Oznaczanie ilościowe Acanthamoeba spp. Ruchliwość
September 20th, 2024
Ta procedura opisuje, jak wizualizować, śledzić i określać ilościowo Acanthamoeba spp. Ruchliwość.
Nasze badania zagłębiają się w naturalne zachowanie Acanthamoeby, tak jak jest w naturze, gdy drogi ludzi i Acanthamoeba nieuchronnie się krzyżują. Na tej podstawie możemy ekstrapolować spostrzeżenia na temat tego, jak nasza Acanthamoeba oddziałuje w różnych środowiskach i powierzchniach, zarówno w soczewce kontaktowej, jak i rogówce, co pozwala nam opracować ukierunkowane strategie zapobiegania zapaleniu rogówki wywołanemu przez Acanthamoeba i poprawy praktyk higieny soczewek kontaktowych. Historycznie rzecz biorąc, dziedzina Acanthamoeba powoli przyjmowała najnowocześniejsze postępy w genetyce i analizie obrazów o wysokiej zawartości.
Jednak obecnie obserwuje się rosnącą tendencję do rutynowego wykorzystywania tych narzędzi w celu rozwikłania genetycznych podstaw zakażeń amebowych i ułatwienia opracowywania leków poprzez analizę przepustowości o wysokiej zawartości. Pozostaje wiele pytań dotyczących ewolucji zakażeń Acanthamoeba u pacjentów. Nasze nieustanne wysiłki koncentrują się na tworzeniu wizualnych i wymiernych narzędzi do modelowania in vitro zakażeń Acanthamoeba, zwłaszcza że modele rogówki 3D stają się coraz bardziej dostępne.
Modele te pozwalają nam zbadać, jak Acanthamoeba zachowuje się podczas początkowego zakażenia zapaleniem rogówki Acanthamoeba, a później z potencjalnym odrodzeniem. Na początek napełnij kolbę T75 30 mililitrami pożywki AC6. Aseptycznie dodać do kolby zawartość fiolki z próbką zawierającą Acanthamoeba.
Inkubuj kulturę przez trzy do pięciu dni w temperaturze od 26 do 30 stopni Celsjusza, aż kolba osiągnie 50% do 80% zbieżności. Dzień przed zapotrzebowaniem na komórki, należy dwukrotnie wstrząsnąć i energicznie uderzyć w główną kolbę hodowlaną, aby usunąć przylegające trofozoity. Napełnij nową kolbę T75 30 mililitrami podłoża AC6.
Następnie przenieś dwa mililitry kultury wzorcowej do kolby. Inkubuj kulturę w temperaturze od 26 do 30 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Przed zbiorem użyj mikroskopu ustawionego na 4-krotne powiększenie, aby wizualnie sprawdzić populację trofozoitów pod kątem przylegania i jednorodności.
Energicznie uderz dwukrotnie w kolbę, aby usunąć przylegające trofozoity. Następnie wlej zawartość do 50-mililitrowej stożkowej tuby. Odwiruj probówkę o masie 500 g przez pięć minut, aby ogranulować amebę.
Po wyrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 2 do 10 mililitrach roztworu 1/4 Ringera. Ponownie zawieszoną próbkę należy wymieszać wirowo, aby zapewnić równomierne wymieszanie. Następnie przenieś 10 mikrolitrów próbki do jednorazowego hemocytometru.
Policz jednostki tworzące kolonie na mililitr. Dodać roztwór Ringera, aby rozcieńczyć osad ameby do wymaganego stężenia. Następnie zasiej amebę na płytce dołka.
Aby zasiać amebę w sterylnej aluminiowej komorze przepływowej, powoli dodaj cztery mililitry zawiesiny przez sterylne porty komory przepływowej. Następnie zaciśnij porty w domk. Na początek umieść szczepy Acanthamoeba pod mikroskopem jasnego pola.
Wizualizuj amebę w 4-krotnym powiększeniu, gdzie tło wydaje się jasnoszare, a ameba jest ciemna. Dostosuj oświetlenie mikroskopu i ustaw ostrość, aby upewnić się, że ameby wyglądają jak solidne, cienie pod oczami. Następnie skonfiguruj oprogramowanie do obrazowania tak, aby nagrywało w regularnych odstępach czasu z maksymalną przerwą 30 sekund między obrazami w celu dokładnego śledzenia.
Śledź ameby przez wiele dni, nagrywając w segmentach po jednej godzinie co 12 godzin przez pięć dni. Jeśli mikroskop i oprogramowanie na to pozwalają, użyj współrzędnych XY, aby zarejestrować wiele dołków lub lokalizacji komórek przepływowych podczas jednej sesji. W razie potrzeby zszyj ze sobą wiele sekcji z jednej studzienki lub komórki przepływowej, aby uzyskać rozszerzony widok przy 4-krotnym powiększeniu.
Otwórz plik mikroskopu w oprogramowaniu do obrazowania. Okno dialogowe Opcje importu formatów biologicznych jest teraz widoczne. W oknie dialogowym włącz opcję Widok stosu
.Ustaw widok z wyborem Hyperstack. Następnie zaznacz opcję Użyj stosu wirtualnego w obszarze Zarządzanie pamięcią i ustaw tryb kolorów na Domyślny. Teraz otwórz Opcje serii Bio-Format i wybierz żądaną serię.
Następnie naciśnij przycisk OK. Przejdź do Obraz, a następnie wybierz Duplikuj, aby zduplikować tylko obraz pojedynczej studni, wybierając tylko jeden kanał C i jeden kanał Z. Pracuj wyłącznie ze zduplikowanym obrazem w celu dalszej manipulacji. Kliknij Obraz, a następnie Typ i 8-bitowy, aby przekonwertować obraz.
Następnie wybierz Proces, a następnie Odejmij tło. Ustaw toczącą się kulę na 10. Zaznacz opcję Jasne tło i wybierz Paraboloidę przesuwną.
Teraz przejdź do Proces, a następnie Ulepszony kontrast. Dostosuj ustawienia Nasycone piksele do 0,1% dla pojedynczych trofozoitów lub 0,3% dla grup komórek i agregatów. Kolejno kliknij Obraz, Dostosuj i Próg.
z wartością Default większą niż Black White. Spowoduje to otwarcie ustawień procesu binarnego. Wybierz opcję Domyślne i zaznacz opcję Czarne tło masek binarnych.
Dostosuj próg agresywnie, aby zminimalizować szum tła, jednocześnie upewniając się, że każda ameba jest częściowo widoczna. Jeśli oprogramowanie odwróciło kolory, aby tło było białe, a ameba czarne, przejdź do Edytuj i kliknij Odwróć, aby przełączyć je na czarne tło z białą amebą. Teraz kolejno kliknij Proces, a następnie Binarny i Zamknij, aby połączyć niewielkie przerwy w zewnętrznej błonie komórek.
Wypełnij wszystkie pozostałe otwory, klikając Proces, Binarny i Wypełnij otwory. Następnie użyj narzędzia do rysowania kształtów i naciśnij Edytuj, a następnie Wypełnij, aby usunąć wszelkie artefakty inne niż ameba. W razie potrzeby ponownie odwróć obraz, aby sfinalizować reprezentację binarną.
Aby zarejestrować rozmiar każdej ameby, kliknij Analizuj, a następnie Analizuj cząstki. Następnie ustaw rozmiar na 10-Nieskończoność, Okrągłość od 0 do 1, a Pokaż na Nic. Zaznacz opcję Wyświetlaj tylko wyniki i Podsumuj, aby uzyskać analizę bez dodatkowych wizualizacji.
Zapisz wynik w plikach CSV, a następnie kliknij Plik, a następnie Zapisz jako i Tiff. aby zapisać obraz w formacie Tiff. Edytuj nazwę zgodnie z wymaganiami.
Przegląd
To badanie koncentruje się na naturalnym zachowaniu Acanthamoeba spp. oraz jej interakcjach z ludzkimi powierzchniami, takimi jak soczewki kontaktowe i rogówka. Opracowując metody wizualizacji, śledzenia i ilościowego określania ruchliwości Acanthamoeba, badania mają na celu zwiększenie naszego rozumienia keratitis wywołanego przez Acanthamoeba i poprawę praktyk higieny soczewek kontaktowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Infekcje Acanthamoeba
- Higiena soczewek kontaktowych
- Modelowanie in vitro infekcji
Tło
- Badanie zachowania Acanthamoeba w różnych środowiskach
- Powolne przyjmowanie zaawansowanych technik obrazowania i genetycznych w tym obszarze
- Tworzenie narzędzi wizualnych do zrozumienia infekcji amebowych
Stosowane metody
- Mikroskopia do wizualizacji ruchliwości Acanthamoeba
- Techniki hodowania in vitro
- Wysoko zawartościowa analiza obrazów do ilościowego określania zachowania ameb
Główne wyniki
- Sukcesywne wizualizowanie i ilościowe określanie ruchliwości Acanthamoeba przez kilka dni
- Produkcja ilościowych danych pomagających w zrozumieniu keratitis wywołanego przez Acanthamoeba
- Wykazanie potencjału zastosowania zaawansowanego obrazowania w badaniu infekcji amebowych
Wnioski
- Badanie dostarcza wglądu w zachowanie Acanthamoeba związane z infekcjami
- Wyniki są istotne dla opracowywania ukierunkowanych strategii w zakresie higieny soczewek kontaktowych
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative tracking of Acanthamoeba spp. motility provides critical insight into pathogen behavior on clinically relevant surfaces, directly informing risk assessment for ocular device contamination. This capability supports predictive confidence in early-stage anti-infective screening and enables mechanistic de-risking for translational infection models. Integrating motility quantification into discovery workflows enhances portfolio decisions for anti-amoebic intervention strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of Acanthamoeba movement patterns to clarify infection pathways on contact lenses and corneal surfaces.
- Supports biological de-risking by quantifying motility changes under different environmental and nutritional conditions.
- Facilitates functional target validation by linking motility metrics to infection stages and behavioral phenotypes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated motility assays for downstream compound screening against Acanthamoeba spp.
- Standardizes quantitative outputs such as distance, speed, and directionality for reproducible assay development.
- Enables scalable, high-content imaging workflows for reliable evaluation of anti-amoebic candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro motility models with disease-relevant 3D cornea systems for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing quantitative infection metrics across preclinical models.
- Enhances predictive de-risking by linking motility data to infection progression and resurgence scenarios.
Pipeline & Workflow Integration
This motility quantification method bridges early discovery, assay development, and translational infection modeling for anti-amoebic R&D pipelines.
- Discovery Biology: Provides quantitative hypothesis testing for infection mechanisms and behavioral phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative motility readouts for compound evaluation workflows.
- Analytics: Generates CSV-based outputs for statistical comparison of motility parameters across conditions.
- Translational Research: Integrates with 3D cornea models to support disease-relevant infection studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for motility analysis across multiple Acanthamoeba strains and surfaces.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection modeling.
- Operational Value: Enables standardized, scalable, and reproducible motility quantification workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient anti-infective portfolio management.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of anti-amoebic candidates and infection models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy, image analysis, and quantitative data interpretation.
- Depends on access to brightfield microscopes, imaging software, and data processing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging intervals, analysis parameters, and data formats.
- Adaptable to various Acanthamoeba strains, surfaces, and nutritional conditions for broad applicability.
- Practical limitations include imaging throughput and potential variability in motility under different assay conditions.
