Oznaczanie ilościowe Acanthamoeba spp. Ruchliwość

Nasze badania zagłębiają się w naturalne zachowanie Acanthamoeby, tak jak jest w naturze, gdy drogi ludzi i Acanthamoeba nieuchronnie się krzyżują. Na tej podstawie możemy ekstrapolować spostrzeżenia na temat tego, jak nasza Acanthamoeba oddziałuje w różnych środowiskach i powierzchniach, zarówno w soczewce kontaktowej, jak i rogówce, co pozwala nam opracować ukierunkowane strategie zapobiegania zapaleniu rogówki wywołanemu przez Acanthamoeba i poprawy praktyk higieny soczewek kontaktowych. Historycznie rzecz biorąc, dziedzina Acanthamoeba powoli przyjmowała najnowocześniejsze postępy w genetyce i analizie obrazów o wysokiej zawartości.

Jednak obecnie obserwuje się rosnącą tendencję do rutynowego wykorzystywania tych narzędzi w celu rozwikłania genetycznych podstaw zakażeń amebowych i ułatwienia opracowywania leków poprzez analizę przepustowości o wysokiej zawartości. Pozostaje wiele pytań dotyczących ewolucji zakażeń Acanthamoeba u pacjentów. Nasze nieustanne wysiłki koncentrują się na tworzeniu wizualnych i wymiernych narzędzi do modelowania in vitro zakażeń Acanthamoeba, zwłaszcza że modele rogówki 3D stają się coraz bardziej dostępne.

Modele te pozwalają nam zbadać, jak Acanthamoeba zachowuje się podczas początkowego zakażenia zapaleniem rogówki Acanthamoeba, a później z potencjalnym odrodzeniem. Na początek napełnij kolbę T75 30 mililitrami pożywki AC6. Aseptycznie dodać do kolby zawartość fiolki z próbką zawierającą Acanthamoeba.

Inkubuj kulturę przez trzy do pięciu dni w temperaturze od 26 do 30 stopni Celsjusza, aż kolba osiągnie 50% do 80% zbieżności. Dzień przed zapotrzebowaniem na komórki, należy dwukrotnie wstrząsnąć i energicznie uderzyć w główną kolbę hodowlaną, aby usunąć przylegające trofozoity. Napełnij nową kolbę T75 30 mililitrami podłoża AC6.

Następnie przenieś dwa mililitry kultury wzorcowej do kolby. Inkubuj kulturę w temperaturze od 26 do 30 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Przed zbiorem użyj mikroskopu ustawionego na 4-krotne powiększenie, aby wizualnie sprawdzić populację trofozoitów pod kątem przylegania i jednorodności.

Energicznie uderz dwukrotnie w kolbę, aby usunąć przylegające trofozoity. Następnie wlej zawartość do 50-mililitrowej stożkowej tuby. Odwiruj probówkę o masie 500 g przez pięć minut, aby ogranulować amebę.

Po wyrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 2 do 10 mililitrach roztworu 1/4 Ringera. Ponownie zawieszoną próbkę należy wymieszać wirowo, aby zapewnić równomierne wymieszanie. Następnie przenieś 10 mikrolitrów próbki do jednorazowego hemocytometru.

Policz jednostki tworzące kolonie na mililitr. Dodać roztwór Ringera, aby rozcieńczyć osad ameby do wymaganego stężenia. Następnie zasiej amebę na płytce dołka.

Aby zasiać amebę w sterylnej aluminiowej komorze przepływowej, powoli dodaj cztery mililitry zawiesiny przez sterylne porty komory przepływowej. Następnie zaciśnij porty w domk. Na początek umieść szczepy Acanthamoeba pod mikroskopem jasnego pola.

Wizualizuj amebę w 4-krotnym powiększeniu, gdzie tło wydaje się jasnoszare, a ameba jest ciemna. Dostosuj oświetlenie mikroskopu i ustaw ostrość, aby upewnić się, że ameby wyglądają jak solidne, cienie pod oczami. Następnie skonfiguruj oprogramowanie do obrazowania tak, aby nagrywało w regularnych odstępach czasu z maksymalną przerwą 30 sekund między obrazami w celu dokładnego śledzenia.

Śledź ameby przez wiele dni, nagrywając w segmentach po jednej godzinie co 12 godzin przez pięć dni. Jeśli mikroskop i oprogramowanie na to pozwalają, użyj współrzędnych XY, aby zarejestrować wiele dołków lub lokalizacji komórek przepływowych podczas jednej sesji. W razie potrzeby zszyj ze sobą wiele sekcji z jednej studzienki lub komórki przepływowej, aby uzyskać rozszerzony widok przy 4-krotnym powiększeniu.

Otwórz plik mikroskopu w oprogramowaniu do obrazowania. Okno dialogowe Opcje importu formatów biologicznych jest teraz widoczne. W oknie dialogowym włącz opcję Widok stosu

Ustaw widok z wyborem Hyperstack. Następnie zaznacz opcję Użyj stosu wirtualnego w obszarze Zarządzanie pamięcią i ustaw tryb kolorów na Domyślny. Teraz otwórz Opcje serii Bio-Format i wybierz żądaną serię.

Następnie naciśnij przycisk OK. Przejdź do Obraz, a następnie wybierz Duplikuj, aby zduplikować tylko obraz pojedynczej studni, wybierając tylko jeden kanał C i jeden kanał Z. Pracuj wyłącznie ze zduplikowanym obrazem w celu dalszej manipulacji. Kliknij Obraz, a następnie Typ i 8-bitowy, aby przekonwertować obraz.

Następnie wybierz Proces, a następnie Odejmij tło. Ustaw toczącą się kulę na 10. Zaznacz opcję Jasne tło i wybierz Paraboloidę przesuwną.

Teraz przejdź do Proces, a następnie Ulepszony kontrast. Dostosuj ustawienia Nasycone piksele do 0,1% dla pojedynczych trofozoitów lub 0,3% dla grup komórek i agregatów. Kolejno kliknij Obraz, Dostosuj i Próg.

z wartością Default większą niż Black White. Spowoduje to otwarcie ustawień procesu binarnego. Wybierz opcję Domyślne i zaznacz opcję Czarne tło masek binarnych.

Dostosuj próg agresywnie, aby zminimalizować szum tła, jednocześnie upewniając się, że każda ameba jest częściowo widoczna. Jeśli oprogramowanie odwróciło kolory, aby tło było białe, a ameba czarne, przejdź do Edytuj i kliknij Odwróć, aby przełączyć je na czarne tło z białą amebą. Teraz kolejno kliknij Proces, a następnie Binarny i Zamknij, aby połączyć niewielkie przerwy w zewnętrznej błonie komórek.

Wypełnij wszystkie pozostałe otwory, klikając Proces, Binarny i Wypełnij otwory. Następnie użyj narzędzia do rysowania kształtów i naciśnij Edytuj, a następnie Wypełnij, aby usunąć wszelkie artefakty inne niż ameba. W razie potrzeby ponownie odwróć obraz, aby sfinalizować reprezentację binarną.

Aby zarejestrować rozmiar każdej ameby, kliknij Analizuj, a następnie Analizuj cząstki. Następnie ustaw rozmiar na 10-Nieskończoność, Okrągłość od 0 do 1, a Pokaż na Nic. Zaznacz opcję Wyświetlaj tylko wyniki i Podsumuj, aby uzyskać analizę bez dodatkowych wizualizacji.

Zapisz wynik w plikach CSV, a następnie kliknij Plik, a następnie Zapisz jako i Tiff. aby zapisać obraz w formacie Tiff. Edytuj nazwę zgodnie z wymaganiami.