Name: Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Odkryj metody generowania organoidów jelitowych z komórek macierzystych przy użyciu matryc bezkserogennych i zwierzęcych. Technika ta umożliwia badanie interakcji lek-choroba w modelach in vitro o wysokiej wierności fizjologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy potwierdzają wcześniejsze szkolenia i ogólne zalecenia dotyczące rozpoczęcia pracy z hiPSC i organoidami od dr Christiny Pacak, Silveli Susuki-Hatano i Russella D'Souzy. Dziękują dr Chelsey Simmons za jej wskazówki dotyczące stosowania systemów hydrożelowych do hodowli komórkowych in vitro. Autorzy chcieliby również podziękować dr Christine Rodriguez i Thomasowi Allisonowi z STEMCELL Technologies za ich wskazówki dotyczące hodowli hiPSC. Autorzy dziękują również TheWell Bioscience za pokrycie kosztów publikacji.

Matrix Comparison for Efficient Human Intestinal Organoid Generation from iPSCs

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+Bidirectional%2C+allosteric+signaling+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines.</a> Cell. 110 (6), 673-687 (2002).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).</li>
<li>Hinz, B., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis%3A+Recent+advances+in+myofibroblast+biology+and+new+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives.</a> F1000 Biol Rep. 2, 78(2010).</li>
<li>Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+modulates+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer.</a> EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).</li>
<li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis%3A+A+dynamic+view%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li>
<li>Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+control+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix control of stem cell fate.</a> Cell. 126 (4), 645-647 (2006).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Tran, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+extracellular+matrix+directs+trans-differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+and+formation+of+salivary+gland-like+organoids+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306(2022).</li>
<li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+drives+deterministic+organoid+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry drives deterministic organoid patterning.</a> Science. 375 (6576), (2022).</li>
<li>Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+extracellular+matrix+for+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Engineering the extracellular matrix for organoid culture.</a> Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Matrigel+and+gelatin+substrata+for+feeder-free+culture+of+undifferentiated+mouse+embryonic+stem+cells+for+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing.</a> Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).</li>
<li>Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf</a> (2024).</li>
<li>biotechne R&D Systems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultrex+Stem+Cell+Qualified+Reduced+Growth+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22biotechne+R%26D+Systems%22%5BJournal%5D)">Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor.</a> biotechne R&D Systems. , (2024).</li>
<li>VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thewellbio.com/video-protocols">https://www.thewellbio.com/video-protocols</a> (2024).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li>
<li>Henderson, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+human+embryos+and+embryonic+stem+cells+show+comparable+expression+of+stage-specific+embryonic+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens.</a> Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).</li>
<li>Haruna, N. F., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+dynamic+biophysical+properties+of+a+tunable+hydrogel+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cytol+Tissue+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture.</a> J Cytol Tissue Biol. 7, 30(2020).</li>
<li>Cherne, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+hydrogel%2C+VitroGel+ORGANOID-3%2C+improves+immune+cell-epithelial+interactions+in+a+tissue+chip+co-culture+model+of+human+gastric+organoids+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells.</a> Front Pharmacol. 12, 707891(2021).</li>
<li>Stewart, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+intestinal+stiffness+and+associations+with+fibrosis+in+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease.</a> PLoS One. 13, e0200377(2018).</li>
<li>Hernandez-Gordillo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+synthetic+matrices+for+in+vitro+culture+of+primary+human+intestinal+enteroids+and+endometrial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids.</a> Biomaterials. 254, 120125(2020).</li>
<li>Broguiere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+epithelial+organoids+in+a+defined+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel.</a> Adv Mater. 30, 1801621(2018).</li>
<li>Barthes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microenvironment+engineering+and+monitoring+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%3A+The+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances.</a> BioMed Res Int. 2014, 921905(2014).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
</ol>

Dr John Huang jest założycielem i dyrektorem generalnym TheWell Bioscience.

Wybór optymalnego mikrośrodowiska do pracy z komórkami macierzystymi i organoidami jest kluczowym wczesnym krokiem w przypadku korzystania z tych platform w szerokim zakresie zastosowań. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że Matrix 4-XFO3 w połączeniu z wyższym stężeniem czynników wzrostu prowadzi do większych organoidów, co sugeruje, że właściwości fizyczne hydrożeli wolnych od ksenotypów można wykorzystać do optymalizacji wytwarzania organoidów przy użyciu tych systemów. Wcześniej wykazano, że unikalne cechy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) są ściśle powiązane z tożsamością komórek w narządzie12. Ponieważ komórki wyczuwają siły zewnętrzne za pośrednictwem integryn i innych receptorów, charakterystyka mechaniczna ECM ma głęboki wpływ na komórki macierzyste, a w odpowiedzi komórki macierzyste mogą generować siły wewnętrzne12. Interakcje między komórkami macierzystymi a ich mikrośrodowiskiem mają kluczowe znaczenie w inicjowaniu różnorodnych szlaków sygnałowych12. Dodatkowo wykazano, że ECM może służyć jako rezerwuar do przechowywania i uwalniania czynników wzrostu i innych cząsteczek sygnałowych, które wpływają na zachowanie komórek. W związku z tym nasze reprezentatywne wyniki i dziesięciolecia badań podkreślają znaczenie uwzględnienia biochemicznych i fizycznych aspektów natywnego mikrośrodowiska komórkowego i właściwości tkanek przy wyborze systemów matrycowych do badań in vitro 29,30.
W protokole wyjaśniono kilka krytycznych kroków i zaleceń, aby poinformować użytkowników o potencjalnych problemach i sposobach ich uniknięcia. Niemniej jednak w tych metodach przedstawiono dwa krytyczne kroki, które są kluczowe dla pomyślnego wdrożenia tego protokołu. Po pierwsze, sprawdzenie specyficznych markerów związanych z populacją komórek macierzystych ma kluczowe znaczenie dla określenia optymalnego systemu powlekania, który utrzyma populację komórek macierzystych w gotowości do skutecznego, kontrolowanego różnicowania. Podobnie, potwierdzenie ekspresji markerów związanych z każdym krokiem różnicowania jest niezbędne do podjęcia decyzji, kiedy przejść do następnego etapu. Protokół ten zawiera ogólne wytyczne dotyczące minimalnego czasu wymaganego na każdym etapie. Niemniej jednak optymalny czas na każdym etapie będzie różny dla różnych linii komórkowych i warunków eksperymentalnych (np. genotyp, sztywność). Dlatego scharakteryzowanie wielu markerów specyficznych dla etapu jest najlepszym podejściem do poprawy wydajności generowania hIO.
Drugim krytycznym krokiem było włączenie wyższego stężenia czynników wzrostu podczas korzystania z systemu Matrix 4-XF bez ksenomechanizmu, co ma ogromne znaczenie. Jednym z często podkreślanych ograniczeń systemów biomateriałowych wolnych od ksenotypów jest brak czynników wzrostu31. Jednak ta słabość może stać się mocną stroną: pełna kontrola czynników wzrostu w systemach w celu poprawy odtwarzalności. Chociaż protokół ten opisuje użycie dostępnych na rynku pożywek i zestawu do suplementacji czynnika wzrostu, to samo uzasadnienie można zastosować w przypadku wytwarzania kompletnych pożywek we własnym zakresie z pojedynczymi komponentami. Konkretny stosunek hydrożelu do podłoża wskazuje, o ile wyższe musi być stężenie czynników wzrostu; Na przykład stosunek 2:1 może wymagać 3-krotnego stężenia czynników wzrostu, aby uzyskać stężenie reprezentatywne dla standardowego zastosowanego kompletnego podłoża. Pełna kontrola czynników wzrostu obecnych w systemie jest korzystna dla odpowiedzi na pytania mechanistyczne i uniknięcia problemów regulacyjnych w wielu zastosowaniach.
Etapy przetwarzania obrazu opisane w kroku 3 są ograniczone jakością obrazów i typem wykonanych obrazów. Może wymagać dopracowania, aby dopasować go do specyficznych wymagań każdego typu i jakości obrazu. Jednak ogólne etapy procesu i próbka kodu MATLAB podstawowej ramy do analizy wielkości organoidów na podstawie obrazów w jasnym polu pomagają zdefiniować przepływ pracy, który można jeszcze bardziej zoptymalizować i rozszerzyć. Co więcej, dostęp do mikroskopu jasnego pola jest bardziej powszechny niż w przypadku innych typów mikroskopów. Chociaż brak dostępu i znajomości MATLAB może ograniczać korzystanie z tego kodu, ogólne kroki procesu są kompatybilne z oprogramowaniem typu open source, takim jak Fiji by Image J. Sam rozmiar organoidu nie jest zalecaną metryką do oceny dojrzałości; Zachęca się do przeprowadzenia oceny określonych markerów reprezentatywnych dla narządu docelowego; niektóre z tych markerów dla tkanki jelitowej przedstawiono w Tabeli 4. Rycina 6 przedstawia przykład barwienia immunofluorescencyjnego całych organoidów cząsteczką adhezyjną komórek nabłonka (EpCAM), która jest zlokalizowana na zewnętrznej powierzchni (podstawno-bocznej) organoidów. Podczas gdy EpCAM został uwidoczniony w organoidach hodowanych we wszystkich systemach ECM, wystąpiły różnice w wielkości tych organoidów. W ten sposób informacje o wielkości organoidów pomagają zoptymalizować warunki hodowli. Ponadto w badaniach odpowiedzi na lek wielkość organoidu służy jako wskaźnik odpowiedzi na badany związek; Zmiany wielkości mogą odzwierciedlać skuteczność lub toksyczność badanych związków. Co ważne, generowanie wielu partii organoidów o ustandaryzowanej wielkości jest obecnie wyzwaniem w tej dziedzinie, ale jest to ważny wskaźnik odtwarzalności eksperymentalnej, dzięki czemu wyniki można porównywać w różnych eksperymentach lub laboratoriach. Ogólnie rzecz biorąc, zautomatyzowany przepływ pracy, który umożliwia ekstrakcję ważnych informacji o organoidach z obrazów w jasnym polu, jest korzystnym narzędziem dla wielu badaczy.
Oba systemy, matryce pochodzenia zwierzęcego i hydrożele wolne od ksenoizolacji, mają swoje wady i zalety. Matryca 2-AB prowadząca do mniejszej liczby uwolnień sferoidów w stadium MH niż w przypadku innych matryc pochodzenia zwierzęcego może wynikać z różnic między partiami, co jest powszechnie znaną cechą dostępnych na rynku matryc pochodzenia zwierzęcego. Należy zauważyć, że stężenie dostępnych na rynku systemów ECM jest różne; Na przykład do przygotowania roztworów powlekających wykorzystano współczynniki rozcieńczenia zawarte w arkuszach specyfikacji produktu, które mogą prowadzić do nieznacznie innych stężeń w przypadku matryc pochodzenia zwierzęcego. Te różnice w stężeniu białka mogą znacząco wpływać na różnicowanie, prowadząc do różnic w skuteczności różnicowania w przypadku stosowania tego samego produktu z różnych partii. Aby dokonać wyboru między tymi systemami, należy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak konkretne cele eksperymentalne, względy etyczne i wymagania prawne. Na przykład w przypadku porównywania wyników eksperymentów in vitro z mysim modelem zwierzęcym w celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące biologii nowotworów i nowotworów, użycie matryc pochodzących z myszy Engelbreth-Holm Swarm EHS może być doskonałym wyborem. Ponadto, ponieważ produkty takie jak Matrigel są używane od dziesięcioleci, istnieje wiele protokołów, danych i odniesień. Jednak użycie dobrze zdefiniowanych matryc wolnych od kseno, które pozwalają na dostosowanie właściwości fizycznych i chemicznych, może być bardziej odpowiednią opcją, gdy pytanie badawcze jest związane z chorobami lub terapiami u ludzi. Ponadto większość systemów hydrożelowych wolnych od kseno-kabli jest zaprojektowana tak, aby spełniała normy regulacyjne, co czyni je odpowiednim wyborem do badań, które wymagają zgodności z dobrymi praktykami produkcyjnymi (GMP) lub innymi wytycznymi regulacyjnymi.
Podsumowując, podczas gdy matryce pochodzenia zwierzęcego są szeroko stosowane do utrzymywania iPSC i generowania organoidów ze względu na ich biokompatybilność, systemy hydrożelowe wolne od ksenoizolacji oferują korzyści pod względem odtwarzalności, opłacalności, zgodności z przepisami i względów etycznych. Wybór między nimi zależy od konkretnych potrzeb badania lub zastosowania klinicznego. Systemy hydrożelowe wolne od kseno-żelu zyskują na popularności jako bardziej wszechstronna i zrównoważona alternatywa, która może wspierać wykorzystanie organoidów i systemów mikrofizjologicznych na potrzeby przedklinicznej krótkiej listy kandydatów terapeutycznych. To zastosowanie może znacznie usprawnić wczesne opracowywanie leków i pomóc w sprostaniu obecnym wyzwaniom związanym z tłumaczeniami klinicznymi w przemyśle farmaceutycznym.

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest dynamicznym i wielofunkcyjnym składnikiem tkanek, który odgrywa kluczową rolę w regulacji zachowania i rozwoju komórek. Jako złożona sieć zapewnia wsparcie strukturalne, ligandy adhezyjne komórek1 oraz magazynowanie czynników wzrostu i cytokin, które regulują sygnalizację komórkową. Na przykład podczas gojenia się ran ECM służy jako rusztowanie dla migrujących komórek i jako rezerwuar czynników wzrostu zaangażowanych w naprawę tkanek2. Podobnie, rozregulowanie ECM może prowadzić do zwiększenia nasilenia różnych chorób, takich jak zwłóknienie i rak3,4. Podczas rozwoju embrionalnego ECM kieruje morfogenezą tkanek. Na przykład w rozwoju serca komponenty ECM odgrywają rolę w tworzeniu prawidłowej architektury i funkcji tkanki serca5. Ponad dekada badań wykazała, że sama sztywność mikrośrodowiska6,7 może kontrolować specyfikację linii komórek macierzystych. Nic więc dziwnego, że podczas różnicowania komórek in vitro ECM wpływa na los komórek macierzystych, dostarczając sygnałów do różnicowania.
Organoidy mogą być generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Rozpoczęcie od odpowiednio scharakteryzowanej linii iPSC jest niezbędne do pomyślnego wytworzenia organoidów. Jednak brak wskazówek fizjologicznych w klasycznych materiałach do hodowli komórkowych utrudnia skuteczne różnicowanie iPSC i wytwarzanie organoidów. Co więcej, ostatnie badania podkreśliły znaczenie składu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), interakcji między komórkami a ECM8, a także wskazówek mechanicznych i geometrycznych9,10,11 w kontekście ekspansji i różnicowania organoidów12. Rozwój technologii organoidów poprzez poprawę odtwarzalności będzie wymagał uwzględnienia wskazówek fizycznych i chemicznych specyficznych dla tkanki.
Organoidy mają na celu odtworzenie rodzimej tkanki w fizjologicznie podobnym mikrośrodowisku. Wybór systemu ECM, który ściśle naśladuje natywny tkankowy ECM, ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia fizjologicznego znaczenia dotyczącego zachowania, funkcji i odpowiedzi komórki na bodźce13. Wybór składników ECM może wpływać na różnicowanie komórek macierzystych w określone typy komórek w organoidzie. Różne białka ECM i ich kombinacje mogą dostarczać wskazówek, które kierują losem komórki14. Na przykład badania wykazały, że stosowanie określonych komponentów ECM może sprzyjać różnicowaniu jelitowych komórek macierzystych w dojrzałe typy komórek jelitowych, co skutkuje fizjologicznie istotnymi organoidami jelitowymi15. Chociaż organoidy są cennym narzędziem podczas modelowania chorób i testowania leków, wybór odpowiedniego systemu ECM ma kluczowe znaczenie dla tego zastosowania. Odpowiedni system ECM może zwiększyć dokładność modelowania choroby poprzez stworzenie mikrośrodowiska, które przypomina dotkniętą chorobą tkankę16. Co więcej, specyficzny tkankowo ECM może pomóc w generowaniu organoidów, które lepiej podsumowują fenotypy związane z chorobą i reakcje na leki17. Optymalizacja systemu ECM stosowanego w różnicowaniu organoidów ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanych wyników różnicowania.
Komercyjnie dostępne systemy membran bazowych pochodzące ze zwierzęcych źródeł ECM (np. Matrigel, Cultrex) i hydrożel wolny od kseno-merów (np. VitroGel) są szeroko stosowane w badaniach nad iPSC i organoidami. Firmy, które je komercjalizują, oraz badacze, którzy z nich korzystają, na przestrzeni lat opracowali wiele instrukcji dotyczących ich konkretnych produktów i zastosowań. Wiele z tych instrukcji posłużyło jako przewodnik przy generowaniu tego protokołu. Co więcej, korzyści i niepowodzenia związane z ich wewnętrznymi właściwościami zostały indywidualnie odnotowane przez wielu18,19,20,21. Nie istnieje jednak systematyczny przepływ pracy, który kierowałby wyborem optymalnych systemów do pracy z iPSC i organoidami. W tym miejscu zapewniony jest przepływ pracy umożliwiający systematyczną ocenę równoważności systemów ECM z różnych źródeł dla iPSC i pracy organoidowej. Jest to badanie porównawcze utrzymania dwóch różnych ludzkich linii iPSC (hiPSC) i generacji organoidów jelitowych człowieka (hIO) w czterech różnych matrycach: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) i VitroGel (Matrix 4-XF). Do hodowli organoidów wykorzystano cztery wersje matrycy wolnej od ksenotypu VitroGel, które wcześniej zostały zoptymalizowane pod kątem hodowli organoidów: ORGANOID 1 (Matrix 4-O1), ORGANOID 2 (Matrix 4-O2), ORGANOID 3 (Matrix 4-O3), ORGANOID 4 (Matrix 4-O4). Wykorzystano również matryce pochodzenia zwierzęcego zoptymalizowane pod kątem organoidów: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) i Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Użyto dostępnych na rynku pożywek do hodowli komórek macierzystych (mTeSR Plus) oraz zestawu do różnicowania organoidów (STEMdiff intestinal organoid kit). Protokół ten łączy indywidualne instrukcje od producentów produktów z doświadczeniami laboratoryjnymi, aby poprowadzić czytelnika w kierunku skutecznej optymalizacji ECM pod kątem ich specyficznej pracy z iPSC i organoidami. Podsumowując, ten protokół i reprezentatywne wyniki podkreślają znaczenie wyboru optymalnego mikrośrodowiska dla pracy komórek macierzystych i różnicowania organoidów.

<table><tbody><tr><td>Płytka 24-dołkowa (poddana hodowli, sterylna)</td><td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Łaźnia wodna</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>Antyadhezyjne płukanie Solutio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego (BSC)</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>Logic</td><td></td></tr><tr><td>Brightfield Microscope</td><td>Echo Rebel</td><td>REB-01-E2</td><td></td></tr><tr><td>BXS0116</td><td>ATCC</td><td>ACS-1030</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z regulacją temperatury (4 &deg; ThermoScientific</td><td></td> <td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe, 15 ml, sterylne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe, 50 mL, sterylne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RGF BME, Typ 2</td><td>Bio-techne</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Stem Cell Kwalifikowany RGF BME&nbsp;</td><td>Bio-techne</td><td>3434-010-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (bez Ca++ i Mg++)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>GeltrexLDEV-Free, hESC Reduce Growth Factor</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>A14133-02</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek Guava Muse lub inny sprzęt do cytometrii przepływowej (opcjonalnie)</td><td>Luminex</td><td>0500-3115</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Heralcell Vios Inkubator do hodowli komórkowych (37 &deg; C, 5% CO2)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>51033775</tr><tr><td>JMP Software</td><td>SAS Institute</td><td>JMP 16</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks, Inc</td><td>R2022b</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej bez LDEV</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>Matrigel Matrix o wysokim stężeniu (HC), obniżony czynnik wzrostu (GFR) bez LDEV</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>354263</tr><tr><td>mTeSR Plus Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 24-dołkowa płytka poddana obróbce powierzchniowej</td><td>Thermo Scientific</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)</td><td>BD Pharmingen</td><td>566841</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-human CDX2&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>563428</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-human FOXA2</td><td>BD Pharmingen</td><td>561589</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human SSEA4&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561565</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>STEMCELL</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>SCTi003-A</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0510</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (10 ml)&nbsp;</td><td>Pipety</td> serologiczne Fisher Scientific <td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>(5 ml)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu organoidów jelitowych STEMdiff</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5145</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Zestaw organoidów jelitowych</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5140</td><td></td></tr><tr><td>Vitrogel Hydrogel Matrix</td><td>TheWell Bioscience</td><td>VHM01</td><td></td></tr><tr><td>VitroGel ORGANOID Discovery Kit</td><td>TheWell Bioscience</td><td>VHM04-K</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych

Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa kluczową rolę w zachowaniu i rozwoju komórek. Organoidy wytwarzane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) znajdują się w centrum uwagi wielu obszarów badawczych. Jednak brak wskazówek fizjologicznych w klasycznych materiałach do hodowli komórkowych utrudnia skuteczne różnicowanie iPSC. Włączenie dostępnego na rynku ECM do hodowli komórek macierzystych dostarcza fizycznych i chemicznych wskazówek korzystnych dla utrzymania komórek. Dostępne na rynku produkty błony podstawnej pochodzenia zwierzęcego składają się z białek ECM i czynników wzrostu, które wspomagają utrzymanie komórek. Ponieważ ECM posiada właściwości specyficzne dla tkanki, które mogą modulować los komórki, matryce wolne od ksenotypów są wykorzystywane do przesyłania translacji do badań klinicznych. Chociaż dostępne na rynku matryce są szeroko stosowane w badaniach nad hiPSC i organoidami, równoważność tych matryc nie została jeszcze oceniona. W tym miejscu przeprowadzono badanie porównawcze utrzymania hiPSC i wytwarzania organoidów jelitowych człowieka (hIO) w czterech różnych matrycach: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) i VitroGel (Matrix 4-XF). Chociaż kolonie nie miały idealnie okrągłego kształtu, spontaniczne różnicowanie było minimalne, a ponad 85% komórek wykazywało ekspresję markera komórek macierzystych SSEA-4. Matrix 4-XF doprowadził do powstania okrągłych grudek 3D. Ponadto zwiększenie stężenia suplementu i czynników wzrostu w pożywkach używanych do wytwarzania roztworu hydrożelu Matrix 4-XF poprawiło ekspresję hiPSC SSEA-4 1,3-krotnie. Różnicowanie hiPSC utrzymywanych przez Matrix 2-AB doprowadziło do mniejszego uwalniania sferoidów w stadium środkowego / tylnego jelita w porównaniu z innymi błonami podstawnymi pochodzenia zwierzęcego. W porównaniu z innymi, matryca organoidowa wolna od ksenotypów (Matrix 4-O3) prowadzi do większych i bardziej dojrzałych hiIO, co sugeruje, że właściwości fizyczne hydrożeli wolnych od ksenotypów można wykorzystać do optymalizacji wytwarzania organoidów. Podsumowując, wyniki sugerują, że różnice w składzie różnych matryc wpływają na etapy różnicowania IO. Badanie to podnosi świadomość na temat różnic w dostępnych na rynku matrycach i stanowi przewodnik po optymalizacji matryc podczas pracy z iPSC i IO.

Zgodnie z niniejszym protokołem, komercyjnie dostępne błony podstawne oraz system hydrożelowy wolny od komponentów zwierzęcych zostały z powodzeniem wykorzystane do hodowli komórek hiPSC i ich różnicowania w hIO. Głównym celem tych eksperymentów była systematyczna ocena równoważności macierzy pochodzących z różnych źródeł w pracy z hiPSC i hIO. Pierwsza część protokołu koncentrowała się na utrzymaniu i charakterystyce zdrowej kultury iPSC, która pozwala na efektywne generowanie organoidów jelitowych. Opisano i porównano proces powlekania naczyń hodowlanych macierzami pochodzenia zwierzęcego Matrix 1-AB, Matrix 2-AB i Matrix 3-AB z systemem hydrożelowym wolnym od komponentów zwierzęcych Matrix 4-XF.
Jak pokazano w Rysunek 3AhiPSC BXS 0116 (pochodne CD34+) wykazują porównywalną morfologię podczas hodowli na trzech matrycach pochodzenia zwierzęcego. Niemniej jednak porównanie linii komórkowej BXS 0116 z linią SCTi003-A (pochodną PBMC) hodowanymi w studzienkach pokrytych Matrix 1-AB podkreśla, że różnice wewnętrzne między liniami komórkowymi (wykazane w Tabela 6) może prowadzić do zmienności w zakresie proliferacji, różnicowania i morfologii komórek. Na przykład, podczas gdy generowanie DE dla linii komórkowych SCTi003-A trwało 3 dni, w przypadku linii BXS0116 trwało to 5 dni. Co więcej, jak pokazano w Rysunek 3B-Chodowla hiPSC w systemach hydrożelowych Matrix 4-XF prowadzi do powstawania kolonii o częściowo zatopionej strukturze 3D, co drastycznie różni się od płaskiej morfologii kultur hiPSC na płytkach powlekanych Matrix 1-AB lub systemach równoważnych. Ponadto jednym z kluczowych aspektów wynikających z tych doświadczeń jest fakt, że stworzenie systemu hydrożelowego wolnego od składników pochodzenia zwierzęcego (xeno-free) przy użyciu trzykrotnego stężenia czynników wzrostu może znacznie poprawić żywotność komórek oraz ekspresję markerów komórek macierzystych. Podsumowując, hodowle hiPSC na macierzach pochodzenia zwierzęcego oraz na wolnym od składników pochodzenia zwierzęcego Matrix 4-XF z trzykrotnym stężeniem czynników wzrostu doprowadziły do równoważnej ekspresji SSEA-4 (markera komórek macierzystych).22; jednakże system hydrożelowy sprzyja tworzeniu się częściowo zanurzonych kolonii 3D.
Druga część niniejszego protokołu koncentruje się na różnicowaniu hiPSC w celu generowania hIO. W tym celu wykorzystano dostępny komercyjnie zestaw opracowany na podstawie metody Spence et al.23, aby zróżnicować komórki do postaci definitywnej endodermy (DE), następnie jelita środkowego/tylnego (MH), a na koniec zebrać sferoidy w celu ich dojrzewania do IO (Ryc. 4C). Aby efektywnie generować IO, kluczowe jest sprawdzenie, czy hodowla hiPSC wykazuje minimalną spontaniczną różnicowanie przed rozpoczęciem protokołu różnicowania. Jak pokazano na Ryc. 4A, im niższa ekspresja markerów komórek macierzystych, takich jak SSEA-4, w momencie rozpoczynania różnicowania do DE, tym mniej efektywny będzie proces na każdym etapie (np. niższa ekspresja markerów MH), co w konsekwencji doprowadzi do słabej generacji hIO. Wykorzystanie kompaktowego, stołowego cytometru przepływowego umożliwiło szybki dostęp do wyników cytometrii przepływowej i podjęcie decyzji o jakości różnicowania przed przejściem do kolejnego etapu. Specyficzną obserwacją było to, że hiPSC utrzymywane na Matrix 2-AB skutkowały mniejszą liczbą uwalnianych sferoidów na etapie jelita środkowego/tylnego w porównaniu do innych systemów pochodzenia zwierzęcego. Innym istotnym aspektem jest fakt, że ponieważ kolonie hiPSC utrzymywane w Matrix 4-XF posiadały już strukturę 3D na początku różnicowania, systemy te prowadziły do powstania większych sferoidów.
Sferoidy osadzono w Matrix 1-ABO, Matrix 3-ABO, Matrix 4-XFO1 oraz Matrix 4-XFO4, a następnie dojrzały one do postaci hIO przy użyciu zestawu. Po 7 dniach dojrzewania sferoidy zostały pasażowane i osadzone w odpowiednich systemach macierzy. Wzrost organoidów w każdym systemie śledzono przez 7 dni na podstawie obrazów w jasnym polu. Chociaż hodowla rozpoczęła się od organoidów o względnie podobnej wielkości, po 5 dniach rozmiar hIO różnił się w zależności od macierzy, w której zostały osadzone (Rycina 5). Spośród czterech wariantów Matrix 4-XFO, formulacją, która doprowadziła do powstania większych organoidów, była Matrix 4-XFO3. Systemy Matrix 4-XFO są opracowane z różnymi ligandami i właściwościami mechanicznymi, aby dopasować je do różnych zastosowań24. W szczególności sztywność Matrix 4-XFO325 jest bliższa sztywności ludzkiego jelita26 niż w przypadku pozostałych formulacji Matrix 4-XFO, co potwierdza niedawne odkrycia dotyczące roli właściwości mechanicznych ECM w ekspansji organoidów12,27,28. Nasze reprezentatywne wyniki wskazują, że Matrix 1-ABO i Matrix 3-ABO w równym stopniu wspomagają wzrost i ekspansję organoidów jelitowych.
<img alt="schematy różnicowania iPSC oraz dane o wzroście; wyniki mikroskopii i wykres słupkowy, pasek skali 200 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wybór systemu macierzy do utrzymania iPSC. (A) Reprezentatywne obrazy dwóch linii komórkowych hodowanych na podłożu z powłoką z trzech różnych systemów macierzy pochodzenia zwierzęcego. (B) Reprezentatywne obrazy porównujące zastosowanie Matrix 4-XF z 1-krotną i 3-krotną suplementacją czynników wzrostu wykazują, że zwiększenie suplementacji czynników wzrostu poprawia żywotność hiPSC na hydrożelu Matrix 4-XF. (C) Porównanie ekspresji SSEA-4 metodą cytometrii przepływowej dla Matrix 1-AB, Matrix 3-AB oraz Matrix 4-XF (3X) wykazuje równoważną ekspresję, podczas gdy Matrix 4-XF (1X) doprowadził do niższej ekspresji SSEA-4. Słupki reprezentują średnią ± SD dla n = 5; do testowania istotności statystycznej zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji (two-way ANOVA) oraz testy post-hoc z nieparametryczną metodą Wilcoxona. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Etapy różnicowania, hodowla hiPSC, dane z cytometrii przepływowej, typy macierzy, różnicowanie do endodermy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Różnicowanie iPSC do endodermy ostatecznej (DE) oraz jelita środkowego/tylnego (MH). (A) Reprezentatywne obrazy różnicowania iPSC do DE z różnymi poziomami markera SSEA4 podkreślają znaczenie rozpoczynania różnicowania z populacją hiPSC o wysokiej ekspresji markerów komórek macierzystych. Czerwone strzałki wskazują obszary spontanicznego różnicowania przed rozpoczęciem etapu DE. (B) Przykład analizy cytometrii przepływowej ekspresji markera komórek macierzystych SSEA4 przed rozpoczęciem różnicowania oraz markera DE FOXA2 po 3 dniach różnicowania do DE dla słabego różnicowania do DE (lewo) oraz dobrego różnicowania (prawo). Każdy wykres przedstawia analizę komórek wyizolowanych z jednej próbki; do analizy statystycznej zaleca się wyciągnięcie średniej z wyników z co najmniej 3 pomiarów cytometrii przepływowej. (C) Reprezentatywne obrazy różnicowania iPSC do hIO na wszystkich badanych macierzach. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wzrost organoidów w macierzach o różnej sztywności; dane dotyczące modułu sprężystości i powierzchni; schemat, wykresy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wybór systemu macierzy do osadzania sferoidów i dojrzewania hIO. (A) Przykładowe obrazy dojrzewania hIO osadzonych w Matrix 4-XFO 1-4. Moduł sprężystości systemów Matrix 4-XFO wynosi około 50-300 Pa, przy czym najwyższy jest dla Matrix 4-XFO3 &gt; Matrix 4-XFO4 &gt; Matrix 4-XFO2 &gt; Matrix 4-XFO1. Sztywność Matrix 1-ABO i Matrix 3-ABO mieści się w zakresie 440-800 Pa w zależności od partii. (B) Przykładowe obrazy dojrzewania hIO osadzonych w Matrix 1-ABO, Matrix 3-ABO i Matrix 4-XFO3 w dniu osadzania (Dzień 0) oraz po 1 tygodniu hodowli (Dzień 7). (C) Dane przedstawiające porównanie wielkości hIO dojrzewających w różnych systemach macierzy. Słupki reprezentują średnią ± SD dla n = 7; do testowania istotności wykorzystano dwuczynnikową analizę wariancji (two-way ANOVA) oraz testy post-hoc z nieparametryczną metodą Wilcoxona. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig05large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy z nałożoną macierzą, barwienie DAPI i EpCAM, identyfikacja komórek, skala 200 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne organoidów jelitowych hodowanych w różnych macierzach potwierdzają obecność populacji komórek nabłonkowych. Całe organoidy jelitowe hodowane w różnych macierzach zostały utrwalone i zabarwione przeciwciałami przeciwko cząsteczce adhezyjnej komórek nabłonkowych (EpCAM) (kolor zielony), a jądra komórkowe przeciwbarwiono DAPI (kolor niebieski). Wszystkie organoidy wykazują obecność komórek EpCAM-dodatnich, co potwierdza obecność populacji komórek nabłonkowych zlokalizowanych na zewnętrznej powierzchni organoidów. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Podsumowanie przygotowania alikwotów, przechowywania i rozcieńczania macierzy stosowanych do powlekania naczyń hodowlanych wykorzystywanych dla iPSC. * Aby uzyskać dokładny współczynnik rozcieńczenia, należy sprawdzić zalecany współczynnik rozcieńczenia i/lub stężenia białek w certyfikacie analizy (Certificate of Analysis) dla każdej partii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%201_Summary%20of%20aliquot%20preparation_RE.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Tabela referencyjna objętości roztworów powlekających na powierzchnię naczyń hodowlanych oraz pożywki mTeSR Plus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%202_Volume%20of%20coating%20solutions_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Tabela referencyjna objętości roztworów prekursorów Matrix 4-XF w przeliczeniu na powierzchnię naczyń hodowlanych i kompletną pożywkę dla komórek macierzystych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%203_Reference%20table%20of%20the%20volume%20of%20Matrix4-XF_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Lista powszechnych markerów zalecanych do charakteryzacji hiPSC i hIO w trakcie procesu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%204_List%20of%20common%20markers_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 5: Podsumowanie pożywek potrzebnych podczas różnicowania hiPSC w organoidy jelitowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%205_Summary%20of%20media%20needed%20during%20hiPSC_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 6: Szczegółowe informacje dotyczące dwóch linii hiPSC wykorzystanych w niniejszym badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%206_iPSC%20lines%20information_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Ogólny kod MATLAB do modyfikacji w zależności od konkretnego typu obrazu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Code%20image%20Processing_RE.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Organoidy stały się cennymi narzędziami do modelowania chorób. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) kieruje losem komórki podczas generowania organoidów, a użycie systemu, który przypomina tkankę natywną, może poprawić dokładność modelu. W badaniu tym porównano wytwarzanie indukowanych organoidów jelitowych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w hydrożelach ECM pochodzenia zwierzęcego i bezksenowęglowych.

Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) ...

Nasze badania mają na celu integrację modeli in vitro i in sillico w celu informowania o odkrywaniu i opracowywaniu leków na wczesnych etapach rozwoju. Krótko mówiąc, łączymy technologię komórek macierzystych, organoidy i mikrofluidykę, aby badać interakcje między lekami a chorobami, integralność błon oraz przewidywać wchłanianie i metabolizm leków. W naszej dziedzinie najnowocześniejsze technologie obejmują fizjologiczne modele in silico w połączeniu z zaawansowanymi systemami in vitro, takimi jak systemy mikroelektrofizjologiczne, takie jak narządy na chipie i organoidy.Oprócz tego obecnie badane jest biodrukowanie 3D, aby zmaksymalizować skalowalność tych bardziej złożonych modeli in vitro. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują poprawę mikrośrodowisk tkankowych i wierności fizjologicznej tych modeli in vitro, zminimalizowanie zmienności eksperymentalnej i optymalizację możliwości w zakresie wysokiej przepustowości. Ustanowienie ustandaryzowanych protokołów, które są zgodne ze standardami regulacyjnymi dotyczącymi opracowywania leków.Mając na celu zmniejszenie zmienności eksperymentalnej, lepsze naśladowanie mikrośrodowiska tkanek i przestrzeganie wytycznych regulacyjnych dotyczących opracowywania leków dla ludzi, protokół ten opisuje optymalizację generowania organoidów i utrzymanie tego układu organoidowego przy użyciu systemu hydrożelowego wolnego od ksenoizolu o składzie kontrolnym i kontrolnych właściwościach mechanicznych. Jesteśmy zainteresowani rozwojem systemów mikrofizjologicznych do modelowania ADMETox w specjalnych populacjach, które nie są dobrze reprezentowane w badaniach klinicznych, jak na przykład osoby żyjące z zespołem Downa. Nasze laboratorium pracuje również nad wprowadzeniem nowatorskich podejść do leczenia opartego na immunoonkologii w nowych warunkach w zakresie nowotworów przewodu pokarmowego i płuc.Na początek umieść probówki zawierające 25 mililitrów przygotowanych na zimno zaawansowanych pożywek DMEM/F-12 na lodzie. Dodaj rozmrożone matryce do każdej probówki. Wymieszać zawiesinę, upewniając się, że nie tworzą się grudki.Teraz odpipetuj 250 mikrolitrów rozcieńczonych matryc do każdego dołka 24-dołkowej płytki. Przechyl płytkę, aby równomiernie rozprowadzić roztwór powlekający. Po inkubacji za pomocą pipety serologicznej delikatnie usunąć nadmiar roztworu bez zarysowania powlekanych powierzchni.Natychmiast odpipetować 250 mikrolitrów ciepłej, kompletnej pożywki z komórek macierzystych do każdej studzienki. Aby pokryć płytki hodowli tkankowych hydrożelem Matrix 4 bez ksenoizolacji, najpierw ogrzej hydrożel do temperatury pokojowej. Dodać dwie objętości hydrożelu do probówki zawierającej jedną objętość 3x pożywki do hodowli komórek macierzystych.Pipetować roztwór w górę i w dół, aby dokładnie go wymieszać. Przenieś 250 mikrolitrów hydrożelu do studzienek 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Następnie przechyl płytkę, aby równomiernie rozprowadzić hydrożel.Po 10 do 15 minutach powlekane płytki są teraz gotowe do hodowli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Na początek odpipetuj od jednego do dwóch mililitrów roztworu płuczącego zapobiegającego przywieraniu do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Zakręć rurką, aby pokryć jej powierzchnię.Następnie odpipetować pięć mililitrów roztworu DPBS do probówki po usunięciu roztworu zapobiegającego przywieraniu. Zakryj powlekane tuby, aż będą potrzebne. Odpipetować dowolne podłoże z płytki zawierającej kopuły organoidów jelitowych człowieka.Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra dodaj jeden mililitr zimnego podłoża DMEM/F-12 bezpośrednio do kopuły, aby odłączyć ją od płytki. Odpipetować kolejny mililitr pożywki, aby zebrać pozostałe organoidy. Przenieś zawiesinę do powlekanych 15-mililitrowych rurek stożkowych.Pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby rozdrobnić organoidy, aż do utworzenia jednolitej zawiesiny fragmentów o pożądanej wielkości organoidu. Następnie odpipetować porcję zawiesiny do policzenia. Pozostałą zawiesinę umieścić na lodzie.Narysuj siatkę XY na dnie każdej studzienki płaskodennej płytki 96-dołkowej. Odpipetować 50 mikrolitrów DPBS do studzienek. Przenieść pięć mikrolitrów podwielokrotności do każdej studzienki.Ręcznie policz całkowitą liczbę organoidów o średnicy od 50 do 200 mikrometrów. Następnie użyj podanego równania, aby obliczyć objętość zawiesiny organoidu. Po policzeniu organoidów usunąć supernatant i mętną warstwę z probówki zawierającej pozostałą zlepioną zawiesinę.Następnie odpipetować dwa mililitry zimnego DMEM/F-12 bezpośrednio na granulkę. Odwirować zawiesinę o sile 200 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W przypadku systemu pochodzenia zwierzęcego dodaj 40 mikrolitrów zimnej matrycy pochodzenia zwierzęcego do osadu organoidowego.Pipetuj organoidy w górę i w dół, aby rozprowadzić je po matrycy. Delikatnie przenieś mieszaninę organoidów matrycowych do środka sterylnej, wstępnie podgrzanej, 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby zapewnić żelowanie kopuły.Następnie odpipetuj 0,5 mililitra ciepłej pożywki wzrostowej organoidów jelitowych po bokach studzienki, nie naruszając kopuły przed inkubacją. W przypadku systemu organoidów Matrix 4 wolnego od ksenoidów dodaj 50 mikrolitrów 3x pożywki wzrostowej organoidów do kulisy. Następnie odpipetować 100 mikrolitrów wybranego organoidu Matrix 4 bez ksenotypów do zawiesiny.Dodaj 40 mikrolitrów hydrożelowej mieszaniny organoidów do środka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji odpipetować 0,5 mililitra organoidalnej pożywki wzrostowej wzdłuż boków studzienki.Następnie ponownie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% suplementacji dwutlenkiem węgla i wilgotności 95%.

comparative-study-basement-membrane-matrices-for-human-stem-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Komórki rosnące w środowisku trójwymiarowym (3D) reprezentują wyraźną poprawę w stosunku do hodowli komórek w środowiskach 2D (np. kolby lub szalki). W tym artykule opisano rozwój wielokomórkowego 3-wymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelita ludzkiego hodowanej w warunkach mikrograwitacji zapewnianej przez bioreaktory o obrotowych ściankach i naczyniach (RWV).

Opracowanie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka hodowanej w warunkach mikrograwitacji

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

W tym miejscu opisano szczegółowe metody generowania, utrzymywania i charakteryzowania ludzkich organoidów jelita cienkiego i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metody te mają na celu poprawę odtwarzalności, rozszerzenie skalowalności i skrócenie czasu pracy wymaganego do posiewu i pasażowania organoidów.

Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Ten protokół ma na celu ocenę biofunkcjonalnych, samoorganizujących się peptydów pod kątem adhezji komórek, morfologii organoidów i ekspresji genów poprzez barwienie immunologiczne. Wykorzystamy linię komórkową raka jelita grubego, aby zapewnić opłacalny sposób pozyskiwania organoidów do intensywnych testów.

Wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Zoptymalizowaliśmy technikę mikroenkapsulacji jako efektywną platformę 3D do propagacji i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w endodermę oraz neurony dopaminergiczne (DA). Zapewnia ona również możliwość immunoisolacji komórek od gospodarza podczas transplantacji. Platforma ta może zostać dostosowana do innych typów komórek.

Mikrokapsułka alginianowa jako trójwymiarowa platforma do propagacji i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w różne linie komórkowe

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Odkryj metody generowania organoidów jelitowych z komórek macierzystych przy użyciu matryc bezkserogennych i zwierzęcych. Technika ta umożliwia badanie interakcji lek-choroba w modelach in vitro o wysokiej wierności fizjologicznej.

Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych

Przeglądaj więcej filmów