Ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans
17 czerwca 2025
Tu przedstawiamy protokół do testowania uczenia się skojarzeniowego poprzez przeprowadzenie klasycznego uwarunkowywania u organizmu modelowego C. elegans. Paradygmat opiera się na łączeniu stężenia soli w środowisku z obecnością lub brakiem pokarmu, co zmienia ich chemotaksję w kierunku soli lub w jej kierunku przeciwnym.
Jednym z najbardziej fascynujących pytań w dziedzinie neurobiologii jest to, jak pamięć uczenia się powstaje z plastyczności neuronów. Zarówno plastyczność, jak i uczenie się maleją z wiekiem. Ale jest w dużej mierze niejasne, dlaczego badamy mechanizmy odpowiedzialne za ten spadek.
Używając organizmów modelowych w postaci nicieni z gatunku Caenorhabditis elegans. Stało się jasne, że prawie każde zachowanie C.elegans zależy od kontekstu i doświadczenia oraz że dzielą one mechanizmy uczenia się skojarzeniowego i nieskojarzeniowego z innymi organizmami. Zauważalnie kluczowe determinanty uczenia się C.elegans, takie jak aktywność neuronowa i sygnalizacja insulinowa, są również zaangażowane w regulację procesów świądu mózgu, a nawet całego organizmu.
Podstawowa technologia stosowana w badaniach chemotaksji polega na podzielonych naczyniach Petriego przez mikroskopy. Używamy również kamer z oprogramowaniem do śledzenia oraz niestandardowych komór behawioralnych do śledzenia trajektorii i obrazowania wapnia z mikrofluidyką, aby wizualizować mechanizmy fizjologiczne leżące u podstaw zachowań, które obserwujemy na naczyniu Petriego. Obecnie testy chemotaksji C.elegans przeprowadzano na płytkach gradientowych lub czworobocznych.
Płytki gradientowe mogą być wymagające do wykonania, ponieważ gradient zmienia się w czasie, a płytki czworoboczne, zostały użyte tylko do porównania dwóch różnych stężeń soli. Dlatego wprowadziliśmy stosowanie białych płytek do tego testu. Chcemy zrozumieć, dlaczego zdolność do uczenia się, która zależy od plastyczności neuronowej, maleje z wiekiem.
Celem jest zastosowanie testu chemotaksji, aby sprawdzić, czy określone ścieżki sygnalizacyjne są odpowiedzialne za ten spadek. Na tej podstawie chcemy opracować terapie ukierunkowane na ten związany z wiekiem spadek poznawczy. Aby rozpocząć, uzyskaj wzrost nicieni, płyty z śrubą zasilaną żywymi bakteriami Escherichia coli OP 50.
Dodaj Caenorhabditis elegans N dwa na płytę i utrzymuj w pozycji do góry nogami w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc, aby zminimalizować utratę wilgoci. Następnego dnia przenieś 30 młodych dorosłych Caenorhabditis elegans na płytkę z wzrostem nicieni. Pozwól zwierzętom składać jaja przez około osiem godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
Po ustalonej czasowo składaniu jaj usuń wszystkie dorosłe robaki z płytki. Kultywuj płytkę w pozycji do góry nogami w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez trzy dni. Do testu zasiej połowę partii pożądanych grup płytek kondycjonujących 200 mikrolitri OP 50 na płytkę.
Pozwól zasiejonym płytkom wyschnąć przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza w inkubatorze obok niezasiejonych płytek. Przygotuj pożądane stężenie jednego litra roztworu chlorku sodu w szklanej butelce. Autoklawuj butelki przez 15 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.
Następnie pozwól butelkom ostygnąć przez 30 minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza w kąpieli wodnej. Tymczasem oznaczyć dno sekcji naczynia YP drzewem z odpowiednim stężeniem chlorku sodu i narysować okrąg o promieniu pięciu milimetrów wokół środka płytki, gdzie ściany się spotykają. Umieść każdą butelkę jednocześnie na podgrzewanej miksownicy magnetycznej.
Dodaj 25 mililitrów jednomolarnego roztworu fosforanu potasu o pH sześć do każdej butelki. Mieszaj intensywnie przez dwie minuty. Następnie sekwencyjnie dodaj cholesterol i chlorek wapnia, mieszając.
Następnie podziel środek zero milimolarowy na jedno kompartyment płytki Y Petriego, aż osiągnie górę wewnętrznej ściany. I pozwól środowisku stwardnieć przez około pięć minut. Podziel środek 100 milimolarowy na drugi kompartyment płytki Y Petriego, aż dotknie stwardniałej sekcji zero milimolarowej sąsiedniej do niego.
Następnie użyj sterylnej końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby złamać napięcie powierzchniowe wzdłuż ściany Y i połączyć ją z sekcją zero milimolarowej soli chlorowej. Pozwól środowisku stwardnieć przez pięć minut. Podziel środek 50 milimolarowy na pozostały kompartyment płytki Y Petriego, aż dotknie stwardniałej sekcji zero milimolarowej i 100 milimolarowej.
Następnie użyj sterylnej końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby złamać napięcie powierzchniowe wzdłuż ściany Y i połączyć sekcję 50 milimolarowej soli chlorowej z pozostałymi dwoma sekcjami. Po pozwoleniu środowisku stwardnieć przez pięć minut przechowuj płytki przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć, pipetą jedno mililitr sterylnego bufora M dziewięć na płytkę wzrostu zawierającą Caenorhabditis elegans.
Delikatnie obróć płytkę, aby uwolnić robaki z trawnika OP 50 bakterii i śruby tworząc zawiesinę. Przechyl płytkę, aby zebrać zawiesinę robaków w buforze M dziewięć za pomocą jednomililitrowej plastikowej końcówki pipety z odcinkiem górnej części. Przenieś zawiesinę do mikro zentrofugowej tubki o pojemności 1,5 mililitra.
Pozwól robakom osiąść na dnie mikro zentrofugowych tub w ciągu około 60 sekund, tworząc pellet. Następnie usuń nadstan przy użyciu jednomili
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół badania uczenia się asocjacyjnego poprzez warunkowanie klasyczne w organizmie modelowym C. elegans. Metoda ta polega na parowaniu stężenia soli z obecnością pokarmu, co wpływa na chemotaksję organizmu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Warunkowanie klasyczne
Wprowadzenie
- C. elegans jest powszechnie stosowanym organizmem modelowym w neuronauce.
- Mechanizmy uczenia się i pamięci są powiązane z plastycznością neuronalną.
- Zrozumienie tych mechanizmów może rzucić światło na związane z wiekiem upośledzenie zdolności uczenia się.
- Uczenie się asocjacyjne u C. elegans wykazuje podobieństwa do procesów zachodzących u innych organizmów.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów uczenia się asocjacyjnego u C. elegans.
- Zbadanie wpływu czynników środowiskowych na zachowanie.
- Zrozumienie roli aktywności neuronalnej w procesach uczenia się.
Zastosowane metody
- Protokół warunkowania klasycznego z wykorzystaniem soli i pokarmu.
- Testy behawioralne w celu pomiaru chemotaksji.
- Analiza aktywności neuronalnej związanej z uczeniem się.
- Badania porównawcze z innymi modelami uczenia się.
Główne wyniki
- C. elegans wykazuje zachowania uczenia się zależne od kontekstu.
- Aktywność neuronalna oraz sygnalizacja insulinowa są kluczowe dla procesu uczenia się.
- Mechanizmy uczenia się asocjacyjnego są konserwatywne pomiędzy gatunkami.
- Związany z wiekiem spadek zdolności uczenia się może być powiązany ze zmianami plastyczności neuronalnej.
Wnioski
- Badanie to pogłębia zrozumienie mechanizmów uczenia się u C. elegans.
- Wyniki mogą dostarczyć informacji przydatnych w badaniach nad spadkiem zdolności uczenia się wraz z wiekiem.
- Wnioski te mogą mieć szersze znaczenie dla neuronauki.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe testy chemotaksji u Caenorhabditis elegans umożliwiają systematyczną analizę uczenia się asocjacyjnego i plastyczności behawioralnej, zapewniając solidny model do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw odpowiedzi adaptacyjnych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów dla szlaków zaangażowanych w spadek funkcji poznawczych i plastyczność neuronalną. Powtarzalność i skalowalność tej metody sprawiają, że jest ona podstawowym narzędziem wczesnego odkrywania i ograniczania ryzyka mechanistycznego w portfelach B&R skoncentrowanych na neurobiologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną walidację szlaków neuronalnych zaangażowanych w uczenie się asocjacyjne i pamięć.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez powiązanie wyników behawioralnych ze specyficznymi kaskadami sygnałowymi.
- Ułatwia badanie mechanizmów związanego z wiekiem pogorszenia funkcji poznawczych w oparciu o sformułowane hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie analiz
- Zapewnia zestandaryzowany, ilościowy test behawioralny do oceny zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych.
- Dostarcza powtarzalne indeksy chemotaksji do porównań między różnymi warunkami oraz w celu przygotowania do screeningu.
- Umożliwia skalowalne testowanie kohortowe dla wysokoprzepustowego fenotypowania behawioralnego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami utraty plastyczności neuronalnej i pogorszenia funkcji poznawczych istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość przejścia od mechanistycznych wniosków z etapu odkryć do przedklinicznego ustalania priorytetów dla celów terapeutycznych.
- Oferuje wartość prognostyczną dla opracowywania translacyjnych biomarkerów w badaniach nad neurodegeneracją.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten test uczenia asocjacyjnego opartego na chemotaksji integruje się z wczesnym etapem procesu od odkrywania do identyfikacji lidera, stanowiąc pomost między badaniem szlaków molekularnych a funkcjonalnymi wynikami behawioralnymi.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących plastyczności neuronalnej i mechanizmów uczenia się.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych i powtarzalnych odczytów behawioralnych dla przesiewów związków chemicznych lub genetycznych.
- Analityka: Pozwala na wyznaczenie indeksów chemotaksji w celu przeprowadzenia rzetelnych porównań statystycznych między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z modelami związanymi z wiekiem spadkiem funkcji poznawczych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Tworzy wielokrotnego użytku platformę behawioralną dla różnorodnych inicjatyw badawczo-rozwojowych w dziedzinie neurobiologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów neuronalnych i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne testy behawioralne.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go w programach odkrywania leków skoncentrowanych na neurobiologii.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i szlaków związanych z pogorszeniem funkcji poznawczych, z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie neuronauki behawioralnej oraz pracy z C. elegans.
- Wymaga dostępu do infrastruktury obrazowania, śledzenia i analizy statystycznej.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji warunków testowych i odczytów pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji dla różnych tła genetycznych i manipulacji środowiskowych u C. elegans.
- Wrażliwość testu na zmienne środowiskowe wymaga starannej kontroli eksperymentalnej.
