</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Consort</td><td></td><td></td></tr> sól <tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>RNBH7571</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat kwercetyny</td><td>Sigma</td><td>STBG3815V</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie statystyczne dla programu Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>XLSTAT&nbsp; Wersja 2022.4.5.</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td> BioXtra, ultrawirówka do <td>lepkiej cieczy</td></tr><tr><td></td><td>Hermle</td><td>Z 326 K</td><td></td></tr><tr><td>System wody ultraczystej</td><td>Adrona</td><td>INTEGRITY+</td><td></td></tr><tr><td>homogenizator ultradźwiękowy</td><td>Bandelin Sonopuls</td><td>HD 2070</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV/Vis</td><td>Hach-Lange</td><td>DR 5000</td><td></td></tr></tbody></table>

zielona synteza, charakterystyka, enkapsulacja i pomiar potencjału uwalniania nowych mikro-/submikronowych cząstek alkaliów ligniny

Green Synthesis, Characterization, Encapsulation, and Measurement of the Release Potential of Novel Alkali Lignin Micro-/Submicron Particles

Możliwość zastosowania mikro-/nanotechnologii biopolimerów w medycynie weterynaryjnej, farmacji i technologii żywności szybko rośnie ze względu na duży potencjał cząsteczek na bazie biopolimerów jako skutecznych systemów nośnikowych. Zastosowanie ligniny jako podstawowej biomatrycy heteropolimerowej do projektowania innowacyjnych preparatów mikro-/submikronowych pozwala na osiągnięcie zwiększonej biokompatybilności i oferuje różne aktywne grupy funkcyjne, stwarzając możliwości dostosowania właściwości fizykochemicznych i bioaktywności preparatów do różnych zastosowań. Celem niniejszej pracy było opracowanie prostej i ekologicznej metodyki syntezy cząstek ligniny o rozmiarach mikro- i submikronowych; ocena ich cech fizykochemicznych, spektralnych i strukturalnych; oraz zbadanie ich zdolności do kapsułkowania biologicznie aktywnych cząsteczek oraz potencjału uwalniania bioflawonoidów in vitro w symulowanych pożywkach żołądkowo-jelitowych. W prezentowanych metodykach stosowane są tanie i ekologiczne rozpuszczalniki; Łatwe, proste, szybkie i czułe procesy wymagające niewielkiej ilości sprzętu, nietoksycznych substancji i prostych metod ich charakteryzacji, określenia zdolności kapsułkowania w kierunku słabo rozpuszczalnych w wodzie związków bioaktywnych morinu i kwercetyny oraz potencjału uwalniania in vitro matryc ligniny.

W celu otrzymania mikro- i submikronowych cząstek lignin alkalicznej zastosowano technikę wytrącania antyrozpuszczalnikiem. Wodny roztwór rozcieńczonego kwasu nieorganicznego – kwasu azotowego oraz kwasu organicznego – kwasu cytrynowego – rozproszono w wodnym roztworze lignin alkalicznej, wzbogaconym ekologicznym surfaktantem/etanolem, co doprowadziło do stopniowego wytrącania się biopolimeru, a po sonikacji otrzymano zawiesinę zwartych cząstek mikro- i submikronowych (Rycina 1).
<img alt="Układ do syntezy mikrocząstek ligniny, spektrofotometr, probówki do porównania cząstek, eksperyment laboratoryjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Homogenizacja cząstek ligniny. (A) Homogenizacja ultradźwiękowa zsyntetyzowanych submikronowych cząstek ligniny; (B) Zhomogenizowane mikrocząstki ligniny z załadowaną i bez załadowanej moriną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wyznaczono rozmiar, liczbę oraz rozkład wielkości nieobciążonych i enkapsulowanych moryną mikronośników ligninowych (Rysunek 2). Dane eksperymentalne wykazały wyższe stężenie, 1 × 107 cząstek/mL (2 037 cząstek/µL), oraz większy średni rozmiar, 6,1 µm, dla mikronośników obciążonych bioflawonoidem (Rysunek 2B) w porównaniu do nieobciążonych, które charakteryzowały się stężeniem 7,4 × 106 cząstek/mL (1 474 cząstek/µL) i średnim rozmiarem 5,7 µm (Rysunek 2A). Procentowy rozkład wielkości obu typów cząstek w zakresie 3-6 µm wyniósł 75,2% dla nieobciążonych i 69,3% dla mikronośników enkapsulowanych moryną, natomiast w zakresie 7-10 µm wartości te wyniosły odpowiednio 20,2% i 25,2%. Ilość, stężenie i szybkość przepływu antirozpuszczalnika, kwasu azotowego, są kluczowe dla rozmiaru cząstek. Wyższe stężenie i większa ilość kwasu prowadzą do powstania większych cząstek, natomiast wyższa szybkość przepływu powoduje agregację zawiesiny.
<img alt="Analiza liczenia komórek przy użyciu automatycznego licznika komórek; wykresy i obrazy mikroskopowe przedstawiające bramkowanie komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Rozkład wielkości cząstek. (A) Rzeczywisty rozkład wielkości niezaładowanych mikrocząstek ligniny w 1 µL zawiesiny – oprogramowanie licznika cząstek; (B) rzeczywisty rozkład wielkości mikrocząstek ligniny alkalicznej z enkapsulowanym morinem w 1 µL zawiesiny – oprogramowanie licznika cząstek. (C) Zdjęcie mikroskopowe z licznika cząstek przedstawiające rozkład niezaładowanych mikrocząstek ligniny; (D) zdjęcie mikroskopowe z licznika cząstek przedstawiające rozkład mikrocząstek ligniny alkalicznej z enkapsulowanym morinem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek 3 przedstawia widma absorpcyjne UV/Vis roztworów moriny w etanolu, wodnych roztworów ligniny alkalicznej oraz mieszanin zawierających morinę i ligninę o różnych stężeniach początkowych. Wyraźnie widać, że piki absorpcyjne czystej ligniny i bioflawonoidu nie pokrywają się, a heteropolimer nie wywiera żadnego zakłócającego wpływu podczas zastosowanej metody spektrofotometrycznej do oznaczania stężenia moriny w fazie ciekłej po enkapsulacji flawonoidu w polimerowych mikonośnikach oraz podczas eksperymentów z uwalnianiem in vitro. Maksimum absorpcji moriny w mieszaninie dwuskładnikowej przesunęło się w stronę dłuższej fali, z λmax = 359 nm do λmax = 395 nm, w wyniku zwiększenia pH środowiska spowodowanego obecnością ligniny alkalicznej. To odchylenie maksimum absorpcji w obszarze widzialnym wymusiło konieczność opracowania krzywych kalibracyjnych moriny dla różnych wartości pH środowiska (Rysunek 4A). Trzy krzywe wzorcowe charakteryzujące się bardzo silnymi korelacjami liniowymi zostały potwierdzone wysokimi wartościami współczynników regresji (R2 &gt; 0.99) w zakresie stężeń moriny Co = 2.5-100 µg/mL. Podobnie trzy krzywe wzorcowe kwercetyny w trzech symulowanych przedziałach fizjologicznych, przedstawione na Rysunku 4B, wykazały wysoką liniowość w tym samym zakresie stężeń.
<img alt="Wykres absorpcji spektroskopowej przedstawiający widma moryny i ligniny, piki λmax przy 359 nm, 395 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Porównanie widm UV/Vis etanolowych roztworów moryny, wodnych roztworów ligniny alkalicznej oraz mieszanin zawierających morynę i ligninę o różnych stężeniach początkowych. Widma czystej ligniny i moryny nie pokrywają się, a heteropolimer nie wywiera żadnego zakłócającego wpływu. Dodatek ligniny do moryny prowadzi do przesunięcia maksimum absorpcji moryny w stronę dłuższej długości fali, z λmax = 359 nm do λmax = 395 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy absorbancji w funkcji stężenia, wpływ pH na analizę spektroskopową, wyniki dopasowania danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Krzywe kalibracyjne etanolowych roztworów flawonoidów. (A) Morin i (B) kwercetyna w zakresie stężeń Co = 2.5-100 µg/mL przy pH = 1.2 (na niebiesko) (odpowiadające symulowanemu płynowi żołądkowemu), pH = 6.8 (na czerwono) (odpowiadające symulowanemu płynowi jelita cienkiego) oraz pH = 7.4 (na zielono) (odpowiadające symulowanemu płynowi jelita grubego). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig04large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Względne stężenie kwasowych i zasadowych centrów aktywnych/grup funkcyjnych na powierzchni nieobciążonych i obciążonych cząstek ligniny alkalicznej określono za pomocą miareczkowania potencjometrycznego. Obliczenia oparto na równoważnych objętościach miarecznika wyznaczonych z krzywych różniczkowych drugiej pochodnej (Rysunek 5). Wartości wyznaczonego pKa, stężenia kwasowych (silnych, słabych, całkowitych) grup funkcyjnych oraz pH i pHpzc cząstek mikro- i submikronowych przedstawiono w Tablicy 1.
<img alt="Wykres miareczkowania cząsteczek ligniny; ΔpH/ΔV² w funkcji objętości NaOH; porównanie cząsteczek submikronowych i mikronowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Krzywe miareczkowania potencjometrycznego drugiej pochodnej dla niezaładowanych i załadowanych mikronowych/submikronowych cząsteczek ligniny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr</td>
			<td>mikrocząsteczki ligniny</td>
			<td>mikrocząsteczki ligniny z enkapsulowaną moriną</td>
			<td>submikronowe cząstki ligniny</td>
			<td>submikronowe cząstki ligniny z enkapsulowaną kwercetyną</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veq., ml</td>
			<td>10.5</td>
			<td>2.75</td>
			<td>2.25 
			4.3</td>
			<td>2.75 
			3.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKa</td>
			<td>11.1</td>
			<td>10.8</td>
			<td>3.0 
			8.0</td>
			<td>4.2 
			7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aa (silny), mgeq/g</td>
			<td>26.25</td>
			<td>6.88</td>
			<td>16.38</td>
			<td>16.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aa (słabe), mgeq/g</td>
			<td>11.25</td>
			<td>13.13</td>
			<td>11.25</td>
			<td>13.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aa (całkowite), mgeq/g</td>
			<td>37.5</td>
			<td>20</td>
			<td>27.63</td>
			<td>29.43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH (zawiesina wodna)</td>
			<td>4.45</td>
			<td>4.1</td>
			<td>4.54</td>
			<td>4.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHpzc</td>
			<td>2.3</td>
			<td>2.0</td>
			<td>3.8</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wartości objętości równoważnej titranta (Veq), ujemnego logarytmu dziesiętnego stałej dysocjacji kwasu (pKa), stężeń kwasowych grup funkcyjnych (silnych, słabych, całkowitych) (Aa, mgeq/g), pH oraz punktu ładunku zerowego (pHpzc) nieobciążonych i obciążonych mikro- oraz submikronowych cząstek ligniny. Mikro- i submikronowe cząstki ligniny, zarówno nieobciążone, jak i obciążone flawonoidami, są naładowane ujemnie, ponieważ ich pH &gt; pHpzc.
Całkowita zawartość związków fenolowych (TPC), oznaczona zmodyfikowaną kolorymetryczną metodą Folina-Ciocalteu i obliczona jako ekwiwalenty kwasu galowego, wyniosła 78,2 mg GAE/g dla nieobciążonych cząstek ligniny, podczas gdy wartość TPC dla mikronośników enkapsulowanych moriną o tym samym stężeniu była 2,3 raza wyższa (183,43 mg GAE/g). Ta ostatnia wartość wskazuje, że cząstki heterobiopolimerowe są wzbogacone o dodatkowe grupy fenolowe dzięki wbudowaniu cząsteczek flawonoidów. Efektywność enkapsulacji flawonoidów wyniosła: 98,1% dla moriny i 97,6% dla kwercetyny. Pojemność enkapsulacji leku wyniosła 28,2% dla mikrocząstek obciążonych moriną oraz 39,0% dla submikronowych cząstek enkapsulowanych kwercetyną.
Kiedyś in vitro zbadano skumulowane uwalnianie moryny i kwercetyny w symulowanych mediach bezenzymatycznych przewodu pokarmowego: płynach żołądkowych, jelita cienkiego i okrężnicy przy wartościach pH odpowiednio 1,2, 6,8 i 7,4 (Rysunek 6). Najwyższą wydajność uwalniania, wynoszącą około 24%, osiągnięto po 30–40 min przy pH = 6,8. Zgodnie z wynikami eksperymentalnymi, ilość uwolnionego flawonoidu w symulowanym ośrodku jelita cienkiego była dwukrotnie większa niż w symulowanym środowisku jelita grubego i trzykrotnie wyższa od wydajności uwalniania określonej w żołądku. Najwyższy stopień uwalniania kwercetyny stwierdzono w SIF przy pH = 7,4 na 70th- 90th wyniosło 34%, co przekroczyło skumulowane uwalnianie flawonoidu w SGF (pH = 1,2) i SIF (pH = 6,8), które wyniosły odpowiednio 23,5% i 18%.
<img alt="Wykres skumulowanego uwalniania in vitro, kwercetyna, moryna, warunki pH SGF 1,2, SIF 6,8, 7,4." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66216/66216fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Analizy porównawcze efektywności skumulowanego uwalniania in vitro moryny i kwercetyny z mikro- i submikronowych cząsteczek ligniny w symulowanych mediach fizjologicznych. Najwyższy stopień uwalniania moryny osiągnięto w symulowanym medium jelita cienkiego. Najwyższą efektywność uwalniania kwercetyny odnotowano w symulowanym płynie jelita grubego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66216/66216fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisujemy nowatorskie, proste metodologie syntezy i charakterystyki biokompatybilnych mikro- i submikronowych cząsteczek ligniny. Preparaty te zapewniają łatwe podejście do wykorzystania heteropolimeru, a także alternatywę dla racjonalnego projektowania wielofunkcyjnych matryc nośnikowych z potencjalnymi zastosowaniami w biomedycynie, technologii farmaceutycznej i przemyśle spożywczym.

Zielona synteza, charakterystyka, enkapsulacja i pomiar potencjału uwalniania nowych mikro-/submikronowych cząstek alkaliów ligniny

The applicability of biopolymer micro-/nano- technology in human, veterinary medicine, pharmaceutical, and food technology is rapidly growing due to the ...

Celem tych badań było stworzenie prostego i przyjaznego dla środowiska procesu wytwarzania małych cząstek ligniny. Badanie miało na celu analizę ich właściwości fizycznych, chemicznych i strukturalnych, a także zbadanie ich zdolności do kapsułkowania i uwalniania bioflawonoidów w symulowanym środowisku żołądkowo-jelitowym. Nasze metody syntetyzują cząstki na bazie ligniny przy użyciu tanich i ekologicznych rozpuszczalników.Proces jest łatwy, szybki i wymaga minimalnego sprzętu i nietoksycznych substancji. Posiada również proste metody charakterystyki enkapsulacji, określania zdolności i potencjału uwalniania in vitro słabo rozpuszczalnych w wodzie związków bioaktywnych. Innowacyjne mikrocząsteczki biopolimeru nadają się do podawania doustnego ze względu na mniejsze ryzyko podrażnienia żołądka.Cząstki submikronowe, ze względu na mały rozmiar i znaczny potencjał uwalniania, mogą być stosowane jako preparaty do wstrzykiwań. Na początek dodaj 125 miligramów ligniny alkalicznej do 25 mililitrów ultraczystej wody i rozpuść ją za pomocą mieszadła magnetycznego. Stopniowo dodawaj jeden mililitr 96% etanolu do alkalicznego roztworu ligniny.Mieszaj mieszaninę na mieszadle magnetycznym z prędkością 500 obr./min przez trzy minuty. Następnie rozpuść 0,5 grama kwasu cytrynowego w ultraczystej wodzie do końcowej objętości 50 mililitrów, aby przygotować 1% roztwór kwasu cytrynowego. Za pomocą strzykawki dodaj do mieszaniny siedem mililitrów 1% kwasu cytrynowego.Kontynuuj mieszanie mieszaniny przez 10 minut, aż klarowny brązowy roztwór zamieni się w mętną, jasnobrązową zawiesinę. Teraz, za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego, homogenizuj mikrocząstki przez dwa cykle, z których każdy trwa cztery minuty z intensywnością 96%Następnie liofilizuj mikrocząstki w temperaturze minus 64 stopni Celsjusza w liofilizatorze i przechowuj je w ex-ek-a-tor do wykorzystania w przyszłości. Aby przygotować naturalne mikro lub submikronowe cząsteczki ligniny otoczone flawonoidami, odważ 0,04 grama kwercetyny.Rozpuść go w jednym mililitrze etanolu i dodaj ten etanolowy roztwór do alkalicznego wodnego roztworu ligniny. Aby rozpocząć, uruchom automatyczny licznik komórek, aby ocenić wielkość cząstek i rozkład wielkości cząstek w przygotowanej próbce. Dodaj jeden mikrolitr zawiesiny cząstek w ultraczystej wodzie do studzienki szkiełka liczącego.Sprawdź liczbę cząstek w jednym mililitrze zawiesiny, wraz z ich liczbą i rozkładem wielkości. Zważ 0,04 grama niezaładowanych lub otoczonych flawonoidami cząstek ligniny. Przenieść zważone cząstki do kolby Erlenmeyera.Następnie dodaj 10 mililitrów 0,1-molowego kwasu solnego. I umieścić kolbę na mieszadle magnetycznym ustawionym na 250 obr./min. Następnie napełnij 50-mililitrową biuretę 0,1-molowym roztworem wzorcowym wodorotlenku sodu.Za pomocą pH-metru laboratoryjnego zmierzyć początkowe pH roztworu w kolbie Erlenmeyera przed rozpoczęciem miareczkowania. Teraz rozpocznij proces miareczkowania i zmierz pH analizowanego roztworu po każdym 0,5 mililitra dodania titranta. Zapisać dane doświadczalne w tabeli, odnotowując objętość zastosowanego titranta i odpowiadającą mu wartość pH.Po zaobserwowaniu prawie stałej wartości pH przy rosnących objętościach roztworu titranta, należy przerwać miareczkowanie. Zilustruj dane doświadczalne w postaci zerowej, pierwszej i drugiej pochodnej różnicowej krzywej miareczkowania. Przygotuj 60 mililitrów 0,1-molowego wodnego roztworu chlorku sodu.Wziąć pięć stożkowych kolb z korkiem. I dodać dziewięć mililitrów 0,1-molowego roztworu chlorku sodu do każdej kolby. Dostosuj pH do początkowych wartości odpowiednio 2, 4, 7, 10 i 12.Następnie dodaj dodatkowy roztwór chlorku sodu, aby dostosować całkowitą objętość roztworu do dokładnie 10 mililitrów. Teraz dodaj 40 miligramów suchych cząstek ligniny do każdej kolby. I bezpiecznie je zakryj.Ustawić kolby pionowo na wytrząsarce orbitalnej i potrząsać nimi przez 24 godziny. Pozostawić kolby do zrównoważenia przez 30 minut. Następnie zmierzyć końcowe pH supernatantów w każdej kolbie.Wykreślić końcowe wartości pH w stosunku do odpowiadających im początkowych wartości pH. Na początek weź 50 mililitrów symulowanej, bezenzymatycznej pożywki żołądkowej w szklanym reaktorze wsadowym wyposażonym w mieszadło mechaniczne. Dodaj do niego 25 miligramów mikro lub submikronowych cząsteczek otoczonych flawonoidami.Umieść reaktor w łaźni termalnej nastawionej na stałą temperaturę około 37 stopni Celsjusza. Zanurz mieszadło na głębokość dwóch trzecich objętości cieczy, aby zapewnić dokładne wymieszanie fazy stałej i ciekłej. Pobieraj jeden mililitr próbki z reaktora co 10 minut do 90. minuty i natychmiast pipetuj jeden mililitr świeżego symulowanego roztworu płynu do reaktora, aby utrzymać całkowitą objętość i zapewnić warunki zlewu.Uwalnianie morinu i kwercetyny badano in vitro w bezenzymatycznych, symulowanych płynach żołądkowych, jelita cienkiego i okrężnicy. Pożywka w jelicie cienkim wykazała dwukrotnie większe uwalnianie flawonoidów w porównaniu z okrężnicą i trzykrotne w porównaniu z żołądkiem. Uwalnianie kwercetyny osiągnęło szczyt na poziomie 34% w płynie jelita cienkiego przy pH 7,4 po 70 do 90 minutach, przewyższając uwalnianie w płynie żołądkowym i płynie jelitowym cienkim przy pH 6,8.

green-synthesis-characterization-encapsulation-measurement-release

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Biomasa roślinna jest głównym neutralnym węglowo zasobem odnawialnym, który może być wykorzystany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu ligniny polifenolowej.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Przedstawiono metodę opartą na konfokalnej mikroskopii Ramanowskiej, która umożliwia bezznakową wizualizację ligniny w ścianach komórkowych roślin oraz porównanie procesu lignifikacji w różnych tkankach, próbkach lub gatunkach.

Bez znakowania in situ Obrazowanie lignifikacji w ścianach komórkowych roślin

Technika dwuniciowej interferencji RNA (dsRNAi) jest stosowana do obniżania poziomu genu reduktazy cynamoylokoenzymu A (ZmCCR1) w kukurydzy w celu obniżenia zawartości ligniny roślinnej. Regulacja w dół ligniny ze ściany komórkowej jest wizualizowana za pomocą analiz mikroskopowych i określana ilościowo metodą Klasona. Analizowane są zmiany składu hemicelulozy i celulozy krystalicznej.

Regulacja ligniny w dół Zea mays za pomocą dsRNAi i analizy ligniny Klason

Odpady przemysłowe mogą być zbierane i modyfikowane w celu analizy rozwoju mikroorganizmów. Techniki ekstrakcji lignocelulozy dostarczają składników do analizy określonej zdolności biodegradacji. Chromatografia gazowa ze spektrometrią mas identyfikuje produkty fermentacji mikroorganizmów wyhodowanych na odpadach z roztwarzania. Metody te określają zdolność metaboliczną mikroorganizmów do rozkładu odpadów z roztwarzania.

Metody ułatwiania rozwoju mikroorganizmów w strumieniach odpadów z celulozowni i charakterystyka potencjału biodegradacji drobnoustrojów hodowlanych

Uwalnianie nanocząstek jest testowane przy użyciu systemu komor, który zawiera licznik cząstek kondensacji, optyczny licznik cząstek i porty do pobierania próbek filtrów do analizy mikroskopowej. Proponowany system komór może być skutecznie wykorzystywany do testowania uwalniania nanomateriałów z powtarzalnym i spójnym zakresem danych.

Badanie uwalniania nanocząstek z kompozytu zawierającego nanomateriał za pomocą systemu komorowego

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia ekstrakcji etanolem ligniny z kilku źródeł biomasy. Przedstawiono wpływ warunków ekstrakcji na uzysk ligniny i zawartość β-O-4. Na otrzymanych ligninach przeprowadza się selektywną depolimeryzację w celu uzyskania produktów o wysokiej zawartości monomerów aromatycznych.

Ekstrakcja ligniny o wysokiej zawartości β-O-4 metodą łagodnej ekstrakcji etanolem i jej wpływ na wydajność depolimeryzacji

Przykład podejścia opartego na zamkniętej pętli w kierunku gospodarki materiałowej o obiegu zamkniętym jest opisany tutaj. Przedstawiono cały zrównoważony cykl, w którym półaromatyczne poliestry pochodzenia biologicznego są projektowane poprzez polimeryzację, depolimeryzację, a następnie repolimeryzację z niewielkimi zmianami w ich wydajności lub właściwościach końcowych.

Zaprojektowany do recyklingu molekularnego: półaromatyczny polimer pochodzenia biologicznego na bazie ligniny

Głęboka eutektyczna obróbka wstępna na bazie rozpuszczalnika, wspomagana mikrofalami, to ekologiczny, szybki i wydajny proces frakcjonowania lignocelulozy i odzyskiwania ligniny o wysokiej czystości.

Ultraszybka ekstrakcja ligniny z nietypowych śródziemnomorskich pozostałości lignocelulozowych

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę TGA do szacowania zawartości ligniny w biomasie roślin zielnych. Metoda ta szacuje zawartość ligniny poprzez tworzenie specyficznych wiązań tioeterowych z ligniną i ma przewagę nad metodą Klasona, ponieważ wymaga stosunkowo małej próbki do oszacowania zawartości ligniny.

Oznaczanie zawartości ligniny w biomasie roślinnej przy użyciu kwasu tioglikolowego (TGA)

31P NMR to potężne narzędzie do strukturalnego wyjaśniania polifenoli. Ta szybka, łatwa, precyzyjna, ilościowa i wysoce odtwarzalna procedura analityczna, która pozwala na kwantyfikację i różnicowanie różnych typów grup hydroksylowych, fenolowych i karboksylowych w ligninach i garbnikach, stała się obecnie rutynowym narzędziem analitycznym.

Ilościowa analiza 31P NMR ligniny i garbników

Poznaj zieloną syntezę mikro- i submikronowych cząstek ligniny oraz ich charakterystykę fizykochemiczną. Ta metoda umożliwia enkapsulację bioflawonoidów i badanie uwalniania w warunkach przewodu pokarmowego.

Zielona synteza, charakterystyka, enkapsulacja i pomiar potencjału uwalniania nowych mikro-/submikronowych cząstek alkaliów ligniny (Wideo) | JoVE Journal

Zielona synteza, charakterystyka, enkapsulacja i pomiar potencjału uwalniania nowych mikro-/submikronowych cząstek alkaliów ligniny

Przeglądaj więcej filmów