Oszacowanie wrażliwości strukturalnej regionów wewnętrznie nieuporządkowanych w odpowiedzi na stres hiperosmotyczny w żywych komórkach za pomocą FRET
12 stycznia 2024
Intherentnie nieuporządkowane regiony (IDR) to elastyczne domeny białkowe, które modyfikują swoją konformację w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Zespołowy transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) może oszacować wymiary białka w różnych warunkach. Przedstawiamy podejście FRET do oceny wrażliwości strukturalnej IDR w żywych komórkach Saccharomyces cerevisiae w warunkach stresu hiperosmotycznego.
Naszym celem jest zrozumienie, w jaki sposób regiony nieuporządkowane odczuwają i reagują na zmiany w fizycznych właściwościach chemicznych środowiska. Łączymy techniki biofizyczne, biochemiczne, genetyczne i biologii komórki, aby monitorować, jak zmienia się strukturalny zespół regionów zaburzeń w żywych komórkach. Techniki biofizyki białek są obecnie wykorzystywane do badania potwierdzenia IDR.
Należą do nich magnetyczny rezonans jądrowy, dichroizm kołowy, rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem i FRET. Większość z tych technik może być stosowana tylko in vitro. Badanie potwierdzenia IDR w kontekście komórkowym jest trudne ze względu na wysokie koszty i czasochłonne techniki.
Zapewniamy alternatywę, aby sprostać tym wyzwaniom. Nasz protokół może monitorować potwierdzenie IDR w łatwy, szybki i powtarzalny sposób, uzupełniając inne metody in vitro. Nasze odkrycia pozwoliły zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw strukturalnej wrażliwości IDR w warunkach stresu.
Pozwala to na wykorzystanie IDR jako biosensorów somatycznych. Precyzyjne śledzenie środowiska komórkowego przyczyni się do bardziej zniuansowanego zrozumienia podstawowych procesów zachodzących w świetle. Nasze badania doprowadziły do zastanowienia się nad determinantami wrażliwości strukturalnej w regionach wewnętrznie nieuporządkowanych.
Jego znaczenie dla funkcji IDR i czynników środowiskowych wpływających na tę czułość. Na początek wyhoduj wybrany transformator drożdżowy w trzech mililitrach pożywki SD ura w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż do osiągnięcia nasycenia. Zmierz gęstość optyczną kultury przy 600 nanometrach.
Odwirować dwa mililitry nocnej kultury w temperaturze 14 000 G w temperaturze pokojowej. Odpipetować supernatant. Ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze bufora MES.
Odwirować mieszaninę w temperaturze 14 000 G w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć supernatant. Po ponownym umyciu komórek buforem MES, ponownie zawieś ogniwa w dwóch mililitrach bufora MES.
Następnie wlej całą objętość do zbiornika odczynnika. Następnie należy skonfigurować czytnik mikropłytek. Przejdź do ikony protokołu zarządzanego, a następnie ustaw typ pomiaru na Intensywność fluorescencji, a tryb odczytu na Skanowanie spektralne.
Wprowadź nazwę mikropłytki do Granier 96 F-bottom i ustaw dolną optykę. Dostęp do ustawień optycznych można uzyskać, wybierając opcję ustaw nademisję skanowania. Dostosuj długość fali wzbudzenia do 433 nanometrów przy szerokości pasma wzbudzenia 10 nanometrów.
Ustaw zakres długości fali emisji od 460 nanometrów do 550 nanometrów z szerokością pasma emisji 10 nanometrów i szerokością kroku wynoszącą jeden nanometr. Ustaw czas wiązania na 0,1 sekundy. Teraz przygotuj różne stężenia roztworu chlorku sodu w studzienkach 96-dołkowej przezroczystej czarnej płytki.
Załaduj 150 mikrolitrów buforu MES do pierwszych trzech studzienek rzędu A. Następnie odpipetuj 150 mikrolitrów odpowiedniego roztworu osmolitu w kolejności rosnącej od lewej do prawej. Za pomocą 12-kanałowej mikropipety kilkakrotnie odpipetuj umytą zawiesinę drożdży. Następnie przenieś 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki.
Kilkakrotnie odpipetować zawartość każdej studzienki, aby zapewnić równomierne wymieszanie. Natychmiast zmierz widma emisyjne intensywności fluorescencji. Obserwuj widma emisji fluorescencji wyświetlane na ekranie.
Konstrukty IDR wykazały kombinację widm emisyjnych M Saru i cytrynu. W przypadku AT Leah 45 stres hiperosmotyczny spowodował wzrost intensywności fluorescencji akceptora przy zmniejszonej intensywności fluorescencji dawcy. Nie zaobserwowano tego w konstrukcji albuminy.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje sposób, w jaki wewnętrznie nieuporządkowane regiony (IDRs) białek reagują na zmiany środowiskowe, w szczególności w warunkach stresu hiperosmotycznego w żywych komórkach Saccharomyces cerevisiae. Wykorzystując zespół fluorescencyjnego transferu energii (FRET), w pracy oceniono wrażliwość strukturalną IDRs.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofizyka
- Biologia komórki
- Chemia białek
Wstęp
- Wrodzone regiony nieuporządkowane (IDR) są elastycznymi domenami białkowymi.
- Zrozumienie zachowania IDR jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat funkcji białek.
- Tradycyjne techniki badania IDR są często ograniczone do warunków in vitro.
- Kontekst komórkowy stwarza wyjątkowe wyzwania dla analizy IDR.
Cel badania
- Zbadanie, w jaki sposób regiony nieustrukturyzowane (IDR) reagują na zmiany w otoczeniu.
- Ocena zmian strukturalnych IDR w żywych komórkach.
- Wykorzystanie techniki FRET jako metody analizy IDR w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Ensamble'owy transfer energii rezonansowej fluorescencji (FRET).
- Techniki biofizyczne, w tym magnetyczny rezonans jądrowy oraz dichroizm kołowy.
- Manipulacje genetyczne Saccharomyces cerevisiae.
- Techniki biologii komórki do monitorowania zmian strukturalnych.
Główne wyniki
- FRET skutecznie mierzy wymiary IDR w warunkach stresu hiperosmotycznego.
- Zespoły strukturalne IDR wykazują znaczące zmiany w odpowiedzi na warunki środowiskowe.
- Badanie dostarcza informacji na temat elastyczności i zdolności adaptacyjnych IDR.
- Wyniki podkreślają znaczenie badania IDR w kontekście komórkowym.
Wnioski
- FRET jest cennym narzędziem do badania IDR w żywych komórkach.
- Zrozumienie zachowania IDR może dostarczyć informacji o szerszych procesach biologicznych.
- Wyniki te przyczyniają się do wiedzy na temat dynamiki białek w warunkach stresu.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kwantyfikacja wrażliwości strukturalnej regionów nieuporządkowanych wewnętrznie (IDR) w warunkach stresu hiperosmotycznego pozwala wypełnić istotną lukę w rozumieniu zachowania białek w żywych komórkach. Podejście oparte na metodzie FRET umożliwia uzyskanie wiarygodnych przewidywań dotyczących reakcji IDR na zaburzenia środowiskowe, co wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Metoda ta ułatwia podejmowanie decyzji portfelowych, dostarczając powtarzalnych, ilościowych danych na temat dynamiki konformacyjnej IDR w kontekście komórkowych odpowiedzi na stres.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę zmian konformacyjnych IDR w żywych komórkach poddanych stresowi.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie wrażliwości domen białkowych na środowisko.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dzięki ilościowym pomiarom FRET.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do celów związanych z IDR w złożonych kontekstach komórkowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalny i skalowalny schemat pracy do monitorowania struktury IDR w formatach wysokoprzepustowych.
- Standaryzuje ilościowe odczyty w celu przeprowadzenia analizy porównawczej różnych konstruktów IDR.
- Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do dalszego przesiewania modulatorów lub stresorów.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na stany konformacyjne IDR.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wrażliwość strukturalną IDR z modelami stresu komórkowego istotnymi dla danej choroby, jeśli jest to możliwe.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez śledzenie odpowiedzi IDR w żywych komórkach.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju programów celowanych w IDR w oparciu o analizę ryzyka.
- Dostarcza wglądu w mechanizmy, które mogą kierować opracowaniem biomarkerów translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda oparta na FRET wpisuje się w kontinuum procesów badawczych – od wczesnego testowania hipotez po walidację w modelach przedklinicznych – umożliwiając rzetelną ocenę zachowania IDR w fizjologicznie istotnych warunkach stresu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wrażliwości środowiskowej IDR oraz zaangażowania szlaków sygnałowych.
- Screening: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki FRET w celu zapewnienia gotowości i powtarzalności testów.
- Analityka: Zapewnia przetworzone pomiary fluorescencji do bezpośredniego porównania konstruktów IDR i odpowiedzi na stres.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany konformacyjne IDR z adaptacją komórkową do stresu, wspierając ciągłość badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do oceny różnych IDR i warunków stresowych w wielu programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach ukierunkowanych na IDR.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, odtwarzalne i skalowalne pomiary w żywych komórkach.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go oraz alokację kapitału poprzez wyjaśnienie funkcjonalnego znaczenia IDR w warunkach stresu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów skoncentrowanych na IDR z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe dane dotyczące wrażliwości strukturalnej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu FRET, spektroskopii fluorescencyjnej oraz hodowli komórek drożdży.
- Wymagany jest dostęp do czytników mikropłytek z funkcją skanowania spektralnego i odpowiednimi filtrami fluorescencyjnymi.
- Wymagana jest standaryzacja przygotowania próbek i skryptów przetwarzania danych pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych typów komórek lub konstruktów IDR w zależności od kontekstu biologicznego.
- Metoda jest ograniczona do IDR podatnych na znakowanie FRET i kompatybilnych z systemami ekspresji drożdżowej.
