Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus

Nasze badania miały na celu opracowanie protokołu skutecznej przemiany w Brassica C. Korzystając z transformacji opartej na żywności, znacznie poprawiliśmy wydajność transformacji w Brassica napus, co jest kluczowe dla naszych badań. Przetestowaliśmy również protokół na gatunku modelowym Arabidopsis Thaliana. Zoptymalizowaliśmy protokół dla odmiany jarej DH 12075 w Brassica Napus.

Kolejnym wyzwaniem jest optymalizacja protokołu przemiany i regeneracji odmiany ozimej w Brassica Napus, a także dla Brassica napa i Brassica oleracea. Cebulki włosów mogą być łatwo rozmnażane, a szybki wzrost umożliwia szybką analizę interesującego genu wkrótce po transformacji. W związku z tym możliwa staje się selektywna regeneracja określonych owłosionych linii korzeniowych, które wykazują cechę pożądania.

Na przykład mutacja genu wprowadzona przez ostre percuss. Na początek umieść nasiona kapustnych napus DH 12075 w mikroprobówkach. Aby odtłuścić nasiona, dodaj wodę i 0,1% detergentu do mikroprobówki i potrząsaj przez 60 sekund.

Teraz opłucz nasiona wodą, a następnie 70% etanolem, każdy przez 60 sekund. Następnie umieść nasiona w 10% roztworze podchlorynu sodu i wstrząsaj przez 20 minut. Po usunięciu wybielacza umyj nasiona cztery razy sterylną wodą przez 60 sekund każde.

Umieść nasiona na szalce Petriego zawierającej pożywkę do kiełkowania nasion. Na zimno rozwarstwiaj nasiona w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc przed przeniesieniem naczynia do pomieszczenia uprawowego. Po pięciu dniach przenieś sadzonki do pudełka z kulturami roślinnymi zawierającego podłoże do wzrostu roślin.

Zaszczepić, tumefacyny agrobacterium bez Ti, C58C1, przenoszące plazmid indukujący owłosiony korzeń, PRIA 4B w pięciu mililitrach pożywki LB. Hoduj kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż osiągnie gęstość optyczną przy 600 nanometrach 0,9 do jednego. Przenieść inokulum bakteryjne do strzykawki.

Za pomocą igły o rozmiarze 26 zamontowanej na strzykawce. Nakłuj hipokotyl 18-dniowej sadzonki na wysokości około jednego centymetra nad podłożem wzrostowym. Wstrzyknąć około 50 mikrolitrów inokulum do rany i podrapać tkankę na powierzchni hipokotylu.

Przywróć roślinę do pomieszczenia uprawowego w temperaturze 21 stopni Celsjusza na dwa do czterech tygodni. Następnie odetnij kalus z wynurzonymi owłosionymi korzeniami z hipokotylu. Umieść kalus z owłosionymi korzeniami na szalce Petriego, zawiera owłosione podłoże do wzrostu korzeni i antybiotyki hamujące rozwój agrobakterii.

Uszczelnij naczynie taśmą przepuszczającą gaz przed inkubacją w temperaturze 24 stopni Celsjusza. Po inkubacji odizoluj owłosione korzenie od kalusa i przenieś poszczególne korzenie na owłosione podłoże do wzrostu korzeni. Alternatywnie, aby wygenerować roślinę złożoną składającą się z pędów typu dzikiego i transgenicznych owłosionych korzeni, usuń rodzime korzenie rośliny, a następnie przenieś roślinę z pojawiającymi się owłosionymi korzeniami do pudełka hodowlanego zawierającego pożywkę dla roślin i antybiotyki w celu zahamowania wzrostu agrobakterii.

W sterylnych warunkach, za pomocą pęsety, przenieś od pięciu do 10 owłosionych linii korzeniowych brassica napus na naczynie zawierającym pożywkę regeneracyjną. Uszczelnij naczynie taśmą przepuszczającą gaz i zakulturuj w temperaturze 21 stopni Celsjusza w długim okresie zdjęciowym. Co trzy do czterech tygodni przenieś owłosione korzenie na szalkę Petriego ze świeżą pożywką regeneracyjną.

Obserwuj zrogowaciałą formację po około dwóch tygodniach i strzelaj z kalusa po kolejnych dwóch tygodniach tworzenia się kalusa. Zindywidualizuj pędy i przenieś je do pudełka do kultur roślinnych zawierającego pożywkę do wydłużania pędów. Po dwóch do trzech tygodniach odetnij resztki kalusa od pędu i przenieś wydłużone pędy do pudełka do kultur roślinnych zawierającego pożywkę do indukcji korzeni

Teraz przenieś ukorzenioną roślinę do gleby i najpierw zaaklimatyzuj ją w fitotronach. Następnie przenieś roślinę do szklarni w celu kwitnienia. Aby przyspieszyć produkcję roślin T one, zbierz krzemionki zawierające dojrzałe zielone nasiona z regeneracji T zero.

Podczas pracy w sterylnej skrzynce przepływowej, Surface sterylizował krzemionki 70% etanolem. Umieść śliliki na pokrywie talerza lub szkiełku. Za pomocą igły o rozmiarze 24 zamontowanej na strzykawce o pojemności jednego mililitra, naciąć krzemionkę wzdłuż brzegów zaworu.

Otwórz nadgarstki i odłóż je na bok. Zbierz niedojrzałe nasiona i przenieś je na płytkę zawierającą pożywkę do kiełkowania nasion. Zapieczętuj płytkę i umieść ją w pomieszczeniu do uprawy do momentu wykiełkowania.

W porównaniu z typem dzikim, owłosione korzenie B.napus wykazywały karłowaty fenotyp z gęstymi systemami korzeniowymi, pomarszczonymi liśćmi i zmienionym czasem kwitnienia. Na początek umieść wysterylizowane powierzchniowo nasiona Arabidopsis thaliana col-0 na płytce zawierającej pożywkę do kiełkowania nasion. Po dwóch dniach zimnej stratyfikacji przenieś płytkę do pomieszczenia uprawowego ustawionego na 21 stopni Celsjusza z długim okresem zdjęciowym dnia i wilgotnością 50%.

Przenieś jednotygodniowe sadzonki do pudełka z kulturami roślinnymi z podłożem do wzrostu roślin. Hoduj kulturę tumefacyny agrobacterium w pożywce LB, aż osiągnie gęstość optyczną przy 600 nanometrach 0,9 do jednego. Za pomocą igły zamontowanej na strzykawce insulinowej wstrzyknij około 50 mikrolitrów kultury bakteryjnej u podstawy pierwotnej influorescencyjnej łodygi miesięcznej sadzonki Arabidopsis.

Zdrap strzykawką tkankę na powierzchni pierwotnej łodygi. Po dwóch do czterech tygodniach wytnij pojawiające się owłosione korzenie i uprawiaj je na szalce Petriego z owłosioną pożywką do korzeni, uzupełnioną antybiotykami w celu zahamowania wzrostu agrobakterii. Posadź owłosiony korzeń w temperaturze 24 stopni Celsjusza w ciemności.

Po jednym do dwóch tygodni zindywidualizuj owłosione korzenie na płytce za pomocą owłosionego podłoża do wzrostu korzeni i przenoś wybrane owłosione linie korzeniowe na świeże podłoże co cztery do pięciu tygodni. Przenieś owłosione korzenie na płytkę z podłożem regeneracyjnym, aby wywołać tworzenie się zrogowaciałości i kulturę w temperaturze 21 stopni Celsjusza w długim okresie zdjęciowym. Gdy pędy wyłonią się z kalusa, odetnij pędy i przenieś je na podłoże wydłużające pędy na dwa do trzech tygodni, aby przyspieszyć wzrost i wydłużenie.

Następnie przenieś wydłużone pędy na podłoże do indukcji korzeni. Na koniec przenieś ukorzenioną roślinę do gleby, aby przeprowadzić selekcję transgeniczną. U A.thaliana żółte Cali zostały wywołane w ciągu 14 dni we wszystkich badanych włoskowatych liniach korzeniowych.

Zawiązki pierwszych pędów, widoczne jako ciemnozielone plamki, pojawiły się w ciągu trzech tygodni po przeniesieniu do pożywki regeneracyjnej. Po czterech tygodniach pędy pokryły owłosione korzenie w 90% linii, a w niektórych przypadkach wykazano przypadkowe tworzenie się korzeni. Jednak jedna linia nie regenerowała się nawet po trzech miesiącach.

W porównaniu z typem dzikim, owłosione korzenie A.thaliana wykazywały karłowaty fenotyp z gęstymi systemami korzeniowymi, pomarszczonymi liśćmi i zmienionym czasem kwitnienia.