Obliczeniowe przewidywanie preferencji aminokwasów potencjalnie wielospecyficznych domen wiążących peptydy zaangażowanych w interakcje białko-białko

Proponujemy protokół do obliczeniowego przewidywania preferencji aminokwasów w bardziej szczegółowych interakcjach białko-białko. Protokół ten można uznać za pierwszy krok w projektowaniu mediatorów tych interakcji. Jesteśmy zainteresowani wykorzystaniem tych mediatorów jako potencjalnych inhibitorów specyficznych interakcji, w technologii immunologicznej.

Nasz implementator służący do charakteryzowania preferencji aminokwasowych wśród konkretnych miejsc wiązania jest kosztowny i kłopotliwy. Nasz protokół to technologia wspierana biologicznie oparta na wydajności i operacjach seryjnych. Strategia ta ma potencjał do przetwarzania dużej liczby sekwencji linii, zapewniając całkowitą i spójną różnicę w preferencjach aminokwasów.

Nasz protokół oferuje profesjonalną opłacalność poprzez przetwarzanie dużej liczby sekwencji DNA preferowanych w stosunku do bardziej kompletnych z zazwyczaj ograniczonej liczby sekwencji, procesów w podejściach laboratoriów internetowych. Oprócz opracowania inhibitorów produktów immunologicznych chcielibyśmy porównać skuteczność tej metodologii z innymi rodzinami produktów. Pozwoli nam to lepiej zrozumieć strukturalne podstawy wieloswoistości, nie tylko w kontekście immunologicznym, ale także w innych funkcjach komórkowych, takich jak sygnalizacja i komunikacja.

Zacznij od pobrania struktury kompleksu białko-białko. W tym celu przejdź do strony głównej banku danych o białkach i wprowadź identyfikator PDB w głównym polu wyszukiwania. Na stronie głównej struktury kliknij Pobierz pliki, a następnie Biological Assembly 1, aby pobrać pliki w formacie PDB gz.

Otwórz pobraną strukturę w UCSF Chimera. Przejdź do Narzędzia, a następnie Edycja struktury i kliknij Zmień identyfikatory łańcucha. Zmień nazwę drugiego łańcucha początkowo oznaczonego jako A, na B. Następnie kliknij Ulubione, a następnie Panel modelu.

Wybierz model z dwoma łańcuchami i kliknij przycisk grupowania/rozgrupowywania, aby rozdzielić każdy łańcuch na inny model. Następnie wybierz dwa modele i kliknij przycisk kopiowania/łączenia. Wprowadź nową nazwę połączonego modelu.

Zaznacz opcję Zamknij modele źródłowe i kliknij przycisk OK. Kliknij Wybierz, a następnie Łańcuch i potwierdź, że łańcuchy w dimerze są teraz identyfikowane jako A i B. Kliknij Plik i zapisz PDB, aby zapisać edytowaną strukturę jako nowy plik PDB. Aby zidentyfikować segment docelowy w białku liganda, przejdź do serwera BUDE Alanine Scan. Kliknij przycisk Wybierz plik w obszarze Przesyłanie struktury i prześlij zapisany plik PDB.

Na następnej stronie sprawdź, czy struktura została poprawnie załadowana, i wprowadź nazwę zadania na serwerze. Ustaw łańcuchy A jako receptor, a B jako ligand, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie, aby przesłać zadanie. Po zakończeniu zadania kliknij pozycję Pokaż wyniki, aby otworzyć stronę Wyniki.

Z listy Pozostałości wybierz odcinek pozostałości, co do którego przewiduje się, że będzie lepiej oddziaływał z docelową powierzchnią wiązania. Korzystając z tego protokołu i segmentu aminokwasów, oddziałującego z powierzchnią wiążącą IRF5, przewidywano. Korzystając z obliczeniowej mutagenezy skaningowej alaniny, przewidywano segment 13 aminokwasów od pozycji 424 do 436, z motywem p L x IS zaczynającym się od argininy 432.

Na początek przygotuj interfejs peptydu białkowego do dywersyfikacji sekwencji. Otwórz plik PDB w Chimerze i upewnij się, że struktura docelowych podjednostek jest nienaruszona, bez brakujących atomów lub wiązań. Aby usunąć wszystkie nieistotne cząsteczki ze struktury, kliknij Wybierz, a następnie Pozostałości, a następnie wybierz wszystkie cząsteczki inne niż standardowe aminokwasy.

Następnie kliknij Akcje, a następnie Adams/Obligacje i usuń. Następnie kliknij Ulubione, w Sekwencja, a następnie kliknij łańcuch uważany za ligand. Przytnij łańcuch liganda do zidentyfikowanego segmentu oddziałującego, usuwając wszystkie pozostałości z wyjątkiem tych między wybranymi pozycjami.

Kliknij Plik i zapisz PDB, aby zapisać edytowaną strukturę do innego pliku PDB. Skopiuj ten plik do lokalizacji systemu Linux dostępnej dla aplikacji Rosetta. Użyj aplikacji fixedbb firmy Rosetta, aby wykonać przepakowanie wszystkich łańcuchów bocznych aminokwasów struktury podstawowej przed dywersyfikacją sekwencji, uruchamiając to polecenie.

Następnie zmień nazwę pliku PDB przepakowania na sufiks _ repack za pomocą następującego polecenia. Następnie uruchom pepspec w trybie projektowania, aby wykonać dywersyfikację sekwencji za pomocą tego polecenia. Następnie wygeneruj pwm przy użyciu gen pepspec pwm.

py skrypt zawarty w pakiecie Rosetta. Aby uruchomić ten skrypt, użyj następującego polecenia. Aby utworzyć logo sekwencji, otwórz plik z sekwencjami peptydowymi wygenerowanymi w poprzednim kroku za pomocą preferowanego edytora tekstu i skopiuj wszystkie sekwencje.

Przejdź do serwera WebLogo i wklej sekwencje w polu tekstowym Wyrównanie wielu sekwencji. Wybierz żądany format i rozmiar logo zgodnie z długością wejściową, a następnie kliknij Utwórz logo. Korzystając z tego protokołu, przewidywano preferencje aminokwasowe dla konserwatywnego motywu p L x IS na powierzchni wiązania IRF5.

Pozycja, macierz wagowa i logo sekwencji wygenerowane po dywersyfikacji sekwencji wykazały preferencję dla glutaminianu na pozycji 432 oraz dla leucyny i izoleucyny na pozycjach 433 i 435. Pozycje 427, 429 i 436, zwykle zajmowane przez serynę, wykazały większą preferencję dla asparaginianu i glutaminianu, podkreślając rolę fosforylacji i dimeryzacji IRF5. Pozycja 425 wykazała wysoką preferencję dla seryny, co sugeruje jej udział w interakcji białko-białko w jej nieufosforylowanej formie.