Przewlekłe uszkodzenie zwężenia dystalnego nerwu podoczodołowego (DIoN-CCI) u myszy w celu zbadania bólu neuropatycznego nerwu trójdzielnego
8 marca 2024
Przewlekłe uszkodzenie zwężenia dystalnego nerwu podoczodołowego u myszy wywołuje zmiany w spontanicznym zachowaniu (zwiększona aktywność pielęgnacji twarzy) i zachowaniu nocyfensyjnym w odpowiedzi na stymulację dotykową (nadreaktywność na stymulację włosów von Freya), które są oznakami trwającego bólu i allodynii oraz służy jako model dla trójdzielnego bólu neuropatycznego.
Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie uszkodzenia nerwu podoczodołowego u myszy w celu zbadania rozwoju bólu neuropatycznego nerwu trójdzielnego i przetestowania nowych strategii leczenia. Izolowane zachowanie wzrostowe fazy po podwiązaniu nerwu podoczodołowego jest jednym z niewielu modeli zwierzęcych do badania spontanicznego bólu neuropatycznego, ale jego stosowanie od dawna jest utrudnione przez złożoność wykonywania podwiązania nerwu podoczodołowego. W porównaniu z testami bólu opartymi na odruchach sensorycznych, takimi jak von Frey lub reakcje wycofania po stymulacji ciepłem lub zimnem.
Pomiar bólu samoistnego lub trwającego nie spotkał się z wystarczającym zainteresowaniem, biorąc pod uwagę, że jest to ważny objaw kliniczny wpływający na jakość życia. Dystalne podejście do nerwu podoczodołowego ma tę zaletę, że jest zabiegiem chirurgicznie mniej wymagającym niż dostęp wewnątrzoczodołowy. Jest mało inwazyjny i może być wykonywany bez użycia ramy stereotaktycznej.
Na początek delikatnie ogol włosy na policzku między opuszką wąsów a okiem znieczulonej myszy. Zamocuj głowicę myszy w ramce stereotaktycznej lub w inny sposób unieruchomij głowę. Nałóż maść na oba oczy, aby uniknąć wysuszenia.
Wyszoruj ogoloną okolicę głowy alkoholem, a następnie Betadine. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj czteromilimetrowe nacięcie skóry prostopadłe do linii środkowej. Mniej więcej w połowie drogi między krawędzią opuszki wąsa a okiem tylko rostralnie do otworu podoczodołowego i wyśrodkowany wokół linii między środkiem oka a środkiem opuszki wąsa.
Aby odsłonić nerw podoczodołowy, tępo oddziel powierzchowną tkankę łączną, minimalizując uszkodzenia mięśni i unikając włókien nerwu ruchowego. Wykonując ruch obrotowy, wsuń głowę haczykowatego środka do podwiązywania pod nerw podoczodołowy. Umieść chromową ligaturę jelitową przez otwór na końcówce środka do podwiązywania i wycofaj pomocnicę tak, aby ligatura pozostała pod nerwem podoczodołowym, przy czym oba końce ligatury znajdują się w równej odległości od nerwu.
Zawiąż węzeł poślizgowy z obu końców ligatury i wsuń go w nerw podoczodołowy. Przesuń węzeł dalej, aby zwęzić nerw podoczodołowy. Następnie umieść normalny węzeł na węźle ślizgowym.
Odetnij końce ligatury, pozostawiając około 1,5 milimetra wolnych końców, aby zapobiec rozplątaniu się węzła. Zamknij nacięcie skóry za pomocą syntetycznych wchłanialnych szwów 6-0. Pozwól myszy odzyskać sprawność na rozgrzanej podkładce lub pod ogrzewaniem na podczerwień lamp.
Aby rozpocząć, przenieś pojedynczą mysz z obudowy do pomieszczenia testowego w zakrytej plastikowej klatce bez materiału ściółkowego. Umieść klatkę przed kamerą wideo, a następnie umieść lustro, aby view twarz myszy, gdy jest ona skierowana tyłem do kamery. Nagrywaj zachowanie myszy przez 10 minut.
Po nagraniu wyczyść klatkę obserwacyjną przed nagraniem następnego zwierzęcia. Niech obserwator będzie ślepy na warunki eksperymentalne, aby przeanalizować zarejestrowane zachowanie myszy. Zwróć uwagę na każdy epizod pielęgnacji twarzy podczas 10-minutowego nagrania.
Rozróżnij izolowaną pielęgnację twarzy i zachowania związane z pielęgnacją twarzy podczas pielęgnacji ciała. Określ liczbę epizodów pielęgnacji twarzy za pomocą czterosekundowego kryterium odcięcia. Czas między czynnościami pielęgnacyjnymi krótszy niż cztery sekundy jest definiowany jako przerwa w obrębie jednego epizodu.
Czas dłuższy niż cztery sekundy definiuje się jako całkowite przerwanie czynności pielęgnacyjnych między dwoma epizodami. Umieść ogon myszy w miękkim silikonowym zacisku i przymocuj zacisk magnetycznie do metalowej płytki na stole. Umieść plastikowy uchwyt o trzech ściankach nad myszą tak, aby z pojemnika wystawała tylko głowa.
Umieść obciążnik na uchwycie, aby utrzymać go na miejscu. Użyj startej serii czterech włosów von Freya, aby przyłożyć siłę do myszy. Przyzwyczaj mysz do ruchów krępujących i sięgających przez 10 minut.
Kiedy mysz jest zrelaksowana, powoli nakładaj najjaśniejsze włosy von Freya w obrębie nerwu podoczodołowego w pobliżu środka wibracji, aż się ugnie. Oceń reakcję myszy na stymulację w jednej z następujących kategorii. Oblicz średni wynik dla odpowiedzi ipsilateralnych na cztery włosy von Freya, a następnie oblicz średnie wyniki dla stron przeciwległych.
Myszy z przewlekłym zwężeniem dystalnego nerwu podoczodołowego wykazywały znaczne pooperacyjne wydłużenie czasu izolowanej pielęgnacji twarzy i epizodów, osiągając szczyt w pierwszym tygodniu, a następnie stopniowo zmniejszając się, pozostając podwyższonym przez sześć tygodni. Początkowo myszy z przewlekłym uszkodzeniem zwężenia dystalnego nerwu podoczodołowego wykazywały prawie całkowity brak reakcji na stymulację mechaniczną, która w ciągu kolejnych tygodni przekształciła się w nadreaktywność trwającą sześć tygodni. Zaobserwowano również nieznaczny wzrost reakcji na kontralateralną stymulację mechaniczną.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje skutki przewlekłego uszkodzenia uciskowego dystalnego nerwu podocznego u myszy jako modelu neuropatycznego bólu trójdzielnego. Model ten pozwala badaczom na analizę spontanicznych zmian behawioralnych oraz reakcji nocyfensywnych, podkreślając niuanse utrzymującego się bólu i allodynii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Modele bólu neuropatycznego
- Analiza behawioralna u myszy
Wstęp
- Neuropatyczny ból trójdzielny jest istotnym problemem klinicznym, który wpływa na jakość życia.
- Badania porównawcze zazwyczaj koncentrują się na testowaniu bólu w oparciu o odruchy sensoryczne, co często pomija objawy bólu o charakterze ciągłym.
- Metoda wykorzystująca dystalny nerw podoczodołowy jest mniej inwazyjna i ma potencjał do szerszego zastosowania w badaniach nad bólem.
- Zrozumienie spontanicznych reakcji na ból neuropatyczny jest kluczowe dla opracowania skutecznych strategii leczenia.
Cel badania
- Wykonanie uszkodzenia nerwu podoczodołowego w celu zbadania rozwoju neuropatycznego bólu trójdzielnego.
- Rozszerzenie wiedzy na temat bólu spontanicznego i trwającego w modelach zwierzęcych.
- Zbadanie potencjalnych nowych strategii leczenia stanów bólu neuropatycznego.
Zastosowane metody
- Obejmuje model chirurgiczny, w którym u myszy podwiązuje się dystalną część nerwu podocznego.
- Badanie ocenia spontaniczne zachowania pielęgnacyjne twarzy oraz reakcje na stymulację włoskami von Freya po uszkodzeniu nerwu.
- Obserwacje prowadzone są w ciągu sześciu tygodni po urazie w celu zarejestrowania zmian w zachowaniu.
- Nagrania behawioralne są analizowane w celu ilościowego określenia epizodów pielęgnacji twarzy oraz reaktywności mechanicznej.
Główne wyniki
- Mysz wystąpił zwiększoną aktywność pielęgnacyjną pyska oraz zmienione reakcje na stymulację dotykową, co wskazywało na utrzymujący się ból i allodynię.
- Istotne pooperacyjne zmiany w zachowaniach pielęgnacyjnych osiągnęły szczyt w pierwszym tygodniu, jednak pozostawały one podwyższone przez sześć tygodni.
- Początkowo obserwowano brak reakcji na stymulację mechaniczną, która z czasem przekształciła się w nadreaktywność.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza wglądu w behawioralne przejawy neuropatycznego bólu trójdzielnego u myszy.
- Podkreśla ono znaczenie oceny spontanicznych zachowań bólowych w zrozumieniu bólu neuropatycznego.
- Wyniki mogą pomóc w opracowaniu nowych metod leczenia schorzeń związanych z bólem trójdzielnym.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Model mysi DIoN-CCI umożliwia rzetelne badanie mechanizmów neuropatycznego bólu trójdzielnego, wspierając wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w portfelach badawczych nad bólem. Ilościowe wyniki behawioralne otrzymywane z tego modelu zapewniają pewność prognostyczną w zakresie ciągłości translacyjnej i stanowią podstawę dla decyzji o dalszym rozwoju projektów w procesach odkrywania leków przeciwbólowych w oparciu o analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów szlaków bólowych istotnych w neuropatii trójdzielnej.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez mierzalne punkty końcowe zachowania.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie fenotypów bólu spontanicznego i wywołanego.
- Zapewnia wiarygodność predykcyjną niezbędną do ustalania priorytetów dla celów terapeutycznych w portfelach badawczych.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Ustanawia zwalidowane testy behawioralne dla bólu spontanicznego i wywołanego u myszy.
- Standaryzuje ilościowe odczyty, takie jak epizody pielęgnacji pyszczka oraz reaktywność na włókna von Frey.
- Umożliwia powtarzalną ocenę potencjalnych leków przeciwbólowych w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
- Wspiera skalowalny screening behawioralny w celu oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie przedklinicznych modeli bólu do objawów klinicznych allodynii spontanicznej i mechanicznej.
- Zapewnia ciągłość procesu przejścia od odkryć mechanistycznych do przedklinicznych testów skuteczności.
- Umożliwia dostosowanie ryzyka przy rozwoju kandydatów na leki przeciwbólowe w oparciu o punkty końcowe istotne translacyjnie.
- Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez mierzalne zmiany behawioralne.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model DIoN-CCI integruje się z continuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między badaniami nad mechanizmami a translacyjnymi badaniami nad bólem.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków mechanizmów bólu trójdzielniczego.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzowane, powtarzalne testy behawioralne do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów spontanicznych i wywołanych zachowań bólowych do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Zapewnia istotne dla choroby punkty końcowe do przedklinicznej walidacji kandydatów na leki przeciwbólowe.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, adaptowalną platformę do badań nad mechanizmami bólu i terapiami w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w leczeniu bólu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność behawioralnych testów bólu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową w procesach opracowywania leków przeciwbólowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój terapii przeciwbólowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach mikrochirurgicznych oraz fenotypowaniu behawioralnym.
- Konieczny jest dostęp do specjalistycznych urządzeń stabilizujących oraz infrastruktury do rejestracji zachowań.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja oceny i analizy behawioralnej pomiędzy zespołami.
- Można potrzebować adaptacji procedury dla różnych szczepów myszy lub rodzajów bólu.
- Punkty końcowe analizy behawioralnej muszą być interpretowane w kontekście ograniczeń specyficznych dla modelu.
