Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

Dlatego nasze laboratorium skupia się na zrozumieniu, że molekularne podstawy stwardnienia rozsianego, choroby immunologicznej ośrodkowego układu nerwowego, która charakteryzuje się demielinizacją, zapaleniem nerwów i uszkodzeniem aksonów. Tak więc protokół ten stanowi ekonomiczną i elastyczną alternatywę dla zestawów komercyjnych. Nasze zdjęcie rentgenowskie można łatwo dostosować do testowania odpowiedzi przeciwciał komórek B na różne peptydy EAE.

Moje laboratorium zajmuje się dalszym zrozumieniem związku między zapaleniem nerwów a neurodegeneracją w przewlekłych chorobach neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Na początek weź mysz poddaną eutanazji i potwierdź brak parametrów życiowych za pomocą uszczypnięcia palca u nogi lub ogona. Spryskaj sierść myszy 70% etanolem.

Następnie umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej na tacy preparcyjnej, zabezpieczając kończyny szpilkami lub taśmą. Ustaw ciało myszy w kierunku źródła światła LED, aby zapewnić prawidłowe oświetlenie klatki piersiowej podczas sekcji. Za pomocą nożyczek do rozwarstwiania wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości od trzech do czterech centymetrów wzdłuż brzucha, zaczynając od miednicy do mieczykowatego.

Następnie użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć membranę z boku. Następnie przeciąć klatkę piersiową do przodu na obu bocznych krawędziach i zatrzymać się przed dotarciem do mostka w linii środkowej. Złóż utworzoną klapkę żebrową na głowie myszy, aby odsłonić serce.

Następnie, delikatnie opierając serce o parę kleszczy, włóż igłę o rozmiarze 25 połączoną ze strzykawką o pojemności jednego mililitra do lewej komory. Delikatnie odciągnąć tłok, aby pobrać krew. Przenieś pobraną krew do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i pozwól jej krzepnąć przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Aby usunąć powstały skrzep, odwirować probówkę o stężeniu 2 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant reprezentujący frakcję surowicy i ostrożnie przechowywać podwielokrotności jednorazowego użytku w probówkach kriogenicznych w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zacznij od ponownego zawieszenia liofilizowanego peptydu MOG 35-55 w wodzie.

Rozcieńczyć podstawowy peptyd do 10 mikrogramów na mililitr w buforze powlekającym przed eksperymentem. Teraz odpipetuj 100 mikrolitrów końcowego roztworu do studzienek na 96-dołkowej płytce. Jednocześnie pokryj równą liczbę studzienek 100 mikrolitrami BSA rozpuszczonymi w buforze powlekającym.

Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną, aby zapobiec parowaniu, i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wykonaj trzy mycia płytki za pomocą 200 mikrolitrów PBS uzupełnionych 0,5%tween 20. Następnie dodać 100 mikrolitrów na studzienkę roztworu blokującego składającego się z 3% BSA w PBS.

Inkubować zapieczętowaną płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji. Po inkubacji umyć płytkę trzykrotnie 200 mikrolitrami na studzienkę PBST. Rozcieńczyć każdą próbkę surowicy uzyskaną z krwi myszy uodpornionych EAE w roztworze blokującym.

I dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę zarówno do studzienek pokrytych MOG 35-55, jak i BSA. Dodaj tę samą objętość roztworu blokującego do wyznaczonych ślepych studzienek. Inkubować szczelnie zamkniętą płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając.

Po inkubacji wyjąć płytkę z inkubatora i przepłukać ją trzykrotnie w ilości 200 mikrolitrów na studzienkę PBST. Rozcieńczyć sprzężone z HRP przeciwciało drugorzędowe w roztworze składającym się z 0,2% BSA w PBST i dodać 100 mikrolitrów do każdej studzienki. Inkubować szczelnie zamkniętą płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej, utrzymując ciągłe wstrząsy.

Umyj płytkę trzykrotnie 200 mikrolitrami na dołek PBST. Dodaj 100 mikrolitrów trzech 3-podstawowych, pięciu 5-podstawowych substratów tetraetylobenzyny do każdej studzienki. Inkubuj w ciemności przez jedną do pięciu minut, monitorując rozwój niebieskiego koloru.

Dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. Następnie użyj czytnika płytek ustawionego na długość fali 450 nanometrów, aby zmierzyć gęstość optyczną w każdym dołku. Wartości gęstości optycznej próbek EAE były znacznie wyższe niż próbek kontrolnych, co wskazuje na silną odpowiedź immunoglobuliny G na peptyd MOG.