Name: Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Poznaj metody izolacji komórek zrębu z kości, szpiku i grasicy myszy oraz ludzkiej grasicy. Protokoły są zoptymalizowane pod kątem analizy multiomiki pojedynczych komórek w badaniach nad krwiotworzeniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Otrzymaliśmy wsparcie fachowej pomocy technicznej od urządzenia do cytometrii przepływowej HSCI-CRM w Massachusetts General Hospital oraz Bauer Core Facility na Uniwersytecie Harvarda. T.K i K.G. byli wspierani przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych, a C.M. przez Niemiecką Fundację Badawczą. Dziękujemy Sergeyowi Isaevowi i I-Hsiu Lee za pomoc w analizie danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.

Optimizing Stromal Cell Isolation from Thymus and Bone Marrow

<ol><li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).</li>
<li>Severe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+changes+in+bone+marrow+stromal+cell+populations+revealed+through+single-cell+protein+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).</li>
<li>Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2020+view+of+thymus+stromal+cells+in+t+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development.</a> J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).</li>
<li>Park, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+t+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), (2020).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+rna-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Lischetti, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+thresholding+and+tissue+dissociation+optimization+for+cite-seq+identifies+differential+surface+protein+abundance+in+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma.</a> Commun Biol. 6 (1), 830(2023).</li>
<li>Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+and+perivascular+cells+maintain+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells.</a> Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+sources+of+pleiotrophin+control+hematopoietic+stem+cell+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).</li>
<li>Zhou, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes+promote+the+regeneration+of+stem+cells+and+haematopoiesis+by+secreting+scf%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf.</a> Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).</li>
<li>Steinmann, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+human+thymus+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Pathol%22%5BJournal%5D)">Changes in the human thymus during aging.</a> Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).</li>
<li>Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involution+of+the+ageing+human+thymic+epithelium+is+independent+of+puberty.+A+morphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study.</a> Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).</li>
<li>Ambrosi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+accumulation+in+the+bone+marrow+during+obesity+and+aging+impairs+stem+cell-based+hematopoietic+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).</li>
<li>Ho, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+bone+marrow+hematopoietic+stem+cell+niches+promotes+myeloid+cell+expansion+during+premature+or+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).</li>
<li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li>
<li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myeloid+dendritic+cells+and+epithelial+cells+from+human+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus.</a> J Vis Exp. (79), e50951(2013).</li>
<li>Gustafsson, K., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+thymus+stromal+cells+from+human+and+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue.</a> Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).</li>
<li>Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html">Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html</a> (2023).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> J Vis Exp. (110), e53936(2016).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+beta-catenin+mutation+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li>
<li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+niche-specific+expression+of+cxcl12+controls+quiescence+of+treatment-resistant+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).</li>
<li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+aml%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li>
<li>O'flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+rna-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biol. 20 (1), 210(2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biol. 19 (1), 224(2018).</li>
</ol>

D.T.S. jest dyrektorem i udziałowcem Agios Therapeutics i Editas Medicines; założyciel, dyrektor, udziałowiec i członek naukowej rady doradczej Magenta Therapeutics i LifeVault Bio, udziałowiec i założyciel Fate Therapeutics i Garuda Therapeutics, a także dyrektor, założyciel i udziałowiec Clear Creek Bio, konsultant FOG Pharma, Inzen Therapeutics i VCanBio oraz laureat sponsorowanego finansowania badań od Sumitomo Dianippon. D.T.S i K.G są wynalazcami patentów US20220143099A1.

Komórki zrębu w narządach krwiotwórczych mają kluczowe znaczenie dla prawidłowej produkcji krwi, a zaburzenia zrębu układu krwiotwórczego mogą powodować poważne upośledzenie utrzymania układu krwiotwórczego i odpowiedzi na stres 9,23,24. Wgląd w hematopoetyczne komórki zrębu jest niezbędny do zrozumienia chorób hematologicznych 7,9,10,24 i możliwości opracowania terapii do ich zwalczania 25,26. Powtarzalne oddzielenie zrębu układu krwiotwórczego od miąższu jest jednak wyzwaniem, szczególnie w związku z pojawieniem się monoomiki jednokomórkowej, która wymaga wysokiej jakości preparatów próbek przy jednoczesnej maksymalizacji wydajności i różnorodności komórek zrębu. Opisane tutaj protokoły zostały zoptymalizowane tak, aby były kompatybilne z większością dalszych aplikacji multiomicznych, jednocześnie spełniając wyzwania związane z izolacją hematopoetycznych komórek zrębowych 1,2,19.
Pierwszą kwestią, którą należy wziąć pod uwagę przy izolacji hematopoetycznych komórek zrębowych, są warunki dysocjacji. Optymalna dysocjacja ma kluczowe znaczenie dla uwolnienia komórek zrębu z tkanki, aby odzwierciedlić pełną heterogeniczność przedziału zrębu 1,2. Wybór odpowiedniej mieszanki dysocjacyjnej zależy od zakresu eksperymentu i dalszych protokołów. Zalecamy przygotowanie mieszanek dysocjacyjnych tak świeżych, jak to możliwe i trzymanie ich na lodzie do czasu użycia. Niektóre składniki są trudne do rozpuszczenia, takie jak dypaza, i mogą wymagać więcej czasu na wymieszanie pipet. Wirowanie nie jest zalecane, ponieważ może to zakłócić natywną konformację enzymów trawiennych, ostatecznie prowadząc do ich inaktywacji. Co ważne, EDTA hamuje aktywność enzymatyczną i należy go unikać podczas etapów aktywnego trawienia, ale może być stosowany do zatrzymania reakcji, jeśli bufor zawierający enzym nie może zostać szybko usunięty. Oprócz samej mieszaniny enzymów, dwa punkty mają kluczowe znaczenie dla skutecznej dysocjacji tkanki: (1) dokładne rozdrabnianie i cięcie w celu zwiększenia powierzchni oraz (2) wystarczający czas inkubacji z enzymami trawiennymi. Na przykład ludzka tkanka grasicy jest znacznie trudniejsza do dysocjacji niż tkanka mysie, dlatego czas trawienia musi być dłuższy. Jeśli nie zostanie dokonana korekta dla tkanki ludzkiej, wydajność zrębu i różnorodność komórek zostaną zmniejszone (ryc. 2A). Enzymy dysocjacyjne wymagają optymalnej temperatury 37 °C, co nieuchronnie wpływa na ekspresję genów27. Chociaż dysocjacja w niskiej lub niższej temperaturze byłaby pożądana w celu zachowania stanów komórek, obecnie nie ma dostępnych na rynku kombinacji enzymów dysocjacji zimno-aktywnej odpowiednich dla kości i szpiku kostnego. W przypadku każdej tkanki, która wymaga trawienia, niejednorodność i procentowy udział uzyskany z różnych typów komórek będą się niezmiennie zmieniać wraz z czasem trawienia, składem koktajlu enzymatycznego i przetwarzaniem. Po tych początkowych etapach niejednorodność i reprezentacja będą dodatkowo ograniczone przez etapy filtracji, takie jak rozmiary dysz podczas sortowania i wychwytywania trudnych typów komórek (np. adipocytów ze zrębu) oraz średnice kanałów urządzeń płynowych. Dlatego porównując zestawy danych, powinniśmy pamiętać, że te różnice w protokołach mogą mieć wpływ na reprezentację subpopulacji. Logicznie wynika z tego, że musimy zachować czujność, aby utrzymać równe etapy przetwarzania podczas pomiaru wpływu zaburzeń w układach zrębowych.
Podczas gdy koszt sekwencjonowania był i nadal maleje, technologie pojedynczych komórek są często ograniczone liczbą komórek, które można przeanalizować. Aby zoptymalizować pojemność każdego zestawu odczynników, w miarę możliwości stosowano wyczerpanie magnetyczne komórek krwiotwórczych. Pozwala to uniknąć dużej liczby komórek zanieczyszczających, które są znacznie liczniejsze niż zrąb zarówno we frakcjach próbek szpiku kostnego, jak i grasicy. Jeśli jednak materiał wyjściowy jest ograniczony, jak w przypadku tkanki grasicy po przeszczepie, zwiększona, niespecyficzna utrata komórek, którą niezmiennie powodują strategie wyczerpania magnetycznego, może sprawić, że będzie to niewskazane. Ponadto podczas przygotowania i trawienia tkanek rozdrabnianie, cięcie i enzymatyczne uwalnianie składników macierzy zewnątrzkomórkowej generuje dużą ilość zanieczyszczeń. Ten rodzaj zanieczyszczenia, jeśli zostanie pozostawiony w próbce do analizy, może powodować problemy z zatykaniem w dalszym przetwarzaniu, powodować ujemne dołki do sortowania indeksów pojedynczych komórek i znacznie zawyżać procenty bramek nadrzędnych w analizie. Barwienie kalceiną zastosowano do bramowania dodatniego dla komórek/żywych komórek. Calcein występuje w różnych kolorach, dzięki czemu doskonale dostosowuje się do matrycy barwiącej. Podczas pracy z kalceiną należy uważać, aby nie poddawać barwnika powtarzającym się cyklom zamrażania i rozmrażania (tj. zawsze przygotowuj świeży i przechowuj w temperaturze pokojowej po rozpuszczeniu).
Możliwość multipleksowania próbek na podstawie przeciwciał oznaczonych kodem kreskowym za pomocą oligonukleotydówDNA 28 pozwala na zwiększenie użyteczności reakcji sekwencjonowania pojedynczych komórek na platformach takich jak 10x Genomics. Przeciwciała hasztagujące przeznaczone do multipleksowania próbek mają różne cele dla cząsteczek na powierzchni komórki lub błony jądrowej oraz specyficzność zarówno dla myszy, jak i człowieka. Podczas gdy system hasztagowania komórek jest z powodzeniem stosowany w wielu tkankach, eksperymenty łączące mieszanki enzymów trawiennych z późniejszym użyciem hashtagów mogą prowadzić do drastycznego zmniejszenia regeneracji. Staraliśmy się włączyć dodatkowe etapy mycia po dysocjacji i dodaliśmy EDTA, aby zahamować aktywność enzymów trawiennych. Jednak nawet przy tych krokach spodziewaj się niższej identyfikacji hashtagu niż w przypadku komórek krwiotwórczych. Stwierdzono, że w przypadku protokołów trawienia enzymatycznego wskaźniki przechwytywania hashtagów wynosiły od 30% do 70%. Dzieje się tak pomimo faktu, że ten sam klon przeciwciała ze sprzęgiem fluorochromowym znakowany >90% komórek zrębu w tej samej populacji. Każdy projekt eksperymentalny łączący trawienie enzymatyczne tkanki z hasztagowaniem powinien być pilotowany i należy zachować ostrożność w celu zapewnienia hamowania enzymatycznego.

U zdrowego dorosłego produkcja de novo komórek krwi występuje w szpiku kostnym i grasicy. Komórki zrębu w tych miejscach są niezbędne do utrzymania hematopoezy, ale zrąb stanowi mniej niż 1% tkanki1,2,3,4. Uzyskanie czystych izolatów hematopoezy podtrzymującej zrąb stanowi zatem poważne wyzwanie, szczególnie w przypadku multiomiki jednokomórkowej, która wymaga celowego przetwarzania w celu uzyskania próbek o wysokiej jakości. Składniki różnych koktajli trawiennych mogą zakłócać niektóre etapy analizy multiomicznej5,6. Przedstawione tutaj protokoły szczegółowo opisują izolację szerokiej gamy komórek zrębu ze szpiku kostnego i tkanek grasicy.
Zaburzenia składników zrębu zarówno w szpiku kostnym, jak i grasicy powodują głębokie zakłócenia w rozwoju komórek krwi i mogą prowadzić do nowotworów złośliwych7,8,9. Hematopoeza podtrzymująca zrąb ulega uszkodzeniu w wyniku kondycjonowania cytotoksycznego i przeszczepu szpiku kostnego, co skutkuje zmniejszonym wydzielaniem cytokin i czynników wzrostu, które podtrzymują hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC)2,10,11. Ponadto starzenie się wpływa na szpik kostny i komórki zrębu grasicy, prawdopodobnie przyczyniając się do starzenia się fenotypów krwiotwórczych. Grasica jest pierwszym narządem, który ulega rozległej inwolucji związanej z wiekiem. Tkanka tłuszczowa i zwłóknieniowa zaczynają zastępować zrąb podporowy limfocytów T już na początku okresu dojrzewania12,13. W szpiku kostnym zawartość adipocytów wzrasta wraz z wiekiem, a nisze naczyniowe i śródkostne ulegają znacznej przebudowie14,15,16.
Aby umożliwić badanie zrębu wspierającego hematopoezę w wielu stanach stresu oraz w przypadku grasicy zarówno tkanki ludzkiej, jak i mysjej, zoptymalizowaliśmy wcześniej opublikowane protokoły trawienia1,2,8,17,18. Protokoły te zapewniają wydajną i powtarzalną izolację komórek i są kompatybilne z sekwencjonowaniem RNA pojedynczej komórki (scRNAseq) i innymi rodzajami multiomiki.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>7AAD (7-aminoaktynomycyna D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl przeciw ludzkiej linii 3-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>643510</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 myszy</td><td>Jackson</td><td>664</td><td>Samce lub samice, 8-12 tygodni</td></tr><tr><td>Calcein&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>65-0853-78</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitka komórkowe Corning, białe, rozmiar oczek: 70 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90083</td><td>&nbsp; 2500 U/mL</td></tr><tr><td>mysia streptawidyna Easysep Zestaw izolacyjny RapidSpheres</td><td>StemCell Technologies</td><td>19860</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>A31605-01</td><td>Kwalifikowany One Shot</td></tr><tr><td>Human Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401127001</td><td>klasy badawczej</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Gibco</td><td>12350</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD235a-BV77</td><td>BD Biosciences</td><td>740785</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD31-PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>303130</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD45-BV77</td><td>Biolegend</td><td>304050</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD4-BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>562658</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD66b-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD8-APC/Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557760</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka EpCam-BV421</td><td>Biolegend</td><td>324220</td><td></td></tr><tr><td>Protector Inhibitor RNazy</td><td>Millipore Sigma</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD105-PE /dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>120424</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD11b-Biotyna</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-myszy CD140a-APC</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-1401-81</td><td></td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysz CD16/CD32 (blok myszy BD Fc)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD31-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612802</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-myszy CD31-BV421</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysi CD3-Biotyna</td><td>Biolegend</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD45.2-Biotyna</td><td>Biolegend</td><td>109804</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysz CD45R/B220-Biotyna</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD51-PE</td><td>Biolegend</td><td>104106</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz EpCam-BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563134</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz Ly-6A/E(Sca-1)-AF700</td><td>Biolegend</td><td>108142</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotyna</td><td></td><td>Biolegend 108404</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz Ter119-Biotyna</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz Ter119-PE</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz Ter119-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116222</td><td></td></tr><tr><td>Stemxyme&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004107</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek umożliwiło mapowanie heterogenicznych populacji komórek w zrębie narządów krwiotwórczych. Metodologie te zapewniają soczewkę, przez którą można badać wcześniej nierozwiązaną heterogeniczność w stanie ustalonym, a także zmiany w reprezentacji typów komórek wywołane naprężeniami zewnętrznymi lub podczas starzenia. W tym miejscu przedstawiamy stopniowe protokoły izolacji wysokiej jakości populacji komórek zrębu z grasicy mysiej i ludzkiej, a także mysich kości i szpiku kostnego. Komórki wyizolowane za pomocą tych protokołów nadają się do generowania wysokiej jakości jednokomórkowych zestawów danych multiomicznych. Omówiono tutaj wpływ trawienia próbek, zubożenia linii krwiotwórczej, analizy/sortowania FACS oraz wpływ tych czynników na zgodność z sekwencjonowaniem pojedynczych komórek. Wraz z przykładami profili FACS wskazujących na udaną i nieefektywną dysocjację oraz wydajność komórek zrębu w dalszej części procesu w analizie po sekwencjonowaniu, przedstawiono rozpoznawalne wskazówki dla użytkowników. Uwzględnienie specyficznych wymagań komórek zrębu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości i powtarzalnych wyników, które mogą przyczynić się do poszerzenia wiedzy w tej dziedzinie.

Niniejsze protokoły pozwalają na uzyskanie powtarzalnych frakcji komórek zrębowych z grasicy i szpiku kostnego, odpowiednich do analizy cytometrycznej przepływowej, a także do wieloomicznych analiz pojedynczych komórek, takich jak sekwencjonowanie scRNA. Tkanka grasicy mysiej ulega znacznej przebudowie w odpowiedzi na stresory, takie jak kondycjonowanie cytotoksyczne poprzedzające transplantację szpiku kostnego lub naturalny proces starzenia. W konsekwencji komórkowość grasicy jest drastycznie zredukowana w obu tych przypadkach (Rycina 1A). Podczas gdy grasica 8-tygodniowej myszy typu dzikiego zawiera około 100 milionów komórek, w przypadku myszy 2-letniej można spodziewać się połowy tej liczby, a w grasicy 4 dni po napromieniowaniu i transplantacji szpiku kostnego liczba ta może być tak niska jak 5,00,000 komórek (Rycina 1A).
Warunkowanie cytotoksyczne będzie preferencyjnie usuwać komórki krwiotwórcze, przez co komponentia zrębową zostanie proporcjonalnie wzbogacona (Rysunek 1B). Jednak ogólnie niska komórkowość sprawi, że izolacja wystarczającej liczby komórek zrębu grasicy będzie wyzwaniem. Może zatem konieczne być łączenie materiału od zwierząt w celu uzyskania liczby komórek kompatybilnej z późniejszymi zastosowaniami multiomicznymi oraz w celu zminimalizowania strat materiału wszędzie tam, gdzie jest to możliwe. Aby przeprowadzić analizy multiomiczne komórek zrębu grasicy, zastosowanie fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) żywych, pojedynczych komórek CD45-Ter119- (Rysunek 1C) zapewni wyizolowanie wystarczającej liczby komórek w większości warunków stresowych.
Aby zachować heterogeniczność komponentu zrębu, zazwyczaj nie przeprowadzamy sortowania na podstawie pojedynczego pozytywnego markera zrębu, lecz wykluczamy komórki hematopoetyczne. W celach analitycznych nadal zaleca się uwzględnienie pozytywnych markerów komórek zrębu, aby upewnić się, że uzyskano prawidłową dysocjację tkanki. Jednakże izolacja metodą FACS jest niedoskonała i jak ustalono za pomocą scRNAseq, 30%-50% posortowanych komórek będzie pochodzenia hematopoetycznego (Rysunek 1D,E). Można to poprawić poprzez magnetyczne usuwanie komórek CD45+ przed FACS; nie jest to jednak zalecane w przypadku zmniejszonej komórkowości grasicy (Rysunek 1A), ponieważ strata materiału wynikająca z dodatkowej obróbki związanej z usuwaniem magnetycznym prowadzi do zbyt niskiej wydajności uzyskania zrębu dla dalszych zastosowań.
W przypadku izolacji zrębu grasicy człowieka najkrytyczniejszym etapem jest trawienie enzymatyczne. Jeśli proces dysocjacji zostanie przeprowadzony zbyt szybko, całkowita wydajność komórek zrębu, a także reprezentacja podtypów tych komórek, ulegną znacznemu zmniejszeniu (Ryc. 2A). Zaleca się również zawsze uwzględniać markery śródbłonka i nabłonka grasicy, aby upewnić się, że trawienie tkanki było optymalne, ponieważ samo wyznaczanie bramkowania ujemnego dla markerów hematopoetycznych nie będzie wystarczające do oceny rzeczywistego uwolnienia komórek zrębu. Przykładowo na Ryc. 2A widać, że odsetek komórek ujemnych dla markerów hematopoetycznych jest wyższy w próbce trawionej przez 30 min w porównaniu z próbką inkubowaną przez 90 min. Jednak, jak widać w kolejnym bramkowaniu, wydajność komórek śródbłonka i nabłonka jest bardzo niska w przypadku krótszego protokołu trawienia (Ryc. 2A).
W celu izolacji ludzkich komórek zrębu grasicy metodą FACS do zastosowań multiomicznych, w celu poprawy wzbogacenia frakcji komórek zrębu, zaleca się barwienie koktajlem przeciwciał przeciwko liniom krwiotwórczym oraz przeciwciałami anty-CD4 i anty-CD8, oprócz pan-hematopoetycznego markera CD45 oraz markera erytroidalnego CD235a (Ryc. 2B). Zatem dla analizy multiomicznej ludzkiego zrębu grasicy należy wyizolować metodą FACS żywe, pojedyncze komórki CD45-CD235a-Lineage-CD4-CD8- (Ryc. 2B). Jak zaobserwowano w przypadku scRNAseq próbek mysich, prowadzi to nadal do zanieczyszczenia w zakresie 30%-50% komórkami krwiotwórczymi, ale wciąż zapewnia dopuszczalną rozdzielczość komponentu zrębu ludzkiej grasicy (Ryc. 2C,D).
W przypadku kości i stromy szpiku kostnego (BM) zastosowano tę samą strategię co dla tkanki grasicy; komórki stromy izoluje się poprzez bramkowanie komórek negatywnych pod kątem markerów hematopoetycznych, a dodatkowe markery komórek stromy służą jako kontrole trawienia (Rycina 3). Dysocjacja tkanki zmineralizowanej, takiej jak kość, prowadzi do znacznego nagromadzenia debris. Dodanie kalceiny jako barwnika żywotności pozwala na wykluczenie większości tych zanieczyszczeń, które w przeciwnym razie sztucznie zawyżają liczbę sortowanych komórek i obniżają częstotliwość populacji w bramce (Rycina 3). Zilustrowano to na wykresach FACS, porównując bramkowanie wszystkich komórek z bramkowaniem wyłącznie populacji Calcein+ (Rycina 3). Podobnie jak w przypadku ludzkich stromalnych komórek grasicy, odsetek komórek negatywnych pod kątem markerów hematopoetycznych nie jest wiarygodnym wskaźnikiem wydajności dysocjacji tkanki kostnej i szpiku kostnego (Rycina 3). Chociaż bramka CD45-Ter119- może zawierać dużą liczbę komórek w próbce, w której etap trawienia nie powiódł się, dalsza analiza typowych markerów komórek stromy kości i szpiku kostnego, takich jak CD31, CD140a i CD51, wyraźnie wykazuje niską wydajność uwalniania stromy (Rycina 3 i Rycina 4).
Do izolacji komórek macierzystych szpiku kostnego i kości myszy metodą FACS sugeruje się zastosowanie strategii bramkowania przedstawionej w Rycina 3gdzie sortujemy wyłącznie komórki CD45-Ter119-Calcein+, monitorując jednocześnie właściwości rozproszenia światła w przód (forward scatter) i w bok (side scatter) oraz ekspresję markerów komórek zrębu w sortowanej populacji, aby zapewnić optymalny przebieg trawienia (Rycina 3A). Połączenie magnetycznego usuwania komórek linii hematopoetycznych z szpiku kostnego przed FACS oraz sortowania zgodnie z przedstawionymi bramkami pozwala na sekwencjonowanie pojedynczych komórek, które są &gt;90% zręb. Przykład takiego przebiegu scRNA-seq (Rycina 5A,B) ilustruje to niskie zanieczyszczenie hematopoetyczne po adnotacji analizowanych komórek na podstawie transkryptomu (przykłady genów markerów hematopoetycznych Rysunek 5C). Stoi to w jaskrawym kontraście do preparatów stropalnych grasicy, w których przed etapem sortowania nie przeprowadzono magnetycznej deplecji komórek ze względu na ograniczoną ilość materiału wyjściowego w tkance grasicy po transplantacji (Rysunek 1F).
<img alt="Komórkowość grasicy i scRNAseq grasicy mysiej; analiza FACS komórek krwiotwórczych i stromalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Analiza cytometryczna i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek stromy grasicy mysiej. (A) Ilościowe oznaczenie liczby tymocytów u 8-tygodniowych myszy (Kontrolna), 8-tygodniowych myszy poddanych letalnemu napromieniowaniu i przeszczepowi 4 dni wcześniej (Przeszczep) oraz 2-letnich myszy (Wiekowa). (B) Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej wykazujące wzbogacenie podtypów komórek stromalnych 4 dni po letalnym napromieniowaniu i przeszczepie. (C) Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej w celu sortowania stromy grasicy mysiej do wieloomicznej analizy pojedynczych komórek. (D) Wykres UMAP grasicy mysiej wskazujący stromę (niebieski) i komórki krwiotwórcze (czerwony). (E) Wykresy UMAP pokazujące mysie geny markerowe linii krwiotwórczej w próbkach grasicy. (F) Ilościowe oznaczenie mysich komórek stromalnych i krwiotwórczych w próbkach scRNAseq grasicy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Dane FACS z ludzkiego grasicy, diagramy UMAP scRNAseq, markery typów komórek dla analizy próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza cytometryczna i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek z obturacyjnego stroma ludzkiej grasicy. (A) Wykresy FACS przedstawiające reprezentatywne wyniki wpływu różnych czasów trawienia na uwalnianie populacji komórek zdomy ludzkiej grasicy. (B) Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej w celu sortowania stroma ludzkiej grasicy do wielomicznej analizy pojedynczych komórek. (C) UMAP ludzkiej grasicy wskazujący stroma (kolor niebieski) i komórki krwiotwórcze (kolor czerwony). (D) Wykresy UMAP przedstawiające ludzkie geny markerowe linii krwiotwórczej w próbkach grasicy. (E) Ilościowe oznaczenie ludzkich komórek stromy i komórek krwiotwórczych w próbkach scRNAseq z grasicy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy rozrzutu z cytometrii przepływowej analizujące markery komórkowe CD45, Ter119, Calcein-FITC, CD140a, CD51, CD31." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Markery zrazowe szpiku kostnego myszy oraz Calcein pomagają w ocenie wydajności dysocjacji. (A) Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej CD45-Ter119- komórek zrazowych szpiku kostnego myszy z bramkowaniem na wszystkie komórki oraz komórki Calcein+. Następnie zastosowano bramkowanie CD31-, wykazując wyższą proporcję komórek CD140a+CD51+ przy wyborze komórek Calcein+. (B) Analiza cytometrii przepływowej reprezentatywna dla nieudanej digestii tkanki kostnej z brakiem komórek CD140a+CD51+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagram cytometrii przepływowej analizujący dysocjację komórek; parametry FSC, SSC; identyfikacja wielokolonialna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Strategia bramkowania zrębu szpiku kostnego. (A) Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej w celu sortowania zrębu szpiku kostnego myszy do wielkoskalowej analizy multiomicznej pojedynczych komórek. (B) Analiza cytometrii przepływowej reprezentująca nieudaną digestię szpiku kostnego z brakiem komórek CD140a+CD51+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="scRNA-seq kości i szpiku kostnego myszy; wykresy UMAP komórek zrębowych/hematopoetycznych; wykres składu próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Sekwencjonanie RNA pojedynczych komórek szpiku kostnego z analizą składu komórek zrębowych i hematopoetycznych. (A) Wykres UMAP kości i szpiku kostnego myszy wskazujący komórki zrębowe (niebieski) oraz komórki hematopoetyczne (czerwony). (B) Ilościowe oznaczenie komórek zrębowych i hematopoetycznych w próbkach kości i szpiku kostnego myszy. (C) Wykres UMAP genów markerowych linii hematopoetycznej w próbkach szpiku kostnego myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Rozwój komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym i grasicy jest w dużym stopniu zależny od wsparcia komórek zrębu. Zaburzenia funkcji krwiotwórczych komórek zrębowych mogą prowadzić do nieefektywnej lub nawet złośliwej produkcji krwi. Nasze laboratorium koncentruje się na zrozumieniu regulacji hematopoezy przez komórki zrębu i sposobach manipulowania nią w celu uzyskania korzyści terapeutycznych.Pojawienie się sekwencjonowania pojedynczych komórek spowodowało kaskadę ostatnich postępów w wielu dziedzinach badawczych. Tak jest również w naszej dziedzinie, gdzie rozdzielczość pojedynczych komórek umożliwiła identyfikację niejednorodnych populacji komórek zrębu w narządach krwiotwórczych, które były wcześniej nieznane. Nasze protokoły są zoptymalizowane, aby rozwiązać ten problem i mamy nadzieję, że umożliwią więcej badań nad komórkami zrębu, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania w tej dziedzinie.Aby rozpocząć, umieść uśpioną mysz na platformie chirurgicznej i otwórz klatkę piersiową. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj poprzeczne nacięcie poniżej klatki piersiowej i przytnij żebra po obu stronach myszy do obojczyka. Następnie przetnij przeponę, aby uwolnić ścianę klatki piersiowej i podnieś żebra kleszczami, aby odsłonić klatkę piersiową.Przytrzymaj grasicę kleszczami i delikatnie przetnij tkankę łączną utrzymującą grasicę na miejscu. Aby przeprowadzić enzymatyczną dysocjację mysiej tkanki grasicy, umieść czystą grasicę w 15-mililitrowej nakrętce probówki i użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby na koniec zmielić tkankę. Dodaj dwa mililitry mysiego koktajlu dysocjacyjnego do probówki.Załóż nasadkę zawierającą kawałki grasicy i odwróć probówkę pięć razy, aby ponownie zawiesić tkankę. Owiń nakrętkę tubki folią parafinową. Po inkubacji umieść probówkę w stojaku i pozwól tkance osiąść.Usuń supernatant i przepuść go przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej lodowatej probówki. Następnie dodaj 20 mililitrów M199 z 2% pożywką FBS do zawiesiny komórek. Odwirować probówkę o natężeniu 500 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w pożywce M199 i 2%FBS. Na początek weź kości udowe, piszczelowe, miednicowe i ramienne odizolowane od myszy. Użyj skalpela, aby przeciąć płytki wzrostowe kości długich, usuwając nasadę.Umieść go w 10-centymetrowym naczyniu z podłożem M199 plus 2% FBS na lodzie. Następnie użyj igły o rozmiarze 28 G i 10-mililitrowej strzykawki wypełnionej pożywką M199 plus 2% FBS, aby przepłukać szpik do 15-mililitrowej probówki na lodzie. Umieść zaczerwienioną kość w naczyniu z nasadą.Pozostaw 15-mililitrową rurkę pionowo na lodzie, aż szpik się uspokoi. Następnie wyjmij medium M199 plus 2%FBS. Dodaj cztery mililitry koktajlu dysocjacyjnego B i M do 15-mililitrowej probówki i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji zebrać supernatant i przefiltrować przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do zimnej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodać dwa mililitry świeżego koktajlu dysocjacyjnego B i M do pozostałej osadki szpiku kostnego i wrzucić ją z powrotem do łaźni wodnej. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra energicznie odpipetuj wszystkie pozostałe kawałki szpiku kostnego.Zebrać całą zawiesinę komórek w tej samej probówce co poprzednio. Dodaj 20 mililitrów pożywki M199 z 0,5% BSA i dwa milimolowe EDTA do zawiesiny komórki. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 500 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Zawiesić osad w 500 mikrolitrach PBS z 0,5% BSA i przeciwciałami biotyny. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dokładnie wymieszaj kulki magnetyczne.Dodaj 25 mikrolitrów kulek do probówki i ponownie inkubuj na wytrząsarce orbitalnej. Umieść probówkę w pasującym magnesie na dwie do trzech minut i zbierz supernatant do świeżej probówki. Połam kości na mniejsze kawałki w 10-centymetrowym naczyniu, używając płaskiego końca 50-mililitrowej tubki.Przefiltrować supernatant przez sitko o średnicy 70 mikrometrów w celu wyizolowania fragmentów kości. Wytnij nożyczkami fragmenty kości w sitku do komórek. Umieść filtr z fragmentami kości na 50-mililitrowej probówce i otwórz filtr skalpelem.Za pomocą pęsety przenieś frakcję kostną do pięciu mililitrów mysiej mieszanki dysocjacyjnej B i M. Następnie umieść rurkę poziomo w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 120 obr./min, wstrząsając przez 30 minut. Po strawieniu dodaj 25 mililitrów pożywki M199 z 0,5% BSA i dwoma milimolowymi EDTA.Przefiltruj supernatant zawierający komórki zrębu przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów do zimnej probówki o pojemności 50 mililitrów.

stromal-cell-isolation-from-hematopoietic-organs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja i transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

W tym filmie pokazano, jak przeprowadzić mikrodysekcję pęcherzyka żółtkowego oraz regionu aorta-gonady-metanefrosy z embrionów i wykorzystać cytometrię przepływową do sortowania hematopoetycznych komórek macierzystych.

Izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z worka żółtkowego i obszaru AGM myszy

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Aby zbadać odpowiedź immunologiczną na zaburzenia mózgu, jednym z powszechnych podejść jest analiza zmian w komórkach odpornościowych. Oto dwa proste i skuteczne protokoły do izolacji komórek odpornościowych z tkanki mózgu mysiego i rdzenia kostnego z czaszki.

Izolowanie komórek odpornościowych z mózgu i czaszki myszy

Poznaj metody izolacji komórek zrębu z kości, szpiku i grasicy myszy oraz ludzkiej grasicy. Protokoły są zoptymalizowane pod kątem analizy multiomiki pojedynczych komórek w badaniach nad krwiotworzeniem.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Przeglądaj więcej filmów