Ilościowa i niedroga bezkomórkowa metoda fluorescencyjna potwierdzająca zdolność nowych związków do chelatowania żelaza

Opracowaliśmy test fluorescencyjny, który może szybko i niedrogo potwierdzić zdolność nowych związków do chelatowania żelaza. Chelatatory żelaza to obiecująca klasa związków, które mogą być stosowane w leczeniu nowotworów. Zakłócenie adaptacji metabolicznej nowotworu przez chelatory może prowadzić do nowej strategii terapeutycznej w leczeniu raka.

Badania koncentrują się na rozwoju chelatorów żelaza w celu zakłócenia adaptacji metabolicznych nowotworów. Nie ma jednak tanich i prostych technik przesiewowych do obserwacji zdolności nowej cząsteczki do chelatowania żelaza. Istnieje niezaspokojona potrzeba prostego, niedrogiego testu do badań przesiewowych nowych chelatorów żelaza.

Test ten pozwoli biologom zajmującym się nowotworami obserwować zdolność chelatacji nowych związków przed zainwestowaniem czasu i zasobów w komórkowe badania przesiewowe aktywności biologicznej. Za pomocą tego testu byliśmy w stanie zaobserwować zdolność chelatacji żelaza nowo opracowanych chelatorów żelaza. Następnie skupiliśmy się na pytaniu, w jaki sposób te chelatory zakłócają metabolizm w komórkach nowotworowych i jak te komórki reagują na to zakłócenie.

Jesteśmy zafascynowani tym, jak komórki nowotworowe reagują na zakłócenia metaboliczne powstałe w wyniku leczenia chelatorami żelaza. Zrozumienie metabolizmu żelaza w nowotworach ma zasadnicze znaczenie dla opracowania nowych metod leczenia i nowych schematów leczenia. Na początek użyj pipety wielokanałowej, aby rozprowadzić 50 mikrolitrów PBS w kolumnach od 2 do 10 rzędów od A do E na 96-dołkowej płytce.

Odpipetować 100 mikrolitrów dwumilimolowego roztworu podstawowego siarczanu żelazowo-amonowego do kolumny 11. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 50 mikrolitrów wywaru siarczanu żelazowo-amonowego z kolumny 11 do kolumny 10. Kilkakrotnie pipetować roztwory, aby dobrze wymieszać.

Przeprowadzić stopniowe podwójne rozcieńczanie w kolumnach od 9 do 2 i w rzędach A do 2. Teraz odpipetować 50 mikrolitrów roztworu z kolumny 2 do wyrzucenia. Po dodaniu PBS do wszystkich studzienek, odpipetuj 10 mikrolitrów 10 mikromolowych zapasów kalceiny do każdej studzienki.

W przypadku autonomicznej kontroli PBS należy odpipetować 100 mikrolitrów PBS do rzędu F kolumn od 1 do 5. Następnie dodać 100 mikrolitrów dwóch milimolowych siarczanu żelazowo-amonowego do rzędu F kolumn 6 do 10 w celu kontroli FAS. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut.

Przeanalizuj fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek. Odpipetować 50 mikrolitrów PBS do kolumn od 2 do 10 rzędów od A do E płytki 96-dołkowej. Do kolumny 11 dodać 100 mikrolitrów dwumikromolowego roztworu podstawowego roztworu chelatora żelaza.

Za pomocą wielokanałowej pipety ręcznej usunąć 50 mikrolitrów roztworu chelatora żelaza z kolumny 11, a następnie przenieść go do PBS w kolumnie 10 z rzędów A do E. Pipetować w górę i w dół, aby dobrze wymieszać roztwór. Kontynuować rozcieńczanie roztworu chelatora w pozostałych kolumnach. Wylać 50 mikrolitrów roztworu ze studzienek w kolumnie 2, a następnie pipetować 30 mikrolitrów PBS do wszystkich studzienek.

Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 10 mikrolitrów 100 mikromolowego bulionu siarczanu żelazowo-amonowego do kolumn od 2 do 12 rzędów od A do E. Dodaj 10 mikrolitrów 10 mikromolowych bulionów kalceinowych do tych samych studzienek. Następnie, w celu kontroli pozytywnej, odpipetuj PBS, kalceinę i bulion siarczanu żelazowo-amonowego do kolumny 1 w rzędach A dwa E. Dobrze wymieszaj próbki, pipetując roztwory w górę iw dół, a następnie dodaj 100 mikrolitrów PBS do rzędu F kolumn od 1 do 5, aby utworzyć kontrolę ujemną PBS. Odpipetować tę samą objętość roztworu chelatora żelaza do rzędu F od kolumny 6 do 10, aby utworzyć samodzielną kontrolę chelatora.

Umieść płytkę studzienki w temperaturze pokojowej na 10 minut w ciemności. Następnie przeanalizuj na multimodalnym czytniku mikropłytek, tak jak poprzednio. Dodanie jonów żelazawych do kalceiny spowodowało liniowy spadek fluorescencji kalceiny.

Chelator żelaza wyprzedził kalceinę w walce o jony żelaza. Chelator zwiększył fluorescencję kalceiny do wartości szczytowej.