Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych

Nasze badania mają na celu integrację modeli in vitro i in sillico w celu informowania o odkrywaniu i opracowywaniu leków na wczesnych etapach rozwoju. Krótko mówiąc, łączymy technologię komórek macierzystych, organoidy i mikrofluidykę, aby badać interakcje między lekami a chorobami, integralność błon oraz przewidywać wchłanianie i metabolizm leków. W naszej dziedzinie najnowocześniejsze technologie obejmują fizjologiczne modele in silico w połączeniu z zaawansowanymi systemami in vitro, takimi jak systemy mikroelektrofizjologiczne, takie jak narządy na chipie i organoidy.

Oprócz tego obecnie badane jest biodrukowanie 3D, aby zmaksymalizować skalowalność tych bardziej złożonych modeli in vitro. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują poprawę mikrośrodowisk tkankowych i wierności fizjologicznej tych modeli in vitro, zminimalizowanie zmienności eksperymentalnej i optymalizację możliwości w zakresie wysokiej przepustowości. Ustanowienie ustandaryzowanych protokołów, które są zgodne ze standardami regulacyjnymi dotyczącymi opracowywania leków.

Mając na celu zmniejszenie zmienności eksperymentalnej, lepsze naśladowanie mikrośrodowiska tkanek i przestrzeganie wytycznych regulacyjnych dotyczących opracowywania leków dla ludzi, protokół ten opisuje optymalizację generowania organoidów i utrzymanie tego układu organoidowego przy użyciu systemu hydrożelowego wolnego od ksenoizolu o składzie kontrolnym i kontrolnych właściwościach mechanicznych. Jesteśmy zainteresowani rozwojem systemów mikrofizjologicznych do modelowania ADMETox w specjalnych populacjach, które nie są dobrze reprezentowane w badaniach klinicznych, jak na przykład osoby żyjące z zespołem Downa. Nasze laboratorium pracuje również nad wprowadzeniem nowatorskich podejść do leczenia opartego na immunoonkologii w nowych warunkach w zakresie nowotworów przewodu pokarmowego i płuc.

Na początek umieść probówki zawierające 25 mililitrów przygotowanych na zimno zaawansowanych pożywek DMEM/F-12 na lodzie. Dodaj rozmrożone matryce do każdej probówki. Wymieszać zawiesinę, upewniając się, że nie tworzą się grudki.

Teraz odpipetuj 250 mikrolitrów rozcieńczonych matryc do każdego dołka 24-dołkowej płytki. Przechyl płytkę, aby równomiernie rozprowadzić roztwór powlekający. Po inkubacji za pomocą pipety serologicznej delikatnie usunąć nadmiar roztworu bez zarysowania powlekanych powierzchni.

Natychmiast odpipetować 250 mikrolitrów ciepłej, kompletnej pożywki z komórek macierzystych do każdej studzienki. Aby pokryć płytki hodowli tkankowych hydrożelem Matrix 4 bez ksenoizolacji, najpierw ogrzej hydrożel do temperatury pokojowej. Dodać dwie objętości hydrożelu do probówki zawierającej jedną objętość 3x pożywki do hodowli komórek macierzystych.

Pipetować roztwór w górę i w dół, aby dokładnie go wymieszać. Przenieś 250 mikrolitrów hydrożelu do studzienek 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Następnie przechyl płytkę, aby równomiernie rozprowadzić hydrożel.

Po 10 do 15 minutach powlekane płytki są teraz gotowe do hodowli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Na początek odpipetuj od jednego do dwóch mililitrów roztworu płuczącego zapobiegającego przywieraniu do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Zakręć rurką, aby pokryć jej powierzchnię.

Następnie odpipetować pięć mililitrów roztworu DPBS do probówki po usunięciu roztworu zapobiegającego przywieraniu. Zakryj powlekane tuby, aż będą potrzebne. Odpipetować dowolne podłoże z płytki zawierającej kopuły organoidów jelitowych człowieka.

Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra dodaj jeden mililitr zimnego podłoża DMEM/F-12 bezpośrednio do kopuły, aby odłączyć ją od płytki. Odpipetować kolejny mililitr pożywki, aby zebrać pozostałe organoidy. Przenieś zawiesinę do powlekanych 15-mililitrowych rurek stożkowych.

Pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby rozdrobnić organoidy, aż do utworzenia jednolitej zawiesiny fragmentów o pożądanej wielkości organoidu. Następnie odpipetować porcję zawiesiny do policzenia. Pozostałą zawiesinę umieścić na lodzie.

Narysuj siatkę XY na dnie każdej studzienki płaskodennej płytki 96-dołkowej. Odpipetować 50 mikrolitrów DPBS do studzienek. Przenieść pięć mikrolitrów podwielokrotności do każdej studzienki.

Ręcznie policz całkowitą liczbę organoidów o średnicy od 50 do 200 mikrometrów. Następnie użyj podanego równania, aby obliczyć objętość zawiesiny organoidu. Po policzeniu organoidów usunąć supernatant i mętną warstwę z probówki zawierającej pozostałą zlepioną zawiesinę.

Następnie odpipetować dwa mililitry zimnego DMEM/F-12 bezpośrednio na granulkę. Odwirować zawiesinę o sile 200 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W przypadku systemu pochodzenia zwierzęcego dodaj 40 mikrolitrów zimnej matrycy pochodzenia zwierzęcego do osadu organoidowego.

Pipetuj organoidy w górę i w dół, aby rozprowadzić je po matrycy. Delikatnie przenieś mieszaninę organoidów matrycowych do środka sterylnej, wstępnie podgrzanej, 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby zapewnić żelowanie kopuły.

Następnie odpipetuj 0,5 mililitra ciepłej pożywki wzrostowej organoidów jelitowych po bokach studzienki, nie naruszając kopuły przed inkubacją. W przypadku systemu organoidów Matrix 4 wolnego od ksenoidów dodaj 50 mikrolitrów 3x pożywki wzrostowej organoidów do kulisy. Następnie odpipetować 100 mikrolitrów wybranego organoidu Matrix 4 bez ksenotypów do zawiesiny.

Dodaj 40 mikrolitrów hydrożelowej mieszaniny organoidów do środka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji odpipetować 0,5 mililitra organoidalnej pożywki wzrostowej wzdłuż boków studzienki.

Następnie ponownie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% suplementacji dwutlenkiem węgla i wilgotności 95%.