Name: Test aspiracji mikropipet fluorescencyjnych w celu zbadania mechanosensacji czerwonych krwinek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj technikę fluorescencyjnej aspiracji mikropipet w badaniu mechanosensacji czerwonych krwinek. Metoda umożliwia analizę napływu jonów wapnia pod wpływem sił mechanicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Nurul Aisha Zainal Abidin i Laura Moldovan za dodatkową rekrutację dawców, pobranie krwi i wsparcie w zakresie flebotomii. Dziękujemy Tomasowi Andersonowi i Arianowi Nasserowi za zorganizowanie sprzętu i odczynników. Badania te zostały sfinansowane przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. A.J.); Narodowa Rada Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) Australia Ideas Grant (APP2003904-L. A.J.); Dotacja na sprzęt NHMRC-L.A.J.; Program Budowania Zdolności Sercowo-Naczyniowych Nowej Południowej Walii (Grant Researcher Grant-L.A.J.); Grant na innowacje badawcze NSW CVRN-VCCRI; Biuro ds. Zaangażowania Globalnego i Badawczego (Sydney-Glasgow Partnership Collaboration Award-L.A.J.); L.A.J. jest stypendystą National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2 (105863) oraz Snow Medical Research Foundation (2022SF176).

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez Komisję Etyki Badań z Udziałem Ludzi Uniwersytetu w Sydney. Od dawców biorących udział w tym badaniu uzyskano świadomą zgodę.
1. Izolacja ludzkich erytrocytów (RBC)
UWAGA: Krok 1.1 powinien być wykonany przez przeszkolonego flebotomistę zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Bioetyczną (Institutional Review Board).
<ol>
	<li>Pobrać 5 ml krwi z żyły łokciowej środkowej, używając igły motylkowej 19 G.</li>
	<li>Przenieś pobraną krew do probówki o pojemności 15 ml zawierającej enoksaparynę w stężeniu 1:200 w celu zapobiegania krzepnięciu.</li>
	<li>Rozcieńczyć 5 µL przeciwkrzepliwej enoksaparyną krwi w 1 ml buforu węglanowo-wodorowęglanowego (bufor C, pH = 8,5-9; Tabela materiałów).</li>
	<li>Odwiruj rozcieńczoną próbkę krwi przy 900 × g przez 1 min, aby doprowadzić do sedymentacji erytrocytów. Ostrożnie odlej nadsącz, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Przemyć osad RBC dwukrotnie, używając 1 ml buforu C (Tabela materiałów), każdorazowo wirując przy 900 × g przez 1 min.</li>
	<li>Następnie osad erytrocytów należy przemyć dwukrotnie 1 ml buforu Tyrode’a, stosując te same warunki wirowania, a następnie zawiesić końcowy osad w 1 ml buforu Tyrode’a, aby otrzymać przemyty roztwór zapasowy zawiesiny erytrocytów.</li>
</ol>
2. Obciążanie wskaźnikiem wapnia
<ol>
	<li>Dostosuj stężenie przemytej roztworu zapasowego RBC do 10 × 106 komórek/mL w buforze Tyrode'a, na podstawie liczby komórek uzyskanej za pomocą automatycznego licznika komórek (Tabela materiałów).</li>
	<li>Oznacz wapń wewnątrz RBC, inkubując je z 16,67 µM Cal-520 AM, barwnikiem wrażliwym na wapń, podczas mieszania na rotacyjnym mieszalniku do probówek przez 1 h.</li>
	<li>Rozcieńcz RBC w buforze Tyrode'a zawierającym 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w stosunku 1:50. Komórki są teraz gotowe do użycia w eksperymentach.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie mikropipet
<ol>
	<li>Zamocuj borokrzemianową kapilarną rurkę szklaną (średnica zewnętrzna 1 mm x średnica wewnętrzna 0,6 mm) w wyciągaczu mikropipet P-1000, aby wytworzyć dwie odpowiadające sobie mikropipety z zamkniętymi końcówkami w miejscu wyciągania, korzystając z zaprogramowanego programu wyciągania. W tej konfiguracji zastosuj następujące wartości programu wyciągania: heat 516, pull 150, velocity 75, time 250, oraz pressure 500. 
	UWAGA: Parametry grzania i wyciągania ustawione w programie wyciągania mogą być dostosowane i zależą od pożądanych ustawień projektu eksperymentalnego12. PUNKT KONTROLNY (patrz Supplemental Table S1).</li>
	<li>Otwórz zamkniętą końcówkę, mocując jedną z zamkniętych mikropipet uzyskanych po wyciąganiu w przecinaku do mikropipet. Ustaw temperaturę grzania na około 50-60 °C.</li>
	<li>Zlokalizuj mikropipetę za pomocą okularu 10x. Przesuń mikropipetę blisko borokrzemianowej kuleczki szklanej, korzystając z pokręteł regulacyjnych.</li>
	<li>Zmień okular na 30x przed ustawieniem mikropipety tak blisko borokrzemianowej kuleczki szklanej, jak to możliwe, bez wyginania końcówki pipety.</li>
	<li>Zmiękcz borokrzemianową kuleczkę szklaną za pomocą ciepła, naciskając pedał grzewczy. Delikatnie wprowadź surową, zamkniętą końcówkę mikropipety do zmiękczonej kuleczki, aż do osiągnięcia pożądanego punktu końcowego, czyli średnicy otworu.</li>
	<li>Zwolnij pedał i pozwól kuleczce szklanej ostygnąć. Upewnij się, że końcówka mikropipety przez cały czas pozostaje wewnątrz kuleczki. 
	UWAGA: Dalsze wprowadzanie końcówki prowadzi do uzyskania większych średnic otworu.</li>
	<li>Delikatnie wyciągnij mikropipetę, co doprowadzi do uzyskania czystego, prostego cięcia na zamkniętej mikropipecie. Potwierdź, że końcowa średnica kapilary wynosi 1 µm. 
	​UWAGA: PUNKT KONTROLNY (patrz Supplemental Table S1)</li>
</ol>
4. Przygotowanie komory komórkowej
<ol>
	<li>Za pomocą rysika diamentowego podziel standardowe szkiełko nakrywowe o wymiarach 40 mm x 22 mm x 0,17 mm na trzy równe paski.</li>
	<li>Przymocuj jeden kawałek dociętego szkiełka nakrywki do dna wykonanego samodzielnie uchwytu komory, używając smaru próżniowego. 
	UWAGA: Uchwyt do komory składa się z dwóch metalowych (miedzianych/aluminiowych) kwadratów połączonych zakrzywionym uchwytem. Odległość między blokami metalowymi musi wynosić mniej niż 40 mm, aby docięte szkiełko nakrywkowe przylegało do uchwytu, tworząc równoległą komorę.</li>
	<li>Przyklej drugi kawałek dociętego szkiełka nakrywki do górnej części wykonanego samodzielnie uchwytu komory, używając smaru próżniowego. 
	UWAGA: PUNKT KONTROLNY (patrz Tabela uzupełniająca S1)</li>
	<li>Wstrzyknąć 200 µL zawiesiny znakowanych erytrocytów (RBC) pomiędzy dwiema szkiełkami nakrywkowymi za pomocą 200 µL dozownik automatyczny (Rysunek 1).</li>
</ol>
<img alt="Schemat komory do obserwacji przepływu krwi; erytrocyty pod szkiełkiem podstawowym w uchwycie komory." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ilustracja komory z komórkami. Dwa docięte kawałki szkiełka podstawowego o wymiarach 40 mm x 22 mm x 0,17 mm są przytwierdzone do uchwytu komory za pomocą smaru. Między dwa docięte szkiełka podstawowe nanosi się około 200 µL zawiesiny komórek w buforze Tyrode'a. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
5. Montaż zestawu do aspiracji mikropipetą
<ol>
	<li>Zamocuj komorę komórkową do uchwytu znajdującego się na platformie mikroskopu. Dostosuj pozycję tak, aby komora komórkowa znajdowała się bezpośrednio nad obiektywem (Rysunek 2B).</li>
	<li>Obniż uchwyt mikropipety poniżej poziomu cieczy w podłączonym zbiorniku z wodą.</li>
	<li>Wprowadź wodę zdemineralizowaną lub bufor Tyroda do wykonanej mikropipety i ostrożnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza za pomocą strzykawki z igłą 34 G (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Odkręć końcówkę uchwytu mikropipety do połowy i pozwól wodzie ściekać z uchwytu mikropipety przez kilka sekund. 
	UWAGA: PUNKT KONTROLNY (patrz Tabela uzupełniająca S1)</li>
	<li>Wsuń mikropipetę do końcówki uchwytu. Dokręć śrubę uchwytu, aby upewnić się, że mikropipeta jest stabilna.</li>
	<li>Wprowadź mikropipetę do komory komórkowej, a następnie zlokalizuj mikropipetę i erytrocyty (RBCs) pod mikroskopem. Użyj mikromanipulatora do regulacji pozycji.</li>
	<li>Obniż dalej końcówkę mikropipety, aby upewnić się, że znajduje się ona na tym samym poziomie co zlokalizowany erytrocyt. 
	UWAGA: PUNKT KONTROLNY (patrz Tabela uzupełniająca S1)</li>
	<li>Wyzeruj ciśnienie hydrauliczne na końcówce mikropipety, regulując wysokość zbiornika z wodą. Następnie lekko podnieś zbiornik z wodą, aby wytworzyć niewielkie ciśnienie dodatnie na końcówce.</li>
</ol>
6. Przeprowadzenie testu aspiracji mikro-pipetą z detekcją fluorescencyjną
<ol>
	<li>Włącz źródło światła wzbudzenia fluorescencyjnego o długości fali 488 nm. Na tym etapie nie otwieraj migawki fluorescencyjnej, aby uniknąć fotoblaknięcia (Rysunek 2C). Włącz kamerę fluorescencyjną oraz kamerę do obrazowania w świetle przechodzącym. 
	UWAGA: Obie kamery są obsługiwane za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>W oprogramowaniu ustaw pożądany czas ekspozycji (100 ms dla obu kamer w niniejszym badaniu), obszar zainteresowania (ROI) oraz rozmiar binningu (brak w niniejszym badaniu) dla obu kamer. Otwórz panel akwizycji wielowymiarowej, aby ustawić liczbę klatek akwizycji (2 000 w niniejszym badaniu) oraz katalog zapisu. 
	UWAGA: Liczba klatek akwizycji zależy od pożądanej liczby zdarzeń aspiracji, które mają zostać zarejestrowane. Dla 1 zdarzenia aspiracji zakres liczby klatek akwizycji powinien zostać ustawiony w przedziale 100-500, co odpowiada około 10-50 s.</li>
	<li>Używając mikromanipulatora, zlokalizuj mikropipetę w polu widzenia.</li>
	<li>Włącz pneumatyczny zacisk ciśnieniowy, w tym jednostkę sterującą i system zaciskowy (Rysunek 2A). Upewnij się, że jednostka sterująca znajduje się w trybie EXTRNL. Skompensuj wszelkie ciśnienie offsetowe wewnątrz systemu, powoli obracając pokrętłem.</li>
	<li>Uruchom osobne oprogramowanie sterujące zaciskiem pneumatycznym. Oprogramowanie posiada panel sterowania elektrycznego do kontroli dyskretnego wejścia analogowego systemu zacisku. Ciśnienie jest regulowane z wykorzystaniem współczynnika konwersji 20 mV/mmHg.</li>
	<li>Wyzeruj ciśnienie wewnątrz systemu. Ostrożnie przesuń mikropipetę w pobliże RBC. Dostosuj położenie zbiornika z wodą, aż przy końcówce mikropipety zostanie zauważone subtelne ciśnienie dodatnie.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję w oprogramowaniu do obsługi kamer. Otwórz migawkę fluorescencyjną.</li>
	<li>Wykonaj aspirację RBC, wpisując w panelu sterowania obliczoną wartość napięcia, aby osiągnąć pożądane ciśnienie. 
	UWAGA: Ciśnienie do aspiracji RBC mieści się zazwyczaj w zakresie Δp = -5 do -40 mmHg. W końcówce mikropipety powinno być widoczne wyraźne wydłużenie języczka komórki (Rysunek 2D).</li>
	<li>Utrzymaj ciśnienie przez zaprogramowany czas, a następnie je zwolnij.</li>
	<li>Przesuń mikropipetę, aby pobrać kolejną komórkę i powtórz eksperyment.</li>
</ol>
7. Analiza intensywności fluorescencji
<ol>
	<li>Wczytaj zapisane obrazy fluorescencyjne do oprogramowania do analizy.</li>
	<li>Dostosuj próg intensywności (intensity threshold) za pomocą karty regulacji wyświetlania (display adjustment). Można to zrobić, wpisując wartości ręcznie lub korzystając z suwaka, aby zapewnić wyraźny kontrast komórki na obrazach fluorescencyjnych w oprogramowaniu do analizy (patrz: Supplemental File 1-Supplemental Figure S1).</li>
	<li>Przewiń do osi czasu na dole ekranu oprogramowania. Zlokalizuj wyznaczone zdarzenie aspiracji.</li>
	<li>Kliknij Add new surfaces. Zdefiniuj ROI (obszar zainteresowania) dla analizy. 
	UWAGA: Oprogramowanie oferuje prowadzony w pięciu krokach proces dostrajania i kończenia segmentacji (patrz: Supplemental File 1-Supplemental Figure S2 oraz Supplemental Figure S3). 
	UWAGA: Utrzymuj ROI w możliwie najmniejszym rozmiarze, aby zaoszczędzić zasoby obliczeniowe.</li>
	<li>Użyj suwaka odejmowania tła oraz dostosuj próg segmentacji za pomocą suwaka, aby uzyskać najlepszy wynik segmentacji. 
	UWAGA: Oznacza to, że poza zdarzeniem aspiracji, tło powinno być segmentowane jak najdokładniej (patrz: Supplemental File 1-Supplemental Figure S4 oraz Supplemental Figure S5).</li>
	<li>Dodaj filtr powierzchni (area), aby wykluczyć szumy tła (patrz: Supplemental File 1-Supplemental Figure S6). 
	UWAGA: Jest to wykonywane na etapie post-processingu.</li>
	<li>Wybierz kartę statistics | kartę detailed | kartę average values. Przewiń, aby znaleźć i zaznaczyć średnią intensywność (intensity mean) (patrz: Supplemental File 1-Supplemental Figure S7).</li>
	<li>Wyeksportuj przebieg sygnału fluorescencji w czasie do pliku .csv.</li>
	<li>Otwórz wyeksportowany plik csv. Odejmij sygnały tła, Fb, od wszystkich pomiarów.</li>
	<li>Oblicz zmianę intensywności wapnia, ΔFmax, korzystając z równania (1): 
	<img alt="Wzór na statyczną równowagę równanie ΔFmax do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/66265/66265eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">     (1) 
	Gdzie ΔFmax to maksymalna zmiana intensywności wapnia, Fb to intensywność tła, a F0 to intensywność spoczynkowa.</li>
</ol>
<img alt="Ustawienie mikroskopu odwróconego do mikromanipulacji; schemat pola jasnego i fluorescencji dla analizy RBC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zespół do aspiracji mikropipetą sprzężonej z fluorescencją. (A>) Przegląd sprzętowy systemu fMPA obejmujący mikroskop odwrócony połączony z kamerami pola jasnego i fluorescencji. Lewa strona obrazu przedstawia wykonany własnoręcznie manometr wodny oraz skrzynkę sterującą, która pozwala na precyzyjne dostrojenie ciśnienia pompy pneumatycznej. (B>) Stolik mikroskopu przedstawiający komorę eksperymentalną z komórkami oraz system mikromanipulatora z pojedynczą mikropipetą. (C>) Schemat ustawienia systemu fMPA. Równoczesne obrazowanie sygnałów pola jasnego (żółty) i fluorescencji (emisja niebieska, wzbudzenie zielone) z wykorzystaniem dwóch luster dichroicznych do kierowania ścieżek światła ze źródła światła fluorescencyjnego (niebieski) do celu, a następnie do kamer do obrazowania (zielony). (D>) Górny rząd przedstawia obrazy w polu jasnym, natomiast dolny rząd prezentuje obrazy fluorescencyjne. Po lewej znajduje się pozycja mikropipety przed aspiracją, gdy RBC spoczywa. Środkowa kolumna ukazuje proces aspiracji, w którym RBC poddano ujemnemu ciśnieniu -40 mmHg. Po prawej przedstawiono morfologię komórki po poddaniu jej ujemnemu ciśnieniu aspiracyjnemu. Pasek skali = 5 µm. Skróty: fMPA = Fluorescence-coupled Micropipette Aspiration; DM = lustro dichroiczne; RBC = czerwony krwinek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Single-Cell Mechanobiology Using Fluorescence Micropipette Aspiration

<ol><li>González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+micropipette+aspiration%3A+applications+in+cell+biomechanics%2C+models%2C+and+extended+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies.</a> Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).</li>
<li>Mierke, C. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMierke%2C+CT+%22Physics+of+Cancer%2C+Volume+3+%28Second+Edition%29%3A+Experimental+biophysical+techniques+in+cancer+research%22">Physics of Cancer, Volume 3 (Second Edition): Experimental biophysical techniques in cancer research</a>. , IOP Publishing. (2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+F-BAR+protein+CIP4+reduces+platelet+production+by+impairing+membrane-cytoskeleton+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Loss of the F-BAR protein CIP4 reduces platelet production by impairing membrane-cytoskeleton remodeling.</a> Blood. 122 (10), 1695-1706 (2013).</li>
<li>Shin, J. -W., Swift, J., Spinler, K. R., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-II+inhibition+and+soft+2D+matrix+maximize+multinucleation+and+cellular+projections+typical+of+platelet-producing+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Myosin-II inhibition and soft 2D matrix maximize multinucleation and cellular projections typical of platelet-producing megakaryocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11458-11463 (2011).</li>
<li>Liapis, H., Foster, K., Miner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+cell+traverse+through+thin+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Red cell traverse through thin glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 61 (2), 762-763 (2002).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-coupled+micropipette+aspiration+assay+to+examine+calcium+mobilization+caused+by+red+blood+cell+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-coupled micropipette aspiration assay to examine calcium mobilization caused by red blood cell mechanosensing.</a> European Biophysics Journal. 51 (2), 135-146 (2022).</li>
<li>Danielczok, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+passage+of+small+capillaries+is+associated+with+transient+Ca2%2B-mediated+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Red blood cell passage of small capillaries is associated with transient Ca2+-mediated adaptations.</a> Frontiers in Physiology. 8, 979(2017).</li>
<li>Diez-Silva, M., Dao, M., Han, J., Lim, C. -T., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+and+biomechanical+characteristics+of+human+red+blood+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Shape and biomechanical characteristics of human red blood cells in health and disease.</a> MRS Bulletin. 35 (5), 382-388 (2010).</li>
<li>Maître, J. -L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+cell-autonomous+contractility+drives+compaction+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo.</a> Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> eLife. 5, e15447(2016).</li>
<li>Bogdanova, A., Makhro, A., Wang, J., Lipp, P., Kaestner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+red+blood+cells-a+perilous+balance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Calcium in red blood cells-a perilous balance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (5), 9848-9872 (2013).</li>
<li>Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf">https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf</a> (2018).</li>
<li>Cahalan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+links+mechanical+forces+to+red+blood+cell+volume%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume.</a> eLife. 4, e07370(2015).</li>
<li>Sforna, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+controls+cell+volume+and+migration+by+modulating+swelling-activated+chloride+current+through+Ca2%2B+influx%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Piezo1 controls cell volume and migration by modulating swelling-activated chloride current through Ca2+ influx.</a> Journal of Cellular Physiology. 237 (3), 1857-1870 (2022).</li>
<li>High speed pressure clamp. ALA Scientific Instruments. , ALA Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://alascience.com/products/hspc-2sb/">https://alascience.com/products/hspc-2sb/</a> (2023).</li>
<li>Teledyne Imaging Prime 95BTM Scientific CMOS Camera Datasheet. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf">https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf</a> (2020).</li>
<li>Lee, L. M., Lee, J. W., Chase, D., Gebrezgiabhier, D., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+advanced+microfluidic+micropipette+aspiration+device+for+single+cell+mechanics+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Development of an advanced microfluidic micropipette aspiration device for single cell mechanics studies.</a> Biomicrofluidics. 10 (5), 054105(2016).</li>
<li>Weaver, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+high-throughput+single-cell+microtechnologies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in high-throughput single-cell microtechnologies.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 114-123 (2014).</li>
<li>Zhou, E. H., Lim, C. T., Quek, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+element+simulation+of+the+micropipette+aspiration+of+a+living+cell+undergoing+large+viscoelastic+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanics+of+Advanced+Materials+and+Structures%22%5BJournal%5D)">Finite element simulation of the micropipette aspiration of a living cell undergoing large viscoelastic deformation.</a> Mechanics of Advanced Materials and Structures. 12 (6), 501-512 (2005).</li>
<li>Oh, M. -J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+substrate-attached+cells+to+estimate+cell+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e3886(2012).</li>
<li>Rand, R. P., Burton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+red+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the red cell membrane.</a> Biophysical journal. 4 (4), 303-316 (1964).</li>
<li>Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+cell+adhesion+by+using+micropipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration.</a> Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).</li>
<li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+E%22%5BJournal%5D)">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European Physical Journal E. 14 (2), 149-167 (2004).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).</li>
<li>Pu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+single+cells+for+both+mechanical+and+electrical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of single cells for both mechanical and electrical characterization.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (11), 3185-3191 (2019).</li>
<li>Guevorkian, K., Maître, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10+-+Micropipette+aspiration%3A+A+unique+tool+for+exploring+cell+and+tissue+mechanics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 10 - Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo.</a> Methods in Cell Biology. , 187-201 (2017).</li>
<li>Biro, M., Maître, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+14+-+Dual+pipette+aspiration%3A+A+unique+tool+for+studying+intercellular+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 14 - Dual pipette aspiration: A unique tool for studying intercellular adhesion.</a> Methods in Cell Biology. 125, 255-267 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych sprzecznych interesów do zgłoszenia w odniesieniu do niniejszego badania.

Testy aspiracyjne mikropipet ucieleśniają udoskonaloną metodologię, wykorzystując znaczną modulację ciśnienia, dokładną orkiestrację przestrzenną i niezawodne rozeznanie czasowe w celu zbadania głębokich zawiłości biomechaniki komórkowej. W badaniu tym położono szczególny nacisk na zastosowanie fMPA jako kluczowego narzędzia do ujawnienia zniuansowanych reakcji mechanowrażliwych prezentowanych przez erytrocyty pod wpływem różnych bodźców. Równoczesne wykorzystanie sygnałów jasnego pola i fluorescencji umożliwiło wieloaspektową eksplorację zjawisk komórkowych, posuwając naprzód monitorowanie i wykrywanie wewnątrzkomórkowego napływu wapnia w czasie rzeczywistym. Podejście to zapewnia kompleksowy wgląd w złożone reakcje mechanodetne erytrocytów.
Co ważne, zastosowanie techniki fMPA wykracza poza erytrocyty, ponieważ można ją stosować w przypadku innych typów komórek, które nie stosują wysokiej czułości mechanicznej, takich jak płytki krwi i neurony9. Ponadto, ze względu na minimalny wpływ na integralność komórki podczas pracy eksperymentalnej, fMPA gwarantuje zachowanie naturalnego stanu komórki, dzięki czemu doskonale nadaje się do stosowania z komórkami pierwotnymi1. Co więcej, metoda fMPA oferuje wszechstronność dzięki regulowanej geometrii mikropipet, co pozwala na szerszy zakres projektów eksperymentalnych dostosowanych do konkretnych pytań badawczych i efektywną eksplorację różnych warunków mechanicznych.
Dodatkowo, dzięki ulepszeniu szlaku optycznego, który zwiększa jednoczesne wykorzystanie obrazowania multifluorescencyjnego, system fMPA pozwala na wykrywanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia podczas aspiracji. Ta zdolność otwiera możliwość badania cząsteczek związanych z wapniem, takich jak mechanowrażliwy kanał jonowy PIEZO1, który, jak wykazano, pośredniczy i odbiera mechaniczne sygnały ze środowiska zewnętrznego 7,14. Najnowsza literatura zwraca uwagę na wzrost napięcia błony jako istotny czynnik stymulujący aktywność kanału PIEZO1, a następnie ułatwiający napływ Ca2+ 6. Podkreśla to kluczowe zastosowanie fMPA, które polega na badaniu wzajemnych zależności między napięciem błony, PIEZO1 i napływem wapnia, rzucając światło na skomplikowane procesy mechanosensacyjne w komórkach.
Z technicznego punktu widzenia warto wspomnieć, że dwoma podstawowymi elementami systemu fMPA, odpowiedzialnymi za generowanie siły zasysającej (bodźców mechanicznych) oraz prowadzenie obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym, są odpowiednio pneumatyczna pompa ciśnieniowa i kamera fluorescencyjna. Wybór odpowiedniej pompy i kamery do systemu powinien opierać się na konkretnym typie komórki i badanym procesie biologicznym. Pompa zastosowana w naszym systemie pracuje w ustalonym zakresie ciśnienia ± 200 mmHg i może reagować na polecenia dotyczące zmian ciśnienia nawet ± 200 mmHg. Czas narastania i opadania ciśnienia nie powinien przekraczać 6-8 ms dla kroku 20 mmHg i 15-20 ms dla kroku 200 mmHg. Aby zapewnić rozdzielczość siły, poziom szumów systemu HSPC powinien być mniejszy niż ± 0,5 mmHg, od szczytu do szczytu. Te wymagania są stosowane w tej konfiguracji; jednak zakres ± 40 mmHg jest wystarczający do uzyskania odpowiedzi dla protokołu eksperymentalnego15. Jeśli chodzi o kamerę fluorescencyjną, wybraliśmy cechy 95% wydajności kwantowej i układ o rozmiarze piksela 11 μm x 11 μm. Ta czuła konfiguracja czujnika skutecznie wychwytuje sygnał fluorescencyjny z dużą prędkością. Ponadto kluczowe jest utrzymanie mediany szumu odczytu na poziomie 1,6e- dla odpowiedniego stosunku sygnału do szumu podczas obrazowania16.
Z proceduralnego punktu widzenia wykonanie fMPA wymaga zestawu zaawansowanych umiejętności. Na przykład tworzenie mikropipet za pomocą obcinaka do mikropipet wymaga precyzji i zręczności, a także skrupulatnej kontroli temperatury i położenia. Umieszczenie mikropipety w polu widzenia mikroskopu wymaga skrupulatnego wysiłku, aby uniknąć uszkodzenia zarówno końcówki mikropipety, jak i komory komórkowej. Ponadto jednym z powszechnych wyzwań związanych z obrazowaniem fluorescencyjnym jest fotowybielanie. Aby złagodzić ten problem, ważne jest, aby zminimalizować czas ekspozycji próbki na system oświetleniowy. W odniesieniu do protokołu "testu aspiracji mikropipet sprzężonych z fluorescencją" migawka fluorescencyjna źródła światła wzbudzającego pozostaje wyłączona do momentu, gdy wszystkie parametry zostaną wprowadzone przez oprogramowanie obsługujące kamerę i system aspiracji będzie gotowy do eksperymentów. Dopiero wtedy włączana jest migawka fluorescencyjna, aby rozpocząć obrazowanie. Aby jeszcze bardziej ograniczyć fotowybielanie, zaleca się stosowanie minimalnego natężenia źródła światła, które nadal zapewnia odpowiednią ekspresję fluorescencji w próbce.
Co więcej, obecna ręczna operacja wymagana do testów fMPA sprawia, że technika ta jest pracochłonna. W związku z tym niespójności, które mogą pojawić się w tym teście, wynikają przede wszystkim ze zmiennych zależnych od operatora, a także z czynników związanych z różnicami w podgrzewaniu żarnika i charakterystyce szkła kapilarnego. W przyszłości optymalizacja wydajności tej techniki będzie wymagała rozważenia potencjalnych wdrożeń tandemowych. Na przykład, w połączeniu z urządzeniami mikroprzepływowymi, aspiracja mikropipet może zostać przekształcona w platformę o wysokiej przepustowości, co znacznie zwiększa szybkość eksperymentów z około 20 komórek na godzinę do około 1000 komórek/h17,18. To włączenie poprawia również odtwarzalność danych. Ponadto z powodzeniem zbadano pewne możliwości poprzez włączenie systemów automatyzacji i analizy obrazu19 . Warto zauważyć, że analiza elementów skończonych (MES) jest narzędziem obliczeniowym powszechnie stosowanym do modelowania testów aspiracji mikropipet. MES może przewidywać reakcję komórkową na bodźce mechaniczne i charakteryzować ich właściwości mechaniczne. Ma on potencjał do optymalizacji konstrukcji mikropipet i dalszej walidacji wyników eksperymentalnych19.
Podsumowując, podejście fMPA oferuje cenny wgląd w mechanowrażliwe zachowania erytrocytów w reagowaniu na bodźce mechaniczne. Badanie to ustanawia fundamentalne ramy dla przyszłych badań nad skomplikowanymi mechanizmami mechanotransdukcji w obrębie erytroinów czerwonych i w szerszych systemach biologicznych. Takie badania są bardzo obiecujące, jeśli chodzi o pogłębienie naszego zrozumienia tych mechanizmów i rozwikłanie ich rozległych implikacji w różnych kontekstach fizjologicznych.

Rozwijające się odkrycia w świecie zachowań komórkowych uwydatniły rolę bodźców mechanicznych, takich jak napięcie, naprężenie ścinające płyn, kompresja i sztywność podłoża, w dyktowaniu dynamicznych aktywności komórkowych, takich jak adhezja, migracja i różnicowanie. Te mechanobiologiczne aspekty mają ogromne znaczenie w wyjaśnianiu, w jaki sposób komórki oddziałują i reagują na swoje środowisko fizjologiczne, wpływając na różne procesy biologiczne1,2.
W ciągu ostatniej dekady, testy aspiracji oparte na mikropipetach wyróżniały się jako wszechstronne narzędzie do badania różnych reakcji komórkowych na bodźce mechaniczne. Technika ta dostarcza cennych informacji na temat wewnętrznych właściwości mechanicznych żywych komórek na poziomie pojedynczej komórki, w tym modułu sprężystości komórek, sztywności i napięcia korowego. Testy te umożliwiają pomiar różnych parametrów mechanicznych, takich jak napięcie błony komórkowej, nacisk wywierany na błonę komórkową i napięcie kory mózgowej (podsumowane w tabeli 1). Badanie sił aspiracyjnych wzbogaciło naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób wpływają one na funkcje i procesy komórkowe, szczególnie w dziedzinie dynamiki błony, w tym fragmentacji, wydłużania i pączkowania3,4.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr mechaniczny</td>
			<td>opis</td>
			<td>Nowatorskie podejścia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sztywność komórki</td>
			<td>Pomiar sztywności mechanicznej i elastyczności ogniwa.</td>
			<td>Aspiracja błony komórkowej i analiza reakcji na odkształcenia na podciśnienie20,21.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siła przyczepności</td>
			<td>Ocena, jak silnie komórki przylegają do powierzchni.</td>
			<td>Zastosowanie kontrolowanego ssania w celu oderwania przylegających komórek od podłoża2,22.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naprężenie membrany</td>
			<td>Ocena napięcia lub stresu w błonach komórkowych.</td>
			<td>Pomiar odkształcenia membrany w odpowiedzi na przyłożone ciśnienie23,24.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Właściwości lepkosprężyste</td>
			<td>Charakterystyka połączonego lepkości i sprężystości komórki.</td>
			<td>Analiza zależnej od czasu reakcji na odkształcenie na aspirację23,25.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odkształcalność</td>
			<td>Określenie, jak łatwo komórka może zmienić kształt.</td>
			<td>Ocena zakresu odkształcenia pod wpływem kontrolowanego ssania20,24.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>napięcie powierzchniowe</td>
			<td>Pomiar napięcia na powierzchni ogniwa.</td>
			<td>Ocena ciśnienia wymaganego do wytworzenia wystającego elementu membrany mikropipety26.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interakcja komórka-materiał</td>
			<td>Badanie interakcji między komórkami a materiałami lub substratami.</td>
			<td>Aspiracja komórek mających kontakt z różnymi materiałami i obserwacja oddziaływań2,24.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interakcja komórka-komórka</td>
			<td>Badanie oddziaływań między sąsiednimi komórkami.</td>
			<td>Aspiracja grupy komórek i analiza ich sił międzykomórkowych27.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry mechaniczne scharakteryzowane przez test aspiracji mikropipet.
Technika aspiracji oparta na mikropipetach jest szeroko stosowana do badania czerwonych krwinek (RBC), oceny odkształcalności i różnych cech mechanicznych krwinek czerwonych, co jest niezbędne do zrozumienia ich funkcji w układzie krążenia. Erytrocyty czerwone wykazują niezwykłą zdolność adaptacji, zachowując swoją mechaniczną wszechstronność przed deformacją podczas poruszania się po skomplikowanej sieci naczyń włosowatych i szczelinach międzyśródbłonkowych5,6. Podczas tej podróży RBC muszą pokonywać przejścia o szerokości zaledwie 0,5-1,0 μm, poddając się wielu siłom mechanicznym, w tym rozciąganiu i ściskaniu7,8,9. Mają również wysoką wrażliwość na naprężenia ścinające generowane przez przepływ krwi podczas krążenia10. Procesy te sprzyjają aktywacji mechanizmów regulacyjnych związanych z napływem wapnia, kluczowym zdarzeniem sygnalizacyjnym o dobrze ugruntowanej roli w odpowiedziach komórkowych na bodźce mechaniczne11,12. Złożone mechanizmy rządzące mechanosensacją za pośrednictwem wapnia pozostają fascynującymi przedmiotami trwających badań.
W tym kontekście, fMPA jest skutecznym podejściem do ujawnienia zakresu mobilizacji wapnia pod precyzyjnie kontrolowanymi siłami mechanicznymi, pozwalając na jednoczesne zastosowanie modulacji mechanicznej (przy użyciu systemu aspiracji mikropipet) i wizualizację intensywności wapnia (za pomocą wskaźników fluorescencyjnych). W szczególności naśladuje fizjologiczny scenariusz, w którym RBC przemieszcza się przez zwężające się naczynia krwionośne. Warto podkreślić, że opracowany przez nas system fMPA może generować ciśnienie z rozdzielczością 1 mmHg. Zaimplementowana kamera szybkoobrotowa może osiągnąć rozdzielczość czasową 100 ms oraz rozdzielczość przestrzenną na poziomie submikrometrów. Konfiguracje te zapewniają precyzyjne przyłożenie sił mechanicznych do żywych komórek i jednocześnie przechwytują powstałą sygnalizację komórkową. Co więcej, ze względu na zintegrowany charakter tej konfiguracji, test aspiracji mikropipet można łatwo dostosować do innych urządzeń lub technik, umożliwiając dalsze badanie zawiłości mechaniki komórek. Ta wszechstronność jest dodatkowym atutem tego podejścia.

<table><tbody><tr><td>&mikro; Manager</td><td>Micro-Manager</td><td></td><td>Wersja 2.0.0</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>210320D</td><td>Współpracuj z Microfil&nbsp;</td></tr><tr><td>200 i mikro; L Pipeta&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>3123000055</td><td>Preparat komórek czerwonego kloodu</td></tr><tr><td>22 x 40 mm Szkiełka nakrywkowe</td><td>Knittel Glass&nbsp;</td><td>MS0014</td><td>Zespół komory celi</td></tr><tr><td>50 ml Strzykawka&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>220617E</td><td>Podłącz do wieży ciśnień</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Preparat buforowy Tryoda - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2</td></tr><tr><td>Wirówka 5425</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5405000280</td><td>Preparat komórek czerwonego clood</td></tr><tr><td>Clexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1235820</td><td>Aby zapobiec krzepnięciu pobranej krwi. 10 000 U/ml</td></tr><tr><td>DAQami</td><td>Diligent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne źródło światła</td><td>CoolLED</td><td>pE-300</td> System <td>sprzętowy do aspiracji mikropipet</td></tr><tr><td>Kapilara szklana</td><td>Narishige</td><td>G-1</td><td>Produkcja</td></tr> <tr>mikropipet<td>Preparat</td> buforowy Glucose <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełniony 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>Tryode's&nbsp; przygotowanie buforu - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2</td></tr><tr><td>Szybka kamera GigE</td><td>Manta</td><td>G-040B</td> System <td>sprzętowy do aspiracji mikropipet</td></tr><tr><td>Zacisk ciśnieniowy o dużej prędkości</td><td>Instrument naukowy</td><td>HSPC-2-SB</td><td>Współpracuj z pompą ciśnieniową</td></tr><tr><td>Stopień głowicy zaciskowej o dużej prędkości&nbsp;</td><td>Instrument naukowy</td><td>HSPC-2-SB</td><td>Współpracuje z pompą ciśnieniową</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia odwrócona&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td>System <td>sprzętowy do aspiracji mikropipet</td> <td>Olympus IX83</td></tr><tr><td>Mikrofil&nbsp;</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne&nbsp;</td><td>MF34G-5</td><td>34 G (67 mm długości) Odkręcić pęcherzyki powietrza w naciętej mikropipecie i sprawdzić otwarcie końcówki pipety&nbsp;</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet&nbsp;</td><td>Instrument Sutter</td><td>P1000</td><td>Produkcja mikropipet&nbsp;</td></tr><tr><td>Milli Q EQ 7000 System oczyszczania wody ultraczystej</td><td>Merck Millipore</td><td>ZEQ7000T0C</td><td>Bufor węglanowy/wodorowęglanowy i Przygotowanie buforu Tryode</td></tr><tr><td>Pipeta microforge&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Produkcja mikropipet</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Preparat buforowy Tryoda - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukoza uzupełniona 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2</td></tr><tr><td>Pompa ciśnieniowa&nbsp;</td><td>Instrument naukowy</td><td>PV-PUMP</td><td>Indukuj kontrolowane ciśnienie podczas eksperymentu</td></tr><tr><td>Kamera Prime 95B&nbsp;</td><td>Fotometria</td><td>Prime 95B sCMOS</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Jednostka zdalna z kołem obrotowym&nbsp;</td><td>Sensapex&nbsp;</td><td>uM-RM3</td><td>Panel sterowania do regulacji pozycji mikropipet&nbsp;</td></tr><tr><td>Scepter 3.0 Ręczny licznik komórek</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC340KIT</td><td>Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy - 2,65 g NaHCO3 z 2,1 g Na2CO3 w 250 ml wody Mili Q - Końcowe pH = 8-9.</td></tr><tr><td>Węglan sodu (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy - 2,65 g NaHCO3 z 2,1 g Na2CO3 w 250 ml wody Mili Q - Końcowe pH = 8-9.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Preparat buforowy Tryoda - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukozy uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny (NaH2PO4 i byk; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Preparat buforowy Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl i 5,5 mM D-glukoza uzupełnione 1 mM CaCl2. Końcowe pH = 7,2</td></tr><tr><td>Jednostka sterująca z ekranem dotykowym&nbsp;</td><td>Sensapex&nbsp;</td><td>uM-TSC</td><td>Panel sterowania do regulacji pozycji mikropipet&nbsp;</td></tr><tr><td>X suchy obiektyw&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td>Olympus 60x/0,70 LUCPlanFL</td> System <td>do aspiracji mikropipet</td></tr></tbody></table>

test aspiracji mikropipet fluorescencyjnych w celu zbadania mechanosensacji czerwonych krwinek

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing

Testy aspiracji mikropipet od dawna stanowią kamień węgielny w badaniach mechaniki żywych komórek, oferując wgląd w reakcje komórek na stres mechaniczny. W artykule opisano innowacyjną adaptację testu aspiracji mikropipet sprzężonych z fluorescencją (fMPA). Test fMPA wprowadza możliwość precyzyjnego administrowania siłami mechanicznymi przy jednoczesnym monitorowaniu procesów mechanotransdukcji żywych komórek, w których pośredniczą kanały jonowe. Wyrafinowana konfiguracja obejmuje precyzyjnie zaprojektowaną mikropipetę ze szkła borokrzemianowego podłączoną do precyzyjnie regulowanego zbiornika na wodę i pneumatycznego systemu zasysania, ułatwiając kontrolowane stosowanie ciśnienia z dokładnością ± 1 mmHg. Znaczącym ulepszeniem jest integracja obrazowania epi-fluorescencyjnego, co pozwala na jednoczesną obserwację i kwantyfikację zmian morfologicznych komórek i wewnątrzkomórkowych przepływów wapnia podczas aspiracji. Test fMPA, dzięki synergicznemu połączeniu obrazowania epifluorescencyjnego z aspiracją mikropipet, ustanawia nowy standard w badaniu mechanoczujników komórek w trudnych mechanicznie środowiskach. To wieloaspektowe podejście można dostosować do różnych konfiguracji eksperymentalnych, dostarczając krytycznych informacji na temat mechanizmów mechanodetekcji pojedynczych komórek.

W celu przeprowadzenia testów aspiracji za pomocą mikropipety, najpierw skonstruowaliśmy specjalną komorę komórkową składającą się z dwóch metalowych kwadratów (miedzianego i aluminiowego) połączonych za pomocą uchwytu. Dwie docięte szklane przykrywki (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) zostały przymocowane w celu utworzenia komory wypełnionej 200 µL RBC zawieszonych w buforze Tyrode'a. Po wprowadzeniu RBC do komory, dostosowaną mikropipetę borokrzemianową zamocowano w uchwycie i ostrożnie ustawiono wewnątrz komory za pomocą mikromanipulatora. Następnie mikropipetę zbliżono, aby uchwycić docelowy RBC.
Do aspiracji komórek wykorzystano pneumatyczny szybki zacisk ciśnieniowy w celu precyzyjnego dostrojenia ujemnego ciśnienia aspiracyjnego. Następnie przeprowadzono obrazowanie fluorescencyjne, aby zbadać mobilizację wapnia przy zastosowaniu różnych ujemnych ciśnień aspiracyjnych.
Wykorzystując fMPA do zbadania reakcji erytrocytów (RBCs) na zmienne ujemne ciśnienia aspiracyjne, nasze wyniki wykazały istnienie wyraźnej zależności proporcjonalnej między przyłożonym ciśnieniem ujemnym a napływem wapnia w aspirowanym erytrocycie. Aby określić zmianę intensywności wapnia, maksymalną intensywność pojedynczej aspirowanej komórki (Fmax) pomniejszoną o intensywność tła (Fb) podzielono przez intensywność spoczynkową (F0) pomniejszoną o Fb. Odnotowano odpowiadający wzrost napływu jonów wapnia do erytrocytów wraz ze stopniowym zwiększaniem ciśnienia od -10 mmHg (Rycina 3A) do -40 mmHg (Rycina 3D). Sugeruje to, że erytrocyty posiadają zdolność wyczuwania zmian mechanicznych i reagowania na nie poprzez szybką aktywność kanałów specyficznych dla wapnia14,15.
<img alt="Schemat obrazowania fluorescencyjnego mobilizacji wapnia wraz z wykresami wariancji ciśnienia i intensywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obrazowanie fluorescencyjne z graficzną reprezentacją znormalizowanych zmian intensywności w czasie. Poziomo przedstawiono migawki fluorescencyjne erytrocytów (RBCs) w spoczynku (po lewej) oraz ludzkich erytrocytów podczas aspiracji mikropipetą (środek). Po prawej stronie widoczne są reprezentatywne przebiegi dla erytrocytów aspirowanych przy wielu ujemnych ciśnieniach aspiracji (Δp). Ujemne ciśnienie aspiracji zwiększano stopniowo, zaczynając od (A) Δp = -10 mmHg, (B) Δp = -20 mmHg, (C) Δp = -30 mmHg oraz (D) Δp = -40 mmHg. Podczas wydłużania się „języka” erytrocytu w trakcie aspiracji można zaobserwować znaczną mobilizację wapnia, co objawia się zwiększoną krotnością zmiany sygnału Cal-520 AM. Do badania mobilizacji wapnia wewnątrz aspirowanego erytrocytu wykorzystano stosunek F/F0. Powyższe krzywe wykazują trend, zgodnie z którym sygnał Cal-520 AM rósł proporcjonalnie do wzrostu przyłożonego ujemnego ciśnienia aspiracji. Pasek skali = 5 µm. Skrót: RBCs = erytrocyty. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela uzupełniająca S1: Punkty kontrolne dla kluczowych etapów w protokołach przygotowania fMPA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supplementary%20File%20-%20Table%20S1%20-%20JoVE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Przewodnik po procesie dostrajania i przeprowadzania segmentacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supp%20File%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Badanie zachowania komórek pod wpływem stresu mechanicznego jest kluczowe dla postępów w mechanice komórkowej i mechanobiologii. Wprowadzamy technikę aspiracji mikropipetami fluorescencyjnymi (fMPA), nowatorską metodę łączącą kontrolowaną stymulację mechaniczną z kompleksową analizą sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w pojedynczych komórkach. Technika ta pozwala na przeprowadzenie nowych, dogłębnych badań nad mechanobiologią żywych komórek.

Test aspiracji mikropipet fluorescencyjnych w celu zbadania mechanosensacji czerwonych krwinek

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to ...

Zakres naszych badań ukierunkowany jest na mechanobiologię stylu życia, a konkretnie na zachowanie komórek, w których stosuje się naprężenia mechaniczne. Badamy sygnalizację wewnątrzkomórkową w pojedynczych komórkach. Proponowany system FMPA wykorzystuje obrazowanie fluorescencyjne w połączeniu z bodźcami mechanicznymi.To jest presja aspiracji. Obecnie istnieją dalsze postępy, w ramach których podjęto próbę połączenia więcej niż dwóch technik z konfiguracją mikroaspiracji, takich jak mikrofluidyka lub oprogramowanie do analizy obrazu. Obecne wyzwania eksperymentalne polegają na tym, że konfiguracja jest dość pracochłonna i zależy od obsługi.Ponieważ system jest obsługiwany ręcznie, pojawiają się niespójności w określonych krokach, na przykład podczas wstępnego podgrzewania filamentu. Wyniki badań wykazały, że nastąpił odpowiedni wzrost napływu jonów wapnia do erytrocytów, gdy ciśnienie było stopniowo zwiększane od 10 milimetrów rtęci do 40 milimetrów słupa rtęci. Sugeruje to, że erytrocyty mają zdolność do wyczuwania zmian w swoim środowisku mechanicznym i reagowania na szybką aktywność kanałów związanych z wapniem.Badanie to kładzie szczególny nacisk na zastosowanie FMPA jako kluczowego narzędzia do ujawniania niuansów, zmechanizowanych, wrażliwych reakcji prezentowanych przez erytrocyty pod wpływem różnych bodźców. Aby rozpocząć, zamontuj borokrzemianową rurkę kapilarną na polarnej mikropipecie P1000. Użyj zaprogramowanego programu z grzaniem ustawionym na 516, prędkością ustawioną na 75, czasem ustawionym na 250 i ciśnieniem ustawionym na 500.Zamontuj jedną z zamkniętych mikropipet na obcinaku do mikropipet, aby otworzyć zamkniętą końcówkę. Dostosuj temperaturę ogrzewania do około 50 do 60 stopni Celsjusza. Za pomocą okularu 10x zlokalizuj mikropipetę.Za pomocą pokręteł regulacyjnych przesuń mikropipetę w pobliże kulki ze szkła borokrzemianowego. Zmień okular na 30x. Następnie przesuń mikropipetę jak najbliżej szklanej kulki, nie zginając końcówki pipety.Stań na łopatce grzewczej, aby zmiękczyć szklany koralik pod wpływem ciepła. Delikatnie włóż surową, zamkniętą końcówkę mikropipety do zmiękczonej kulki, aż do uzyskania pożądanej średnicy. Zwolnij pedał nożny, aby szklana koralik ostygł.Następnie delikatnie wyjąć mikropipetę o średnicy jednego mikrometra, wykonując wyraźne proste nacięcie na zamkniętej pipecie. Na początek użyj diamentowego ołówka, aby podzielić standardową szklaną szkiełko okładkowe na trzy równe paski. Użyj smaru próżniowego, aby przykleić kawałek paska szkiełka nakrywkowego do dna domowego uchwytu komory.Podobnie przymocuj drugi kawałek paska szkiełka nakrywkowego do górnej części uchwytu komory. Następnie za pomocą pistoletu do pipet wstrzyknąć 200 mikrolitrów oznakowanej zawiesiny RBC między dwa szkiełka nakrywkowe. Aby zmontować zestaw do aspiracji mikropipet, zamontuj komorę celi na stoliku uchwytu na platformie mikroskopowej.Dostosuj położenie komory, aż znajdzie się bezpośrednio pod obiektywem. Teraz opuść uchwyt, aż znajdzie się poniżej poziomu płynu w podłączonym zbiorniku na wodę. Wstrzyknąć wodę demineralizowaną do mikropipety.Następnie użyj strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 34, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Odkręć koniec uchwytu mikropipety do połowy i pozwól, aby woda kapała z uchwytu przez kilka sekund. Następnie włóż mikropipetę wypełnioną zawiesiną do końcówki uchwytu i dokręć uchwytu.Umieścić mikropipetę w komorze celi. Następnie zlokalizuj pipetę i erytrocyty pod mikroskopem. Opuść końcówkę pipety, aby upewnić się, że jest wypoziomowana z umieszczonym RBC.Dostosuj wysokość zbiornika na wodę, aby wyzerować ciśnienie hydrauliczne na końcówce. Następnie lekko podnieś zbiornik na wodę, aby wytworzyć subtelne nadciśnienie. Włącz fluorescencyjne źródło światła wzbudzającego o długości fali 488 n.Włącz kamerę fluorescencyjną i kamerę przesyłaną. Wprowadź czas ekspozycji, obszar zainteresowania i rozmiar kategoryzacji dla obu kamer w odpowiednim oprogramowaniu. Następnie ustaw numer nabycia na 2000 w wielowymiarowym panelu pozyskiwania.Wybierz żądany katalog zapisywania. Następnie zlokalizuj mikropipetę za pomocą mikromanipulatora. Włącz ciśnienie pneumatyczne clamp i upewnij się, że skrzynka sterownicza jest w trybie zewnętrznym.Powoli obracaj pokrętłem, aby skompensować przesunięcie ciśnienia wewnątrz systemu. Uruchom oprogramowanie sterujące zaciskiem pneumatycznym. Użyj elektrycznego panelu sterowania, aby utrzymać ciśnienie pod kontrolą za pomocą współczynnika konwersji rtęci 20 miliwoltów na milimetr.Teraz wyzeruj ciśnienie wewnątrz systemu. Następnie ostrożnie umieść mikropipetę w pobliżu erytrocytów. Dostosuj położenie zbiornika na wodę, aby wytworzyć subtelne nadciśnienie na końcówce mikropipety.Rozpocznij akwizycję w oprogramowaniu aparatu i włącz migawkę fluorescencyjną. Wpisz obliczoną wielkość napięcia do panelu sterowania, aby osiągnąć żądane ciśnienie i zassać RBC. Przytrzymaj ciśnienie przez określony czas, a następnie zwolnij je.Podobnie, powtórz eksperyment z następnym RBC przed dalszą analizą. Stopniowy wzrost ciśnienia powodował zwiększoną mobilizację jonów wapnia do erytrocytów.

fluorescence-micropipette-aspiration-assay-to-investigate-red-blood

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru sztywności komórek. Ogólna zasada tego podejścia polega na pomiarze deformacji błony w odpowiedzi na ściśle określone podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą mikropipety. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania właściwości biomechanicznych komórek przytwierdzonych do podłoża.

Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

W tym filmie sondy siły biomembranowej (BFP) są używane do pomiaru sił między receptorami i ligandami. Technika ta może wykrywać interakcje poprzez monitorowanie ciśnienia potrzebnego do zerwania wiązań między pMHC sprzężonym na kulkach sondy a TCR na komórkach docelowych.

Sonda wymuszająca biomembranę do ilościowego określania interakcji receptor-ligand

Protokół opisuje szczegółowo eksperymentalną procedurę ilościowego oznaczania agregatów krwinek czerwonych (RBC) pod kontrolowaną i stałą szybkością ścinania, w oparciu o techniki przetwarzania obrazu. Celem tego protokołu jest odniesienie rozmiarów agregatów RBC do odpowiedniej szybkości ścinania w kontrolowanym środowisku mikroprzepływowym.

Kontrolowane środowisko mikroprzepływowe do dynamicznego badania agregacji czerwonych krwinek

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Tutaj opisany jest zintegrowany protokół oparty na pęsetach optycznych i mikroskopii defoksyjnej do pomiaru właściwości reologicznych komórek. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w badaniu właściwości lepkosprężystych erytrocytów w zmiennych warunkach fizjopatologicznych.

Analiza ilościowa właściwości lepkosprężystych krwinek czerwonych przy użyciu pęsety optycznej i mikroskopii defoksyjnej

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Opracowaliśmy metodę odpowiedzi wizualno-motorycznej (Visual-Motor Response), aby ilościowo określić reakcję motoryczną larw zebrafish w odpowiedzi na przyrosty i spadki natężenia światła. Zbadaliśmy również mutanty wzroku zebrafish, w tym mutanty z brakiem odpowiedzi optokinetycznej (nrc), które uznano za całkowicie niewidome podczas testowania za pomocą innego badania wzroku – odruchu optokinetycznego.

Test behawioralny do pomiaru reaktywności rybek zebrafish na zmiany natężenia światła

Poznaj technikę fluorescencyjnej aspiracji mikropipet w badaniu mechanosensacji czerwonych krwinek. Metoda umożliwia analizę napływu jonów wapnia pod wpływem sił mechanicznych.

Test aspiracji mikropipet fluorescencyjnych w celu zbadania mechanosensacji czerwonych krwinek

Przeglądaj więcej filmów