Pomiar kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych

Nasze badania koncentrują się na interakcji pożytecznych bakterii kłączowych z korzeniami roślin. Poszukujemy kluczowych mechanizmów zwiększających kolonizację pożytecznych bakterii, poprawiając tym samym wydajność i stabilność nawozów mikrobiologicznych na polu. Metody kolonizacji bakteryjnej korzeni roślin zostały szeroko przebadane, ale nadal istnieją problemy.

Na przykład trudno jest wyraźnie zmierzyć kolonizację w różnych miejscach. Sądzimy, że w przyszłości zastosowanie mikroskopu i zliczanie o wysokiej przepustowości pomoże rozwiązać te problemy. Nasz protokół ma duże zastosowanie z dobrą powtarzalnością i jest bardziej odpowiedni do dokładnego określania kolonizacji bakterii ryzosferowych.

Aby przygotować pożywkę dla sadzonek Arabidopsis thaliana, wymieszaj połową mocy Murashige i Skoog lub MS Medium z 2% sacharozą i 0,9% agarem. Po sterylizacji wlej pożywkę na kwadratową szalkę Petriego, upewniając się, że nie wysusza się na powietrzu, aby utrzymać wilgotność. Zanurz nasiona Arabidopsis w dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr sterylnej wody o temperaturze czterech stopni Celsjusza na ponad 12 godzin.

Następnie sterylizuj nasiona jednym mililitrem 2% roztworu podchlorynu sodu przez dwie minuty. Dokładnie umyj nasiona sześć razy sterylną wodą, aby usunąć roztwór podchlorynu sodu. Używając sterylnej końcówki o pojemności jednego mililitra, zasiej nasiona na szalce agarowej MS.

Uszczelnij szalkę Petriego oddychającą taśmą medyczną i umieść ją pionowo w lekkim inkubatorze na tydzień w temperaturze 28 stopni Celsjusza przy wilgotności od 40 do 60%Wykonaj pięć milimetrowych otworów na sitku do komórek o wielkości porów 40 mikronów i sterylizuj je w temperaturze 115 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po pobraniu przeszczep trzy siedmiodniowe rośliny A thaliana przez otwory sitka komórkowego i umieść je na sześciodołkowej płytce zawierającej trzy mililitry pożywki MS o połowie mocy z 0,5% sacharozy. Zaszczepić komórki Bacillus velezensis w sterylnym podłożu Luria Bertani i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 170 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,8 21,2.

Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 6 000 G przez dwie minuty. I ponownie zawieś osad w buforze PBS. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić osad w świeżym podłożu MS o połowie mocy do końcowej gęstości optycznej 1 przy 600 nanometrach.

Rozcieńczyć kulturę bakteryjną 100 razy, aż gęstość optyczna osiągnie 0,01. Inokulować rozcieńczoną zawiesinę bakteryjną na sześciodołkowej płytce zawierającej siewki Arabidopsis thaliana i uprawiać przez dwa dni w lekkim inkubatorze. Na początek zważ dwie mililitrowe probówki i zapisz początkową masę jako W0. Zbierz tkanki korzenia rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) i umyj je trzykrotnie w sterylnej wodzie.

Umieść korzeń na bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar wody. Przenieś korzenie do wstępnie zważonej probówki mikrowirówkowej. Zważ korzenie za pomocą rurki i zapisz je jako W1. Następnie dodaj jeden mililitr PBS do probówki i Vortex przez osiem minut z maksymalną prędkością.

Rozcieńczyć zawiesiny zawierające skolonizowane komórki bakteryjne korzenia od jednego na 10 do ujemnego pierwszego do jednego na 10 do ujemnego piątego. Rozcieńczone zawiesiny bakteryjne rozprowadzić na płytkach agarowych Luria Bertani i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 godzin. Po inkubacji policz kolonie bakterii na płytkach agarowych Luria Bertani.

Oblicz jednostki tworzące kolonie zgodnie z odpowiednim rozcieńczeniem i znormalizuj dane za pomocą świeżej masy korzenia, aby uzyskać liczbę komórek bakteryjnych skolonizowanych na gram korzenia. Dwa dni po inokulacji kolonizacja Bacillus velezensis dzikiego typu sqr nine i pochodnego mutanta, delta eight MCP, wykazała znaczne zmniejszenie kolonizacji korzeni delta eight MCP, co sugeruje skuteczność tego stanu i metody w pomiarze kolonizacji bakterii.