Przebieg pracy do ilościowej oceny endofitycznych i epifitycznych mikrobiomów bakteryjnych kory Populus trichocarpa

[Prezenter] Przepływ pracy do ilościowej oceny endofitycznych i napitetycznych mikrobiomów bakteryjnych kory Populus trichocarpa. Tutaj zaprojektowaliśmy i przetestowaliśmy szczegółowy przepływ pracy w celu zbadania mikrobiomu kolonizującego tkanki wewnętrzne lub powierzchnie kory Populus trichocarpa. Ten przepływ pracy szczegółowo opisuje pobieranie próbek endofitycznych i napitetycznych mikrobiomów kory Populus trichocarpa, przetwarzanie zebranych materiałów, ekstrakcję genomowego DNA, amplifikację PCR regionów docelowych, przygotowanie bibliotek DNA oraz sekwencjonowanie endofitycznych i nabłonkowych mikrobiomów bakteryjnych za pomocą technologii sekwencjonowania nowej generacji. Zapewniamy również krótką procedurę analityczną dla uzyskanych danych sekwencjonowania. Ten sprawdzony przebieg pracy zapewni skuteczne podejście do empirycznego badania endofitycznych i epitetycznych zbiorowisk mikrobiomu kory Populus trichocarpa i innych gatunków leśnych. Wyhoduj trzymiesięczne sadzonki Populus trichocarpa w komorze wzrostowej, przytnij 10-centymetrowe segmenty łodygi Populus trichocarpa od dwóch do 12 centymetrów nad wysterylizowaną powierzchnią gleby za pomocą wysterylizowanego sekatora. Umieść segmenty łodygi na wysterylizowanej kwadratowej szalce Petriego. Kilkakrotnie przetrzyj naskórek łodygi na wysterylizowanej kwadratowej szalce Petriego za pomocą sterylnej bawełny o zawartości 0,1%. Animacja 20. Przechowuj każdy kawałek bawełny zawierający mikroorganizmy, próbki nabłonka w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po wytarciu powierzchni łodygi rozetnij korę sterylnym skalpelem, oderwij korę i umieść ją na kwadratowej szalce Petriego. Korę oderwaną od łodygi pokrój na około centymetrowe segmenty za pomocą sterylnego skalpela. Wysterylizuj powierzchnie segmentów, mocząc je w 70% alkoholu przez dwie minuty, a następnie namocz segmenty w podchlorynie sodu z 0,1%, Tween 80 przez pięć minut. Na koniec sterylizuj segmenty w 70% alkoholu przez 30 sekund. Następnie umyj wszystkie próbki trzykrotnie sterylną wodą destylowaną i umieść je na czystej ławce do wysuszenia na powietrzu. Przechowuj każdą wysterylizowaną próbkę endofityczną kory łodygi w sterylnej dwumililitrowej probówce wirówkowej w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Umieść odcinki kory łodygi w sterylnych pięciomililitrowych twardych probówkach i dodaj trzy wysterylizowane stalowe koraliki do każdej probówki. Twarde probówki zawierające próbki należy zamrozić w ciekłym azocie na 10 minut. Miażdż próbki kory przez pięć minut za pomocą ubijaka do koralików. Następnie ponownie zamroź twardą rurkę w ciekłym azocie na jedną minutę i powtórz etap ubijania kulek przez pięć minut. Dodaj zmiażdżoną korę łodygi Populus trichocarpa i przylegające do bawełny zbiorowiska bakterii nabłonkowych, po 0,25 grama każda, do każdej z probówek z kulkami, a następnie dodaj 60 mikrolitrów roztworu C1 dostarczonego przez zestaw komercyjny i delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Następnie homogenizuj próbki endofityczne i epitetyczne za pomocą ubijaka do kulek w czterech jednominutowych przebiegach. Po każdym przebiegu należy umieścić próbki na lodzie na 30 sekund. Odwirować probówki pod ciśnieniem 10 000 razy większym od grawitacji przez jedną minutę, wyekstrahować próbki endofityczne i nabłonkowe za pomocą zestawu zgodnie z instrukcjami producenta, dodać 30 mikrolitrów roztworu C6 do środka białej membrany filtracyjnej i inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Wirować przy 10 000 razy większej grawitacji w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Zmierzyć stężenia genomowego DNA wyekstrahowanego z próbek epitetycznych i endofitycznych za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Rozcieńczyć każdą próbkę DNA sterylnym ddH2O do dwóch nanogramów na mikrolitr, aby uzyskać matrycę DNA do amplifikacji PCR. Amplifikuj region V5 do V7 bakteryjnego genu 16S rRNA za pomocą startera do przodu 799F i startera wstecznego 1193R. W międzyczasie amplifikuj region V4 bakteryjnego genu 16S rRNA za pomocą startera do przodu 5115F i startera odwrotnego 806R. Dokładnie wymieszaj każdą próbkę i odwiruj, aby wyeliminować pęcherzyki. Wykonaj amplifikację regionu V5 do V7 lub V4 bakteryjnych genów 16S rRNA na termocyklerze. Załaduj pięć mikrolitrów każdej próbki Amplicon na 1% żel agarozowy i wykonuj elektroforezę przy napięciu 120 woltów przez 30 minut. Zobacz żel pod lampami UV, aby potwierdzić pomyślną amplifikację PCR. Dla każdej próbki wymieszać trzy powtórzenia produktów amplifikacji PCR w probówce do PCR. Określić stężenie amplifikowanych produktów za pomocą zestawu handlowego zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierz fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek. Wykreślić standardową krzywą DNA i użyć jej do obliczenia stężeń DNA w amplifikowanych produktach. Zgodnie z ich zmierzonym stężeniem wymieszaj otrzymane produkty PCR z próbek endofitycznych lub epifitycznych z kory Populus trichocarpa w równym stężeniu, aby zbudować bibliotekę Amplicon. Przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym za pomocą aparatury do elektroforezy. Krótko przygotuj 1,3% żel agarozowy, 1,3 grama proszku agarozy w 100 mililitrach jednorazowego buforu TAE. Usuń grzebienie po zestaleniu żelu i umieść żel w zbiorniku do elektroforezy z jednorazowym buforem TAE. Następnie dodaj jedną jednostkę objętości sześciokrotnego pomarańczowego bufora ładującego do pięciu jednostek objętości każdego produktu PCR ze 100 mikrolitrami drabiny załadowanej do każdej studzienki. Dodaj 30 mikrolitrów drabiny DNA do jednego dołka. Po podłączeniu przewodów dodatniego i ujemnego wykonuj elektroforezę 80 V przez 50 minut. Wyciąć fragmenty DNA z żelu agarozowego za pomocą czystego, ostrego skalpela. Zważ plasterek żelu i przenieś go do bezbarwnej tubki. Dodaj bufor, aby zanurzyć plasterek żelu. Wykonaj ekstrakcję żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta. Określ stężenie oczyszczonej biblioteki Amplicon na fluorymetrze za pomocą komercyjnego zestawu zgodnego z protokołem producenta do profilowania sekwencjonowania. Odczyt probówek wzorcowych i probówek do próbek za pomocą fluorymetru i potwierdź jakość biblioteki, wizualizując pojedyncze pasmo. Analizuj i opisuj sekwencje genu 16S rRNA za pomocą II. Twórz adnotacje taksonomiczne za pomocą bazy danych Silver zgodnie z sekwencjami referencyjnymi. Wizualizacja tych wyników za pomocą pakietu ggplot2 w R. Uzyskano wysokiej jakości genomowe DNA endofitycznych i napitetycznych mikrobiomów bakteryjnych kory Populus trichocarpa. Amplifikacja PCR wszystkich 12 próbek dała pojedyncze mocne prążki o odpowiedniej wielkości. Biblioteka Amplicon została dodatkowo zbudowana z pojedynczym pikiem, który spełnił wymagania wstępnego sekwencjonowania. W przypadku mikrobiomów endofitycznych uzyskano wysokiej jakości odczyty przy użyciu par starterów odpowiednio 799F/1193R i 515F/806R. Para starterów 799F/1193R przyniosła znacznie mniej wzmocnionych odczytów roślin. Liczba ASV z mikrobiomu nabłonkowego kory Populus trichocarpa była istotnie wyższa przy użyciu starterów 799F/1193R w porównaniu ze starterami 515F/806R. Oszacowano, że wskaźnik Shannona jest niższy w epifitycznej społeczności bakteryjnej kory niż w endofitycznej społeczności bakteryjnej przy użyciu pary starterów 799F/1193R. Charakterystyki taksonomiczne zbiorowisk bakteryjnych w endofitycznych i epifitycznych częściach kory Populus trichocarpa były dalej badane przy użyciu pary starterów 799F/1193R. Stworzono niezawodny i wydajny przepływ pracy, od pobrania próbki do analizy danych, w celu ilościowego określenia składu i różnorodności endofitycznych i napitetycznych mikrobiomów bakteryjnych kory Populus trichocarpa. Nasz protokół może służyć jako ścieżka do badania mikrobiomu kory gatunków roślin drzewiastych, umożliwiając lepsze zrozumienie cech społeczności bakteryjnych zamieszkujących inne rośliny drzewiaste.