Technologia 2D-HPLC-MS połączona z siecią molekularną do identyfikacji składników w medycynie tybetańskiej Tojad wahadłowy

W tym badaniu zastosowaliśmy kompleksowe podejście wykorzystujące technologię 2D-HPLC-MS w połączeniu z sieciami molekularnymi, aby ujawnić skomplikowany skład chemiczny tybetańskiej rośliny leczniczej APB. Naszym celem jest opracowanie skuteczniejszej metody określania składu chemicznego leków naturalnych. Głównym wyzwaniem obecnych eksperymentów jest to, że sekcja spektrometrii mas nie jest wyposażona w spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości, co skutkuje detekcją mniejszej liczby składników.

2D-LC-MS umożliwia dokładniejszą identyfikację i kwantyfikację złożonych mieszanin złożonych w oparciu o separację próbek w połączeniu z technologią sieci molekularnych, może lepiej przetwarzać złożone informacje o danych oraz poprawiać wydajność i dokładność analizy. Nasze laboratorium koncentruje się na stosowaniu istniejących technologii, aby uzyskać separację naturalnych medycznych składników chemicznych. Przygotowanie próbki należy rozpocząć od zważenia tulei wahadła Aconitum lub APB.

Używając wagi o czułości 1 na 10 000, zważ 0,25 grama suchego APB w trzymililitrowej probówce mikrowirówkowej. Dodaj do niego 2,5 mililitra metanolu, a następnie sonikuj przez 30 minut z mocą 240 watów i częstotliwością 40 kiloherców. Odwirować sonifikowaną próbkę o sile 1,2 G przez pięć minut i zebrać supernatant.

Przefiltruj go przez filtr membranowy o grubości 0,22 mikrona. Następnie przygotuj dwuwymiarową fazę ruchomą, używając acetonitrylu jako fazy organicznej lub fazy B i ultraczystej wody zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego jako fazy wodnej lub fazy A. Po wykonaniu filtracji dwufazowej przez filtr 0,22 mikrona, poddaj fazy ruchome ultradźwiękowej sonikacji o częstotliwości 40 kiloherców przez 15 minut. Oczyść wymienioną fazę ruchomą, aby usunąć pęcherzyki.

Wybierz kolumnę C18 jako kolumnę 1D i kolumnę hydrofilową jako kolumnę 2D i zamontuj je na instrumencie. Aby wyregulować odpowiedni współczynnik bocznikowy, podłącz obrys przyrządu 2D-LC przez T do wlotu masy, a drugi koniec T do linii bocznikowej. Dostosuj natężenie przepływu do odpowiedniej wartości, aby zapewnić odpowiednie natężenie przepływu dla widma masowego.

Aby rozpocząć chromatografię cieczową 2D-Liquid lub 2D-LC, kliknij dwukrotnie ikonę urządzenia w trybie online, a chemiczna stacja robocza automatycznie pokomunikuje się z 1260LC i wejdzie do stacji roboczej. Aby ustawić parametr metody 2D-LC, kliknij moduł wtryskiwacza, kliknij prawym przyciskiem myszy Metoda i ustaw natężenie przepływu objętości wtrysku i gradient czasu fazy ruchomej na pompę 1D. Wprowadź przykładowe środowisko uruchomieniowe w obszarze Czas zatrzymania.

Kliknij instrument menu głównego i kliknij Metoda 2D-LC w menu rozwijanym. Wybierz opcję Wszechstronny w trybie 2D-LC. Wprowadź dwie minuty w czasie modulacji i 1,9 minuty w czasie zatrzymania gradientu 2D.

Ustaw ustawienia przepływu na dwa mililitry. Edytuj gradient 2D i ustaw długości fal. Po edycji metody wybierz Zapisz metodę jako w menu metody, aby nazwać nową metodę, a następnie kliknij OK.To rozpocząć, włącz przełącznik pompy próżniowej, otwórz główny zawór butli z argonem i zawór rozdzielacza ciśnienia i dostosuj ciśnienie do około 0,3 megapaskali .

Aby skonfigurować metodę MS, wprowadź czas wykonywania w ciągu kilku minut do 93,00 i wprowadź wartości, aby skonfigurować czas akwizycji, polaryzację, zakres masy, liczbę wartości transferu, czas trwania wartości transferu i inne. Skonfiguruj szczegóły zdarzenia skanowania zgodnie z wartościami wyświetlanymi na ekranie. Aby skonfigurować ustawienia zależne od danych, użyj oddzielnych ustawień polaryzacji jako wyłączonych.

Ustaw neutralną stratę w zakresie od góry do trzech, a listę masy produktu w zakresie od góry do trzech. Zapisz, aby skonfigurować ustawienia jako metodę instrumentu. Kliknij przycisk Ustawienia sekwencji, aby otworzyć tabelę sekwencji.

Wprowadź typ próbki, nazwę pliku, ścieżkę, identyfikator próbki, metodę urządzenia, lokalizację, ilość wstrzyknięcia i inne informacje w formularzu. Zapisz informacje, aby nagrać listę sekwencji. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij analizę, aby skonfigurować i rozpocząć akwizycję MS.

Aby rozpocząć przygotowanie danych, należy wyeksportować surowe dane spektralne mas 2D-HPLC-MS. Następnie, aby połączyć się z serwerem FTP GNPS, w interfejsie WIN SCP na stronie Session Configuration (Konfiguracja sesji) wprowadź informacje o połączeniu. Po wypełnieniu informacji kliknij przycisk Start, aby nawiązać połączenie z serwerem FTP GNPS.

Twórz sieci molekularne, otwierając przeglądarkę internetową i odwiedzając stronę internetową GNPS. Nowi użytkownicy muszą założyć konto, a następnie zalogować się. W głównym interfejsie strony internetowej GNPS kliknij Utwórz sieć molekularną w obszarze Analiza danych.

Na stronie tworzenia zadania kliknij przycisk Wybierz pliki wejściowe, a następnie wybierz i przekaż plik danych. Na kartach Opcja przepływu pracy ustaw różne parametry, które generują sieć molekularną lub MN. Parametry te obejmują algorytm wyodrębniania pików, wartość piku nad wartością ruchu, metodę obliczania podobieństwa i tak dalej. Po wprowadzeniu odpowiednich ustawień parametrów zgodnie z potrzebami kliknij przycisk Prześlij u dołu strony, aby uruchomić zadanie.

Po uruchomieniu zadania znajdź utworzone zadania na karcie Zadania i kliknij nazwę przepływu pracy, aby wyświetlić wyniki analizy. Witryna zawiera diagramy MN, substytuty, sieci symbiotyczne i inne powiązane informacje. Cztery składniki alkaloidowe w próbkach APB zidentyfikowanych przez MN to akonityna, 14-benzoiloakonina, 14-oecetalnelen i hipokonatyna.

Cztery związki miały to samo jądro macierzyste. Tojadyna, 14-benzoiloakonina, 14-benzoiloakonina i hipokonatyna były podobne, a różniły się tylko podstawniki.