Test aspiracji mikropipet fluorescencyjnych w celu zbadania mechanosensacji czerwonych krwinek

Zakres naszych badań ukierunkowany jest na mechanobiologię stylu życia, a konkretnie na zachowanie komórek, w których stosuje się naprężenia mechaniczne. Badamy sygnalizację wewnątrzkomórkową w pojedynczych komórkach. Proponowany system FMPA wykorzystuje obrazowanie fluorescencyjne w połączeniu z bodźcami mechanicznymi.

To jest presja aspiracji. Obecnie istnieją dalsze postępy, w ramach których podjęto próbę połączenia więcej niż dwóch technik z konfiguracją mikroaspiracji, takich jak mikrofluidyka lub oprogramowanie do analizy obrazu. Obecne wyzwania eksperymentalne polegają na tym, że konfiguracja jest dość pracochłonna i zależy od obsługi.

Ponieważ system jest obsługiwany ręcznie, pojawiają się niespójności w określonych krokach, na przykład podczas wstępnego podgrzewania filamentu. Wyniki badań wykazały, że nastąpił odpowiedni wzrost napływu jonów wapnia do erytrocytów, gdy ciśnienie było stopniowo zwiększane od 10 milimetrów rtęci do 40 milimetrów słupa rtęci. Sugeruje to, że erytrocyty mają zdolność do wyczuwania zmian w swoim środowisku mechanicznym i reagowania na szybką aktywność kanałów związanych z wapniem.

Badanie to kładzie szczególny nacisk na zastosowanie FMPA jako kluczowego narzędzia do ujawniania niuansów, zmechanizowanych, wrażliwych reakcji prezentowanych przez erytrocyty pod wpływem różnych bodźców. Aby rozpocząć, zamontuj borokrzemianową rurkę kapilarną na polarnej mikropipecie P1000. Użyj zaprogramowanego programu z grzaniem ustawionym na 516, prędkością ustawioną na 75, czasem ustawionym na 250 i ciśnieniem ustawionym na 500.

Zamontuj jedną z zamkniętych mikropipet na obcinaku do mikropipet, aby otworzyć zamkniętą końcówkę. Dostosuj temperaturę ogrzewania do około 50 do 60 stopni Celsjusza. Za pomocą okularu 10x zlokalizuj mikropipetę.

Za pomocą pokręteł regulacyjnych przesuń mikropipetę w pobliże kulki ze szkła borokrzemianowego. Zmień okular na 30x. Następnie przesuń mikropipetę jak najbliżej szklanej kulki, nie zginając końcówki pipety.

Stań na łopatce grzewczej, aby zmiękczyć szklany koralik pod wpływem ciepła. Delikatnie włóż surową, zamkniętą końcówkę mikropipety do zmiękczonej kulki, aż do uzyskania pożądanej średnicy. Zwolnij pedał nożny, aby szklana koralik ostygł.

Następnie delikatnie wyjąć mikropipetę o średnicy jednego mikrometra, wykonując wyraźne proste nacięcie na zamkniętej pipecie. Na początek użyj diamentowego ołówka, aby podzielić standardową szklaną szkiełko okładkowe na trzy równe paski. Użyj smaru próżniowego, aby przykleić kawałek paska szkiełka nakrywkowego do dna domowego uchwytu komory.

Podobnie przymocuj drugi kawałek paska szkiełka nakrywkowego do górnej części uchwytu komory. Następnie za pomocą pistoletu do pipet wstrzyknąć 200 mikrolitrów oznakowanej zawiesiny RBC między dwa szkiełka nakrywkowe. Aby zmontować zestaw do aspiracji mikropipet, zamontuj komorę celi na stoliku uchwytu na platformie mikroskopowej.

Dostosuj położenie komory, aż znajdzie się bezpośrednio pod obiektywem. Teraz opuść uchwyt, aż znajdzie się poniżej poziomu płynu w podłączonym zbiorniku na wodę. Wstrzyknąć wodę demineralizowaną do mikropipety.

Następnie użyj strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 34, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Odkręć koniec uchwytu mikropipety do połowy i pozwól, aby woda kapała z uchwytu przez kilka sekund. Następnie włóż mikropipetę wypełnioną zawiesiną do końcówki uchwytu i dokręć uchwytu.

Umieścić mikropipetę w komorze celi. Następnie zlokalizuj pipetę i erytrocyty pod mikroskopem. Opuść końcówkę pipety, aby upewnić się, że jest wypoziomowana z umieszczonym RBC.

Dostosuj wysokość zbiornika na wodę, aby wyzerować ciśnienie hydrauliczne na końcówce. Następnie lekko podnieś zbiornik na wodę, aby wytworzyć subtelne nadciśnienie. Włącz fluorescencyjne źródło światła wzbudzającego o długości fali 488 n.

Włącz kamerę fluorescencyjną i kamerę przesyłaną. Wprowadź czas ekspozycji, obszar zainteresowania i rozmiar kategoryzacji dla obu kamer w odpowiednim oprogramowaniu. Następnie ustaw numer nabycia na 2000 w wielowymiarowym panelu pozyskiwania.

Wybierz żądany katalog zapisywania. Następnie zlokalizuj mikropipetę za pomocą mikromanipulatora. Włącz ciśnienie pneumatyczne clamp i upewnij się, że skrzynka sterownicza jest w trybie zewnętrznym.

Powoli obracaj pokrętłem, aby skompensować przesunięcie ciśnienia wewnątrz systemu. Uruchom oprogramowanie sterujące zaciskiem pneumatycznym. Użyj elektrycznego panelu sterowania, aby utrzymać ciśnienie pod kontrolą za pomocą współczynnika konwersji rtęci 20 miliwoltów na milimetr

Teraz wyzeruj ciśnienie wewnątrz systemu. Następnie ostrożnie umieść mikropipetę w pobliżu erytrocytów. Dostosuj położenie zbiornika na wodę, aby wytworzyć subtelne nadciśnienie na końcówce mikropipety.

Rozpocznij akwizycję w oprogramowaniu aparatu i włącz migawkę fluorescencyjną. Wpisz obliczoną wielkość napięcia do panelu sterowania, aby osiągnąć żądane ciśnienie i zassać RBC. Przytrzymaj ciśnienie przez określony czas, a następnie zwolnij je.

Podobnie, powtórz eksperyment z następnym RBC przed dalszą analizą. Stopniowy wzrost ciśnienia powodował zwiększoną mobilizację jonów wapnia do erytrocytów.