Name: Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj nowy model myszy C57BL/6J do badania endometriomy i związanej z nią niepłodności. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy patofizjologiczne i wspiera rozwój terapii w medycynie rozrodczej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to jest finansowane w ramach programu badawczego opartego na tematyce przyznanego przez Radę ds. Grantów Badawczych rządu Hongkongu Specjalnego Regionu Administracyjnego (T13-602/21-N).

Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone i uregulowane zgodnie z protokołem nr 21-203-MIS_[C] przez Komitet Etyczny Chińskiego Uniwersytetu w Hongkongu.
1. Aklimatyzacja i selekcja zwierząt
<ol>
	<li>Przygotowanie myszy<ol>
		<li>Zdobądź 18 myszy C57BL/6J (pierwiastki żeńskie, 8-9 tygodniowe: 6 dawców, 12 biorców) od renomowanego dostawcy. Sprawdź świadectwa zdrowia.</li>
		<li>Utrzymuj wszystkie myszy w kontrolowanym środowisku mieszkaniowym: 22-24 °C, poziom wilgotności od 40% do 60%, przy 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Używaj powietrza przefiltrowanego przez HEPA, jeśli jest dostępne.</li>
		<li>Pozwól myszom na 72-godzinną aklimatyzację z ciągłym dostępem do pożywienia i wody, minimalizując interakcję człowieka w celu zmniejszenia stresu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synchronizacja cyklu rujowego<ol>
		<li>Zbieraj ściółkę zawierającą męskie feromony; Wprowadzaj go do klatek dla samic na 48 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytologia pochwy<ol>
		<li>Wykonaj cytologię pochwy następnego dnia rano. UWAGA: Konieczne jest wykonywanie wymazu o stałej porze dnia, zwykle o 9:00.<ol>
			<li>Przygotuj wcześniej waciki dwugłowe, autoklawowany PBS, szalkę Petriego 35 mm i szkiełka podstawowe. Dozować 10 ml PBS na szalkę Petriego. Zanurz jeden koniec bawełnianego wacika w PBS, aby mógł wchłonąć płyn.</li>
			<li>Delikatnie wyjmij jedną mysz z klatki i umieść ją na pokrywie pustej klatki.</li>
			<li>Chwyć ogon kciukiem i palcem wskazującym jednej ręki, a drugą ręką weź zwilżony bawełniany wacik i delikatnie włóż go do pochwy myszy. Ostrożnie włóż końcówkę patyczka do wacików na głębokość około 1.0 cm do pochwy myszy. Delikatnie obróć wacik, zachowując kąt około 45° do długiej osi ciała zwierzęcia. UWAGA: Powolne obracanie wacika podczas wprowadzania może ułatwić płynniejszą procedurę i zminimalizować potencjalną stymulację szyjki macicy.</li>
			<li>Delikatnie usuń komórki ze światła i ścian pochwy, ciągle obracając wacik, a następnie ostrożnie wyjmij wacik. UWAGA: Podczas tego procesu upewnij się, że wacik jest stale obracany, uważając, aby nie zetknąć się z otaczającymi włosami. Następnie ostrożnie wyjmij wacik, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia.</li>
			<li>Przenieś zebrane komórki, delikatnie zwijając końcówkę wacika na czyste, wstępnie oznaczone szklane szkiełko. UWAGA: Patyczek do wacików należy wyrzucić po przeniesieniu komórek na szkiełka, a dla każdego zwierzęcia należy użyć nowego.</li>
			<li>Sprawdź szkiełka pod mikroskopem, aby wykryć zrogowaciałe komórki nabłonka. Zwróć uwagę na jednolitą obecność zrogowaciałych komórek nabłonka w cytologii pochwy, co wskazuje na stadium rui. Rób zdjęcia i zapisuj obserwacje. UWAGA: Przy odpowiedniej wiedzy barwienie wymazów z pochwy nie jest konieczne. Jeśli jednak eksperymentator nie może "odczytać" rozmazów bez ich zabarwienia, jest to konieczne.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ustalenie modelu endometrioma
UWAGA: Myszy wybieraj tylko w stadium rui jako myszy dawcę i biorcę w układzie modelowym. Wykonując eksperymenty na jednej myszy, upewnij się, że jest ona poza zasięgiem wzroku innych i nie jest ponownie wprowadzana do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostanie całkowicie wyleczona. Schemat generowania modelu można znaleźć na rysunku 1.
<ol>
	<li>Przygotowanie tkanki dawcy<ol>
		<li>Uspokój myszy dawców kombinacją ketaminy (75 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Poddaj eutanazji myszy dawcy przez translokację szyjki macicy w znieczuleniu.</li>
		<li>Zdezynfekuj okolice brzucha wacikiem z 70% etanolu.</li>
		<li>Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać nacięcie (1 cm) wzdłuż linii środkowej otrzewnej, aby odsłonić warstwę mięśniową. Wybierz inną parę nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć warstwę mięśniową i odsłonić jamę miednicy.</li>
		<li>Zamknij końcówki kleszczy i delikatnie unieś jelita za pomocą części środkowej.</li>
		<li>Zlokalizuj macicę i tkanki jajnika. Przeprowadź sterylną sekcję całego rogu macicy, w tym obu rogów macicy, upewniając się, że przybliżony rozmiar usuwanego fragmentu wynosi ~1,5 cm długości. Umieść wycięte tkanki na szalce Petriego zawierającej PBS i usuń nadmiar tkanki tłuszczowej.</li>
		<li>Drobno rozetnij tkanki na kawałki o wielkości 1 mm³ za pomocą wysterylizowanego skalpela. Utrzymuj tkanki wilgotne, okresowo dodając PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura transplantacji<ol>
		<li>Znieczulić myszy biorcę mieszaniną ketaminy (75 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).</li>
		<li>Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu. Umieść myszy w pozycji leżącej na sterylnej desce chirurgicznej.</li>
		<li>Określ miejsce operacji, delikatnie manipulując tylnymi nogami myszy, z wyczuwalną pod skórą kościstą wypukłością. Ten punkt wypukłości, wyraźnie widoczny przez skórę, służy jako wiarygodny marker anatomiczny dla jajników myszy biorcy podczas zabiegu chirurgicznego.</li>
		<li>Ogolić miejsce operacji, upewniając się, że 150% otaczającego go obszaru jest oczyszczone z sierści. Następnie zdezynfekuj skórę naprzemiennie porcjami betadyny i 70% alkoholu co najmniej 3 razy. Użyj sterylnej serwety chirurgicznej, aby zapobiec kontaktowi tkanek, sterylnych narzędzi i szwów z pozostałym futrem. Na koniec wykonaj precyzyjne nacięcie boczne (3-5 mm) w określonym wcześniej miejscu operacji.</li>
		<li>Ustabilizuj jajnik za pomocą niedominujących kleszczy ręcznych. Delikatnie wstrzyknąć 100 μl PBS do kaletki jajnika, obserwując niewielką separację.</li>
		<li>Stwórz maleńką szczelinę w kaletce. Przeszczep fragmenty tkanki macicy (1 mm³) za pomocą mikrokleszczy. UWAGA: Unikaj nadmiernego wypełniania, aby zapobiec naciskowi na otaczające tkanki.</li>
		<li>W przypadku operacji pozorowanej powtórz wszystkie kroki z wyjątkiem kroku 2.2.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opieka pooperacyjna<ol>
		<li>Zszyj warstwy mięśni szwami wchłanialnymi (tj. 5-0 vicryl), a skórę szwami niewchłanialnymi (tj. nylonem 5-0).</li>
		<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C, aż powróci pełna świadomość. Monitoruj oddech i poczekaj, aż kończyny zmienią kolor na różowy.</li>
		<li>Buprenorfinę (0,1 mg/kg mc., podskórnie) należy podawać na ból co 12 godzin przez 48 godzin. Sprawdzaj, czy nie ma oznak bólu, infekcji lub niepokoju co 8 godzin przez pierwsze 24 godziny, a następnie 3 razy dziennie przez następne 3 dni. UWAGA: Zwierzę nie jest pozostawione bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżenie mostka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Walidacja modelu
<ol>
	<li>Walidacja brutto<ol>
		<li>Po 4 tygodniach znieczulij myszy biorcy za pomocą kombinacji ketaminy (75 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg). Następnie, w głębokiej narkozy, poddaj myszy eutanazji, wykonując translokację szyjki macicy.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej i odsłoń jamę brzuszną w celu zbadania narządów.</li>
		<li>Usuń jajniki z widocznymi zmianami i zrób zdjęcia.</li>
		<li>Dokładnie sprawdź, czy nie ma zewnętrznych zmian endometriowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Walidacja histologiczna UWAGA: Ze względu na obecność w doświadczeniach histologicznych potencjalnie drażniących rozpuszczalników zapachowych, należy je przeprowadzić w dygestorium.<ol>
		<li>Napraw jajniki razem ze zmianami w 10% neutralnie buforowanej formalinie.</li>
		<li>Przetwarzaj tkanki zgodnie z tymi samymi procedurami, które opisano przez Adeniran i wsp.37, w tym alokacją tkanek, utrwalaniem i osadzaniem.</li>
		<li>Tkanki należy szeregowo ciąć na grubość 4-5 μm, unosić się w łaźni wodnej w temperaturze 45 °C i montować na szkiełkach podstawowych. Wyraźnie oznacz slajdy numerem myszy, stroną jajnika i numerem sekcji. Suszyć przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Barwienie PAS-hematoksyliną<ol>
			<li>Deparafinizacja: Umieść szkiełka w ksylenie lub substytucie ksylenu, aby usunąć parafinę. UWAGA: Może być konieczne wykonanie tego kroku kilka razy.</li>
			<li>Nawadnianie: Stopniowo nawadniaj skrawki tkanki, umieszczając szkiełka w serii zmniejszających się stężeń etanolu (100%, 95%, 80%, 70%).</li>
			<li>Okresowe leczenie kwasem: Przykryj skrawki tkanki 1% roztworem kwasu okresowego i pozostaw je na 5-10 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: Ten etap utlenia grupy glikolowe tkanki do grup aldehydowych, umożliwiając reakcję z odczynnikiem Schiffa i powstanie fioletowo-różowego barwnika wskazującego na struktury jajników.</li>
			<li>Dokładnie wypłucz szkiełka wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości kwasu okresowego.</li>
			<li>Wybarwieć skrawki tkanki roztworem Schiffa przez 15 minut.</li>
			<li>Najpierw opłucz szkiełka w gorącej bieżącej wodzie z kranu, aby usunąć nadmiar plam, a następnie w wodzie destylowanej.</li>
			<li>Przeciwbarwić skrawki 1 g/l hematoksyliny Meyera przez 2-3 minuty.</li>
			<li>Płucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 2-3 minuty.</li>
			<li>Zastosuj odczynnik do niebieszczenia przez 30 sekund.</li>
			<li>Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej.</li>
			<li>Stopniowo odwadniaj sekcje, zanurzając je w rosnących stężeniach etanolu (70%, 80%, 95% i 100%).</li>
			<li>Zanurz sekcje w środku czyszczącym (np. ksylenie), aby były przezroczyste.</li>
			<li>Nałóż medium montażowe na sekcje na szkiełkach i delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na sekcje, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu w kapturze, aby ułatwić zestalenie się medium mocującego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbadaj pod mikroskopem świetlnym. Udokumentuj obecność gruczołów endometrialnych, zrębu i torbieli krwotocznych potwierdzających endometriozę w jajniku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Development of a Novel Endometrioma-Simulating Mouse Model

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Rozpowszechnienie OMA w globalnej populacji kobiet podkreśla poważny problem zdrowotny38. Poza ogólnymi objawami endometriozy, OMA niesie ze sobą dodatkowe wyzwania dla płodności, w tym silny ból miednicy, możliwość skrętu jajnika i inne godne uwagi implikacje39,40. Podczas gdy zrozumienie patogenezy i progresji OMA jest w dużej mierze owiane tajemnicą, próżnia wiedzy nie tylko utrudnia formułowanie ukierunkowanych strategii terapeutycznych, ale także oznacza, że wiele kobiet nadal cierpi z powodu nieoptymalnych metod leczenia i nawracających objawów. Decyzja wielu współczesnych kobiet o odłożeniu ciąży jeszcze bardziej zwiększa obawy związane z płodnością związaną z OMA, co sprawia, że jeszcze ważniejsze jest kompleksowe zrozumienie i zajęcie się jej patofizjologią.
Historycznie rzecz biorąc, jedną z najważniejszych przeszkód na drodze do pogłębienia naszej wiedzy na temat OMA był brak zdecydowanego i dokładnego modelu zwierzęcego. Chociaż w przeszłości badano kilka modeli, często nie były one w stanie odtworzyć specyfiki OMA lub wprowadzić dodatkowych zmiennych zakłócających ze względu na manifestację zmian w narządach innych niż jajniki41. Opracowaliśmy model mysi w celu replikacji OMA i lepszego zrozumienia choroby. Nasza technika chirurgiczna polegała na wszczepieniu zmielonych tkanek macicy do kaletki jajnika myszy, aby zapewnić rozwój zmian endometriotycznych w jajnikach. Ścisłe monitorowanie po operacji pozwoliło nam ocenić postęp OMA i zapewnić dobre samopoczucie myszy. Aby zwiększyć przydatność modelu, pozostawiliśmy kaletkę jajnika w stanie nienaruszonym, zamiast ją usuwać. Zmiana ta miała na celu zapobieżenie przeciekaniu implantów do innych narządów oraz zapewnienie specyficznej lokalizacji zmian w jajnikach. Dodatkowo zajęliśmy się potencjalnymi powikłaniami, takimi jak krwawienie lub infekcja, podczas zabiegu. W tym badaniu barwienie PAS zastosowano do wykrycia obecności śluzu, co jest powszechnie wykonywane w celu oceny histologii pęcherzyków jajnikowych42,43. Identyfikacja pęcherzyków akretycznych w odcinkach jajników przylegających do zmiany endometriotycznej jest kluczowym dowodem na to, jak endometrioza negatywnie wpływa na rozwój pęcherzyków 43,44,45. Odkrycie to ma istotne znaczenie dla dalszych badań nad niepłodnością związaną z endometrioma, co potwierdza nasz model. Włączenie walidacji histologicznej pozwoliło na kompleksowe zrozumienie zmian patologicznych związanych z endometriozą w naszym modelu. To włączenie wzmacnia wiarygodność i znaczenie naszych ustaleń oraz pomaga w ustaleniu związku między endometriozą a dysfunkcją jajników. Ważne jest również, aby zdać sobie sprawę z ograniczeń naszej techniki. Chociaż model ten z powodzeniem odtworzył zmiany w jajnikach związane z OMA, może nie uchwycić w pełni złożoności endometriozy. Przekładanie wyników z modeli zwierzęcych na ludzkie ma nieodłączne ograniczenia wynikające z różnic międzygatunkowych.
W przeciwieństwie do tego, badanie to opiera się na wcześniejszych badaniach nad mysimi modelami endometriozy jajników, w których przeprowadzono podobną procedurę wszczepienia rogów macicy do jajników46. Istnieją jednak znaczące różnice między tą metodą a poprzednimi modelami. Po pierwsze, model ten tworzy zmiany wyłącznie na jajnikach, podczas gdy poprzedni model wykazywał zmiany endometriotyczne również w innych narządach, a nie tylko w jajnikach. To rozróżnienie sprawia, że ich model z większym prawdopodobieństwem naśladuje połączone podtypy endometriozy, a nie jest specyficzny dla OMA. Nasza ukierunkowana manifestacja umożliwia naukowcom skoncentrowanie się na niuansach OMA bez mylącego wpływu zmian w innych narządach. Pokonując te ograniczenia, nasz model zapewnia dokładniejsze odwzorowanie OMA i służy jako solidna platforma dla przyszłych badań. Po drugie, model ten wykazuje godny pochwały wskaźnik sukcesu wynoszący 83% w odzwierciedlaniu OMA, zapewniając wysoką wierność w odtwarzaniu choroby.
Warto zauważyć, że nawrót OMA jest poważnym problemem, ponieważ wiele kobiet doświadcza nawracających objawów nawet po początkowych interwencjach terapeutycznych. W kilku badaniach oceniano nawroty endometriozy i testy diagnostyczne w tym kontekście. Na przykład Yildiz i wsp. omówili zastosowanie ultrasonografii przezpochwowej jako narzędzia diagnostycznego do wykrywania określonych markerów i wzorców ultrasonograficznych w celu dokładnej diagnozy i monitorowania nawrotu47. Inne badanie koncentrowało się na długoterminowej obserwacji kobiet z endometriozą i oceniano częstość nawrotów po leczeniu chirurgicznym48. Badanie to podkreśla znaczenie zindywidualizowanych strategii leczenia opartych na charakterystyce choroby i czynnikach pacjenta w celu zminimalizowania ryzyka nawrotu. Ponadto niektórzy badacze zbadali potencjał krążących biomarkerów w przewidywaniu nawrotu endometriozy49. W badaniu zbadano specyficzne markery molekularne i ich związek z nawrotem choroby, dostarczając informacji na temat rozwoju nieinwazyjnych testów diagnostycznych i spersonalizowanych podejść do leczenia. Badania te podkreślają nieustanne wysiłki mające na celu zrozumienie i rozwiązanie problemu nawrotów endometriozy oraz opracowanie testów diagnostycznych w celu poprawy wyników leczenia pacjentek. Włączenie wiedzy z tych badań do naszych badań na mysim modelu OMA może przyczynić się do kompleksowego zrozumienia choroby, wzorców nawrotów i potencjalnych strategii diagnostycznych w zakresie monitorowania i leczenia OMA.
Podsumowując, stworzenie tego specyficznego mysiego modelu OMA służy jako kamień węgielny nowej ery badań w dziedzinie endometriozy. Wypełniając długotrwałą lukę, obiecuje kaskadę spostrzeżeń i przełomów, które mogą zrewolucjonizować sposób, w jaki rozumiemy, leczymy i potencjalnie zapobiegamy endometriomie, prowadząc do lepszych wyników klinicznych i poprawy jakości życia kobiet dotkniętych chorobą. Co ważne, porównując tę metodę z poprzednimi modelami OMA i uwzględniając wyniki badań nad nawrotami endometriozy i testami diagnostycznymi, możemy jeszcze bardziej zwiększyć znaczenie i możliwość zastosowania naszych badań w szerszym kontekście badań nad endometriozą i opieki nad pacjentką.

Endometrioma (OMA) jest najbardziej dominującym podtypem endometriozy, obserwowanym u około 17-44% osób, u których zdiagnozowano endometriozę 1,2. Charakteryzuje się powstawaniem torbieli endometriotycznych w obrębie jajników. Torbiele te, potocznie nazywane "torbielami czekoladowymi", swoją nazwę zawdzięczają charakterystycznej brązowej, smolistej konsystencji3. Oprócz OMA, endometrioza może również objawiać się jako endometrioza powierzchowna otrzewnowej (SUP) i endometrioza głęboko naciekająca (DIE). SUP odnosi się do zmian na błonie śluzowej otrzewnej, podczas gdy DIE odnosi się do zmian penetrujących więcej niż 5 mm pod powierzchnią otrzewnej4. Niejednorodność lokalizacji, wyglądu i głębokości zmian między tymi podtypami endometriozy skutkuje zróżnicowanymi objawami klinicznymi i zmiennym nasileniem choroby 5,6. OMA jest szczególnie związana z cięższymi stadiami endometriozy i jest zaangażowana w niepłodność, zrosty miednicy mniejszej i zwiększone ryzyko raka jajnika 1,7,8,9.
Związek endometriozy, zwłaszcza OMA, z niepłodnością jest kwestią kliniczną budzącą poważne zaniepokojenie. Endometrioza występuje u 25-50% niepłodnych kobiet, przy czym 30-50% kobiet, u których zdiagnozowano endometriozę, doświadcza niepłodności 10,11,12,13,14. Chociaż dokładne mechanizmy niepłodności związane z OMA pozostają nieuchwytne, postawiono pewne hipotezy. Jedna z nich sugeruje, że endometrioza prowadzi do przewlekłego stanu zapalnego, który może zakłócić normalne funkcjonowanie jajników i pogorszyć jakość oocytów15,16. Inny sugeruje nieprawidłowe przeciążenie żelazem w płynie pęcherzykowym jajników, co uważa się za związane z zaburzeniami dojrzewania oocytów14. Inne badania dotyczą zakłóceń w regulacji hormonalnej17, jakości oocytów18 i rozwoju zarodka19.
Historycznie rzecz biorąc, modele gryzoni odegrały kluczową rolę w pogłębieniu naszej wiedzy na temat endometriozy, szczególnie w badaniu jej patologii, wpływu na płodność i mechanizmy bólu 20,21,22,23. Gryzonie, zwłaszcza szczury i myszy, były szeroko wykorzystywane jako modele zwierzęce do badania związków przyczynowo-skutkowych, mechanizmów leżących u podstaw, potencjalnych technik diagnostycznych i interwencji terapeutycznych w tej chorobie 22,24,25,26. Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że wszystkie modele zwierzęce mają swoje specyficzne zastosowania i ograniczenia. Wybór konkretnego modelu zależy od konkretnego wyniku lub aspektu, który jest mierzony lub badany27. Na przykład model szczurzy wykazał, że stres może nasilać objawy endometriozy i wpływać na parametry zapalne, dostarczając informacji na temat potencjalnych czynników wywołujących chorobę28.
W kontekście badań nad endometriozą stosuje się różne modele gryzoni. Jednym z powszechnie stosowanych podejść jest model homologiczny, który polega na przeszczepieniu tkanki macicy gryzonia do jamy otrzewnej lub naczyń krezkowych tego samego gatunku29. Model ten oferuje korzyści pod względem kompetencji immunologicznej i przydatności do badań długoterminowych30. Ograniczenia wynikają jednak z częściowej rozbieżności między zagnieżdżoną ektopową tkanką macicy myszy a charakterystyką zmian endometriotycznychu ludzi 31. Innym podejściem jest model heterologiczny, w którym ludzka biopsja endometrium jest wszczepiana myszy z obniżoną odpornością32. Model ten pozwala na wykorzystanie ludzkiego ektopowego endometrium jako tkanki dawcy do rozwoju zmiany, zapewniając konstruktywną trafność32. Opiera się jednak na myszach z obniżoną odpornością jako biorcach, co utrudnia kompleksową ocenę odpowiedzi immunologicznych zaangażowanych w etiologię zaburzenia33. Niemniej jednak ważne jest, aby przyznać, że istniejące modele koncentrują się przede wszystkim na odzwierciedleniu uogólnionego stanu SUP, nieodpowiednio oddając unikalne cechy OMA i DIE34. Obecnie istnieje niedostatek konkretnych modeli dostępnych do badania DIE, istnieje tylko kilka modeli, w tym niedawny model gryzoni opracowany przez Yana i wsp.35. Ten niedobór podkreśla potrzebę dalszych badań i rozwoju modeli, które dokładnie oddają specyficzne cechy DIE. Ponadto nasze zrozumienie OMA, a zwłaszcza jej zniuansowanego związku z płodnością, również pozostaje ograniczone26,36.
Odnosząc się do istniejących wyzwań, w niniejszym artykule przedstawiono nowatorski eksperymentalny homologiczny model myszy, zaprojektowany w celu specyficznej symulacji OMA. Ma on na celu dostarczenie unikalnych informacji na temat patologicznych mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z OMA, wypełniając w ten sposób lukę w wiedzy w tej kluczowej dziedzinie medycyny reprodukcyjnej. Krótko mówiąc, myszy C57BL/6J wykorzystano ze względu na ich cechy reprodukcyjne podobne do ludzkich. Po synchronizacji cyklu rujowego tkanki macicy myszy dawców zostały rozdrobnione i przeszczepione do kaletki jajnikowej myszy biorczyni w stosunku 1:2. Po 4-tygodniowym odstępie przeprowadzono zarówno badania morfologiczne, jak i histologiczne zmian w jajnikach w celu potwierdzenia obecności OMA i oceny związanego z nim atrezji pęcherzykowej. Z 83% skutecznością, model ten oferuje naukowcom niezawodną platformę do badań OMA, kładąc nacisk na rozwój zmian chorobowych w szczególności w jajnikach w celu przeprowadzenia ukierunkowanych badań.

<table><tbody><tr><td>1 strzykawka o pojemności 1 ml z igłą 25 G</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>301320</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Naczynie do hodowli tkankowych</td><td>SOKÓŁ</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>10% buforowana formalina</td><td>Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Igła 30 G</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>305107</td><td></td></tr><tr><td>5-0 pleciony jedwabny niewchłanialny szew</td><td>Ethicon Inc.</td><td>Szer. 500H</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepne szkiełka mikroskopowe</td><td>Lotnisko Marienfeld</td><td>810401</td><td></td></tr><tr><td>Wstrzyknięcie buprenorfiny&nbsp;</td><td>Med-Vet Międzynarodowy</td><td>RXBUPRENOR5</td><td></td></tr><tr><td>Wacik bawełniany dwugłowy</td><td>SANYO Co., Sp. z o.o.</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Alfasan International b.v</td><td>2203095-08</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurki</td><td>Corning&nbsp;</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę</td><td>Korporacja Excelta</td><td>2827-NH-35-SE-ND</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Główne farmaceutyki</td><td>10033691</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia kwasem okresowym Schiffa (PAS)&nbsp;</td><td>Księga Abcam</td><td>Zobacz materiał AB150680</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne rękawiczki bezpudrowe</td><td>Fisher Naukowy</td><td>19020558</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do przetwarzania/zatapiania</td><td>Fisher Naukowy</td><td>15-197-700A</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel rozmiar 3</td><td>Fisher Naukowy</td><td>22-079-657</td><td></td></tr><tr><td>Małe ząbkowane, półzakrzywione kleszcze</td><td>Narzędzia chirurgiczne Roboz Co.</td><td>Złącze RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki chirurgiczne</td><td>Narzędzia chirurgiczne Roboz Co.</td><td>Złącze RS-5850</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy mikroskop świetlny</td><td></td><td></td><td>Do oceny cytologii pochwy, rozmazów i analizy histologicznej.</td></tr><tr><td>Stalowe ostrza skalpela #10</td><td>B.Braun</td><td>BB510 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna gaza</td><td>MEDICOM</td><td>HMWS 077</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizowane szalki Petriego ze szkła pyrexowego</td><td>Corning</td><td>70160-101</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka elektryczna termoregulowana&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VICRYL RAPIDE (poliglaktyna 910) szew wchłanialny</td><td>Ethicon Inc.</td><td>Zobacz materiał W9918</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna&nbsp;</td><td>Alfasan International b.v</td><td>2110333-10</td><td></td></tr></tbody></table>

stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Establishment of an Experimental Mouse Model of Endometrioma to Study its Related Infertility

Endometrioma (OMA), podtyp endometriozy charakteryzujący się powstawaniem torbieli endometriozy w jajnikach, dotyka 17-44% osób, u których zdiagnozowano endometriozę. Kobiety z OMA często doświadczają upośledzonej płodności, jednak dokładne mechanizmy leżące u podstaw niepłodności związanej z OMA pozostają niejasne. Warto zauważyć, że istniejące modele zwierzęce symulują powierzchowną endometriozę otrzewnowej (SUP) i endometriozę głęboko naciekającą (DIE), pozostawiając zauważalną lukę w badaniach skoncentrowanych na OMA. W odpowiedzi na lukę w wiedzy, w niniejszym artykule przedstawiono pionierski model myszy symulujący OMA i przedstawiono kompleksowy opis technik i procedur zastosowanych w tym modelu. Dzięki wysokiemu wskaźnikowi sukcesu wynoszącemu 83% i swoistości dla zmian jajnikowych, model ten jest bardzo obiecujący dla pogłębienia naszej wiedzy na temat OMA, szczególnie w kontekście niepłodności. Stanowi on cenną platformę do prowadzenia ukierunkowanych badań nad wyzwaniami związanymi z płodnością związaną z OMA, potencjalnie torując drogę dla ulepszonych strategii diagnostycznych i terapeutycznych w dziedzinie medycyny reprodukcyjnej.

Pomyślne wytworzenie OMA 
Spośród 12 myszy poddanych protokołowi transplantacji, u 10 wystąpiły charakterystyczne zmiany OMA, zarówno na poziomie makroskopowym, jak i histologicznym, co przełożyło się na wskaźnik sukcesu wynoszący 83%. Badanie makroskopowe wykazało obecność wypełnionych płynem zmian przylegających do jajników, przypominających kliniczne objawy OMA (Rysunek 2). Analiza histopatologiczna, przedstawiona na Rysunku 3, potwierdziła pomyślną implantację ektopowej tkanki endometrium. Co więcej, naciek zmian endometriozowych wywołał masywną atrezję pęcherzyków obok implantów, co wskazuje na zakłócenie środowiska jajnika.
Specyficzność modelu 
Kluczowym elementem walidacji modelu była jego specyficzność względem endometriozy jajnika. Po dokładnym badaniu nie zidentyfikowano żadnych obcych implantów endometrioidalnych w żadnym innym narządzie miednicy lub jamy brzusznej, co podkreśla precyzję modelu oraz jego potencjał jako niezawodnego narzędzia do badania endometriomy i związanej z nią niepłodności.
<img alt="Proces implantacji zarodka; schemat; biologia rozrodu; implantacja od dawcy; eksperyment na myszach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66240/66240fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Tworzenie modelu endometriomy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66240/66240fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie tkanki jajnika; grupa pozorowana vs endometrioma, schemat przedstawia różnice morfologiczne w badaniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66240/66240fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Anatomia makroskopowa endometriomy. W porównaniu z grupą kontrolną (pozorowaną), w grupie OMA 4 tygodnie po transplantacji w badaniu morfologicznym widoczny był ektopowy torbielowaty wzrost endometrium w obrębie morfologii jajnika. Niebieska przerywana linia: zmiana endometriozowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66240/66240fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Histologia tkanki jajnika; kontrola pozorowana vs endometrioma; powiększone przekroje; analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66240/66240fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Barwiony histologicznie przekrój zmiany endometralnej z modelu mysiego. W badaniu histologicznym grupy OMA, 4 tygodnie po transplantacji, widoczny był ektopowy torbielowaty wzrost endometrium w obrębie jajnika w porównaniu z grupą kontrolną pozorowaną. Czarne strzałki wskazują pęcherzyki atretyczne. Paski skali = 0.5 mm. Skrót: OMA = endometrioma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66240/66240fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Badanie to wprowadza nowy model mysi zaprojektowany specjalnie do symulacji endometriozy, klinicznie istotnego podtypu endometriozy. Wykorzystując myszy C57BL/6J, model ma na celu wyjaśnienie patofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z endometrioma, oferując wyrafinowane narzędzie do wypełnienia obecnej luki w wiedzy w medycynie reprodukcyjnej.

Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Endometrioma (OMA), a subtype of endometriosis characterized by the formation of endometriotic cysts in the ovaries, affects 17-44% of individuals ...

Zakres naszych badań skupia się na zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z endometriozą. Naszym celem jest wypełnienie luki w wiedzy poprzez opracowanie mysiego modelu, który symuluje endometrioma i zbadanie jego wpływu na płodność. W dziedzinie badań nad endometriozą ostatnie osiągnięcia obejmują postęp w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw endometriozy, identyfikację nowych markerów do diagnozy i leczenia oraz opracowanie innowacyjnych modeli do badania określonych podtypów, takich jak endometrioma. Osiągnięcia te przyczyniają się do poprawy wiedzy i potencjalnych strategii terapeutycznych w endometriozie. Obecne wyzwania eksperymentalne w badaniach nad endometrioma obejmują brak wiarygodnego modelu zwierzęcego, ograniczoną wiedzę na temat patogenezy i wpływu na płodność oraz potrzebę badań nawrotów i testów diagnostycznych. Mysi model endometriomy i włączenie wyników rozwiązują te wyzwania i naprzód tę dziedzinę.Nasz protokół oferuje wyraźne zalety w porównaniu z innymi technikami. W szczególności koncentruje się na naśladowaniu endometrioma, podczas gdy żadna inna podtyp nie została ustalona tą metodą. Dzięki wysokiemu wskaźnikowi sukcesu umożliwia modyfikacje genetyczne i replikuje cechy reprodukcyjne podobne do ludzkich, co czyni go cennym narzędziem do badania niepłodności związanej z endometrioma. Nasze odkrycia utorowały drogę do nowej ery badań nad endometriozą. Wypełniając długotrwałą lukę, nasz model obiecuje transformacyjny wgląd, rewolucjonizując nasze zrozumienie, leczenie i potencjalnie zapobieganie endometriomie. Integrując wyniki badań nad nawrotami i diagnostyką, nasze badania wzbogacają szerszy kontekst badań nad endometriozą i opieki nad pacjentką.[Narrator] Po zebraniu ściółki zawierającej męskie feromony należy wprowadzić je do klatki samicy myszy na 48 godzin. Wlej 10 mililitrów PBS na szalkę Petriego i zanurz w niej jeden koniec bawełnianego wacika, aby wchłonąć płyn. Delikatnie wyjmij jedną mysz z klatki i umieść ją na pokrywie. Delikatnie włóż zwilżony bawełniany wacik do pochwy i delikatnie obróć wacik pod kątem 45 stopni do długiej osi ciała zwierzęcia. Po pobraniu komórek ze ścianek luminantu pochwy ostrożnie wyjmij wacik. Delikatnie przetocz końcówkę wacika na czystym, wstępnie oznaczonym szkiełku, aby przenieść zebrane komórki. Zbadaj szkiełko pod mikroskopem pod kątem obecności zrogowaciałych komórek nabłonka wskazujących na stadium rui. Na początek zdezynfekuj okolice brzucha samicy myszy w stadium rui poddanej eutanazji dawcy 70% etanolem. Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać jednocentymetrowe nacięcie wzdłuż linii środkowej otrzewnej, odsłaniając warstwę mięśniową. Następnie użyj innej pary nożyczek, aby przeciąć warstwę mięśniową i odsłonić jamę miednicy. Zamknij końcówki kleszczy i delikatnie unieś jelita za pomocą części środkowej. Po zlokalizowaniu macicy należy sterylnie wypreparować cały róg macicy, zapewniając usunięcie obu rogów macicy. Umieścić wycięte tkanki na szalce Petriego zawierającej PBS i usunąć nadmiar tkanki tłuszczowej. Za pomocą sterylnego skalpela drobno rozetnij tkanki na jednomilimetrowe kawałki sześcienne. Okresowo dodawaj PBS, aby tkanki były wilgotne. Umieść znieczuloną mysz biorcy w pozycji leżącej na sterylnej desce chirurgicznej. Zidentyfikuj miejsce operacji, delikatnie manipulując tylnymi nogami, aby wyczuć kościstą wypukłość pod skórą. Zdezynfekuj obszar operacyjny wacikiem z 70% etanolu, a następnie Betadine. W wybranym miejscu wykonaj precyzyjne nacięcie boczne od trzech do pięciu milimetrów. Ustabilizuj jajnik za pomocą niedominujących kleszczy ręcznych i wstrzyknij 100 mikrolitrów PBS do kaletki jajnika, obserwując niewielką separację. Zrób małą szczelinę w kaletce i za pomocą mikrokleszczy przeszczep jednomilimetrowe sześcienne fragmenty tkanki macicy. Po zabiegu należy zszyć warstwy mięśniowe szwami wchłanialnymi, a skórę szwami niewchłanialnymi. Po czterech tygodniach wyjmij przeszczepioną mysz biorcę z klatki w pomieszczeniu. Wykonaj nacięcie w linii środkowej na myszy poddanej eutanazji biorcy i odsłoń jamę brzuszną do badania narządów. Dokładnie sprawdź jamę brzuszną pod kątem zewnętrznych zmian endometriotycznych. Następnie wydobądź jajniki z widocznymi zmianami do fotografii. Napraw jajniki ze zmianami w 10% neutralnej buforowanej formalinie. Po przecięciu i zamontowaniu skrawków tkanki na szkiełku, umieść roztwór ksylenu szkiełka, aby usunąć parafinę. Ponownie nawodnić skrawki tkanki, umieszczając szkiełko w serii zmniejszających się stężeń etanolu. Traktuj skrawki tkanek 1% kwasem okresowym przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dokładnie spłucz szkiełko wodą destylowaną, aby usunąć resztki kwasu okresowego. Teraz zabarwić skrawki tkanek roztworem przesuwnym przez 15 minut. Opłucz szkiełko w gorącej wodzie z kranu, aby usunąć nadmiar plamy, a następnie w wodzie destylowanej. Przeciwbarwij skrawki tkanki hematoksyliną Mayera przez dwie do trzech minut. Opłucz szkiełko pod bieżącą wodą z kranu przed nałożeniem odczynnika do niebieszczenia przez 30 sekund. Po przepłukaniu szkiełka w wodzie destylowanej należy odwodnić sekcje w rosnących stężeniach etanolu. Zanurz sekcje w ksylenie, aby były przezroczyste. Nałóż medium montażowe na sekcje i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe, unikając pęcherzyków powietrza. Po wyschnięciu zbadaj szkiełko pod mikroskopem świetlnym pod kątem obecności gruczołów endometrialnych, zrębu i torbieli krwotocznych potwierdzających endometriozę w jajniku. W porównaniu z pozorowaną grupą kontrolną, ektopowy wzrost torbieli endometrium był widoczny w związku z morfologią jajnika cztery tygodnie po przeszczepie w grupie endometrium. Dalsze badania histopatologiczne potwierdziły udaną implantację ektopowej tkanki endometrium w grupie endometrium.

establishment-an-experimental-mouse-model-endometrioma-to-study-its

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opis chirurgicznego indukowania endometriozy u myszy i szczurów poprzez autotransplantację tkanki macicy do kaskady tętniczej krezki jelitowej.

Myszowy model chirurgicznie wywołanej endometriozy poprzez autotransplantację tkanki macicy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fluorescencyjnie znakowanych fragmentów ludzkiego endometrium przeszczepionych myszom. Metoda pozwala na badanie wpływu wybranych leków na wielkość zmiany endometriotycznej poprzez monitorowanie i kwantyfikację fluorescencji emitowanej przez reporter fluorescencyjny w czasie...

Nieinwazyjne monitorowanie wielkości zmiany w heterologicznym mysim modelu endometriozy

Wiele modeli endometriozy u gryzoni jest ograniczonych przez techniczną złożoność, powtarzalność i/lub potrzebę stosowania zwierząt z obniżoną odpornością lub specjalnych myszy reporterowych. Przedstawiamy uproszczony system indukcji zmian chorobowych przy użyciu dowolnej myszy eksperymentalnej z niezależnie weryfikowalnym, obiektywnym systemem punktacji i bez konieczności wycinki owariektomii lub operacji przeżycia.

Syngeniczny mysi model endometriozy przy użyciu myszy z naturalną jazdą na rowerze

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia organoidów nabłonka endometrium myszy do ekspresji genów i analiz histologicznych.

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

Ustanowienie ciąży to dynamiczny proces obejmujący skomplikowane przenikanie się zarodków i macicy. Dokładny wkład środowiska macicy matki w te procesy pozostaje aktywnym obszarem badań. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe protokoły, które mają pomóc w projektowaniu modeli zwierzęcych in vivo, aby odpowiedzieć na te pytania badawcze.

Metody badania wkładu macicy w powstanie ciąży w mysim modelu owariektomii

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia prostego i efektywnego modelu implantacji zarodków in vitro do oceny istotnych cząsteczek wpływających na proces implantacji zarodka.

Opracowanie modelu implantacji zarodka in vitro

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania niezawodnego i powtarzalnego cienkiego endometrium o bardzo niskiej śmiertelności i minimalnych zrostach wewnątrzmacicznych poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do macicy myszy w ciągu 1-3 minut.

Ustalenie mysiego modelu cienkiego endometrium

Utrata integralności otrzewnej stanowi nowy paradygmat w rozumieniu i leczeniu przewlekłego bólu miednicy u kobiet z łagodnymi postaciami endometriozy i może być łatwo wykryta poprzez śródoperacyjne podanie barwnika podczas laparoskopii.

Śródoperacyjne wykrywanie subtelnej endometriozy: nowy paradygmat diagnostyki i leczenia bólu miednicy związanego z utratą integralności otrzewnej

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Opracowaliśmy nowatorski model ex vivo do badania działania hormonów w ludzkiej piersi. Opiera się na mikrostrukturach tkankowych wyizolowanych z chirurgicznych próbek tkanki piersi, które zachowują architekturę tkanki, interakcje międzykomórkowe i sygnalizację parakrynną.

Model ex vivo do badania działania hormonów w ludzkiej piersi

Poznaj nowy model myszy C57BL/6J do badania endometriomy i związanej z nią niepłodności. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy patofizjologiczne i wspiera rozwój terapii w medycynie rozrodczej.

Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Przeglądaj więcej filmów