Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Rozwój komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym i grasicy jest w dużym stopniu zależny od wsparcia komórek zrębu. Zaburzenia funkcji krwiotwórczych komórek zrębowych mogą prowadzić do nieefektywnej lub nawet złośliwej produkcji krwi. Nasze laboratorium koncentruje się na zrozumieniu regulacji hematopoezy przez komórki zrębu i sposobach manipulowania nią w celu uzyskania korzyści terapeutycznych.

Pojawienie się sekwencjonowania pojedynczych komórek spowodowało kaskadę ostatnich postępów w wielu dziedzinach badawczych. Tak jest również w naszej dziedzinie, gdzie rozdzielczość pojedynczych komórek umożliwiła identyfikację niejednorodnych populacji komórek zrębu w narządach krwiotwórczych, które były wcześniej nieznane. Nasze protokoły są zoptymalizowane, aby rozwiązać ten problem i mamy nadzieję, że umożliwią więcej badań nad komórkami zrębu, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania w tej dziedzinie.

Aby rozpocząć, umieść uśpioną mysz na platformie chirurgicznej i otwórz klatkę piersiową. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj poprzeczne nacięcie poniżej klatki piersiowej i przytnij żebra po obu stronach myszy do obojczyka. Następnie przetnij przeponę, aby uwolnić ścianę klatki piersiowej i podnieś żebra kleszczami, aby odsłonić klatkę piersiową.

Przytrzymaj grasicę kleszczami i delikatnie przetnij tkankę łączną utrzymującą grasicę na miejscu. Aby przeprowadzić enzymatyczną dysocjację mysiej tkanki grasicy, umieść czystą grasicę w 15-mililitrowej nakrętce probówki i użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby na koniec zmielić tkankę. Dodaj dwa mililitry mysiego koktajlu dysocjacyjnego do probówki.

Załóż nasadkę zawierającą kawałki grasicy i odwróć probówkę pięć razy, aby ponownie zawiesić tkankę. Owiń nakrętkę tubki folią parafinową. Po inkubacji umieść probówkę w stojaku i pozwól tkance osiąść.

Usuń supernatant i przepuść go przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej lodowatej probówki. Następnie dodaj 20 mililitrów M199 z 2% pożywką FBS do zawiesiny komórek. Odwirować probówkę o natężeniu 500 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w pożywce M199 i 2%FBS. Na początek weź kości udowe, piszczelowe, miednicowe i ramienne odizolowane od myszy. Użyj skalpela, aby przeciąć płytki wzrostowe kości długich, usuwając nasadę.

Umieść go w 10-centymetrowym naczyniu z podłożem M199 plus 2% FBS na lodzie. Następnie użyj igły o rozmiarze 28 G i 10-mililitrowej strzykawki wypełnionej pożywką M199 plus 2% FBS, aby przepłukać szpik do 15-mililitrowej probówki na lodzie. Umieść zaczerwienioną kość w naczyniu z nasadą.

Pozostaw 15-mililitrową rurkę pionowo na lodzie, aż szpik się uspokoi. Następnie wyjmij medium M199 plus 2%FBS. Dodaj cztery mililitry koktajlu dysocjacyjnego B i M do 15-mililitrowej probówki i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji zebrać supernatant i przefiltrować przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do zimnej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodać dwa mililitry świeżego koktajlu dysocjacyjnego B i M do pozostałej osadki szpiku kostnego i wrzucić ją z powrotem do łaźni wodnej. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra energicznie odpipetuj wszystkie pozostałe kawałki szpiku kostnego.

Zebrać całą zawiesinę komórek w tej samej probówce co poprzednio. Dodaj 20 mililitrów pożywki M199 z 0,5% BSA i dwa milimolowe EDTA do zawiesiny komórki. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 500 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Zawiesić osad w 500 mikrolitrach PBS z 0,5% BSA i przeciwciałami biotyny. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dokładnie wymieszaj kulki magnetyczne.

Dodaj 25 mikrolitrów kulek do probówki i ponownie inkubuj na wytrząsarce orbitalnej. Umieść probówkę w pasującym magnesie na dwie do trzech minut i zbierz supernatant do świeżej probówki. Połam kości na mniejsze kawałki w 10-centymetrowym naczyniu, używając płaskiego końca 50-mililitrowej tubki.

Przefiltrować supernatant przez sitko o średnicy 70 mikrometrów w celu wyizolowania fragmentów kości. Wytnij nożyczkami fragmenty kości w sitku do komórek. Umieść filtr z fragmentami kości na 50-mililitrowej probówce i otwórz filtr skalpelem.

Za pomocą pęsety przenieś frakcję kostną do pięciu mililitrów mysiej mieszanki dysocjacyjnej B i M. Następnie umieść rurkę poziomo w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 120 obr./min, wstrząsając przez 30 minut. Po strawieniu dodaj 25 mililitrów pożywki M199 z 0,5% BSA i dwoma milimolowymi EDTA.

Przefiltruj supernatant zawierający komórki zrębu przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów do zimnej probówki o pojemności 50 mililitrów.