Name: Pomiar kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Poznaj metodę pomiaru kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych. Protokół zapewnia powtarzalność i dokładność w ilościowym określaniu bakterii korzeniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32370135), Program Innowacji Chińskiej Akademii Nauk Rolniczych (CAAS-CSAL-202302), Projekt Naukowo-Technologiczny Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).

1. Sterylna uprawa hydroponiczna A. thaliana
<ol>
	<li>Przygotuj sadzonki A. thaliana.
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę z siewek A. thaliana, która składa się z 1/2 MS pożywki (Murashige i Skoog) z 2% (wag./obj.) sacharozy i 0,9% (wag./obj.) agaru.</li>
		<li>Wlej przygotowaną pożywkę sterylizacyjną do sterylnych kwadratowych szalek Petriego (13 cm x 13 cm) przed zestaleniem. Unikaj suszenia powietrzem, aby utrzymać wilgotność.</li>
		<li>Zanurzyć nasiona A. thaliana w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml wypełnionej 1 ml sterylnej wody o temperaturze 4 °C na ponad 12 godzin, a następnie sterylizować nasiona 1 ml 2% (obj./obj.) NaClO przez 2 min.</li>
		<li>Dokładnie umyj nasiona sterylną wodą sześć razy, aby usunąć roztwór NaClO. Zasiej nasiona na szalkach Petriego za pomocą pożywki agarowej MS ze sterylną końcówką o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Uszczelnij szalki Petriego oddychającą taśmą medyczną i umieść je pionowo w lekkim inkubatorze, aby rosły przez 1 tydzień. Ustaw stosunek dzień/noc inkubatora światła na 16 h/8 h, utrzymuj temperaturę na poziomie 23 °C i wilgotność na poziomie 40%-60%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeszczep A. thaliana.
	<ol>
		<li>Wytnij 5 mm otwory w barwniku komórkowym o wielkości porów 40 μm i wysterylizuj je.</li>
		<li>Przesadź trzy 7-dniowe rośliny A. thaliana przez otwory sitka komórkowego i umieść je na 6-dołkowej płytce zawierającej 3 ml sterylnego płynu 1/2 MS pożywki z 0,5% sacharozy.</li>
		<li>Umieść 6-dołkowe płytki w lekkim inkubatorze (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A) i inkubuj przez 10 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla i inokulacja bakterii
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę bakteryjną do inokulacji.
	<ol>
		<li>W przypadku Bacillus velezensis zaszczepić komórki bakteryjne w sterylnym podłożu LB i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 170 obr./min, aż osiągnie OD600 0,8-1,2.</li>
		<li>Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie przy 6000 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić komórki w buforze PBS (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Powtórz etapy wirowania i ponownego zawieszania 3 razy, aby usunąć pożywkę LB i metabolity bakteryjne.</li>
		<li>Zawiesić komórki bakteryjne w świeżej pożywce 1/2 MS o końcowym stężeniu OD600 0,01. Zaszczepić zawiesiny bakterii na 6-dołkowych płytkach, na których rosną siewki A. thaliana, umieścić 6-dołkowe płytki w inkubatorze światła i hodować je przez 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiar bakterii skolonizowanych na korzeniach
<ol>
	<li>Zbierz tkankę korzenia i pokryj płytki skolonizowanymi komórkami. 
	UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w warunkach gnotobiotycznych
	<ol>
		<li>Zważyć probówki o pojemności 2 ml i zapisać masę jako W0.</li>
		<li>Zbierz współhodowane tkanki korzenia A. thaliana i umyj je 3 razy w sterylnej wodzie. Umieść korzeń na bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar wody.</li>
		<li>Umieść korzeń w zważonej probówce do mikrowirówki, zważ korzenie razem z probówką i zapisz go jako W1.</li>
		<li>Dodaj 1 ml PBS do każdej probówki i wiruj probówki przez 8 minut z maksymalną prędkością.</li>
		<li>Rozcieńczyć zawiesiny zebranymi komórkami bakteryjnymi skolonizowanymi przez korzeń do 1 x 10-1-1 x 10-4 (zgodnie ze zdolnością kolonizacji bakterii). Rozcieńczone zawiesiny bakteryjne rozprowadzić na płytkach zawierających podłoże agarowe LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz kolonie i znormalizuj dane.
	<ol>
		<li>Policz kolonie bakterii na płytkach LB.</li>
		<li>Obliczyć jtk jtk zgodnie z odpowiednim rozcieńczeniem i znormalizować dane za pomocą świeżej masy korzenia (W1-W 0). Końcowe wyniki wskazują na liczbę komórek bakteryjnych skolonizowanych na gram korzenia w 2 dni po inokulacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Rhizobacterial Colonization Detection on Arabidopsis thaliana

<ol><li>Wang, B., Wan, C., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+on+cotton+plants+with+a+GFP+labeled+strain+of+Bacillus+axarquiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis.</a> Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).</li>
<li>Zhai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+tool+for+production+of+GFP-expressing+Rhodopseudomonaspalustris+for+visualization+of+bacterial+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization.</a> AMB Express. 9 (1), 141(2019).</li>
<li>Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+strategies+of+plant+colonization+by+beneficial+endophytic+Enterobacter+sp.+SA187%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187.</a> Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+velezensis+tolerance+to+the+induced+oxidative+stress+in+root+colonization+contributed+by+the+two-component+regulatory+system+sensor+ResE%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE.</a> Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+commensal+type+VII+secretion+system+causes+iron+leakage+from+roots+to+promote+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization.</a> Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).</li>
<li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chemotaxis+compounds+in+root+exudates+and+their+sensing+chemoreceptors+in+plant-growth-promoting+Rhizobacteria+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).</li>
<li>Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichoderma%3A+a+multipurpose%2C+plant-beneficial+microorganism+for+eco-sustainable+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).</li>
<li>Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+study+on+colonization+and+antimicrobial+property+of+endophytic+bacteria+associated+with+ethnomedicinal+plants+of+Meghalaya%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc+Ultrastruct%22%5BJournal%5D)">Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya.</a> J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).</li>
<li>Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+from+rhizosphere+microbes+that+promote+plant+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth.</a> Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).</li>
<li>Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calling+from+distance%3A+attraction+of+soil+bacteria+by+plant+root+volatiles%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles.</a> ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).</li>
<li>Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe-induced+plant+volatiles%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Microbe-induced plant volatiles.</a> New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).</li>
<li>Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+members+increase+Bacillus+subtilis+maintenance+on+the+roots+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Phytobiomes+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana.</a> Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).</li>
<li>Yahya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+root+exudation+and+architecture+for+improved+growth+of+wheat+mediated+by+phosphate+solubilizing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 744094(2021).</li>
<li>Husna, K. B. -E., Won, M. -H., Jeong, M. -I., Oh, K. -K., Park, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+genomic+insight+of+surfactin-producing+Bacillus+velezensis+and+its+biocontrol+potential+against+pathogenic+contamination+in+lettuce+hydroponics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.

Aby osiągnąć dobrą odtwarzalność, istnieją cztery krytyczne etapy procesu wykrywania kolonizacji tego protokołu. Po pierwsze, należy upewnić się, że liczba zaszczepionych komórek bakteryjnych jest dokładnie taka sama w każdym eksperymencie. Po drugie, konieczne jest również kontrolowanie intensywności czyszczenia nieskolonizowanych bakterii sterylną wodą. Po trzecie, każdy proces rozcieńczania próbki musi być wirowany przed wykonaniem, aby próbka mogła być w stanie całkowitego wymieszania, aby uniknąć błędów wchłaniania spowodowanych charakterystyką bakterii, które łatwo zatopić w probówce mikrowirówkowej. Dlatego zalecamy użycie przyrządu wirowego do mieszania zawiesiny bakteryjnej przed każdym wchłonięciem. Po czwarte, podczas wszystkich operacji wykonywanych tą metodą należy ściśle zapewnić aseptykę, aby uniknąć jakiejkolwiek możliwości zanieczyszczenia. 
Ta metoda służy do określenia bakterii skolonizowanych na powierzchni korzenia. Oprócz bakterii powierzchniowych korzeni, bakterie endofityczne i grzyby również kolonizują ryzosferęrośliny 7. Zdolność kolonizacyjną bakterii endofitycznych można nadal wykryć za pomocą protokołu opisanego w tym artykule, ale tkanka korzeniowa powinna zostać zmielona w celu uwolnienia bakterii endofitycznych. Jednak grzyby endofityczne różnią się od bakterii. Większość metod głównego nurtu wykorzystuje transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) do obserwacji wzrostu strzępek, która jest jakościową metodą wykrywania podobną do znakowania fluorescencyjnego bakterii do wizualizacji8. 
Porównując kolonizację różnych szczepów, nie należy ich zaszczepiać na jednej płytce 6-dołkowej, aby uniknąć wpływu bakteryjnych związków lotnych9 i roślinnych związków lotnych10,11. Wybraliśmy 2-dniowy okres po inokulacji do wykrycia korzenia, ponieważ kolonizacja SQR9 osiągnęła maksimum między 2 a 4 dniami; Czas wykrywania kolonizacji bakteryjnej można dostosować w zależności od szczepów.
W porównaniu z innymi opisanymi metodami, ta metoda jest dokładna i łatwa w obsłudze. Na przykład metoda opisana przez Noama i wsp. polega na tym, że rzodkiewnik z hodowli w postaci stałej jest zaszczepiany bakteriami natychmiast po przesadzeniu do warunków hydroponicznych12,13. W tym przypadku proponujemy, aby bakterie zostały zaszczepione do ryzosfery po kilku dniach od przesadzenia, aby uniknąć wpływu adaptacji roślin do zmienionego środowiska wzrostu. Metoda opisana w tym badaniu jest również dobra dla roślin do uwalniania wysięku korzeniowego, który wpływa na kolonizację.
Aby pędy roślin rosły oddzielnie w powietrzu i całkowicie z dala od zanurzenia w cieczy, dokonaliśmy kilku drobnych modyfikacji i obróbki na barwierce komórek, aby udostępnić je dla tej metody hydroponicznej. Co więcej, metoda ta jest bardziej odpowiednia do dokładnego oznaczania kolonizacji bakteryjnej w małych ilościach, ale nie do dużych ilości wysięków korzeniowych zebranych w hydrokulturze14. Należy zauważyć, że metoda ta jest modyfikowana na podstawie wcześniej opublikowanych badań 12,14,15.

Istnieją ilościowe i jakościowe metody wykrywania kolonizacji ryzosfery przez pojedynczy szczep bakterii. W przypadku metody jakościowej należy użyć szczepu, który konstytutywnie wyraża fluorescencję, a rozkład i intensywność fluorescencji należy zbadać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub laserowych instrumentów konfokalnych1,2. Strategie te mogą dobrze odzwierciedlać kolonizację bakteryjną in situ3, ale nie są tak dokładne, jak tradycyjne metody liczenia płytek w kwantyfikacji. Poza tym, ze względu na ograniczenie polegające na wyświetlaniu tylko częściowych stref korzeniowych pod mikroskopem, czasami może to mieć wpływ na subiektywne uprzedzenia. 
Tutaj opisujemy metodę ilościową, która obejmuje zbieranie skolonizowanych komórek bakteryjnych i liczenie bakteryjnych CFU na talerzu. Metoda ta opiera się na rozcieńczaniu i posiewie, za pomocą którego można policzyć skolonizowane szczepy, które zostały usunięte z korzeni roślin, i obliczyć całkowitą liczbę skolonizowanych bakterii na korzeniu4,5. 
Najpierw, A. thaliana została wyhodowana w warunkach hydroponicznych, a następnie komórki bakteryjne zostały zaszczepione w ryzosferze w końcowym stężeniu 0,01 OD600. Zainfekowane tkanki korzeni pobrano 2 dni po inokulacji i umyto w sterylnej wodzie w celu usunięcia nieskolonizowanych komórek bakteryjnych. Ponadto komórki bakteryjne skolonizowane na korzeniu zebrano, rozcieńczono w buforowanym fosforanem buforze soli fizjologicznej (PBS) i posiano na pożywce agarowej Luria-Bertani (LB). Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez 10 godzin, pojedyncze kolonie na płytkach LB policzono i znormalizowano w celu określenia komórek bakteryjnych skolonizowanych na korzeniach.
Ta metoda jest wysoce przydatna, ma dobrą powtarzalność i jest bardziej odpowiednia do dokładnego określenia kolonizacji bakteryjnej ryzosfery.

<table><tbody><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik do komórek filtracyjnych</td><td>Solarbio</td><td>F8200-40&micro; m</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Murashige i Skoog medium</td><td>Hopebio</td><td>HB8469-5</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Alfa</td><td>L14709</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowa szalka Petriego</td><td>Ruiai Zhengte</td><td>PYM-130</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie2</td><td>Scientific Industries</td><td>G560E</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar kolonizacji bakteryjnej korzeni arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Pomiar kolonizacji bakteryjnej na korzeniu Arabidopsis thaliana jest jednym z najczęstszych eksperymentów w badaniach interakcji roślina-mikroorganizm. Ustandaryzowana metoda pomiaru kolonizacji bakteryjnej w ryzosferze jest niezbędna do poprawy odtwarzalności. Najpierw wyhodowaliśmy sterylną A. thaliana w warunkach hydroponicznych, a następnie zaszczepiliśmy komórki bakteryjne w ryzosferze przy końcowym stężeniu OD600 wynoszącym 0,01. Po 2 dniach od inokulacji tkanka korzenia została pobrana i trzykrotnie przemyta w sterylnej wodzie w celu usunięcia nieskolonizowanych komórek bakteryjnych. Korzenie zostały następnie zważone, a komórki bakteryjne skolonizowane na korzeniu zostały zebrane przez wir. Zawiesinę komórkową rozcieńczano w gradiacji buforem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), a następnie posiewano na pożywce agarowej Luria-Bertani (LB). Płytki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 10 godzin, a następnie pojedyncze kolonie na płytkach LB policzono i znormalizowano, aby wskazać komórki bakteryjne skolonizowane na korzeniach. Metoda ta służy do wykrywania kolonizacji bakteryjnej w ryzosferze w warunkach monooddziaływania, z dobrą odtwarzalnością.

Aby przetestować dokładność wykrywania zdolności kolonizacji bakterii w ryzosferze A. thaliana za pomocą tej metody, zaszczepiliśmy osobno w ryzosferze A. thaliana szczep dziki Bacillus velezensis SQR9 oraz pochodną mutantę Δ8mcp. Mutanta Δ8mcp jest mutantą pozbawioną wszystkich genów kodujących chemoreceptory, co skutkuje znacznym zmniejszeniem kolonizacji6. Po 2 dniach od inokulacji zmierzyliśmy stopień ich kolonizacji, stosując opisany tutaj test kolonizacji korzeni. Wyniki wykazały istotną redukcję kolonizacji korzeni przez mutantę Δ8mcp, co wskazuje, że zastosowane warunki i metoda skutecznie mierzą kolonizację bakterii (Rycina 1C).
<img alt="Kolonizacja korzeni Arabidopsis; układ płyt wielodołkowych; wykres wzrostu drobnoustrojów; wyniki eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66241/66241fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wzrost A. thaliana oraz kolonizacja korzeni przez Bacillus velezensis SQR9 i Δ8mcp. (A) Widok z góry na 7-dniowe rośliny A. thaliana rosnące w płytkach 6-dołkowych z barwnikiem komórkowym w warunkach hydroponicznych. (B) Widok z boku na 7-dniowe rośliny A. thaliana rosnące w płytkach 6-dołkowych, gdzie każdy dołek zawiera 3 siewki. (C) Kolonizacja przez szczep dziki B. velezensis SQR9 oraz Δ8mcp zmierzona przy użyciu przedstawionego testu. Wykonano sześć powtórzeń, a dane przedstawiono jako średnia ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66241/66241fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Kolonizacja ryzobakterii wspomagających wzrost roślin (PGPR) w ryzosferze jest niezbędna dla jej efektu stymulującego wzrost. Konieczne jest ujednolicenie metody wykrywania kolonizacji ryzosfery bakteryjnej. W tym miejscu opisujemy powtarzalną metodę ilościowego określania kolonizacji bakteryjnej na powierzchni korzenia.

Pomiar kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Nasze badania koncentrują się na interakcji pożytecznych bakterii kłączowych z korzeniami roślin. Poszukujemy kluczowych mechanizmów zwiększających kolonizację pożytecznych bakterii, poprawiając tym samym wydajność i stabilność nawozów mikrobiologicznych na polu. Metody kolonizacji bakteryjnej korzeni roślin zostały szeroko przebadane, ale nadal istnieją problemy.Na przykład trudno jest wyraźnie zmierzyć kolonizację w różnych miejscach. Sądzimy, że w przyszłości zastosowanie mikroskopu i zliczanie o wysokiej przepustowości pomoże rozwiązać te problemy. Nasz protokół ma duże zastosowanie z dobrą powtarzalnością i jest bardziej odpowiedni do dokładnego określania kolonizacji bakterii ryzosferowych.Aby przygotować pożywkę dla sadzonek Arabidopsis thaliana, wymieszaj połową mocy Murashige i Skoog lub MS Medium z 2% sacharozą i 0,9% agarem. Po sterylizacji wlej pożywkę na kwadratową szalkę Petriego, upewniając się, że nie wysusza się na powietrzu, aby utrzymać wilgotność. Zanurz nasiona Arabidopsis w dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr sterylnej wody o temperaturze czterech stopni Celsjusza na ponad 12 godzin.Następnie sterylizuj nasiona jednym mililitrem 2% roztworu podchlorynu sodu przez dwie minuty. Dokładnie umyj nasiona sześć razy sterylną wodą, aby usunąć roztwór podchlorynu sodu. Używając sterylnej końcówki o pojemności jednego mililitra, zasiej nasiona na szalce agarowej MS.Uszczelnij szalkę Petriego oddychającą taśmą medyczną i umieść ją pionowo w lekkim inkubatorze na tydzień w temperaturze 28 stopni Celsjusza przy wilgotności od 40 do 60%Wykonaj pięć milimetrowych otworów na sitku do komórek o wielkości porów 40 mikronów i sterylizuj je w temperaturze 115 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po pobraniu przeszczep trzy siedmiodniowe rośliny A thaliana przez otwory sitka komórkowego i umieść je na sześciodołkowej płytce zawierającej trzy mililitry pożywki MS o połowie mocy z 0,5% sacharozy. Zaszczepić komórki Bacillus velezensis w sterylnym podłożu Luria Bertani i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 170 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,8 21,2.Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 6 000 G przez dwie minuty. I ponownie zawieś osad w buforze PBS. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić osad w świeżym podłożu MS o połowie mocy do końcowej gęstości optycznej 1 przy 600 nanometrach.Rozcieńczyć kulturę bakteryjną 100 razy, aż gęstość optyczna osiągnie 0,01. Inokulować rozcieńczoną zawiesinę bakteryjną na sześciodołkowej płytce zawierającej siewki Arabidopsis thaliana i uprawiać przez dwa dni w lekkim inkubatorze. Na początek zważ dwie mililitrowe probówki i zapisz początkową masę jako W0. Zbierz tkanki korzenia rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) i umyj je trzykrotnie w sterylnej wodzie.Umieść korzeń na bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar wody. Przenieś korzenie do wstępnie zważonej probówki mikrowirówkowej. Zważ korzenie za pomocą rurki i zapisz je jako W1. Następnie dodaj jeden mililitr PBS do probówki i Vortex przez osiem minut z maksymalną prędkością.Rozcieńczyć zawiesiny zawierające skolonizowane komórki bakteryjne korzenia od jednego na 10 do ujemnego pierwszego do jednego na 10 do ujemnego piątego. Rozcieńczone zawiesiny bakteryjne rozprowadzić na płytkach agarowych Luria Bertani i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 godzin. Po inkubacji policz kolonie bakterii na płytkach agarowych Luria Bertani.Oblicz jednostki tworzące kolonie zgodnie z odpowiednim rozcieńczeniem i znormalizuj dane za pomocą świeżej masy korzenia, aby uzyskać liczbę komórek bakteryjnych skolonizowanych na gram korzenia. Dwa dni po inokulacji kolonizacja Bacillus velezensis dzikiego typu sqr nine i pochodnego mutanta, delta eight MCP, wykazała znaczne zmniejszenie kolonizacji korzeni delta eight MCP, co sugeruje skuteczność tego stanu i metody w pomiarze kolonizacji bakterii.

measuring-bacterial-colonization-on-arabidopsis-thaliana-roots

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Źródło: Nathoo, N., et al. Hydroponiczny system kouprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych roślina/mikroorganizm oraz sygnalizacji. J. Vis. Exp. (2017).Ten film przedstawia hydroponiczny system wspólnej uprawy do badania interakcji między roślinami a bakteriami w sterylnych warunkach. Sadzonki roślin przenosi się do sterylnego, kwaśnego podłoża wzrostowego, inkubuje i sprawdza pod kątem zanieczyszczenia przed zaszczepieniem Agrobacterium. Aktywowane bakterie...

System wspólnej uprawy do badania reakcji molekularnych gospodarzy roślinnych i bakterii oddziałujących na siebie

Źródło: Harris, S. L. i in. Monitorowanie kolonizacji bakteryjnej i utrzymania korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym. J. Vis. Exp. (2019)Ten film prezentuje protokół monitorowania kolonizacji bakterii związanych z korzeniami na sadzonkach Arabidopsis thaliana uprawianych w systemie bezglebowym. Po kolonizacji bakterie są usuwane przez sonikację, następnie rozcieńczane, pokładane i inkubowane, tworząc kolonie odzwierciedlające przywiązanie i żywotność bakterii.

Monitorowanie kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w bezglebowym systemie

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Prosta metoda pomiaru i charakteryzowania przyczepności bakterii do roślin, szczególnie korzeni i pędów, jest opisana w tym artykule.

Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium

Tutaj opisujemy hydroponiczny test wzrostu roślin, aby określić ilościowo obecność gatunków i zobrazować przestrzenne rozmieszczenie bakterii podczas początkowej kolonizacji korzeni roślin i po ich przeniesieniu do różnych środowisk wzrostu.

Monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym

Używamy prostych narzędzi laboratoryjnych do badania architektury systemu korzeniowego (RSA) Arabidopsis i Medicago. Sadzonki są uprawiane hydroponicznie na siatce i rozprowadzane za pomocą pędzla artystycznego, aby odsłonić RSA. Obrazy są wykonywane za pomocą skanowania lub kamery o wysokiej rozdzielczości, a następnie analizowane za pomocą ImageJ w celu zmapowania cech.

Prosty protokół mapowania cech architektury systemu korzeniowego roślin

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

In planta pomiar strumieni składników odżywczych i toksycznych jest niezbędny do badania odżywiania i toksyczności roślin. W tym miejscu omawiamy protokoły radioznacznikowe do oznaczania napływu i odpływu w nienaruszonych korzeniach roślin, używając jako przykładów strumieni potasu (K+) i amoniaku/amonu (NH3/NH4+). Omówiono zalety i ograniczenia takich technik.

Pomiar strumieni mineralnych składników odżywczych i substancji toksycznych w roślinach z radioaktywnymi znacznikami

Poznaj metodę pomiaru kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych. Protokół zapewnia powtarzalność i dokładność w ilościowym określaniu bakterii korzeniowych.

Pomiar kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych

Przeglądaj więcej filmów