Name: Ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-17T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę warunkowania klasycznego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans. Protokół ten pozwala badać mechanizmy uczenia się asocjacyjnego i plastyczności neuronalnej w modelu organizmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dedykujęmy ten artykuł pamięci Johannes Berthold. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center (CGC), które jest finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). E.I.B. z wdzięcznością wyraża wdzięczność za wsparcie finansowe Studienstiftung des deutschen Volkes.

1. Przygotowanie płyt do wzrostu (GP) w celu synchronizacji C. elegans przed testem uczenia się asocjacyjnego i płyt do kondycjonowania (CP) w celu indukcji skojarzenia [NaCl]-pokarm w dniu testu
UWAGA: Naczynia Petriego do wzrostu i kondycjonowania są identyczne ze standardowymi płytami z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)12, z tą różnicą, że stężenie NaCl zmieniano na płytach 0 mM NaCl CP i 100 mM NaCl CP.
<ol>
	<li>Przygotuj cztery czyste szklane butelki o pojemności 500 mL i dodaj następujące elementy:
	<ol>
		<li>Dodaj 1,25 g peptonu, 8,5 g agaru, 487,5 mL wody destylowanej i mikser magnetyczny do jednej butelki (dla 0 mM NaCl CP);</li>
		<li>Dodaj 1,5 g NaCl, 1,25 g peptonu, 8,5 g agaru, 487,5 mL wody destylowanej i mikser magnetyczny do każdej z dwóch butelek (dla 50 mM NaCl CP i GP odpowiednio);</li>
		<li>Dodaj 3 g NaCl, 1,25 g peptonu, 8,5 g agaru, 487,5 mL wody destylowanej i mikser magnetyczny do jednej butelki (dla 100 mM NaCl CP).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Autoklawuj cztery butelki przez 15 min w 121 °C, a następnie pozwól im ostygnąć przez 30 min w 55 °C w kąpieli wodnej.</li>
	<li>Umieść butelki (jedna po drugiej) na podgrzewanej mikserze magnetycznym. Dodaj do każdej butelki 12,5 mL 1 M KPO4 (pH = 6,0 w temperaturze pokojowej [RT]). Mieszaj dokładnie przez 2 min, następnie dodaj 0,5 mL 1 M CaCl2, 0,5 mL 5 mg/mL cholesterolu w etanolu i 0,5 mL 1 M MgSO4 (wszystkie roztwory muszą być sterylne). Mieszaj za pomocą mieszania magnetycznego. 
	UWAGA: Dokładne mieszanie po dodaniu KPO4 zapobiega osadzaniu się fosforanu wapnia po dodaniu CaCl2.</li>
	<li>Dla każdego rodzaju płyty (0 mM CP, 50 mM CP, 100 mM CP, GP) dodaj 8 mL odpowiedniego medium do każdej 55 mm x 10 mm płyty Petriego w prawie sterylnych warunkach (w komorze przepływowej lub obok palnika Bunsena). 
	UWAGA: Z tego kroku można wykonać około 62 płyt NGM każdego rodzaju.</li>
	<li>Ostygnij płyty, pozostawiając je w RT przez około 3 godziny, a następnie przechowuj je w 4 °C do 2 tygodni przed użyciem.</li>
	<li>Dodaj 200 μL zawiesiny E. coli OP50 do każdej NGM GP i pozostaw do wyschnięcia na noc w 20 °C w inkubatorze. 
	UWAGA: Płyty można przechowywać w RT do 1 tygodnia przed użyciem.</li>
</ol>
2. Utrzymanie C. elegans i przygotowanie do testu uczenia się asocjacyjnego poprzez czasowe składanie jaj 13 (3 dni przed testem)
UWAGA: Jedna runda testu chemotaksji w sugerowanym formacie wymaga co najmniej 24 płyt do wzrostu (GP), 48 płyt do testu (Płyty testowe, AP) i 8 płyt na grupę kondycjonującą (Płyty kondycjonujące, CP). Dla klasy podzielonej na osiem grup studentów oznacza to, że każda grupa studentów otrzymuje 3 GP, 6 CP i 6 AP - czyli 1 CP i 1 AP na każdą warunkową wartość eksperymentalną.
<ol>
	<li>Utrzymuj C. elegans N2 (var. Bristol) na płytach agarowych NGM z karmieniem żywym E. coli OP50 w 20 °C. Przechowuj płyty do góry nogami podczas utrzymania, aby zminimalizować utratę wilgoci.</li>
	<li>Przenieś 30 młodych (dzień 2) dorosłych N2 na każdą GP.</li>
	<li>Pozwól zwierzętom składać jaja przez około 8 godzin w 20 °C.</li>
	<li>Usuń wszystkich dorosłych ze słoików i uprawiaj do góry nogami w 20 °C przez 3 dni.</li>
</ol>
3. Przygotowanie testu (1 dzień przed testem)
<ol>
	<li>Przygotuj zasiane (+) i niezasiane (-) CP.
	<ol>
		<li>Zasiej połowę partii każdej z 0 mM NaCl CP, 50 mM NaCl CP i 100 mM NaCl CP 200 μL OP50 na płytę (CP0+, CP50+ i CP100+ odpowiednio). 
		UWAGA: Dodanie zawiesiny OP50 do CP0+ może prowadzić do przeniesienia niewielkiej ilości NaCl (<2 mM NaCl), co jest mało prawdopodobne, aby znacząco wpłynąć na zachowanie chemotaksji. W sytuacjach, gdy małe stężenia NaCl są istotne, można to uwzględnić, dodając 2 mM NaCl do płyt CP0- i "bez soli" na płytach testowych.</li>
		<li>Pozwól płytom wyschnąć na noc w 20 °C w inkubatorze obok niezasionych połowy CP (CP0-, CP50-, i CP100- odpowiednio)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj płyty testowe (AP).
	<ol>
		<li>Przygotuj trzy czyste szklane butelki o pojemności 1 L i dodaj następujące elementy:
		<ol>
			<li>Dodaj 2,5 g peptonu, 17 g agaru, 975 mL wody destylowanej i mikser magnetyczny do jednej butel

<ol><li>Ardiel, E. L., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+mind%3A+Learning+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">An elegant mind: Learning and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learn Mem. 17, 191-201 (2010).</li>
<li>Rescorla, R. A., Holland, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+studies+of+associative+learning+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Psychol%22%5BJournal%5D)">Behavioral studies of associative learning in animals.</a> Ann Rev Psychol. 33, 265-308 (1982).</li>
<li>Schleyer, M., Fendt, M., Schuller, S., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+learning+of+stimuli+paired+and+unpaired+with+reinforcement%3A+Evaluating+evidence+from+maggots%2C+flies%2C+bees%2C+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychol%22%5BJournal%5D)">Associative learning of stimuli paired and unpaired with reinforcement: Evaluating evidence from maggots, flies, bees, and rats.</a> Front Psychol. 9, 1494(2018).</li>
<li>Dekkers, M. P. J., Salfelder, F., Sanders, T., Umuerri, O., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+gustatory+and+nociceptive+neurons+controls+decision+making+in+C.+elegans+salt+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity in gustatory and nociceptive neurons controls decision making in C. elegans salt navigation.</a> Comm Biol. 4, 1053(2021).</li>
<li>Lim, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CaMKI+function+disrupts+salt-aversive+learning+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of CaMKI function disrupts salt-aversive learning in C. elegans.</a> J Neurosci. 38 (27), 6114-6129 (2018).</li>
<li>Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13+-+Salt+Chemotaxis+Learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chapter 13 - Salt Chemotaxis Learning in Caenorhabditis elegans.</a> Handb Behav Neurosci. 22, 151-159 (2013).</li>
<li>Kunitomo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+memory-dependent+synaptic+plasticity+of+a+taste+circuit+regulates+salt+concentration+chemotaxis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Comm. 4, 2210(2013).</li>
<li>Hiroki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+encoding+and+synaptic+decoding+of+context+during+salt+chemotaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Molecular encoding and synaptic decoding of context during salt chemotaxis in C. elegans.</a> Nat Comm. 13, 2928(2022).</li>
<li>Hukema, R. K., Rademakers, S., Jansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+plasticity+in+C.+elegans+involves+integration+of+negative+cues+and+NaCl+taste+mediated+by+serotonin%2C+dopamine%2C+and+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Gustatory plasticity in C. elegans involves integration of negative cues and NaCl taste mediated by serotonin, dopamine, and glutamate.</a> Learn Mem. 15, 829-836 (2008).</li>
<li>Tomioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin%2FPI+3-kinase+pathway+regulates+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The insulin/PI 3-kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 51 (5), 613-625 (2006).</li>
<li>Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G-protein+gamma+subunit+gpc-1+of+the+nematode+C.elegans+is+involved+in+taste+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The G-protein gamma subunit gpc-1 of the nematode C.elegans is involved in taste adaptation.</a> EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22Maintenance+of+C.+elegans.+WormBook%22">Maintenance of C. elegans. WormBook</a>. , Pasadena, CA. (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> J Vis Exp. 27, e1152(2009).</li>
<li>Cold Spring Harbor Laboratory. M9 Buffer for Worms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harb+Protocol%22">Cold Spring Harb Protocol</a>. , (2014).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li>
<li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+chemotaxis+responses%3A+Sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming chemotaxis responses: Sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li>
<li>Amano, H., Maruyama, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aversive+olfactory+learning+and+associative+long-term+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Aversive olfactory learning and associative long-term memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learn Mem. 18 (10), 654-665 (2011).</li>
<li>Nishijima, S., Maruyama, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appetitive+olfactory+learning+and+long-term+associative+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Appetitive olfactory learning and long-term associative memory in Caenorhabditis elegans.</a> Front Behav Neurosci. 11, 80(2017).</li>
<li>Park, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+ClC+chloride+channel+CLH-1+in+food-associated+salt+chemotaxis+behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Roles of the ClC chloride channel CLH-1 in food-associated salt chemotaxis behavior of C. elegans.</a> eLife. 10, e55701(2021).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+pathway+of+Caenorhabditis+elegans+mediates+chemotaxis+response+to+the+attractant+2-heptanone+in+a+Trojan+horse-like+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The signaling pathway of Caenorhabditis elegans mediates chemotaxis response to the attractant 2-heptanone in a Trojan horse-like pathogenesis.</a> J Biol Chem. 291 (45), 23614-23627 (2016).</li>
<li>Jeong, J., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+mutants+defective+in+chemotaxis+toward+cAMP%5BTitle%5D)+AND+%22Integ+Biosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of Caenorhabditis elegans mutants defective in chemotaxis toward cAMP.</a> Integ Biosci. 10 (4), 237-241 (2006).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Ikeda, D. D., Duan, Y., Matsuki, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CASY-1%2C+an+ortholog+of+calsyntenins%2Falcadeins%2C+is+essential+for+learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CASY-1, an ortholog of calsyntenins/alcadeins, is essential for learning in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Nat Acad Sci. 105 (13), 5260-5265 (2008).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li>
<li>Iino, Y., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+use+of+two+behavioral+mechanisms+for+chemotaxis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel use of two behavioral mechanisms for chemotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 29 (17), 5370-5380 (2009).</li>
<li>Rabinowitch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+neural+damage+in+a+C.+elegans+chemosensory+circuit+using+genetically+engineered+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Circumventing neural damage in a C. elegans chemosensory circuit using genetically engineered synapses.</a> Cell Syst. 12, 263-271 (2021).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+encoding+of+perception%2C+memory%2C+and+movement+in+a+C.+elegans+chemotaxis+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynamic encoding of perception, memory, and movement in a C. elegans chemotaxis circuit.</a> Neuron. 82 (5), 1115-1128 (2014).</li>
<li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

W tym artykule opisujemy ocenę uczenia się asocjacyjnego u nicienia C. elegans za pomocą chemotaksji jako paradygmatu eksperymentalnego. W naszym przykładzie zastosowaliśmy sześć warunków eksperymentalnych. Konkretnie, nicienie dzikiej populacji N2 C. elegans były warunkowane na płytkach z niską (0 mM), średnią (50 mM) lub wysoką (100 mM) stężeniem NaCl, które były albo zasiano standardowym pokarmem nicieni (E. coli szczep OP50) albo pozostawione bez zasiewu. Następnie nicienie C. elegans</...

Aby znacząco współdziałać ze swoim otoczeniem i wytwarzać adaptacyjne zachowania, zwierzęta muszą interpretować informacje zmysłowe, które otrzymują: czy dany bodźca zmysłowy jest korzystny czy szkodliwy dla ich przetrwania, prawie zawsze nie jest przeznaczony, ale zależy to od kontekstu. Kluczowym zadaniem układów sensorycznych i nerwowych jest zatem przypisywanie wartości informacjom z otoczeniem poprzez uczenie się skojarzeniowe. Niektóre bodźce są z natury apetyczne, takie jak jedzenie, a inne są z natury awersyjne, takie jak bodźce nocyceptywne. Takie bezwarunkowe bodźce (US) mogą zmienić reakcje na inne bodźce prezentowane razem z nimi; w rezultacie zwierzęta mogą rozwijać przyciąganie lub awersję do innego, uwarunkowanego bodźca (CS). Jest to interpretowane w taki sposób, że CS sygnalizuje lub przewiduje US1,2,3. Badanie modeli uczenia się skojarzeniowego jest konieczne, aby wyjaśnić podstawowe mechanizmy genetyczne, komórkowe i fizjologiczne. Jednakże może to być wyzwaniem ze względu na konieczność stosowania modeli in vivo, zmienności zachowania, wymaganego licencjonowania obsługi zwierząt lub często długich czasów szkolenia zarówno badacza, jak i zwierząt, co zwykle wyklucza przeprowadzenie takich badań przez studentów na poziomie licencjackim w środowisku badawczym, a jeszcze bardziej w środowisku dydaktycznym.
Dlatego modele bezkręgowców oferują możliwość przeprowadzenia testów uczenia się skojarzeniowego z udziałem studentów na poziomie licencjackim lub magisterskim. Bezkręgowce nie wymagają licencji na zwierzęta do ich obsługi i mogą być opłacalne. Często stosowanym paradygmatem uczenia się skojarzeniowego jest uczenie się chemotaksji soli u C. elegans4,5,6,7,8,9. C. elegans wyczuwają stężenie chlorku sodu (NaCl) w swoim środowisku i uczą się kojarzyć określone [NaCl] z obecnością lub brakiem jedzenia, odpowiednio. Ogólnie zwierzęta uczą się migrować w kierunku stężeń soli, które wcześniej były prezentowane z dużą ilością pokarmu bakteryjnego i uczą się migrować z tych, które były prezentowane w przypadku braku pokarmu bakteryjnego. Sól jest zatem bodźcem uwarunkowanym, a jedzenie lub głód jest bodźcem bezwarunkowym3. Ta asocjacja jest tworzona w ciągu mniej niż godziny i jest przykładem krótkotrwałej pamięci skojarzeniowej. Uczenie się skojarzeniowe chemotaksji NaCl jest modulowane, między innymi, przez sygnalizację zależną od wapnia/kalmoduliny (CaMK), dopaminergiczną i insulinową/fosfatydyloinozytolową (PI) 3-kinazę5,9,10, co sugeruje, że wiąże się to z systemami motywacyjnymi oraz zależną od CaMK plastycznością synaptyczną i może działać w podobny sposób jak ścieżki sygnałowe rządzące uczeniem się skojarzeniowym u kręgowców.
W ugruntowanym protokołe uczenia się chemotaksji soli zwierzęta migarują w przestrzennym gradientzie soli na płytce agarowej stworzonym przez umieszczenie dwóch wkładek agarowych bez soli lub z dużą zawartością soli na płytce7. Te testy są trudne do przeprowadzenia w sposób ilościowy przez studentów z powodu dynamicznej zmiany stężenia NaCl na płytce do testu chemotaksji w czasie i przestrzeni, ponieważ NaCl z wkładek ciągle dyfunduje do płytki agarowej. Łatwiej do wykonania jest test z użyciem płytek czworobocznych, gdzie prezentowane są dwa różne stężenia soli (np. 25 mM NaCl i 0 mM NaCl) i oddzielone są one plastikowymi barierami11. Jednakże ze względu na prezentację tylko dwóch różnych stężeń NaCl, nie może być on użyty jednocześnie do badania przyciągania lub/i uniknięcia obniżonego lub zwiększonego NaCl względem warunków wyjściowych. C. elegans jest zwykle hodowana na płytkach NGM (Nematode Growth Media) w obecności 50 mM NaCl i bakterii E. coli OP5012, a zatem domyślnie tworzy pozytywne skojarzenie tego stężenia NaCl z pokarmem.
Przedstawiamy tutaj przystosowany protokół uczenia się chemotaksji soli, który może być wykonywany zarówno przez badaczy, jak i studentów. Zwierzęta są najpierw kondycjonowane na różne środowiska NaCl prezentowane w obecności lub braku pokarmu. Następnie są przenoszone na płytki testowe z wyborem niskiego, średniego i wysokiego stężenia soli w płytkach agarowych z komorami Y. Ich uczenie się chemotaksji w tym ustawieniu może być wykorzystane do badania wpływu różnych czynników na niego modulacyjnych, takich jak genotyp, konteksty środowiskowe lub wiek zwierząt.
Ten protokół jest dostosowany do zajęć praktycznych z laboratorium na poziomie licencjackim, podzielonych na osiem grup studentów, przy czym każda grupa studentów wykonuje zestaw sześciu pomiarów w każdym punkcie

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Chemsolute</td><td>9972-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1M solution&nbsp;</td><td>Merck</td><td>2389</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans strains</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8866.1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50 liquid culture</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chemsolute</td><td>22731000</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Roth</td><td>&nbsp;P018.2</td><td></td></tr><tr><td>KPO4 (KH2PO4, K2HPO4) 1 M solution&nbsp;</td><td>Chemsolute</td><td>16341000</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 1 M solution&nbsp;</td><td>Roth</td><td>T888.2</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Roth</td><td>T877.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemsolute</td><td>13671000</td><td></td></tr><tr><td>Y-Petri dishes 90 x 10 mm</td><td>Moonlab</td><td>4-0033</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia caenorhabditis elegans

Measuring Associative Learning in Chemotaxis of the Nematode Caenorhabditis elegans

Aby przystosować swoje zachowanie, zwierzęta przypisują wartość wrażeniom zmysłowym poprzez uczenie się skojarzeniowe i aktualizują tę skojarzeniową asocjację, gdy warunki środowiskowe się zmieniają. Zachowania Caenorhabditis elegans w odpowiedzi na chlorek sodu oferują dobrze zdefiniowany paradygmat do badania mechanizmów rządzących uczeniem się skojarzeniowym. Wystawianie dżdżownic na określone stężenia NaCl w powiązaniu z obecnością lub brakiem pokarmu wywołuje chemotaksję w kierunku lub wcześniej od tego stężenia NaCl, odpowiednio. Pamięć skojarzeniowa formuje się w ciągu kilku godzin i może być modyfikowana w tym samym czasie po wystawieniu zwierząt na inne stężenie NaCl.
Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić test na plastyczność behawioralną i uczenie się na podstawie chemotaksji solowej u C. elegans. Szczepy testowe są hodowane w zsynchronizowanych kohortach aż osiągną dorosłość, a następnie kondycjonowane przez kilka godzin na płytkach z różnymi stężeniami NaCl, albo w obecności albo w braku pokarmu. Zwierzęta są następnie przenoszone na płytki testowe zawierające regiony o niskich, średnich lub wysokich stężeniach NaCl i pozwala się im pełzać przez 30 min przed zliczeniem liczby dżdżownic w każdym regionie. Następnie oblicza się indeks chemotaksji z dystrybucji dżdżownic na płytce. Test może być wykorzystany do sprawdzenia wpływu szerokiego zakresu czynników wpływających na uczenie się.

Kondycjonowanie przez 4 godziny na płytkach z różnymi ilościami NaCl (0 mM, 50 mM, 100 mM), z jedzeniem lub bez, znacząco wpłynęło na zachowanie gatunku C. elegans typu dzikiego (N2). Po 30 min. na płytce badawczej, robaki kondycjonowane na płytkach z wysokimi stężeniami NaCl i jedzeniem (CP100+) oraz robaki kondycjonowane na płytkach bez NaCl i bez jedzenia (CP0-) miały dodatni CI, co wskazuje na preferencję wyższych stężeń NaCl (Rycina 2, Tabela 1, Tabela 2</strong...

Tu przedstawiamy protokół do testowania uczenia się skojarzeniowego poprzez przeprowadzenie klasycznego uwarunkowywania u organizmu modelowego C. elegans. Paradygmat opiera się na łączeniu stężenia soli w środowisku z obecnością lub brakiem pokarmu, co zmienia ich chemotaksję w kierunku soli lub w jej kierunku przeciwnym.

Ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans

To adapt their behavior, animals assign valence to sensory information through associative learning, and update this association when environmental ...

Jednym z najbardziej fascynujących pytań w dziedzinie neurobiologii jest to, jak pamięć uczenia się powstaje z plastyczności neuronów. Zarówno plastyczność, jak i uczenie się maleją z wiekiem. Ale jest w dużej mierze niejasne, dlaczego badamy mechanizmy odpowiedzialne za ten spadek.Używając organizmów modelowych w postaci nicieni z gatunku Caenorhabditis elegans. Stało się jasne, że prawie każde zachowanie C.elegans zależy od kontekstu i doświadczenia oraz że dzielą one mechanizmy uczenia się skojarzeniowego i nieskojarzeniowego z innymi organizmami. Zauważalnie kluczowe determinanty uczenia się C.elegans, takie jak aktywność neuronowa i sygnalizacja insulinowa, są również zaangażowane w regulację procesów świądu mózgu, a nawet całego organizmu.Podstawowa technologia stosowana w badaniach chemotaksji polega na podzielonych naczyniach Petriego przez mikroskopy. Używamy również kamer z oprogramowaniem do śledzenia oraz niestandardowych komór behawioralnych do śledzenia trajektorii i obrazowania wapnia z mikrofluidyką, aby wizualizować mechanizmy fizjologiczne leżące u podstaw zachowań, które obserwujemy na naczyniu Petriego. Obecnie testy chemotaksji C.elegans przeprowadzano na płytkach gradientowych lub czworobocznych.Płytki gradientowe mogą być wymagające do wykonania, ponieważ gradient zmienia się w czasie, a płytki czworoboczne, zostały użyte tylko do porównania dwóch różnych stężeń soli. Dlatego wprowadziliśmy stosowanie białych płytek do tego testu. Chcemy zrozumieć, dlaczego zdolność do uczenia się, która zależy od plastyczności neuronowej, maleje z wiekiem.Celem jest zastosowanie testu chemotaksji, aby sprawdzić, czy określone ścieżki sygnalizacyjne są odpowiedzialne za ten spadek. Na tej podstawie chcemy opracować terapie ukierunkowane na ten związany z wiekiem spadek poznawczy. Aby rozpocząć, uzyskaj wzrost nicieni, płyty z śrubą zasilaną żywymi bakteriami Escherichia coli OP 50.Dodaj Caenorhabditis elegans N dwa na płytę i utrzymuj w pozycji do góry nogami w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc, aby zminimalizować utratę wilgoci. Następnego dnia przenieś 30 młodych dorosłych Caenorhabditis elegans na płytkę z wzrostem nicieni. Pozwól zwierzętom składać jaja przez około osiem godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Po ustalonej czasowo składaniu jaj usuń wszystkie dorosłe robaki z płytki. Kultywuj płytkę w pozycji do góry nogami w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez trzy dni. Do testu zasiej połowę partii pożądanych grup płytek kondycjonujących 200 mikrolitri OP 50 na płytkę.Pozwól zasiejonym płytkom wyschnąć przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza w inkubatorze obok niezasiejonych płytek. Przygotuj pożądane stężenie jednego litra roztworu chlorku sodu w szklanej butelce. Autoklawuj butelki przez 15 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.Następnie pozwól butelkom ostygnąć przez 30 minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza w kąpieli wodnej. Tymczasem oznaczyć dno sekcji naczynia YP drzewem z odpowiednim stężeniem chlorku sodu i narysować okrąg o promieniu pięciu milimetrów wokół środka płytki, gdzie ściany się spotykają. Umieść każdą butelkę jednocześnie na podgrzewanej miksownicy magnetycznej.Dodaj 25 mililitrów jednomolarnego roztworu fosforanu potasu o pH sześć do każdej butelki. Mieszaj intensywnie przez dwie minuty. Następnie sekwencyjnie dodaj cholesterol i chlorek wapnia, mieszając.Następnie podziel środek zero milimolarowy na jedno kompartyment płytki Y Petriego, aż osiągnie górę wewnętrznej ściany. I pozwól środowisku stwardnieć przez około pięć minut. Podziel środek 100 milimolarowy na drugi kompartyment płytki Y Petriego, aż dotknie stwardniałej sekcji zero milimolarowej sąsiedniej do niego.Następnie użyj sterylnej końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby złamać napięcie powierzchniowe wzdłuż ściany Y i połączyć ją z sekcją zero milimolarowej soli chlorowej. Pozwól środowisku stwardnieć przez pięć minut. Podziel środek 50 milimolarowy na pozostały kompartyment płytki Y Petriego, aż dotknie stwardniałej sekcji zero milimolarowej i 100 milimolarowej.Następnie użyj sterylnej końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby złamać napięcie powierzchniowe wzdłuż ściany Y i połączyć sekcję 50 milimolarowej soli chlorowej z pozostałymi dwoma sekcjami. Po pozwoleniu środowisku stwardnieć przez pięć minut przechowuj płytki przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć, pipetą jedno mililitr sterylnego bufora M dziewięć na płytkę wzrostu zawierającą Caenorhabditis elegans.Delikatnie obróć płytkę, aby uwolnić robaki z trawnika OP 50 bakterii i śruby tworząc zawiesinę. Przechyl płytkę, aby zebrać zawiesinę robaków w buforze M dziewięć za pomocą jednomililitrowej plastikowej końcówki pipety z odcinkiem górnej części. Przenieś zawiesinę do mikro zentrofugowej tubki o pojemności 1,5 mililitra.Pozwól robakom osiąść na dnie mikro zentrofugowych tub w ciągu około 60 sekund, tworząc pellet. Następnie usuń nadstan przy użyciu jednomili

measuring-associative-learning-chemotaxis-nematode-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

W niniejszym opracowaniu opisujemy metody testowania uczenia się warunkowego oraz krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej u C. elegans. Te populacyjne testy wykorzystują zdolność nicieni do chemotaksji w kierunku lotnych substancji zapachowych oraz tworzenie pozytywnych skojarzeń poprzez parowanie pożywienia z chemoatraktantem, jakim jest butanon. Zwiększenie liczby okresów warunkowania indukuje pamięć długotrwałą.

C. elegans: testy uczenia się pozytywnego względem butanonu oraz testy krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej

Ten film przedstawia chemotaksję u nicienia C. elegans i pokazuje przykładowy protokół testujący chemotaktyczną awersję do siarczanu miedzi.

C. elegans (C. elegans) Test chemotaksji: metoda testowania chemosensacji u robaków

Badacze mogą uruchomić ruch na żądanie u C. elegans, stosując pole elektryczne, które robaki wyczuwają i na które reagują. Ten film przedstawia zachowanie elektrotaktyczne i pokazuje przykładowy protokół, który jest wykonywany w urządzeniu mikroprzepływowym.

Test elektrotaksji: metoda obserwacji lokomocji u C. elegans

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Wcześniej opracowaliśmy protokoły dla Caenorhabditis elegans do tworzenia krótko- i długoterminowych wspomnień asocjacyjnych odpowiednio poprzez trening masowy i rozłożony w odstępach. Tutaj opisano szczegółowe protokoły warunkowania C. elegans poprzez parowanie 1-propanolu i kwasu solnego jako bodźców uwarunkowanych i bezwarunkowych, odpowiednio, w celu utworzenia awersyjnej pamięci asocjacyjnej.

Awersyjne uczenie się asocjacyjne i tworzenie pamięci poprzez połączenie dwóch substancji chemicznych w Caenorhabditis elegans

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje zmodyfikowaną tablicę do dołków, która jest zestawem testów behawioralnych, który zawiera cechy otwartego pola i tradycyjnej tablicy do dołków. Układ ten umożliwia analizę różnicową nieuwarunkowanych zachowań małych ssaków laboratoryjnych, a także analizę zdolności poznawczych.

Zmodyfikowana tablica z otworami - pomiar zachowania, funkcji poznawczych i interakcji społecznych u myszy i szczurów

Opisana jest metoda, w której 3-4 miesięczne niemowlęta uczą się zadania poprzez odkrywanie, a ruchy ich nóg są rejestrowane w celu ilościowego określenia procesu uczenia się.

Kwantyfikacja uczenia się u małych niemowląt: śledzenie działań nóg podczas zadania uczenia się przez odkrywanie

Labirynt Wieży Otwartego Pola (OFTM) to labirynt stworzony do badania behawioralnych i neuronalnych mechanizmów uczenia się przestrzennego (np. uczenia się miejsca lub odpowiedzi) u szczurów. Ten labirynt jest szczególnie przydatny dla eksperymentatorów, którzy chcą wykorzystać bezstresowy paradygmat labiryntu do zbadania uczenia się przestrzennego w swoich badaniach.

Nauka miejsca i reagowania w labiryncie wieży na otwartym polu

Poznaj metodę warunkowania klasycznego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans. Protokół ten pozwala badać mechanizmy uczenia się asocjacyjnego i plastyczności neuronalnej w modelu organizmu.

Ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów