Name: Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj protokół transformacji i regeneracji korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus. Zoptymalizowana metoda umożliwia szybką analizę cech genetycznych w badaniach nad genetyką roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jiříemu Macasowi (Centrum Biologii CAS, Czeskie Budziejowice, Czechy) za dostarczenie szczepu agrobakteryjnego. Główny Zakład Nauk o Roślinach CEITEC MU jest znany ze wsparcia technicznego. Prace te były wspierane przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej w ramach projektu Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego "SINGING PLANT" (nr 2). CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) oraz projekt INTER-COST LTC20004.

Agrobacterium-Mediated Hairy Root Induction and Regeneration in Plants

<ol><li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+binary+vectors+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).</li>
<li>Christey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Ri-mediated+transformation+for+production+of+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-Mediated+Plant+Transformation%3A+the+Biology+behind+the+%E2%80%9CGene-Jockeying%E2%80%9D+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).</li>
<li>Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+transformed+roots%3A+from+plant+disease+to+biotechnological+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource.</a> Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).</li>
<li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+cultures%E2%80%94a+versatile+tool+with+multiple+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root cultures—a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).</li>
<li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+planta+hairy+root+transformation%3A+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044(2022).</li>
<li>Petit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+extension+of+the+opine+concept%3A+plasmids+in+Agrobacterium+rhizogenes+cooperate+for+opine+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation.</a> Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).</li>
<li>Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOzyigit%2C+II+%22Crop+improvement%22">Crop improvement</a>. , Springer. Boston, MA. (2013).</li>
<li>Jedličková, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR%2FCas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+%28Brassica+napus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290(2022).</li>
<li>Steinbauerová, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li>
<li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromeres+off+the+hook%3A+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li>
<li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22(2023).</li>
<li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+transgenic+kale+%28Brassica+oleracea+var.+acephala%29%2C+rape+%28B.+napus%29+and+turnip+%28B.+campestris+var.+rapifera%29+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li>
<li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+%28Brassica+oleracea+and+B.+campestris%29+via+Ri-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone bez jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Opracowaliśmy prosty protokół transformacji owłosionych korzeni i późniejszej regeneracji u B. napus i A. thaliana. Proces ten obejmuje indukcję owłosionych korzeni w hipokotylu (B. napus) lub pierwotnej łodydze kwiatostanowej (A. thaliana) za pomocą iniekcji. Metoda wstrzykiwania hipokotylu ze szczepem agrobakteryjnym C58C1 przenoszącym plazmid Ri była również skuteczna w rodzinie bobowatych10,11, oprócz członków Brassicaceae przedstawionych w tym badaniu.
Alternatywą dla metody opartej na iniekcji jest transformacja oparta na zanurzeniu, polegająca na zanurzeniu eksplantatu w zawiesinie bakteryjnej, a następnie współhodowli eksplantatu z agrobakteriami. Przewagą metody opartej na iniekcji nad metodą zanurzeniową jest oszczędność czasu wynikająca z braku niektórych etapów protokołu: przygotowania eksplantatu, badania czasu kouprawy oraz hodowli na pożywce zawierającej hormon do indukcji owłosionych korzeni. Chociaż oba podejścia są skuteczne w przypadku indukcji owłosionych korzeni, wyższą wydajność transformacji zaobserwowano u niektórych gatunków przy metodzie opartej na iniekcji w porównaniu z metodą zanurzenia w eksplantacji12,13. Co więcej, transformacja oparta na iniekcjach jest również przydatna do generowania roślin kompozytowych (transgeniczne owłosione korzenie i pędy typu dzikiego). Po odcięciu pierwotnych korzeni przekształconej rośliny, owłosione korzenie wspomagają wzrost rośliny, a transgen może być badany w kontekście całej rośliny.
Krytycznym etapem indukcji owłosionych korzeni jest wstrzyknięcie inokulum do hipokotylu, czyli łodygi pierwotnego kwiatostanu. Hipokotyle B. napus są łamliwe, a przecięcie całego hipokotylu może łatwo nastąpić. To samo można zaobserwować u A. thaliana ze względu na cienkość łodygi kwiatostanu. Jeśli wymagane jest porównanie wydajności przemiany różnych gatunków/odmian, zalecamy, aby jedna osoba przeprowadziła wszystkie eksperymenty, aby uniknąć błędu spowodowanego manipulacją i umiejętnością wstrzykiwania roślin.
Opracowaliśmy skuteczny protokół regeneracji cebulek owłosionych u B. napus DH12075 i A. thaliana Col-0. Ponieważ regeneracja jest bardzo zmiennym procesem, pewne modyfikacje protokołu mogą być stosowane do wybranego gatunku lub odmiany. Na przykład owłosione pędy wywodzące się z korzeni mogą być wywołane przez inny stosunek auksyny do cytokininy (1:1) w B. oleracea14. Alternatywnie zamiast BAP można zastosować cytokininę tidiazuron, tak jak w przypadku owłosionych korzeni B. campestris 15.
Wielokrotne inserkcje plazmidu Ri T-DNA do genomu rośliny stanowią potencjalne ograniczenie systemu transformacji i regeneracji owłosionych korzeni. W takich przypadkach po analizie segregacji siewek T1 nie odkrywa się żadnych roślin wolnych od TL/TR z plazmidu Ri . Dlatego zalecamy wygenerowanie kilku niezależnych linii owłosionych korzeni dla każdego transgenu.
Owłosione kultury korzeniowe są niezwykle potężnym narzędziem do badań funkcjonalnych genów, głównie ze względu na ich szybkie założenie i tanią konserwację (brak hormonów potrzebnych w podłożach uprawowych). Protokół ten obejmuje metody indukcji i regeneracji owłosionych korzeni u B. napus i A. thaliana, które mogą być wykorzystane do badania transgenu będącego przedmiotem zainteresowania bezpośrednio w owłosionych kulturach korzeniowych, w kontekście całej rośliny przy użyciu roślin kompozytowych lub po regeneracji roślin transgenicznych.

Transformacja roślin jest wąskim gardłem każdego badania genetycznego w biologii roślin. Bakteria przenoszona przez glebę, Agrobacterium tumefaciens, jest szeroko stosowana jako środek dostarczania genów przez zanurzenie kwiatowe lub hodowlę tkankową w celu wytworzenia transformantów. A. tumefaciens infekuje rośliny w miejscu zranienia i powoduje nowotwory w wyniku transferu i integracji T-DNA z plazmidu indukującego nowotwór (Ti) do genomu rośliny gospodarza. Zmodyfikowane szczepy A. tumefaciens ze zmodyfikowanym plazmidem Ti bez T-DNA typu dzikiego i wektorem binarnym ze sztucznym T-DNA i miejscami klonowania w celu wstawienia interesującego genu są powszechnie stosowane jako wydajny system transformacji roślin1. Jednak wiele modelowych gatunków i roślin uprawnych jest opornych na zanurzanie się w kwiatach lub regenerację roślin in vitro lub ma długie cykle wzrostu, co wpływa na wydajność tego systemu przemian.
Agrobacterium rhizogenes powoduje powstawanie korzeni przybyszowych lub owłosionych w miejscu zranienia po zakażeniu rośliny żywicielskiej. Podobnie jak A. tumefaciens, A. rhizogenes przenosi T-DNA z plazmidu indukującego korzenie (Ri) do genomu rośliny żywicielskiej, powodując rozwój transgenicznych owłosionych korzeni. Proces ten jest kontrolowany głównie przez geny onkogennych loci korzenia (rol)2,3. Wykorzystując szczepy agrobakteryjne przenoszące zarówno plazmid Ri, jak i sztuczny wektor binarny kodujący interesujący gen, owłosione kultury korzeniowe wykorzystano do produkcji rekombinowanych białek, analizy funkcji promotorów lub genów lub edycji genomów za pomocą Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Nasz protokół wykorzystuje transkoniugowany szczep A. tumefaciens C58C1 przenoszący plazmid Ri pRiA4b7. T-DNA plazmidu Ri składa się z dwóch regionów, prawego i lewego T-DNA (odpowiednio TR-DNA i TL-DNA), które mogą niezależnie integrować się z genomem roślinnym8. Wykorzystując ten system, zoptymalizowano długotrwały proces transformacji eksplantacji odmiany Brassica napus DH120759. Opisany poniżej protokół pozwala na regenerację wybranych linii korzeni owłosionych i uzyskanie roślin T1 będących nosicielami interesującego transgenu i wolnych od genów rol w ciągu około 1 roku. Transformacja owłosionego korzenia oparta na iniekcjach może być stosowana u innych gatunków Brassicaceae, jak pokazano na przykładzie transformacji Arabidopsis thaliana Col-0. Podczas gdy hipokotyl jest używany do przekształcania B. napus, A. thaliana jest wstrzykiwany do pierwotnej łodygi kwiatostanu.

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,50 ml</td><td>Eppendorf</td><td>125.215</td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór wybielacza komercyjnego&nbsp;</td><td>SAVO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas 1-naftalenooctowy (NAA)&nbsp;</td><td>Duchefa</td><td>N0903</td><td>Pożywka regeneracyjna kalusa</td></tr><tr><td>2,0 ml probówki</td><td>Eppendorf</td><td>108.132/108.078</td><td></td></tr><tr><td>Taśma mikroporowa 3M</td><td>Micropore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine (BAP)&nbsp;</td><td>Duchefa</td><td>B0904</td><td>Pożywka regeneracyjna kalusa, Podłoże do wydłużania pędów&nbsp;</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agar bakteriologiczny</td><td>HiMedia</td><td>RM201</td><td>LB medium</td></tr><tr><td>Pepton bakteriologiczny</td><td>Oxoid</td><td>LP0037</td><td>LB i YEB Pożywka</td></tr><tr><td>Ekstrakt z wołowiny</td><td>Roth</td><td>X975.1</td><td>YEB medium</td></tr><tr><td>Butelki</td><td>DURAN</td><td>L300025</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaksym sodu</td><td>Duchefa</td><td>C0111</td><td>Podłoże do uprawy owłosionych korzeni, Pożywka do regeneracji kalusa, Pożywka do wydłużania pędów, Pożywka do indukcji korzeni</td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Serva</td><td>3955301</td><td></td></tr><tr><td>CTAB Bromek heksadecylotrimetyloamoniowy</td><td>Sigma</td><td>52365</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>EDTA - Titriplex III, Kwas (etylenodinitrylo)tetraoctowy, Sól disodowa, Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>ES134-250G</td><td></td></tr><tr><td>agar do elektroforezy z kuwetą</td><td></td><td></td><td></td>elektryczną</tr>, <tr><td>peqGOLD uniwersalna</td> komora do elektroforezy <td>VWR</td><td>732-2789</td><td></td></tr> czytnik <tr><td>żelu do elektroforezy</td><td>BIO-RAD</td> elektroporator BIO-RAD <td></td><td></td></tr><tr><td>GenePulser Xcell</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> bromek etydyny <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kuwety elektroporacyjne AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser, odstęp 0,2 cm</td><td>BIO-RAD</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>Gene Ruler Drabinka DNA mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0331</td><td></td></tr><tr><td>Kwas giberelinowy (GA3)</td><td>Duchefa</td><td>G0907</td><td>Medium do wydłużania pędów&nbsp;</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (2-(4-(2-hydroksyetylo)-1-pirerazynylo)-etansulfonique</td><td>Merck</td><td>1101100250</td><td></td></tr><tr><td>kwas indolo-3-masłowy (IBA)</td><td>Duchefa</td><td>I0902</td><td>Pożywka do indukcji korzeni</td></tr><tr><td>monosiarczan kanamycyny</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>Magenta GA-7 Pudełko do kultur roślinnych z pokrywką</td><td>Pożywka roślinna</td><td>V8505-100</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder</td><td></td><td></td><td></td>miarowy</tr><tr><td>MES monohydrat</td><td>Duchefa</td><td>M1503</td><td>Podłoże do uprawy owłosionych korzeni, Pożywka do regeneracji kalusa, Pożywka do wydłużania pędów, Pożywka do indukcji korzeni, Pożywka do kiełkowania, Pożywka do uprawy roślin</td></tr><tr><td>Murashige i Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0237</td><td>Pożywka do kiełkowania, Pożywka do uprawy roślin</td></tr><tr><td>Murashige i Skoog (MS) + witaminy B5&nbsp;</td><td>Duchefa</td><td>M0231</td><td>Owłosione podłoże do uprawy korzeni, Pożywka do regeneracji kalusa, Pożywka do wydłużania pędów, Pożywka do indukcji korzeni</td></tr><tr><td>igła Agani 26G x 1/2 - 0,45 x 13mm</td><td></td> Miernik pH Terumo <td></td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td>Pożywka regenerująca kalus, Pożywka do indukcji korzeni, Pożywka do kiełkowania</td></tr><tr><td></td> PVP 40 (poliwinylopirolidon Mr 40000)Sigma <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>9003-39-8</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Redtaq, Taq do rutynowego PCR z obojętnym barwnikiem, w zestawie bufor 10X</td><td>Sigma</td><td>D4309-250UN</td><td></td></tr><tr><td>Młyn Retsh</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Lachner</td><td>30093-APO</td><td>LB średni</td></tr><tr><td>kwadrat Szalki Petriego</td><td>Corning</td><td>GOSSBP124-05</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Penta</td><td>24970-31000</td><td>Pożywka do uprawy owłosionych korzeni, Pożywka do regeneracji kalusa, Pożywka do wydłużania pędów, Pożywka do indukcji korzeni, Pożywka do kiełkowania, Pożywka do uprawy roślin</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Carl Roth</td><td>P666.1</td><td>Filtry strzykawkowe Rotylabo 0,22 i mikro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>termomikser</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ticarcillin disodowy</td><td>Duchefa</td><td>T0180</td><td>Owłosione podłoże do uprawy korzeni</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan Serva</td><td></td><td>3719003</td><td></td></tr><tr><td>ultraczysta woda</td><td>Millipore Milli-Q woda oczyszczona&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Duchefa</td><td>Y1333</td><td>LB medium</td></tr></tbody></table>

transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u arabidopsis thaliana i brassica napus

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

Transformacja owłosionego korzenia stanowi wszechstronne narzędzie do biotechnologii roślin u różnych gatunków. Zakażenie szczepem Agrobacterium przenoszącym plazmid indukujący korzenie (Ri) indukuje tworzenie się owłosionych korzeni w miejscu zranienia po przeniesieniu T-DNA z plazmidu Ri do genomu rośliny. W protokole szczegółowo opisano procedurę indukcji owłosionych korzeni korzeniowych w postaci iniekcji u Brassica napus DH12075 i Arabidopsis thaliana Col-0. Owłosione korzenie mogą być wykorzystane do analizy interesującego nas transgenu lub przetworzone w celu wytworzenia roślin transgenicznych. Pożywka regeneracyjna zawierająca cytokininę 6-benzyloaminopurynę (5 mg/L) i kwas auksyno-1-naftalenooctowy (8 mg/L) skutecznie wywołuje tworzenie pędów u obu gatunków. Protokół obejmuje genotypowanie i selekcję regenerantów i roślin T1 w celu uzyskania roślin przenoszących interesujący nas transgen i wolnych od T-DNA z plazmidu Ri. Przedstawiono również alternatywny proces prowadzący do powstania rośliny kompozytowej. W tym przypadku owłosione korzenie są utrzymywane na pędzie (zamiast naturalnych korzeni), co umożliwia badanie transgenu w owłosionych kulturach korzeniowych w kontekście całej rośliny.

Wcześniej zoptymalizowaliśmy protokół indukcji korzeni włochatych metodą iniekcji u trzech odmian Brassica napus, a mianowicie DH12075, Topas DH4079 oraz Westar9. Aby zastosować ten protokół transformacji u gatunku modelowego A. thaliana, do głównych łodyg kwiatonośnych miesięcznych siewek wstrzyknięto inokulum agrobakterii. Korzenie włochate pojawiły się w miejscu iniekcji po 2-4 tygodniach. Korzenie włochate wycięto i hodowano na podłożu stałym. Porównanie tej metody u obu gatunków przedstawiono na Rysunku 1.
Wybrane linie korzeni włochatych przeniesiono na podłoże regeneracyjne w celu indukcji tworzenia pędów. W przypadku A. thaliana żółte kalusy zostały indukowane w ciągu 14 dni we wszystkich 10 badanych liniach korzeni włochatych. Pierwsze prymordia pędów, widoczne jako ciemnozielone punkty, pojawiły się w ciągu 3 tygodni po przeniesieniu na podłoże regeneracyjne (Rycina 2). Po 4 tygodniach hodowli pędy pokryły korzenie włochate w 9 z 10 linii (wydajność regeneracji 90%). W niektórych przypadkach z kalusa wyinducingowano korzenie przybyszowe (Rycina 2H). Jedna linia nie uległa regeneracji nawet po 3 miesiącach na podłożu regeneracyjnym (korzenie włochate przenoszono na świeże podłoże co 4 tygodnie). Zatem wydajność regeneracji korzeni włochatych A. thaliana przypomina wydajność B. napus DH120759.
Regeneranty z korzeni włochatych B. napus oraz A. thaliana wykazują fenotyp karłowaty (Rycina 3), co jest typową cechą roślin pochodzących z korzeni włochatych2. Zaobserwowano również gęste systemy korzeniowe, pomarszczone liście oraz zmiany w czasie kwitnienia. Tak zwany fenotyp korzenia włochatego (lub Ri) jest spowodowany przez geny rol z plazmidu Ri wbudowanego w genom rośliny. Insercja T-DNA z Ri oraz transgenu zakodowanego na wektorze binarnym może być niezależna lub sprzężona. W związku z tym analiza segregacji potomstwa T1 powstałego w wyniku samozapylenia pomaga w identyfikacji roślin wolnych od genów rol, które wykazują ekspresję interesującego nas transgenu. Genotypowanie roślin T1 przeprowadza się za pomocą starterów PCR specyficznych dla ORF TL i TR oraz badanego transgenu. Brak kontaminacji agrobakteriami weryfikuje się poprzez brak produktów PCR dla starterów virC (Rycina 1).
<img alt="Schemat procesu transgenezy roślin pokazujący transformację, indukcję HR, PCR, selekcję antybiotykową i genotypowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Podsumowanie procedury u A. thaliana i B. napus. Iniekcja inokulum Agrobacterium do podkotylu lub łodygi głównego kwiatostanu indukuje rozwój włochatych korzeni. Włochate korzenie mogą zastąpić korzenie natywne, tworząc roślinę kompozytową, która zostanie poddana genotypowaniu i analizie (niebieskie strzałki). Hodowane włochate korzenie mogą zostać zregenerowane do roślin T0, rozmnożone w roślinach T1 i poddane genotypowaniu (zielone strzałki). Włochate korzenie mogą być również poddawane subkulturowaniu w celu analizy funkcjonalnej (czarna strzałka). Przedstawiono przykłady wyników genotypowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zdjęcia mikroskopowe rozwoju korzeni w ciągu czterech tygodni, pokazujące wzrost i zmiany strukturalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Regeneracja korzeni włochatych u A. thaliana. (A) Kultura korzeni włochatych 1 dzień po przeniesieniu na płytki. (B, C) Kalusy powstałe w ciągu 2 tygodni hodowli na podłożu regeneracyjnym. (D, E) Primordia pędów pojawiły się po 3 tygodniach hodowli. (G, H) Pędy uformowane po 4 tygodniach. (H) Korzenie przybyszowe powstałe z kalusa. (C, F, I) Linia korzeni włochatych niepodlegająca regeneracji. Paski skali oznaczają 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Regeneracja Arabidopsis i B. napus; porównanie wzrostu roślin; wyniki regenerantów pochodzących z korzeni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne zdjęcia roślin typu dzikiego B. napus oraz A. thaliana i regenerantów pochodzących z włochatych korzeni (rośliny T0). Zwróć uwagę na fenotyp Ri regenerantów. Paski skali reprezentują 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Protokół opisuje indukcję owłosionych korzeni za pomocą łodyg kwiatostanu Arabidopsis i hipokotyli Brassica napus. Owłosione korzenie mogą być hodowane i wykorzystywane jako eksplantaty do regeneracji roślin transgenicznych.

Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

Nasze badania miały na celu opracowanie protokołu skutecznej przemiany w Brassica C. Korzystając z transformacji opartej na żywności, znacznie poprawiliśmy wydajność transformacji w Brassica napus, co jest kluczowe dla naszych badań. Przetestowaliśmy również protokół na gatunku modelowym Arabidopsis Thaliana. Zoptymalizowaliśmy protokół dla odmiany jarej DH 12075 w Brassica Napus.Kolejnym wyzwaniem jest optymalizacja protokołu przemiany i regeneracji odmiany ozimej w Brassica Napus, a także dla Brassica napa i Brassica oleracea. Cebulki włosów mogą być łatwo rozmnażane, a szybki wzrost umożliwia szybką analizę interesującego genu wkrótce po transformacji. W związku z tym możliwa staje się selektywna regeneracja określonych owłosionych linii korzeniowych, które wykazują cechę pożądania.Na przykład mutacja genu wprowadzona przez ostre percuss. Na początek umieść nasiona kapustnych napus DH 12075 w mikroprobówkach. Aby odtłuścić nasiona, dodaj wodę i 0,1% detergentu do mikroprobówki i potrząsaj przez 60 sekund.Teraz opłucz nasiona wodą, a następnie 70% etanolem, każdy przez 60 sekund. Następnie umieść nasiona w 10% roztworze podchlorynu sodu i wstrząsaj przez 20 minut. Po usunięciu wybielacza umyj nasiona cztery razy sterylną wodą przez 60 sekund każde.Umieść nasiona na szalce Petriego zawierającej pożywkę do kiełkowania nasion. Na zimno rozwarstwiaj nasiona w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc przed przeniesieniem naczynia do pomieszczenia uprawowego. Po pięciu dniach przenieś sadzonki do pudełka z kulturami roślinnymi zawierającego podłoże do wzrostu roślin.Zaszczepić, tumefacyny agrobacterium bez Ti, C58C1, przenoszące plazmid indukujący owłosiony korzeń, PRIA 4B w pięciu mililitrach pożywki LB. Hoduj kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż osiągnie gęstość optyczną przy 600 nanometrach 0,9 do jednego. Przenieść inokulum bakteryjne do strzykawki.Za pomocą igły o rozmiarze 26 zamontowanej na strzykawce. Nakłuj hipokotyl 18-dniowej sadzonki na wysokości około jednego centymetra nad podłożem wzrostowym. Wstrzyknąć około 50 mikrolitrów inokulum do rany i podrapać tkankę na powierzchni hipokotylu.Przywróć roślinę do pomieszczenia uprawowego w temperaturze 21 stopni Celsjusza na dwa do czterech tygodni. Następnie odetnij kalus z wynurzonymi owłosionymi korzeniami z hipokotylu. Umieść kalus z owłosionymi korzeniami na szalce Petriego, zawiera owłosione podłoże do wzrostu korzeni i antybiotyki hamujące rozwój agrobakterii.Uszczelnij naczynie taśmą przepuszczającą gaz przed inkubacją w temperaturze 24 stopni Celsjusza. Po inkubacji odizoluj owłosione korzenie od kalusa i przenieś poszczególne korzenie na owłosione podłoże do wzrostu korzeni. Alternatywnie, aby wygenerować roślinę złożoną składającą się z pędów typu dzikiego i transgenicznych owłosionych korzeni, usuń rodzime korzenie rośliny, a następnie przenieś roślinę z pojawiającymi się owłosionymi korzeniami do pudełka hodowlanego zawierającego pożywkę dla roślin i antybiotyki w celu zahamowania wzrostu agrobakterii.W sterylnych warunkach, za pomocą pęsety, przenieś od pięciu do 10 owłosionych linii korzeniowych brassica napus na naczynie zawierającym pożywkę regeneracyjną. Uszczelnij naczynie taśmą przepuszczającą gaz i zakulturuj w temperaturze 21 stopni Celsjusza w długim okresie zdjęciowym. Co trzy do czterech tygodni przenieś owłosione korzenie na szalkę Petriego ze świeżą pożywką regeneracyjną.Obserwuj zrogowaciałą formację po około dwóch tygodniach i strzelaj z kalusa po kolejnych dwóch tygodniach tworzenia się kalusa. Zindywidualizuj pędy i przenieś je do pudełka do kultur roślinnych zawierającego pożywkę do wydłużania pędów. Po dwóch do trzech tygodniach odetnij resztki kalusa od pędu i przenieś wydłużone pędy do pudełka do kultur roślinnych zawierającego pożywkę do indukcji korzeni.Teraz przenieś ukorzenioną roślinę do gleby i najpierw zaaklimatyzuj ją w fitotronach. Następnie przenieś roślinę do szklarni w celu kwitnienia. Aby przyspieszyć produkcję roślin T one, zbierz krzemionki zawierające dojrzałe zielone nasiona z regeneracji T zero.Podczas pracy w sterylnej skrzynce przepływowej, Surface sterylizował krzemionki 70% etanolem. Umieść śliliki na pokrywie talerza lub szkiełku. Za pomocą igły o rozmiarze 24 zamontowanej na strzykawce o pojemności jednego mililitra, naciąć krzemionkę wzdłuż brzegów zaworu.Otwórz nadgarstki i odłóż je na bok. Zbierz niedojrzałe nasiona i przenieś je na płytkę zawierającą pożywkę do kiełkowania nasion. Zapieczętuj płytkę i umieść ją w pomieszczeniu do uprawy do momentu wykiełkowania.W porównaniu z typem dzikim, owłosione korzenie B.napus wykazywały karłowaty fenotyp z gęstymi systemami korzeniowymi, pomarszczonymi liśćmi i zmienionym czasem kwitnienia. Na początek umieść wysterylizowane powierzchniowo nasiona Arabidopsis thaliana col-0 na płytce zawierającej pożywkę do kiełkowania nasion. Po dwóch dniach zimnej stratyfikacji przenieś płytkę do pomieszczenia uprawowego ustawionego na 21 stopni Celsjusza z długim okresem zdjęciowym dnia i wilgotnością 50%.Przenieś jednotygodniowe sadzonki do pudełka z kulturami roślinnymi z podłożem do wzrostu roślin. Hoduj kulturę tumefacyny agrobacterium w pożywce LB, aż osiągnie gęstość optyczną przy 600 nanometrach 0,9 do jednego. Za pomocą igły zamontowanej na strzykawce insulinowej wstrzyknij około 50 mikrolitrów kultury bakteryjnej u podstawy pierwotnej influorescencyjnej łodygi miesięcznej sadzonki Arabidopsis.Zdrap strzykawką tkankę na powierzchni pierwotnej łodygi. Po dwóch do czterech tygodniach wytnij pojawiające się owłosione korzenie i uprawiaj je na szalce Petriego z owłosioną pożywką do korzeni, uzupełnioną antybiotykami w celu zahamowania wzrostu agrobakterii. Posadź owłosiony korzeń w temperaturze 24 stopni Celsjusza w ciemności.Po jednym do dwóch tygodni zindywidualizuj owłosione korzenie na płytce za pomocą owłosionego podłoża do wzrostu korzeni i przenoś wybrane owłosione linie korzeniowe na świeże podłoże co cztery do pięciu tygodni. Przenieś owłosione korzenie na płytkę z podłożem regeneracyjnym, aby wywołać tworzenie się zrogowaciałości i kulturę w temperaturze 21 stopni Celsjusza w długim okresie zdjęciowym. Gdy pędy wyłonią się z kalusa, odetnij pędy i przenieś je na podłoże wydłużające pędy na dwa do trzech tygodni, aby przyspieszyć wzrost i wydłużenie.Następnie przenieś wydłużone pędy na podłoże do indukcji korzeni. Na koniec przenieś ukorzenioną roślinę do gleby, aby przeprowadzić selekcję transgeniczną. U A.thaliana żółte Cali zostały wywołane w ciągu 14 dni we wszystkich badanych włoskowatych liniach korzeniowych.Zawiązki pierwszych pędów, widoczne jako ciemnozielone plamki, pojawiły się w ciągu trzech tygodni po przeniesieniu do pożywki regeneracyjnej. Po czterech tygodniach pędy pokryły owłosione korzenie w 90% linii, a w niektórych przypadkach wykazano przypadkowe tworzenie się korzeni. Jednak jedna linia nie regenerowała się nawet po trzech miesiącach.W porównaniu z typem dzikim, owłosione korzenie A.thaliana wykazywały karłowaty fenotyp z gęstymi systemami korzeniowymi, pomarszczonymi liśćmi i zmienionym czasem kwitnienia.

hairy-root-transformation-regeneration-arabidopsis-thaliana-brassica

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium za pomocą metody zanurzania kwiatów może być z powodzeniem wykorzystana do stworzenia stabilnych linii transgenicznych modelu ekstremofitu Schrenkiella parvula. Przedstawiamy protokół zmodyfikowany w stosunku do tego dla Arabidopsis thaliana, biorąc pod uwagę różne nawyki wzrostu i cechy fizjologiczne ekstremofitu.

Wzrost roślin i przemiana kwiatowa za pośrednictwem Agrobacterium ekstremofitu Schrenkiella parvula

Opisujemy metodę wywoływania owłosionych korzeni przez przemianę za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes w gryce tartarskiej (Fagopyrum tataricum). Może to być wykorzystane do zbadania funkcji genów i produkcji metabolitów wtórnych w gryce tartarskiej, może być wykorzystane do dowolnej transformacji genetycznej lub wykorzystane do innych roślin leczniczych po ulepszeniu.

Wywoływanie owłosionych korzeni przez przemianę za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes w gryce winnej (Fagopyrum tataricum)

Tutaj prezentujemy protokół do wysokowydajnej produkcji transgenicznych korzeni owłosionych soi.

Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół jednoetapowej metody transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, w celu produkcji roślin kompozytowych.

Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes

Przedstawiamy wydajny, zoptymalizowany protokół transformacji apłciowej obojburzliwej odmiany Brassicaceae, Rorippa aquatica, wywoływanej przez Agrobacterium, bez wymagających zasobów procedur hodowli tkanek sterylnych. Wykorzystanie markera transformacji wizualnej i pipeline'u regeneracji pędów skutecznie wygenerowało transformanty bliskie klonalne, co przyczyniło się do dalszych badań nad adaptacją roślin do środowiska podwodnego.

Efektywna transformacja agrobakterii oparta na regeneracji bezpłciowego gatunku z rodziny kapustnych, Rorippa aquatica

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę izolacji nienaruszonych protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis. Biorąc pod uwagę, że wyizolowane protoplasty pozostają nienaruszone przez co najmniej 96h i są izolowane z siewek zamiast z miesięcznych, dojrzałych roślin, procedura ta przyspiesza analizy wymagające zastosowania nienaruszonych protoplastów.

Izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Niniejszy artykuł przedstawia metodę floral-dip w transformacji Arabidopsis thaliana za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens. Poprzez wprowadzenie do Arabidopsis promotora-reportera regulowanego cyklem komórkowym, pTSO2::β-glucuronidase (GUS), obrazujemy sposób wykrywania ekspresji reportera GUS w siewkach transgenicznych.

Transformacja Arabidopsis thaliana metodą floral-dip w celu zbadania ekspresji genu reporterowego pTSO2::β-glucuronidase

Skład ekstraktów lipidów polarnych oraz skład kwasów tłuszczowych poszczególnych gliceryolipidów są określane w prostym i niezawodnym eksperymencie profilowania lipidów. W tym celu gliceryolipidy są izolowane za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, a następnie poddawane transmetylacji ich grup acylowych. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej.

Profilowanie polarnych glicerolipidów Arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Poznaj protokół transformacji i regeneracji korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus. Zoptymalizowana metoda umożliwia szybką analizę cech genetycznych w badaniach nad genetyką roślin.

Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus

Przeglądaj więcej filmów