Name: Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Naucz się elastycznego protokołu ELISA do kwantyfikacji przeciwciał autoreaktywnych u myszy z modelem EAE, ekonomicznej alternatywy dla komercyjnych zestawów. Ta metoda umożliwia badanie odpowiedzi przeciwciałowej B-komórek w stwardnieniu rozsianym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health (R03NS131908) i Departament Obrony poprzez Program Badań nad Stwardnieniem Rozsianym pod numerem nagrody W81XWH-22-1-0517. Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autora i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony. Badanie to było również wspierane przez fundusze startowe Uniwersytetu Wschodniej Karoliny.

Wszystkie procedury z udziałem myszy zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi eksperymentalnymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wschodniej Karoliny (IACUC). W badaniu wykorzystano samice myszy typu dzikiego C57BL/6J w wieku 8-10 tygodni. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). EAE zostało wywołane zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami12,13,14.
1. Kolekcja surowicy
<ol>
	<li>Poddać eutanazji mysz eksperymentalną przez uduszenie CO2 lub przedawkowanie izofluranu w wymaganym punkcie czasowym (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) po wywołaniu EAE poprzez immunizację MOG35-55. 
	UWAGA: Całkowita liczba myszy i punkty czasowe do pobrania surowicy mogą się różnić w zależności od konkretnego eksperymentu.</li>
	<li>Po potwierdzeniu braku parametrów życiowych przez uszczypnięcie palca u nogi lub ogona, umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej na tacy sekcyjnej i przymocuj kończyny do pozycji za pomocą szpilek lub taśmy. Ustaw korpus myszy na źródle światła LED (patrz Tabela materiałów), aby oświetlić klatkę piersiową zwierzęcia.</li>
	<li>Spryskaj futro myszy 70% etanolem i wykonaj nacięcie w linii środkowej 3-4 cm wzdłuż brzucha od miednicy do mieczykowatego za pomocą nożyczek do rozwarstwiania, uważając, aby uniknąć jakichkolwiek narządów i głównych naczyń (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1A-C). Aby ułatwić zabieg, użyj kleszczy, aby chwycić skórę nad wyrostkiem mieczykowatym.</li>
	<li>Przeciąć przeponę bocznie, a następnie przeciąć klatkę piersiową do przodu na obu bocznych krawędziach za pomocą nożyczek sprężynowych, zatrzymując się przed dotarciem do mostka w linii środkowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D). Złóż klapkę żeber, która została utworzona nad głową myszy, aby odsłonić serce (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). 
	UWAGA: Należy unikać przecinania mostka, ponieważ spowoduje to uszkodzenie głównych tętnic piersiowych przylegających do kości i zmniejszy objętość krwi, którą można zebrać.</li>
	<li>Wprowadzić igłę 25 G połączoną ze strzykawką o pojemności 1 ml do lewej komory i pobrać krew, delikatnie odciągając tłok (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F). Aby ułatwić nakłucie igłą, delikatnie przymocuj serce do kleszczy. 
	UWAGA: Jeśli krew nie pojawi się natychmiast w strzykawce, igłę należy powoli obracać i badać pod innym kątem. Należy jednak dołożyć starań, aby przy pierwszej próbie prawidłowo umieścić igłę, aby uniknąć tworzenia niepotrzebnych otworów w sercu, przez które może wyciekać krew.</li>
	<li>Przenieś krew do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i pozwól jej krzepnąć przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć skrzep przez odwirowanie w temperaturze 2000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant, który reprezentuje frakcję surowicy, i przechowywać podwielokrotności jednorazowego użytku w probówkach kriogenicznych w temperaturze -80 °C do przyszłych badań.</li>
</ol>
2. Test ELISA
<ol>
	<li>Zawiesić liofilizowany peptyd MOG35-55 (patrz tabela materiałów) w wodzie, aby uzyskać zapas 10 mg/ml. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy rozcieńczyć materiał podstawowy do 10 μg/ml w buforze powlekającym (patrz Tabela Materiałów) i odpipetować 100 μl/basenik roztworu końcowego do płytki 96-dołkowej. Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną, aby uniknąć parowania, i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Dla każdej próbki należy obliczyć co najmniej 2 studzienki, a w przypadku ślepej próby należy również uwzględnić 2 dodatkowe studzienki.</li>
	<li>Równolegle pokryć tę samą liczbę studzienek 100 μl/studzienkę albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczonej w buforze powlekającym o stężeniu 10 μg/ml. Te dodatkowe studnie będą służyć jako kontrolki w tle. 
	UWAGA: Zaleca się pokrycie studzienek kontrolnych BSA, ponieważ powłokowe i blokujące mają różny skład. Należy pamiętać, że inne peptydy encefalitogenne (takie jak PLP139-151 lub MBP84-104) mogą być stosowane jako nieistotne antygeny jako alternatywa dla BSA.</li>
	<li>Następnego dnia przemyj płytkę 3 razy 200 μl/studzienkę soli fizjologicznej z buforem fosforanowym uzupełnionym 0,05% Tween 20 (PBS-T). Następnie dodać 100 μl/basenik roztworu blokującego sporządzonego z 3% BSA w PBS (bez Tween 20) i inkubować szczelnie zamkniętą płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w piecu do hybrydyzacji.</li>
	<li>Umyć płytkę 3 razy 200 μl/dołek PBS-T. Rozcieńczyć każdą próbkę surowicy w stosunku 1:100 w roztworze blokującym i dodać 100 μl / studzienkę do studzienek pokrytych MOG35-55 i BSA. Dodać tę samą objętość roztworu blokującego do studzienek oznaczonych jako ślepe próby. Inkubować szczelnie zamkniętą płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając (250 obr./min).</li>
	<li>Umyć płytkę 3 razy 200 μl/dołek PBS-T. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP (1:2000, patrz Tabela Materiałów) w roztworze wykonanym z 0,2% BSA w PBS-T i dodać 100 μl / basenik do wszystkich studzienek. Inkubować szczelnie zamkniętą płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając (250 obr./min).</li>
	<li>Umyć płytkę 3 razy 200 μl/dołek PBS-T. Dodać 100 μl/studzienkę substratu 3,3',5,5' tetrametylobenzydyny (TMB) (patrz tabela materiałów) do wszystkich studzienek i inkubować w ciemności przez 1-5 minut, monitorując rozwój niebieskiego koloru.
	<ol>
		<li>Zatrzymać reakcję przez dodanie 100 μl/studzienkę roztworu zatrzymującego (patrz tabela materiałów) i zmierzyć gęstość optyczną (OD) w każdym studzience za pomocą czytnika płytek ustawionych na długość fali 450 nm. 
		UWAGA: Podłoże TMB należy równoważyć w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut przed dodaniem go do studzienek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Wypełnij arkusz kalkulacyjny programu Excel wartościami OD odczytanymi z tabliczki. Uśrednić wartości OD uzyskane ze zduplikowanych studzienek (zarówno MOG35-55, jak i pokrytych BSA) dla każdej próbki.</li>
	<li>Dla każdej próbki należy odjąć średnią wartość studzienek pokrytych BSA od wartości studzienek pokrytych MOG35-55. Uzyskane skorygowane wartości tła będą proporcjonalne do stężenia przeciwciał anty-MOG35-55 w różnych próbkach surowicy. 
	UWAGA: Ślepe studzienki powinny skutkować skorygowanymi wartościami około 0.</li>
	<li>Zastosuj nieparametryczny test statystyczny, taki jak test U Manna-Whitneya, aby porównać średnie wartości OD między dwoma warunkami eksperymentalnymi. Należy uwzględnić co najmniej 3 niezależne próbki dla każdego warunku.</li>
</ol>

Investigating Humoral Response in Autoimmune Demyelination

<ol><li>Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).</li>
<li>Baranzini, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+repertoire+diversity+and+clonal+expansion+in+multiple+sclerosis+brain+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions.</a> J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).</li>
<li>Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+autoantibodies+associated+with+myelin+damage+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+hypomethylation+programs+underpin+b+cell+activation+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118(2021).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocrelizumab+versus+interferon+beta-1a+in+relapsing+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).</li>
<li>Montalban, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocrelizumab+versus+placebo+in+primary+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).</li>
<li>Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+multiple+sclerosis%3A+Advantages+and+limitations+towards+better+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies.</a> Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).</li>
<li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).</li>
<li>Khare, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-specific+antibodies+from+multiple+sclerosis+patients+exacerbate+disease+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model.</a> J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).</li>
<li>Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+antibodies+recognize+glycosylated+epitopes+and+perturb+oligodendrocyte+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).</li>
<li>Flach, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-boosted+t-cell+reactivation+in+the+target+organ+triggers+manifestation+of+autoimmune+cns+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).</li>
<li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+regulates+b+cell+function+and+the+severity+of+autoimmune+experimental+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).</li>
<li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+tau+methylation+patterns+and+synaptic+transcriptional+alterations+are+associated+with+neural+vulnerability+during+chronic+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation.</a> J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).</li>
<li>Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-specific+argonaute+profiling+identifies+micrornas+associated+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 297(2020).</li>
<li>Lanz, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+b+cells+in+multiple+sclerosis+bind+ebv+ebna1+and+glialcam%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam.</a> Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W tym przypadku opisano prosty i skuteczny protokół oparty na teście ELISA, który pozwolił na dokładne ilościowe określenie odpowiedzi humoralnej w odpowiednim zwierzęcym modelu patologii stwardnienia rozsianego. Metoda ta została niedawno zastosowana do opisania nowej roli białka ataksyny-1 w kontrolowaniu poziomów autoprzeciwciał w surowicy w paradygmacie MOG35-55/C57BL6J EAE12. W związku z tym należy wziąć pod uwagę szereg czynników, aby uzyskać spójne i biologicznie miarodajne wyniki za pomocą...

Stwardnienie rozsiane (MS) jest przewlekłą chorobą autoimmunologiczną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) charakteryzującą się ogniskową infiltracją komórek odpornościowych do miąższu mózgu, rozpadem osłonek mielinowych owijających aksony, aktywacją gleju i utratą neuronów1. Oprócz dobrze ugruntowanej roli patogennych limfocytów T, wiele linii dowodowych podkreśliło udział limfocytów B w pośredniczeniu w odpowiedzi autoimmunologicznej przeciwko OUN. Limfocyty B ulegają ekspansji klonalnej w mózgu SM, a przeciwciała przeciwko składnikom mieliny zostały wykryte w uszkodzeniach demielinizowanych2,3. Selektywna aktywacja obwodowych limfocytów B na początku choroby została niedawno udokumentowana, co sugeruje przypuszczalną rolę tego przedziału komórek odpornościowych również w inicjacji choroby4. Sukces terapii zubożających limfocyty B, takich jak przeciwciała monoklonalne anty-CD20, dodatkowo potwierdza mechanistyczny związek między nieprawidłowym funkcjonowaniem komórek B a autoimmunologiczną demielinizacją5,6. Z molekularnego punktu widzenia limfocyty B mogą przyczyniać się do choroby poprzez prezentację autoantygenu, prozapalne wydzielanie cytokin i autoreaktywną produkcję przeciwciał.
Wiele modeli zwierzęcych zostało opracowanych w celu podsumowania specyficznych cech złożonego fenotypu MS. Wśród nich eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest najpowszechniej stosowanym paradygmatem in vivo i opiera się na immunizacji zwierząt doświadczalnych krótkimi peptydami pochodzącymi z białek mielinowych, takich jak glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG) i podstawowe białko mieliny (MBP)<klasa sup='xref'>7. U zwierząt uodparnionych EAE rozwija się patologia demielinizacyjna, która pod wieloma względami przypomina stwardnienie rozsiane, w tym silną odpowiedź humoralną przeciwko peptydowi encefalitogennemu8. Z tego powodu badania EAE odegrały zasadniczą rolę w analizie funkcji limfocytów B i autoprzeciwciał w kontekście choroby. Wykazano na przykład, że przeciwciała specyficzne dla MOG wyizolowane od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym mogą pogarszać przebieg kliniczny w modelach EAE9. Warto zauważyć, że reszta proliny w pozycji 42 w ludzkim MOG okazała się kluczowa dla określenia patogeniczności autoprzeciwciał10. Ostatnio odkryto, że autoprzeciwciała specyficzne dla MOG sprzyjają chorobie nie tylko poprzez pośredniczenie w utracie mieliny, ale także poprzez zwiększanie reaktywacji autoreaktywnych limfocytów T w klasie CNS<sup='xref'>11. 
Biorąc pod uwagę znaczenie odpowiedzi przeciwciał w autoimmunizacji OUN, ten artykuł przedstawia protokół oparty na ELISA, aby skutecznie mierzyć poziomy przeciwciał autoreaktywnych w surowicy u myszy C57BL/6J EAE immunizowanych peptydem MOG35-55. W pierwszej części protokołu opisana zostanie metoda pobierania surowicy poprzez nakłucie dosercowe. Następnie szczegółowo omówione zostaną procedury konfiguracji testu ELISA i uzyskania danych. Na koniec omówiona zostanie analiza i interpretacja danych.

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Igły 25 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB)</td><td>Thermo Fisher</td><td>N301</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Uszczelki samoprzylepne</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>C57BL/6J samice myszy</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>000664</td><td>Zwierzęta w wieku 8-10 tygodni powinny być wykorzystywane do eksperymentów EAE</td></tr><tr><td>Probówki kriogeniczne</td><td>Fisher</td><td>10-500-25</td><td></td></tr><tr><td>Taca preparcyjna</td><td></td><td>Nożyczki do</td> dyssekcji Fisher S111022 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do powlekania ELISA</td><td>BioLegend</td><td>421701</td><td>Przechowywać w 4&deg; C</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Excel</td><td>Arkusz kalkulacyjny</td><td>Microsoft</td><td></td> Analysis</tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Koza Anti-Mouse IgG, Reklamy ludzkie-HRP</td><td>SouthernBiotech</td><td>1030-05</td><td>Sklep pod adresem 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>LED Fisher</td><td>AMPSILED21</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Fisher</td><td>14-377-575&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy biologii molekularnej</td><td>Corning</td><td>46-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd myszy MOG35-55</td><td>EZBiolab</td><td>cp7203</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 & deg; C</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Axygen</td><td>AP-12-200-P</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15011-12</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 96-dołkowe płytki</td><td>BioLegend</td><td>423501</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Fisher</td><td>88-861-023</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>VWR</td><td>445-0024</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sola fizjologiczna (PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa z chłodzeniem</td><td>Thermo Fisher</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>Stop roztwór</td><td>Thermo Fisher</td><td>N600</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to model choroby, który podsumowuje chorobę autoimmunologiczną stwardnienie rozsiane (MS) na poziomie histopatologicznym i molekularnym. EAE jest indukowany przez uodparnianie zwierząt doświadczalnych poprzez podskórne wstrzyknięcie krótkich peptydów mielinowych wraz ze specyficznymi adiuwantami w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Podobnie jak ludzki odpowiednik, u myszy EAE rozwijają się zmiany demielinizacyjne, infiltracja komórek odpornościowych do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), aktywacja gleju i uszkodzenie neuronów. Spójny materiał dowodowy potwierdza również mechanistyczną rolę dysfunkcji komórek B w etiologii zarówno stwardnienia rozsianego, jak i EAE. Limfocyty B mogą służyć jako komórki prezentujące antygen, a także jako główne źródło cytokin prozapalnych i autoprzeciwciał. W EAE wytwarzane są przeciwciała przeciwko peptydom mieliny, które zostały wykorzystane do wywołania choroby. Wykazano, że takie autoprzeciwciała pośredniczą w utracie mieliny lub reaktywacji patogennych limfocytów T do OUN. W artykule opisano skuteczny protokół oparty na ELISA do ilościowego oznaczania autoprzeciwciał w surowicy myszy C57BL / 6J immunizowanych peptydem glikoproteiny mielinowej oligodendrocytów 35-55 (MOG35-55). Proponowana metoda służy jako potężne narzędzie do badania swoistości i wielkości nieprawidłowej odpowiedzi humoralnej w kontekście demielinizacji autoimmunologicznej.

Aby wykazać odporność opracowanego testu ELISA, metodę przetestowano na próbkach surowicy wyizolowanych z grupy samic myszy C57BL/6J w 20. dniu po immunizacji (dpi) 100 μg peptydu MOG35-55 w kompletnym adjuwancie Freunda (CFA), zgodnie z zwalidowanym protokołem indukcji EAE12,13,14. Zwierzęta otrzymały również 400 ng toksyny krztuśca w dniu 0 i 2. Próbki surowicy od zwierząt immunizowanych pozornie (wszystkimi składnikami poza p...

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to zwierzęcy model stwardnienia rozsianego (MS), który dzieli z ludzką chorobą silną humoralną odpowiedź autoimmunologiczną. W tym miejscu przedstawiamy prosty i elastyczny protokół ELISA do ilościowego oznaczania autoprzeciwciał w surowicy myszy uodpornionych na EAE.

Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological ...

Dlatego nasze laboratorium skupia się na zrozumieniu, że molekularne podstawy stwardnienia rozsianego, choroby immunologicznej ośrodkowego układu nerwowego, która charakteryzuje się demielinizacją, zapaleniem nerwów i uszkodzeniem aksonów. Tak więc protokół ten stanowi ekonomiczną i elastyczną alternatywę dla zestawów komercyjnych. Nasze zdjęcie rentgenowskie można łatwo dostosować do testowania odpowiedzi przeciwciał komórek B na różne peptydy EAE.Moje laboratorium zajmuje się dalszym zrozumieniem związku między zapaleniem nerwów a neurodegeneracją w przewlekłych chorobach neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Na początek weź mysz poddaną eutanazji i potwierdź brak parametrów życiowych za pomocą uszczypnięcia palca u nogi lub ogona. Spryskaj sierść myszy 70% etanolem.Następnie umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej na tacy preparcyjnej, zabezpieczając kończyny szpilkami lub taśmą. Ustaw ciało myszy w kierunku źródła światła LED, aby zapewnić prawidłowe oświetlenie klatki piersiowej podczas sekcji. Za pomocą nożyczek do rozwarstwiania wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości od trzech do czterech centymetrów wzdłuż brzucha, zaczynając od miednicy do mieczykowatego.Następnie użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć membranę z boku. Następnie przeciąć klatkę piersiową do przodu na obu bocznych krawędziach i zatrzymać się przed dotarciem do mostka w linii środkowej. Złóż utworzoną klapkę żebrową na głowie myszy, aby odsłonić serce.Następnie, delikatnie opierając serce o parę kleszczy, włóż igłę o rozmiarze 25 połączoną ze strzykawką o pojemności jednego mililitra do lewej komory. Delikatnie odciągnąć tłok, aby pobrać krew. Przenieś pobraną krew do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i pozwól jej krzepnąć przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Aby usunąć powstały skrzep, odwirować probówkę o stężeniu 2 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant reprezentujący frakcję surowicy i ostrożnie przechowywać podwielokrotności jednorazowego użytku w probówkach kriogenicznych w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zacznij od ponownego zawieszenia liofilizowanego peptydu MOG 35-55 w wodzie.Rozcieńczyć podstawowy peptyd do 10 mikrogramów na mililitr w buforze powlekającym przed eksperymentem. Teraz odpipetuj 100 mikrolitrów końcowego roztworu do studzienek na 96-dołkowej płytce. Jednocześnie pokryj równą liczbę studzienek 100 mikrolitrami BSA rozpuszczonymi w buforze powlekającym.Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną, aby zapobiec parowaniu, i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wykonaj trzy mycia płytki za pomocą 200 mikrolitrów PBS uzupełnionych 0,5%tween 20. Następnie dodać 100 mikrolitrów na studzienkę roztworu blokującego składającego się z 3% BSA w PBS.Inkubować zapieczętowaną płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji. Po inkubacji umyć płytkę trzykrotnie 200 mikrolitrami na studzienkę PBST. Rozcieńczyć każdą próbkę surowicy uzyskaną z krwi myszy uodpornionych EAE w roztworze blokującym.I dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę zarówno do studzienek pokrytych MOG 35-55, jak i BSA. Dodaj tę samą objętość roztworu blokującego do wyznaczonych ślepych studzienek. Inkubować szczelnie zamkniętą płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając.Po inkubacji wyjąć płytkę z inkubatora i przepłukać ją trzykrotnie w ilości 200 mikrolitrów na studzienkę PBST. Rozcieńczyć sprzężone z HRP przeciwciało drugorzędowe w roztworze składającym się z 0,2% BSA w PBST i dodać 100 mikrolitrów do każdej studzienki. Inkubować szczelnie zamkniętą płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej, utrzymując ciągłe wstrząsy.Umyj płytkę trzykrotnie 200 mikrolitrami na dołek PBST. Dodaj 100 mikrolitrów trzech 3-podstawowych, pięciu 5-podstawowych substratów tetraetylobenzyny do każdej studzienki. Inkubuj w ciemności przez jedną do pięciu minut, monitorując rozwój niebieskiego koloru.Dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. Następnie użyj czytnika płytek ustawionego na długość fali 450 nanometrów, aby zmierzyć gęstość optyczną w każdym dołku. Wartości gęstości optycznej próbek EAE były znacznie wyższe niż próbek kontrolnych, co wskazuje na silną odpowiedź immunoglobuliny G na peptyd MOG.

quantification-autoreactive-antibodies-mice-upon-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niektóre szczepy myszy są odporne na indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mielnowodnego (EAE) za pomocą podstawowego białka mieliny. Opisano tutaj prosty protokół immunizacji, który przełamuje tę brak reakcji i indukuje chorobę porażenną u kilku typowych szczepów myszy odpornych na EAE.

Przełamanie braku reakcji u szczepów myszy odpornych na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) poprzez transfer adopcyjny i stymulację antygenową

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Ten film demonstruje metodę wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) poprzez wstrzykiwanie peptydów pochodzących z mieliny z adiuwantem w celu aktywacji autoreaktywnych limfocytów T, które migrują do mózgu. Toksyna krztuścowa jest podawana w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając tym limfocytom T i innym komórkom odpornościowym przedostanie się do mózgu. Te komórki odpornościowe powodują demielinizację, co prowadzi do...

Generowanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Podwyższony poziom białka w płynie mózgowo-rdzeniowym może być wynikiem dyfuzji białka osocza przez zmienioną barierę krew-mózg lub syntezy dokanałowej. W artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół testowy, który pomaga rozróżnić oba przypadki i zapewnia pomiary ilościowe białek syntetyzowanych dokanałowo.

Ilościowy pomiar białek syntetyzowanych dooponowo u myszy

Ten manuskrypt przedstawia protokół indukcji aktywnego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy. Przedstawiono również metodę izolacji i charakterystyki naciekających limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), aby pokazać, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

Naucz się elastycznego protokołu ELISA do kwantyfikacji przeciwciał autoreaktywnych u myszy z modelem EAE, ekonomicznej alternatywy dla komercyjnych zestawów. Ta metoda umożliwia badanie odpowiedzi przeciwciałowej B-komórek w stwardnieniu rozsianym.

Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów