Wykrywanie i kwantyfikacja DNA wirusa zapalenia wątroby typu B w czasie rzeczywistym w oparciu o reakcję łańcuchową polimerazy
15 grudnia 2023
Wykrywanie i kwantyfikacja DNA wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) w czasie rzeczywistym oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) jest czułą i dokładną metodą diagnozowania i monitorowania zakażenia HBV. W tym miejscu przedstawiamy protokół detekcji DNA HBV i pomiaru wiremii w próbce.
W tym filmie pokażemy Ci krok po kroku protokół wykrywania DNA HBV i ilościowego określania jego wiremii za pomocą naszego zatwierdzonego przez IVD zestawu do prawdziwego miana wirusa HBV opartego na prawdziwym PCR w czasie rzeczywistym. Badania diagnostyczne HBV wykorzystują PCR w czasie rzeczywistym, cyfrowy PCR NGS i testy serologiczne. Realtime PCR jest złotym standardem w wykrywaniu DNA HBV i kwantyfikacji wiremii.
Cyfrowy PCR określa ilościowo bezwzględną wiremię. NGS identyfikuje nowe mutacje i testy serologiczne, wykrywa antygeny lub przeciwciała. Istnieje kilka wyzwań eksperymentalnych związanych z wykrywaniem przypadków niskiego miana wirusa i utajonych zakażeń HBV.
Niektóre testy mogą nie działać dobrze we wszystkich genotypach HBV, a pojawiające się nowe mutacje mogą prowadzić do fałszywie ujemnych wyników. W porównaniu z innymi technikami, protokół PCR w czasie rzeczywistym jest najbardziej czułą, specyficzną i ilościową metodą wykrywania HBV dostępną na rynku. Jest to również stosunkowo szybka technika, co czyni ją idealną do użytku klinicznego Aby rozpocząć rozmrażanie wszystkich odczynników znajdujących się w zestawie do PCR w czasie rzeczywistym w temperaturze pokojowej.
Po rozmrożeniu pulsacyjnie wiruj składniki przez 10 sekund z umiarkowaną prędkością, aby je wymieszać. Następnie wirować w temperaturze 8000G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej. Trzymaj rozmrożone elementy na bloku chłodzącym.
Następnie należy przygotować mieszaninę PCR dla próbki dodatniej pod względem HBV. Pięć standardów HBV i brak kontroli szablonu. Dokładnie wymieszaj dodane odczynniki, delikatnie pipetując 7 do 10 razy, a następnie pulsuj, wiruj i wiruj w temperaturze 8000G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej.
Następnie odpipetować 15 mikrolitrów mieszanki PCR do każdej probówki PCR. Dodaj 15 mikrolitrów wyekstrahowanej próbki DNA, pięć wzorców HBV i wodę wolną od nukleaz jako kontrolę bez matrycy. Zamknij probówki do PCR i krótko odwiruj w wirówce.
Załaduj probówki do PCR do maszyny do PCR w czasie rzeczywistym. Teraz uruchom oprogramowanie termocyklera, wybierz barwniki fluorescencyjne i zaprogramuj termocykler do PCR w czasie rzeczywistym. Po uruchomieniu przeanalizuj wykres wzmocnienia za pomocą skali liniowej.
Ustaw próg reakcji PCR w fazie wykładniczej. Utrzymuj spójność ustawień progowych, aby zapewnić dokładność i odtwarzalność. Użyj tego samego progu dla wszystkich próbek na określonej maszynie do PCR.
Próbki z amplifikacją przed wartością CD 38 należy traktować jako dodatnie HBV w oparciu o punkt odcięcia testu. Stosować pięć wzorców kwantyfikacji DNA specyficznego dla HBV, skalibrowanych względem czwartego międzynarodowego standardu WHO dla DNA HBV. Wygeneruj krzywą wzorcową z tymi wzorcami, aby określić ilościowo DNA HBV w nieznanych próbkach.
Interpretuj wartości dla nieznanych próbek tylko wtedy, gdy standardowe nachylenie krzywej mieści się w zakresie od minus 3,1 do minus 3,6. Wartość R kwadrat mieści się w przedziale od 0,99 do 1,0. Skuteczność PCR mieści się w zakresie od 90% do 110%, a w kontroli ujemnej nie ma amplifikacji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół oparty na metodzie real-time PCR do detekcji i kwantyfikacji DNA wirusa zapalenia wątroby B (HBV), co jest niezbędne do dokładnej diagnozy i monitorowania zakażeń HBV. Metoda ta jest uznawana za złoty standard ze względu na swoją czułość i swoistość w określaniu miana wirusa HBV.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Wykrywanie wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV)
- Ilościowe oznaczanie miana wirusa
- Diagnostyka kliniczna
Wstęp
- Znaczenie dokładnego wykrywania HBV w warunkach klinicznych
- Wyzwania w identyfikacji niskiej wiremii i zakażeń utajonych
- Porównanie PCR z innymi technikami diagnostycznymi
Zastosowane metody
- Polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym (real-time PCR)
- Próbki obejmują dodatnie kontrole HBV
- Zastosowanie międzynarodowego standardu WHO do kalibracji
Główne wyniki
- Skuteczna kwantyfikacja HBV DNA z wykorzystaniem krzywej wzorcowej
- Identyfikacja próbek z istotną amplifikacją
- Kalibracja parametrów zapewniająca wysoką dokładność i powtarzalność
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza niezawodnego protokołu detekcji HBV DNA oraz pomiaru wiremii.
- Wysoka czułość tej metody sprawia, że jest ona cennym narzędziem w badaniach nad zapaleniem wątroby oraz w diagnostyce klinicznej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wykrywanie i kwantyfikacja HBV DNA z wykorzystaniem metody real-time PCR odpowiada na krytyczną potrzebę czułego i powtarzalnego pomiaru ładunku wirusowego w badaniach nad chorobami zakaźnymi oraz w diagnostyce klinicznej. Możliwość ta pozwala na precyzyjne monitorowanie stanu zakażenia HBV, wspierając podejmowanie decyzji opartych na danych w kluczowych punktach zwrotnych w opracowywaniu leków przeciwwirusowych oraz w badaniach translacyjnych. Standaryzacja i rygor ilościowy tej metody stanowią podstawę pewności prognostycznej i priorytetyzacji portfolio w procesach rozwoju produktów biofarmaceutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia rzetelną analizę mechanizmów replikacji i persistencji HBV w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów przeciwwirusowych poprzez ilościowe określanie redukcji DNA wirusa.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnianie rzeczywistych efektów biologicznych od artefaktów testowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany, ilościowy odczyt do oceny skuteczności związków przeciwko HBV.
- Zapewnia powtarzalność i standaryzację analizy dla wielu genotypów HBV i rodzajów próbek.
- Wykazuje wysoką czułość w wykrywaniu niskich mian wirusa, wspierając wczesny etap przesiewowy i identyfikację związków wiodących.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny ze standardami klinicznych biomarkerów dzięki kalibracji ilościowej do międzynarodowych referencji WHO.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć in vitro do walidacji przedklinicznej poprzez standaryzowany pomiar wiremii.
- Wspiera rozwój z uwzględnieniem analizy ryzyka, dostarczając ilościowych punktów końcowych do oceny skuteczności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół RT-PCR integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania przedkliniczne, umożliwiając spójną kwantyfikację ładunku wirusowego i wspierając ciągłość translacyjną.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe oznaczanie HBV DNA w modelach eksperymentalnych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków i standaryzacji testów.
- Analityka: Dostarcza precyzyjne wartości Ct, kalibrację krzywej standardowej oraz wskaźniki wydajności w celu rzetelnego porównywania danych.
- Badania translacyjne: Zapewnia zgodność ze standardami klinicznymi i wspiera podejmowanie decyzji w oparciu o biomarkery.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny, ustandaryzowany przepływ pracy, który można dostosować do różnych programów badawczych nad HBV oraz programów rozwoju leków przeciwwirusowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych HBV.
- Wartość operacyjna: Zapewnia wysoką powtarzalność, czułość i stosowalność w różnych genotypach dla skalowalnych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie portfelem kapitałowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów na leki przeciwwirusowe.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu wirusologii molekularnej oraz ilościowej analizy PCR.
- Konieczny jest dostęp do aparatury do PCR w czasie rzeczywistym oraz zwalidowanych wzorców kalibracyjnych.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja parametrów progu (threshold) i wydajności pomiędzy zespołami.
- Metoda musi być dostosowana do różnych genotypów HBV oraz macierzy próbek.
- Kluczowe jest przestrzeganie rygorystycznych kontroli jakości w celu uniknięcia wyników fałszywie ujemnych i zapewnienia integralności testu.
