Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół izolowania komórek Müllera glejowych siatkówki od oczu myszy. Protokół rozpoczyna się od enukleacji i sekcji oczu myszy, po której następuje izolacja, wysiew i hodowla komórek Müllera.

Komórki Müllera są głównymi komórkami glejowymi siatkówki. Odgrywają one bardzo ważną rolę w utrzymaniu wysoce aktywnych metabolicznie neuronów siatkówki. Nasze laboratorium opracowało technikę izolowania komórek Müllera z oczu myszy. Technika ta umożliwi badanie roli komórek Müllera w różnych chorobach siatkówki, zrozumienie patogenezy chorób, a także opracowanie celów terapeutycznych.

[Narrator] Etycznie poddaj mysz eutanazji zgodnie z metodami zatwierdzonymi przez twoją instytucję. Wyłuszczenie oczu poprzez naciśnięcie pęsety w stylu 5/45 w obszarze oczodołu w celu wywołania wytrzeszcza, a następnie ekstrakcja oka poprzez ustawienie ramion pęsety w tylnej części oka, a następnie delikatne pociągnięcie od obszaru oczodołu. Umieść oczy w 10 ml roztworu do oczu Mullera i pozostaw je na noc lub na około 18 godzin w temperaturze pokojowej. Po 18 godzinach zdekantować roztwór do oczu, wylewając go z probówki i wyrzucić. Przemyć oczy podgrzaną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS. Ponownie zdekantować PBS, wylewając go z probówki, która ma zostać wyrzucona. Następnie umieść oczy na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 10 ml roztworu trypsyny. Umieść naczynie w inkubatorze i inkubuj przez 1,5 do 2 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po inkubacji przenieś oczy na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą około pięciu ml kompletnej pierwotnej pożywki do wzrostu komórek Müllera. Warto zauważyć, że film został nagrany na zewnątrz maski dla lepszej widoczności i wyraźnej demonstracji. W przypadku rzeczywistych eksperymentów należy je przeprowadzać w okapie z przepływem laminarnym, jak pokazano. Umieść oczy pod mikroskopem preparacyjnym i rozpocznij preparację. Użyj pęsety w stylu M5S i nożyczek Vannas, aby usunąć tkankę łączną, mięśnie zewnątrzgałkowe i nerw wzrokowy. Tutaj nerw wzrokowy jest cięty nożyczkami Vannas. Chwyć oko pęsetą w stylu M5S i wykonaj nacięcie w sekcji ora serrata nożyczkami Vannas lub igłą strzykawki. Chwyć nacięcie dwiema pęsetami w stylu M5S i zacznij ciągnąć lub odrywać rogówkę z tylnej części oka. Wprowadzaj małe przyrosty, aby upewnić się, że integralność siatkówki pozostaje nienaruszona. Oto demonstracja, jak usunąć rogówkę z tylnej części muszli ocznej. Po odsłonięciu soczewki i siatkówki nerwowej usuń pigmentowaną warstwę oka, do której prawdopodobnie przylega tęczówka. Następnie usuń siatkówkę nerwową z soczewki. Usuń wszelkie pigmentowane tkanki z siatkówki nerwowej, aby zwiększyć czystość izolacji. Biorąc pod uwagę lepką naturę siatkówki nerwowej, jest mało prawdopodobne, że usuniesz całą pigmentowaną tkankę. Zbierz wszystkie siatkówki nerwowe i rozerwij je na mniejsze kawałki. Umieść siatkówki nerwowe w kolbie T25 zawierającej cztery ml kompletnej pierwotnej pożywki do wzrostu komórek Müllera. Na koniec umieścić kolbę w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Panel A pokazuje zdrową hodowlę komórek Müllera w pasażu zerowym i pasażu pierwszym. Brak pigmentu wskazuje na brak komórek RPE, które są głównym zanieczyszczeniem w izolacji. Jest on wzmocniony w panelu B za pomocą RP65, znacznika specyficznego dla RP.