Obrazowanie in vivo sferoid wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy

W naszej grupie wykorzystujemy przednią komorę oka myszy jako miejsce przeszczepu do obrazowania in vivo i nieinwazyjnego obrazowania steroidów wątrobowych. Ta nowo powstała platforma obrazowania zapewni unikalne narzędzie dla badaczy i poszerzy naszą wiedzę na temat fizjologii i patologii wątroby zarówno w badaniach podstawowych, jak i przedklinicznych. W badaniach biomedycznych opieramy się na wizualizacji procesów komórkowych, aby zrozumieć mechanizmy chorobowe.

W dziedzinie badań nad wątrobą brakuje obecnie metod obrazowania in vivo w wysokiej rozdzielczości, w których komórki wątroby można monitorować podłużnie w czasie. W porównaniu z obrazowaniem wątroby przyżyciowej, nasza technika jest nieinwazyjna, a komórki wątroby mogą być obrazowane wielokrotnie podczas wielu sesji obrazowania, co pozwala nam monitorować czynność wątroby z rozdzielczością pojedynczej komórki w odpowiedzi na różne wyzwania. Dzięki naszej platformie sterydy wątrobowe przeżywają w oku przez wiele miesięcy, a ta sama mysz biorcy może być obrazowana nieinwazyjnie w czasie.

Pozwala to na zmniejszenie liczby wykorzystywanych przez nas zwierząt doświadczalnych przy jednoczesnym poprawie jakości danych in vivo. W ciągu ostatniej dekady nasza grupa opracowała platformę obrazowania oka, która ma być potężnym narzędziem badawczym. Początkowo został zaprojektowany do obrazowania oczek trzustki, ale obecnie został dostosowany do sterydów wątrobowych i ma potencjał, aby zostać rozszerzony na inne narządy i obszary badawcze.

Na początek zbierz wszystkie wymagane zasoby i wyczyść rurkę strzykawki Hamilton i kaniulę 70% etanolem, a następnie solą fizjologiczną. Po napełnieniu ich solą fizjologiczną przyklej strzykawkę Hamilton do ławki poziomo. Następnie przygotuj jednostkę znieczulającą izofluran i podgrzej poduszkę grzewczą do 37 stopni Celsjusza.

Przykryj końcówki kleszczy przymocowanych do solidnego uniwersalnego złącza kawałkiem rurki polietylenowej, aby utworzyć pętlę. Za pomocą pipety i końcówki o pojemności 200 mikrolitrów przenieś PHE wątroby z płytki 96-dołkowej do 35-milimetrowego naczynia do zawiesiny komórek zawierającej pożywkę konserwacyjną. Po znieczuleniu myszki przenieś ją na poduszkę grzewczą i unieruchamij głowicę za pomocą.

Następnie delikatnie wysuń oko z oczodołu i zabezpiecz je kleszczami. Aby zapobiec wysuszeniu, umieść kroplę soli fizjologicznej na obu oczach. Za pomocą strzykawki Hamiltona odessać sferoidy wątroby pod stereoskopem.

Umieść kaniulę poziomo na czystej powierzchni. Za pomocą igły o rozmiarze 23 ostrożnie nakłuć rogówkę i przesunąć igłę na boki, aby poszerzyć nacięcie. Osusz sączącą się ciecz wodnistą chusteczką i dodaj krople soli fizjologicznej do oka, aby było wilgotne.

Ustaw kaniulę pionowo, aby sferoidy wątroby mogły grawitować w kierunku końcówki A następnie delikatnie włóż ją do otworu za pomocą strzykawki Hamiltona, powoli wyrzuć sferoidy wątroby do ACE. Używając końcówki kaniuli, delikatnie popchnij rogówkę od zewnątrz, aby ustawić steryd wątrobowy wokół źrenicy. Po pięciu do 10 minutach uwolnij oko z kleszczy.

Aby nasmarować i wyleczyć rogówkę, nałóż maść do oczu z wazeliną na operowane oko. Przed obudzeniem myszy podawaj środek przeciwbólowy podskórnie, aby uniknąć dyskomfortu pooperacyjnego. Na początek znieczulij mysz ze sferoidami wątroby przeszczepionymi do ACE i unieruchomij głowę za pomocą.

Aby zapobiec wysuszeniu, umieść kroplę sztucznego żelu łzowego na obu oczach. Wstrzyknąć sondy fluorescencyjne dożylnie przez żyłę ogonową i natychmiast przystąpić do obrazowania. Po odchyleniu głowicy delikatnie wysuń oko z oczodołu i zaciśnij je pod obiektywem obrazowania.

Aby wypełnić przestrzeń między rogówką a obiektywem, nałóż dużą ilość sztucznego żelu łzowego i skup się na sferoidach wątroby przez okular. Korzystając z obiektywu 25x, uzyskaj obrazy in vivo. Na koniec nałóż wazelinową maść na oko przed obudzeniem zwierzęcia.

Nieinwazyjne wewnątrzgałkowe obrazowanie in vivo sferoid wątroby wykazało obecność naczyń krwionośnych. Sieć wyspowa i zdolność absorpcji LDL. Sferoidy wątroby wyrażające fluorescencyjny biosensor wskaźnika cyklu komórkowego ubikwityny monitorowano podłużnie z rozdzielczością pojedynczej komórki.