Name: Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Naucz się izolować pierwotne komórki glejowe Müllera siatkówki myszy. Ta metoda umożliwia badanie roli tych komórek w chorobach siatkówki i rozwój terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Eye Institute (NEI), The National Eye Institute (NEI) fund R01 EY029751-04. Chcielibyśmy podziękować dr Sylvii B. Smith, ponieważ ten protokół został zmodyfikowaną wersją w oparciu o jej protokół izolacji komórek Müllera.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały przeprowadzone zgodnie z naszym protokołem zwierzęcym zatwierdzonym przez Komitet Instytutu Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) oraz zasady Uniwersytetu Oakland (numer protokołu 2022-1160)
1. Przygotowanie podłoża i roztworu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do badania oka z komórek Müllera, uzupełniając zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle Medium (DMEM, szczegóły w tabeli materiałów) penicyliną/streptomycyną w rozcieńczeniu 1:1000. Na przykład na 10 ml DMEM dodaj 10 μl penicyliny/streptomycyny. 
	UWAGA: Jest to prosty przygotowany nośnik bez surowicy. Należy również podgrzać całe podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przed użyciem go do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Przygotuj kompletną pierwotną pożywkę do wzrostu komórek Müllera, uzupełniając DMEM 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS, inaktywowaną termicznie) i 1% penicyliną/streptomycyną. Na przykład (500 ml pożywki DMEM + 50 ml FBS + 5 ml penicyliny/streptomycyny).</li>
	<li>Przygotuj 0,05% roztwór trypsyny-EDTA z kolagenazą IV o stężeniu 200 U/ml (Trypsin-EDTA służy do rozpuszczenia obliczonej ilości proszku kolagenazy IV w celu osiągnięcia wymaganego stężenia).</li>
</ol>
2. Wyłuszczenie
<ol>
	<li>Etycznie poddaj mysz eutanazji za pomocą inhalacji CO2 zgodnie z wytycznymi IACUC.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, umieść zwierzę (zwierzęta) w komorze CO2 w celu wprowadzenia 100% CO2 przy szybkości napełniania 30-70% objętości / min komory CO2, aby osiągnąć cel, jakim jest szybka utrata przytomności w ciągu 2-3 minut przy minimalnym stresie myszy.</li>
		<li>Ponieważ myszy są w młodym wieku (~10 dni), należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy jako drugorzędną metodę zapewnienia prawidłowej eutanazji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wysterylizowaniu obszaru roboczego 70% etanolem umieść mysz na sterylnym podkładce.</li>
	<li>Wyodrębnij oczy, umieszczając ramiona pęsety z tyłu oka, delikatnie pociągając za obszar oczodołu i wyłuszczając oczy, wywierając nacisk pęsetą w stylu 5/45 na obszar oczodołu, aby spowodować wytrzeszcz. 
	UWAGA: Przed preparacją wysterylizuj narzędzia do preparowania 70% etanolem, a następnie roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym.</li>
	<li>Upewnij się, że nerw wzrokowy jest nadal połączony z okiem, powoli wyłuszczając oko. Upewnij się, że nerw wzrokowy (wizualnie identyfikowany jako biały sznur) znajduje się za okiem. 
	UWAGA: Ten krok nie musi być wykonywany pod mikroskopem i może być wykonany na wysterylizowanej stole.</li>
</ol>
3. Leczenie wyłuszczonych oczu
<ol>
	<li>Przykryj probówkę wirówkową o pojemności 15 ml folią aluminiową i napełnij probówkę 10 ml roztworu do pomiaru komórek Müllera.</li>
	<li>Wypreparowane oczy umieścić w 15 ml probówce zawierającej roztwór do oczu z komórek Müllera i pozostawić je na noc lub około 18 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 18 godzinach zdekantować roztwór do oczu i krótko przepłukać oczy 2-3 ml podgrzanego (37 °C) roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Zdekantować PBS i przesunąć oczy na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 10 ml roztworu trypsyny. (przygotowane w kroku 1.3). 
	UWAGA: Trypsyna jest stosowana na całe wyłuszczone oko, działając jako środek dysocjacyjny ułatwiający oddzielanie komórek od warstw siatkówki podczas sekcji. Wypreparowana siatkówka ma wiele komórek, w tym komórki RPE, które są lepkie i najprawdopodobniej zanieczyszczą hodowlę komórek Müllera14. Badania mikroskopowe jednoznacznie wykazały, że po 5 dniach izolacji (podczas pierwszej zmiany podłoża) komórki RPE oderwały się od płytki i obumarły13. Pożywką stosowaną do izolacji RPE jest DMEM/F-12, o innym składzie niż DMEM (stosowany w izolacji komórek Müllera), zawierająca pirogronian sodu i niską zawartość glukozy.</li>
	<li>Umieścić naczynie w inkubatorze i inkubować przez 1,5 do 2 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po inkubacji przenieść oczy na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą około 5 ml kompletnej pierwotnej pożywki do wzrostu komórek Müllera.</li>
</ol>
4. Sekcja
UWAGA: Ta procedura musi być przeprowadzona w sterylnym środowisku okapu hodowlanego. Dlatego konieczne jest dokładne wysterylizowanie powierzchni okapu 70% alkoholem, wraz ze wszystkimi narzędziami i mikroskopem preparacyjnym. Warto zauważyć, że film został nagrany na zewnątrz maski dla lepszej widoczności i wyraźniejszych celów demonstracyjnych.
<ol>
	<li>Umieść mały kawałek wysterylizowanej tkanki laboratoryjnej w naczyniu, aby ustabilizować oczy podczas sekcji. Umieść oczy pod mikroskopem preparacyjnym, aby rozpocząć sekcję. 
	UWAGA: Zastosowanie tkanki laboratoryjnej ułatwia manewrowanie oczami w naczyniu wypełnionym płynem (kompletne podłoże), zapewniając precyzyjną sekcję.</li>
	<li>Użyj nożyczek Vannas i pęsety w stylu M5S, aby usunąć tkankę łączną, mięśnie zewnątrzgałkowe i nerw wzrokowy.
	<ol>
		<li>Chwyć oko pęsetą w stylu M5S i wykonaj nacięcie w sekcji ora serrata nożyczkami Vannas lub igłą lub igłą strzykawki. 
		UWAGA: Między przednią a tylną częścią oka znajduje się jasnoniebieska okrągła linia zwana ora serrata, która może być używana jako punkt orientacyjny dla dokładnego kierunku podczas sekcji.</li>
		<li>Chwyć nacięcie pęsetą typu M5S i pociągnij lub oderwij rogówkę z tylnej części oka. Wprowadzaj małe przyrosty, aby upewnić się, że integralność siatkówki pozostaje nienaruszona. 
		UWAGA: Te kroki mają na celu usunięcie przedniej części oka (rogówki, tęczówki i soczewki) z tylnej części muszli oka (siatkówki nerwowej i pigmentowej).</li>
		<li>Aby zachować integralność warstw siatkówki, delikatnie pociągnij i usuń nabłonek barwnikowy siatkówki z siatkówki nerwowej. Siatkówka nerwowa powinna być wolna od jakichkolwiek czarnych plamek, aby zapewnić jak największą czystość izolacji, ponieważ warstwa RPE jest zwykle lepka i przyczepiona do siatkówki neuronalnej.</li>
		<li>Pokrój wypreparowaną siatkówkę nerwową na małe kawałki przed zebraniem jej na płytkę, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie komórek na płytce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść siatkówki nerwowe w kolbie T25 zawierającej 4 ml kompletnej pierwotnej pożywki do wzrostu komórek Müllera.</li>
	<li>Na koniec umieścić kolbę w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
5. Hodowla pierwotnych komórek glejowych Müllera
<ol>
	<li>Nie przesuwaj kolby przez 3-5 dni, aby pobudzić wzrost komórek.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę po piątym dniu, a następnie co drugi dzień, aż komórki zlewają się w 90%.</li>
</ol>
6. Pasażowanie pierwotnych komórek glejowych Müllera
<ol>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórek Müllera, a następnie 2 ml przemywania do PBS i odessać PBS. Dodaj 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA (1x) lub tyle, aby pokryć płytkę.</li>
	<li>Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Upewnij się, że komórki są odłączone od płytki pod mikroskopem. Następnie zebrać zawiesinę komórkową i dodać 4 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) kompletnej pożywki do wzrostu komórek Müllera (przygotowanej w kroku 1.2) do probówki zbiorczej.</li>
	<li>Wirować przez 7 minut przy 300 x g. Po zaessaniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 10 ml kompletnej pierwotnej pożywki do wzrostu komórek Müllera. Ponieważ liczba komórek może się różnić w zależności od liczby wypreparowanych oczu, dlatego lepiej jest policzyć komórki przed wysiewem i inkubacją. Zalecana gęstość wysiewu wynosi 3,0 x 106 komórek w kolbie T75. 
	UWAGA: Komórki mogą być pasażowane do 4-5 razy. Jednak najbardziej spójne wyniki eksperymentu uzyskuje się po 1-2 przejściach.</li>
</ol>
7. Immunofluorescencja
UWAGA: Użyj protokołu immunofluorescencji, aby wybarwić i zweryfikować specyficzność komórek Müllera. Oto krótki przegląd protokołu immunofluorescencyjnego. Ten krok jest wykonywany po pierwszym fragmencie12.
<ol>
	<li>Zasiej komórki w szkiełku do hodowli komórek (30 000 komórek na studzienkę dla szkiełka z 8 dołkami).</li>
	<li>Hodować wyizolowane komórki przez 24–48 godzin w kompletnej pożywce Müllera (przygotowanej w kroku 1.2) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Odessać pożywkę i umyć szkiełko komory 250-300 μl 1x PBS na każdym dołku, gdy komórki są zlewające się w 80-90%.</li>
	<li>Umieść szkiełko na 10 do 15 minut w 250-300 μl 4% paraformaldehydu na każdym dołku, a następnie przemyj PBS/TX-100 (5 minut każdy/3 razy).</li>
	<li>Dodać bufor blokujący na 1 godzinę w temperaturze 37 °C (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odessać roztwór blokujący, a następnie dodać pierwszorzędowe przeciwciała specyficzne dla komórek Müllera, aby potwierdzić czystość wyizolowanych komórek za pomocą syntetazy glutaminy i wimentyny5,12. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C (przy stężeniu przeciwciał 1:100-1:200 w buforze blokującym w objętości 150-200 μl/szkiełko). Umyj szkiełko praniami PBS/TX-100 (5 i 10 min każde). 
	UWAGA: Przeciwciała te zostały wybrane, ponieważ są cechami charakterystycznymi do identyfikacji komórek Müllera i zapewniają sukces i czystość hodowli komórek Müllera.</li>
	<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe (o stężeniu przeciwciała w zakresie 1:1000 w buforze blokującym w 150–200 μl/szkiełko) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie umyj PBS/Triton X-100 trzy razy (po 5-10 minut).</li>
	<li>Nałóż kroplę podłoża montażowego DAPI, aby oznaczyć jądra przed przykryciem szkiełka nakrywkowego. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas zakładania szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby sprawdzić szkiełko i zrobić zdjęcia (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Komórki są zlokalizowane z DAPI na ex/em 359/461 przy 10-krotnym powiększeniu, aby zlokalizować komórki; Większe powiększenie może uchwycić komórki. Inne długości fal zależałyby od wybranego koloru. Kolor zielony (GFP)- ex/em 488/510. Kolor czerwony (Cy3)- ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signaling+in+m%C3%BCller+glia%3A+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophth%22%5BJournal%5D)">Cellular signaling in müller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109(2019).</li>
<li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+M%C3%BCller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Beyoglu+Eye+J%22%5BJournal%5D)">Importance of Müller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li>
<li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+M%C3%BCller+cell+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse Müller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).</li>
<li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Ret+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Müller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li>
<li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina%3A+neurotransmitters+and+trophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li>
<li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Müller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+%28Danio+rerio%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997(2018).</li>
<li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+isolated+glial+%28M%C3%BCller%29+cells+from+the+turtle+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of isolated glial (Müller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li>
<li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+membrane+component+1+%28PGRMC1%29+expression+in+murine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li>
<li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12-HETE+activates+M%C3%BCller+glial+cells%3A+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29%5BTitle%5D)+AND+%22Prostag+Oth+Lipid+M%22%5BJournal%5D)">12-HETE activates Müller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805(2024).</li>
<li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine%2C+rats+and+mice+m%C3%BCller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice müller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do dyspozycji oświadczeń o konflikcie interesów, które miałyby związek z treścią niniejszego artykułu.

Izolacja pierwotnego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od myszy została wcześniej udokumentowana przez nasze laboratorium. Niniejszy manuskrypt opisuje szczegółowy protokół demonstracyjny do izolacji pierwotnych komórek Müllera. Procedura ta obejmuje enukleację, leczenie, preparację, pobranie, wysiew, hodowlę i charakterystykę komórek Müllera wyizolowanych z oczu myszy. Opiera się na wcześniej udanym protokole, który został znaleziony we wcześniejszych publikacjach i naszym zmodyfikowanym protokole, którego użyliśmy w niedawnej publikacji1, 2,13. Chociaż kroki są proste, skuteczna izolacja komórek Müllera wymaga przestrzegania określonych ograniczeń i podstawowych wymagań. Po licznych próbach optymalizacji tego protokołu metodą prób i błędów, zidentyfikowano wiele czynników wpływających na jego sukces.
Stwierdzono, że idealny wiek myszy, jak zaobserwowano w naszych eksperymentach, wynosi od 5 do 11 dni, aby wyhodować izolowane komórki do czterech pasaży. Na kulturę wpływa również to, ile oczu jest odizolowanych i wykształconych. Do pojedynczej izolacji wymagane jest co najmniej dwoje oczu, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek, aby móc rosnąć i rozmnażać się. Innym ważnym aspektem jest czas między enukleacją a posiewem; Dlatego ten krok należy wykonać stosunkowo szybko. Zaobserwowano, że długotrwała manipulacja tkanką oka ma szkodliwy wpływ na zdolność komórek do przylegania do kolby i namnażania się. Aby upewnić się, że bliskość izolowanych komórek jest wystarczająco blisko, aby zachęcić do proliferacji, zalecamy użycie kolby T25. Po wykonaniu pierwszego przejścia, ogniwa można posiać na T75. Nie należy również naruszać komórek po izolacji i wysiewie poprzez wyjęcie kolby do hodowli tkankowej z inkubatora lub zmianę pożywki na co najmniej 5 dni. Wreszcie, komórki można przejść tylko około cztery razy, zanim przestaną przylegać. Chociaż ta procedura jest prosta i łatwa do wykonania, ma pewne ograniczenia, w tym wiek myszy, ograniczoną liczbę przejść komórkowych itp.
Nie ma wielu protokołów izolacji komórek Müllera, ale istnieją pewne znaczące różnice między tym protokołem a protokołami, które są dostępne 5,14. Po pierwsze, czas między enukleacją a izolacją jest znacznie inny. Inne protokoły sugerują sekcję wkrótce po enukleacji, zwykle w ciągu 10 minut. Natomiast obecny protokół sugeruje okres spoczynku wynoszący co najmniej 18 godzin, ponieważ zapewniło to najlepsze wyniki dla izolacji w tym protokole. Kolejną istotną różnicą między tym protokołem a innymi protokołami jest punkt, w którym oczy są traktowane enzymami. W tym protokole oczy są leczone przed wykonaniem jakiejkolwiek sekcji, nawet przed usunięciem tkanki łącznej i mięśni zewnątrzgałkowych. Podczas gdy inne protokoły izolują siatkówki od oka przed leczeniem enzymatycznym. Co więcej, receptura enzymu jest również inna. W tym protokole roztwór enzymatyczny składa się z trypsyny i kolagenazy typu IV. W podobnych protokołach papaina i DNaza są używane do trawienia tkanek. Dodatkowo naczynie hodowlane jest inne, ten protokół sugeruje hodowlę na T25, a następnie na T75 po pierwszym pasażu. Podczas gdy inne protokoły wykorzystują szalki Petriego lub płytki wielodołkowe. Wreszcie, protokół ten sugeruje, że kolba nie powinna być naruszana (przez 5-7 dni), aby pobudzić wzrost komórek. Podczas gdy w innych protokołach wymiana nośnika odbywa się po jednym dniu.

Komórki Müllera (MCs) są głównymi i najliczniejszymi komórkami glejowymi występującymi w tkance siatkówki. Są kluczowymi graczami w zapewnianiu integralności strukturalnej i funkcji metabolicznych w siatkówce1. Strategiczna struktura MC jest rozłożona na całej grubości siatkówki, zapewniając w ten sposób wsparcie siatkówki. Oprócz właściwości podobnych do rusztowań, pełnią funkcje metaboliczne dla neuronów siatkówki, dostarczając im substratów energetycznych, w tym glukozy i mleczanu. Funkcje te są kluczowe dla utrzymania zdrowych funkcji neuronalnych. Doniesiono, że upośledzone MC przyczyniają się do różnych chorób siatkówki, w tym zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, retinopatii cukrzycowej i jaskry2,3. MC mogą być endogennymi źródłami komórkowymi terapii regeneracyjnej w klasie retina<sup="xref">1. Stanowią one również znaczną część siatkówki, a mocne dowody sugerują, że u kilku gatunków komórki te mogą być stymulowane do zastępowania brakujących neuronów2. Korzystnie współpracują z neuronami, a stożkowato rozgałęzione końcówki komórek Müllera gęsto odsłaniają naczynia krwionośne i łączą składniki nerwowe siatkówki. W celu utrzymania rozwoju neuronów i plastyczności neuronalnej, komórki Müllera działają jak miękki substrat dla neuronów, chroniąc je przed urazami mechanicznymi3. Dodatkowo, w warunkach patologicznych, komórki Müllera mogą różnicować się w progenitory neuronalne lub komórki macierzyste, które replikują lub regenerują utracone fotoreceptory i neurony2,3,4. Komórki Müllera zachowują cechy komórek macierzystych siatkówki, w tym różne poziomy potencjału do samoodnawiania i różnicowania5,6. Komórka glejowa Müllera ma znaczącą linię siatkówki, która wytwarza czynniki neurotroficzne, wychwytuje i przetwarza neuroprzekaźniki, przestrzennie buforuje jony i utrzymuje barierę krew-siatkówka, aby utrzymać siatkówkę w homeostazie7,8,9. Podkreśla to potencjał komórek Müllera jako obiecującego narzędzia w terapiach komórkowych w leczeniu chorób związanych ze zwyrodnieniem siatkówki. Komórki Müllera są pierwotnymi komórkami glejowymi rozmieszczonymi w siatkówce, łączącymi się zarówno z neuronami, jak i naczyniami krwionośnymi. Odgrywają kluczową rolę ochronną, zapewniając niezbędne wsparcie strukturalne i metaboliczne w celu utrzymania żywotności i stabilności komórek siatkówki. Niestety, w literaturze można znaleźć bardzo niewiele protokołów pierwotnej izolacji komórek Müllera z siatkówki 10,11.
Prezentujemy ulepszone podejście do niezawodnego izolowania i hodowli pierwotnych komórek Müllera myszy. Protokół ten został wykorzystany w naszej grupie do wyizolowania komórek Müllera od myszy C57BL/6 typu dzikiego i myszy transgenicznych12,13. Do tego protokołu wykorzystuje się myszy w wieku od 5 do 11 dni, bez preferencji płciowych. Komórki zostały pasażowane do 4 razy; jednak w P4 przestają przylegać do kolby i trudno jest wyhodować zdrową kulturę. Hodowla jest często zanieczyszczona komórkami nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), dlatego komórki powinny być pasażowane co najmniej raz przed wykonaniem jakichkolwiek dodatkowych eksperymentów na linii komórkowej. Pasażowanie pozwala na dalszą izolację od zanieczyszczeń. W związku z tym przedstawiony protokół oferuje szybki i skuteczny sposób izolowania mysich komórek Müllera, który może być następnie wykorzystany jako niezawodna platforma do badania celów terapeutycznych i oceny potencjalnych metod leczenia chorób siatkówki14.

<table><tbody><tr><td>Zlewka : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV&nbsp;</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004188</tr><tr><td>Jednorazowe pipety z podziałką: 3,2 ml sterylne</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media do uprawy M&uuml; Komórki llera&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>Do kompletnych pożywek do hodowli komórek Müllera</td></tr><tr><td>Syntaza glutaminy</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Heracell VISO 160i</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Strzykawka z dołączoną igłą 21 G x 1 1/2 cala, sterylna, jednorazowego użytku, 3 ml</td><td>BD</td><td></td><td></td>309577</tr><tr><td>Mikro probówka wirówkowa: 2 ml</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>Do kompletnego M&uuml; Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna w buforze fosforanowym (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851. </td><td></td></tr><tr><td>Pęseta AP o pozytywnym działaniu, styl 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Iris Standard Prosta 11,5 cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall St8</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305</td><td>Mikroskop Zeiss</td><td>n/A</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne, #11, stal nierdzewna</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli w zawieszeniu 60mm x 15mm Styl</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych: 100x20mm styl</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Probówki: 15mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Tornado: 50mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta 5MS, 8.2cm, prosta, 0.09x0.05mm Końcówki</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Positive Action Style 5, Biologiczna, Dumostar, Polerowane wykończenie, 110 mm Mikroskopia elektronowa OAL</td><td>Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki, umiarkowane : 23" x 36"</td> <td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas - krawędź tnąca 2,5 mm</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych komórek glejowych müllera siatkówki myszy

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

Główną komórką podtrzymującą siatkówkę jest komórka Müllera glejowa siatkówki. Pokrywają one całą powierzchnię siatkówki i znajdują się w bliskiej odległości zarówno od naczyń krwionośnych siatkówki, jak i neuronów siatkówki. Ze względu na swój wzrost, komórki Müllera wykonują kilka kluczowych zadań w zdrowej siatkówce, w tym wychwyt i recykling neuroprzekaźników, związków kwasu retinowego i jonów (takich jak potas K+). Oprócz regulowania przepływu krwi i utrzymywania bariery krew-siatkówka, regulują również metabolizm i dostarczanie składników odżywczych do siatkówki. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono ustaloną procedurę izolowania pierwotnych mysich komórek Müllera. Aby lepiej zrozumieć podstawowe procesy molekularne związane z różnymi mysimi modelami zaburzeń oczu, doskonałym podejściem jest izolacja komórek Müllera. Niniejszy manuskrypt przedstawia szczegółową procedurę izolacji komórek Müllera od myszy. Od enukleacji do wysiewu cały proces trwa około kilku godzin. Przez 5-7 dni po wysiewie nie należy zmieniać podłoża, aby umożliwić wyizolowanym komórkom niezakłócony wzrost. Kolejnym krokiem jest charakterystyka komórek przy użyciu morfologii i odrębnych markerów immunofluorescencyjnych. Maksymalne przejścia dla komórek to 3-4 razy.

Walidacja swoistości, czystości i funkcji barierowej wyizolowanych komórek Müllera 
W celu potwierdzenia żywotności, morfologii i charakterystycznych cech wyizolowanych komórek Müllera, poddano je badaniu pod mikroskopem świetlnym. Zarejestrowano obrazy z pasażów P0 i P1 (Rycina 1A). Aby sprawdzić stopień zanieczyszczenia wyizolowanych komórek Müllera komórkami RPE i potwierdzić ich czystość, przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne (IF) z użyciem przeciwciał specyficznych dla markera komórek RPE, RPE65. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano ludzkie barwnikowe komórki siatkówki (ARPE-19). Komórki RPE wybarwione RPE65 (kolor czerwony, barwienie jąder na niebiesko) przedstawiono na Rycini 1B (panel dolny). Przeciwciała specyficzne dla RPE65 nie wybarwiły wyizolowanych komórek Müllera (Rycina 1B, panel górny). Fakt, że RPE65 wybarwił komórki ARPE-19 (czerwony), a nie wybarwił wyizolowanych komórek, wskazuje, że wyizolowane komórki nie są komórkami RPE. Obecność pirogronianu i niska zawartość glukozy w pożywce tworzą niekorzystne warunki dla wzrostu komórek RPE. W konsekwencji, nawet w przypadku zanieczyszczenia komórkami RPE, ulegną one z czasem odczepieniu od kolby.
Ponadto, aby potwierdzić tożsamość wyizolowanych komórek, zastosowano barwienie immunofluorescencyjne komórek Müllera przeciwko specyficznym markerom, co pozwoliło potwierdzić pomyślną izolację tych komórek. Wykorzystano białko filamentów pośrednich cytoszkieletu zwane wimentyną12,13. Dodatkowo wykorzystano syntetazę glutaminy (GS), która katalizuje reakcję kondensacji glutaminianu i amoniaku w celu utworzenia glutaminy, co stanowi kluczową funkcję glialnych komórek Müllera siatkówki5.
Ogólnie rzecz biorąc, wyizolowane komórki nie wykazały barwienia dla RPE65 (czerwony, Rysunek 1B), dodatnie pod kątem wimentyny (zielone, Rycina 1C) i GS (zielone, Rysunek 1D). Barwienie immunofluorescencyjne (IF) potwierdza pomyślną izolację (czystość i swoistość) wyizolowanych komórek Müllera. Rycina 1Ejest kontrolą negatywną dla wimentyny (panel górny) i GS (panel dolny), co potwierdza swoistość przeciwciał.
<img alt="Seria mikroskopowa hodowli komórkowych; barwienie markerów RPE65, wimentyny i GS; analiza różnicowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66237/66237fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Walidacja izolacji komórek Müllera (czystość i specyficzność). (A) Obraz z mikroskopii świetlnej dla morfologii pasaży: pasaż zero (P0) oraz (P1). (B) Immunobarwienie RPE65 w połączeniu z barwieniem jąder DAPI. (C) Immunobarwienie wimentyny z barwieniem jąder DAPI przy dużym powiększeniu. (D) Immunobarwienie GS przy tym samym dużym powiększeniu. (E) Kontrole negatywne w celu potwierdzenia specyficzności barwienia przeciwciałami przeciwko wimentyninie i GS. Pasek skali = odpowiednio 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66237/66237fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół izolowania komórek Müllera glejowych siatkówki od oczu myszy. Protokół rozpoczyna się od enukleacji i sekcji oczu myszy, po której następuje izolacja, wysiew i hodowla komórek Müllera.

Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

Komórki Müllera są głównymi komórkami glejowymi siatkówki. Odgrywają one bardzo ważną rolę w utrzymaniu wysoce aktywnych metabolicznie neuronów siatkówki. Nasze laboratorium opracowało technikę izolowania komórek Müllera z oczu myszy. Technika ta umożliwi badanie roli komórek Müllera w różnych chorobach siatkówki, zrozumienie patogenezy chorób, a także opracowanie celów terapeutycznych.[Narrator] Etycznie poddaj mysz eutanazji zgodnie z metodami zatwierdzonymi przez twoją instytucję. Wyłuszczenie oczu poprzez naciśnięcie pęsety w stylu 5/45 w obszarze oczodołu w celu wywołania wytrzeszcza, a następnie ekstrakcja oka poprzez ustawienie ramion pęsety w tylnej części oka, a następnie delikatne pociągnięcie od obszaru oczodołu. Umieść oczy w 10 ml roztworu do oczu Mullera i pozostaw je na noc lub na około 18 godzin w temperaturze pokojowej. Po 18 godzinach zdekantować roztwór do oczu, wylewając go z probówki i wyrzucić. Przemyć oczy podgrzaną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS. Ponownie zdekantować PBS, wylewając go z probówki, która ma zostać wyrzucona. Następnie umieść oczy na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 10 ml roztworu trypsyny. Umieść naczynie w inkubatorze i inkubuj przez 1,5 do 2 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po inkubacji przenieś oczy na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą około pięciu ml kompletnej pierwotnej pożywki do wzrostu komórek Müllera. Warto zauważyć, że film został nagrany na zewnątrz maski dla lepszej widoczności i wyraźnej demonstracji. W przypadku rzeczywistych eksperymentów należy je przeprowadzać w okapie z przepływem laminarnym, jak pokazano. Umieść oczy pod mikroskopem preparacyjnym i rozpocznij preparację. Użyj pęsety w stylu M5S i nożyczek Vannas, aby usunąć tkankę łączną, mięśnie zewnątrzgałkowe i nerw wzrokowy. Tutaj nerw wzrokowy jest cięty nożyczkami Vannas. Chwyć oko pęsetą w stylu M5S i wykonaj nacięcie w sekcji ora serrata nożyczkami Vannas lub igłą strzykawki. Chwyć nacięcie dwiema pęsetami w stylu M5S i zacznij ciągnąć lub odrywać rogówkę z tylnej części oka. Wprowadzaj małe przyrosty, aby upewnić się, że integralność siatkówki pozostaje nienaruszona. Oto demonstracja, jak usunąć rogówkę z tylnej części muszli ocznej. Po odsłonięciu soczewki i siatkówki nerwowej usuń pigmentowaną warstwę oka, do której prawdopodobnie przylega tęczówka. Następnie usuń siatkówkę nerwową z soczewki. Usuń wszelkie pigmentowane tkanki z siatkówki nerwowej, aby zwiększyć czystość izolacji. Biorąc pod uwagę lepką naturę siatkówki nerwowej, jest mało prawdopodobne, że usuniesz całą pigmentowaną tkankę. Zbierz wszystkie siatkówki nerwowe i rozerwij je na mniejsze kawałki. Umieść siatkówki nerwowe w kolbie T25 zawierającej cztery ml kompletnej pierwotnej pożywki do wzrostu komórek Müllera. Na koniec umieścić kolbę w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Panel A pokazuje zdrową hodowlę komórek Müllera w pasażu zerowym i pasażu pierwszym. Brak pigmentu wskazuje na brak komórek RPE, które są głównym zanieczyszczeniem w izolacji. Jest on wzmocniony w panelu B za pomocą RP65, znacznika specyficznego dla RP.

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie zademonstrujemy, jak izolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i hodować je in vitro w celu uzyskania klonalnych sfer siatkówkowych. Izolowane sfery posiadają kluczowe właściwości komórek macierzystych: zdolność do samoodnowy oraz wielopotencjalność.

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

Ten film pokazuje hodowlę komórek glejowych Müllera (MG) wyizolowanych z siatkówki myszy. Siatkówki są dysocjowane w zawiesinę jednokomórkową za pomocą enzymów trawiennych. Komórki są następnie hodowane w pożywce z czynnikiem wzrostu, który sprzyja proliferacji komórek MG i śmiertelności komórek neuronalnych. Martwe komórki neuronalne są usuwane podczas pasażowania, a komórki MG są hodowane w celu dalszej analizy.

Ustanowienie hodowli komórek glejowych Müllera uzyskanej z siatkówki myszy

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Tutaj opisujemy izolację komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej jelita za pomocą sekwencyjnych inkubacji EDTA do chelatowania kationów dwuwartościowych, a następnie inkubacji w nieenzymatycznym roztworze do odzyskiwania komórek. Posiewanie powstałej zawiesiny komórkowej na poli-D-lizynie i lamininie daje w wyniku wysoce wzbogaconą hodowlę komórek glejowych podśluzówkowych do analizy funkcjonalnej.

Izolacja komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej dorosłej myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Pierwotne kultury glejowe Müllera uzyskane z siatkówki myszy stanowią bardzo solidne i niezawodne narzędzie do badania konwersji gleju w komórki progenitorowe siatkówki po leczeniu mikroRNA. Pojedyncze cząsteczki lub ich kombinacje mogą być badane przed ich późniejszym zastosowaniem w metodach in vivo.

Pierwotne hodowle komórkowe w celu zbadania potencjału regeneracyjnego mysiego gleju Müllera po leczeniu mikroRNA

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolacji pierwotnych komórek Müllera siatkówki od noworodków szczurów Sprague-Dawley (SD). Procedura obejmuje wyłuszczenie gałek ocznych, wypreparowanie tkanki siatkówki, ekstrakcję i identyfikację komórek oraz kluczowe kwestie dotyczące późniejszej hodowli komórek.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek Müllera siatkówki od szczurów Sprague-Dawley (SD)

Naucz się izolować pierwotne komórki glejowe Müllera siatkówki myszy. Ta metoda umożliwia badanie roli tych komórek w chorobach siatkówki i rozwój terapii.

Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów