Name: Ilościowa i niedroga bezkomórkowa metoda fluorescencyjna potwierdzająca zdolność nowych związków do chelatowania żelaza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Poznaj ilościową metodę fluorescencyjną do badania chelatowania żelaza przez nowe związki z użyciem sondy Calcein. Ta technika umożliwia szybką i niedrogą selekcję chelatorów żelaza w badaniach nad rakiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Uniwersytetowi Northumbria za wsparcie.

1. Przygotowanie roztworu podstawowego
<ol>
	<li>Przygotowując roztwory wyjściowe Calcein, należy zapobiegać fotodegradacji, trzymając roztwory w ciemności. Przygotuj 1 mM roztwór kalceiny w PBS firmy Dulbecco, bez magnezu i wapnia14. Na 5 ml 1 ml roztworu kalceiny dodać 3,1 mg kalceiny (622,5 g/M) do 5 ml PBS firmy Dulbecco. Używając 1 mM skarpety Calcein, przygotuj 1 ml porcji wtórnych roztworów podstawowych w probówce do mikrofuge, jak opisano w Tabeli 1.</li>
	<li>Przygotować sześciowodny roztwór siarczanu żelazowo-amonowego, rozpuszczając 19 mg sześciowodnego FAS (392,1 g/M) w 5 ml PBS firmy Dulbecco w celu otrzymania 10 mM roztworu siarczanu żelazowo-amonowego (FAS). Przygotować zapasy wtórne FAS przez rozcieńczenie. Aby przygotować zapas 2 mM FAS (fA), rozcieńczyć 200 μL z 10 mM FAS z PBS z 800 μL PBS firmy Dulbecco. Aby przygotować zapas 100 μM FAS (fB), rozcieńczyć 50 μL naczyń fA 950 μL PBS firmy Dulbecco.</li>
	<li>Aby przygotować 10 mM wywaru deferypronu, rozpuść 2,8 mg (139,15 g/M) w 2 ml PBS firmy Dulbecco. Przygotować zapasy wtórne chelatora żelaza 2 mM, rozcieńczając 200 μl 10 mM zapasów 800 μl PBS. firmy Dulbecco.
	UWAGA: W tym teście wybrany chelator żelaza powinien być rozpuszczony w PBS firmy Dulbecco bez magnezu i wapnia. Jako działający przykład użyliśmy chelatora żelaza Deferypronu.</li>
</ol>
2. Walidacja testu poprzez określenie liniowego zakresu fluorescencji kalceiny
<ol>
	<li>Przygotować szereg wywarów kalceiny od 1 mM do 1 μM, zgodnie z opisem w tabeli roztworu podstawowego (patrz Tabela 1). Roztwory podstawowe należy przechowywać w ciemności, aby zapobiec degradacji fotochemicznej.</li>
	<li>Odpipetować 90 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do studzienek od A do H i od 1 do 12 z płytki 96-dołkowej za pomocą jednokanałowej pipety ręcznej lub wielokanałowej pipety ręcznej.</li>
	<li>Dodać 10 μl 1 mM bulionu kalceinowego do kolumny 12, rzędy od A do H, płytki 96-dołkowej za pomocą jednokanałowej pipety ręcznej.</li>
	<li>Dodać 10 μl wstępnie przygotowanego bulionu kalceinowego o wielkości 800 μM (Tabela 1) do 96-dołkowej płytki w kolumnie 11, rzędy od A do H, używając jednokanałowej pipety ręcznej.</li>
	<li>Powtórzyć procedurę dodawania z wsadami z tabeli 1 tak, aby kolumna 10 zawierała 10 μl wsadu 400 μM, a kolumna 9 zawierała 10 μl wsadu 200 μM itd. Kontynuuj tę procedurę krok po kroku we wszystkich kolumnach, aż kolumna 2 będzie zawierała 10 μl wsadu 1 μM. 
	UWAGA: Końcowe stężenie kalceiny w każdym dołku jest 10-krotnie niższe niż w roztworach podstawowych ze względu na rozcieńczenie 1:10.</li>
	<li>Dodać 10 μl PBS do kolumny 1, wierszy A–E.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut i ustawić analizator na czytniku mikropłytek na wzbudzenie 490 nm i detekcję 530 nm (lub odpowiedni zestaw filtrów do fluorescencji Calcien).</li>
</ol>
3. Walidacja testu za pomocąhartowania jonów Fe2+ w celu zmniejszenia fluorescencji kalceiny
<ol>
	<li>Przygotować zapas kalceiny (cB) o pojemności 10 μM i zapas FAS (fA) o wielkości 2 mM (patrz tabela materiałów). Trzymaj bulion Calcein w ciemności, aby zapobiec fotodegradacji.</li>
	<li>Używając jednokanałowej pipety ręcznej lub wielokanałowej pipety ręcznej, dodaj 50 μl PBS do kolumn od 2 do 10, rzędów od A do E. Nie dodawaj PBS do kolumny 11.</li>
	<li>Dodać 100 μl zapasu FAS (fA) o pojemności 2 mM do 96-dołkowej płytki w kolumnie 11 (rzędy od A do E) za pomocą jednokanałowej pipety ręcznej.</li>
	<li>Za pomocą wielokanałowej pipety ręcznej usunąć 50 μl fA z kolumny 11 i odpipetować go do PBS już w kolumnie 10, dokładnie wymieszać pipetując.</li>
	<li>Kontynuować tę stopniową procedurę podwójnego rozcieńczania w kolumnach 9-2, rzędach od A do E płytki 96-dołkowej i mieszać pipetując.</li>
	<li>Pobrać 50 μl roztworu przez pipetowanie z kolumny 2 i wyrzucić roztwór do odpadów.</li>
	<li>Dodać 40 μl PBS do wszystkich studzienek z roztworem w nich, kolumny 2-12, rzędy od A do E.</li>
	<li>Dodać 90 μl PBS do studzienek kolumna 1, rzędy A-E. Studzienki te działają jako pozytywna kontrola 1 μM Calcein i 0 μM FAS.</li>
	<li>Dodać 10 μl 10 μM bulionu kalceinowego (cB) do każdej studzienki z roztworem w niej (kolumny od 1 do 12, rzędy od A do E). Daje to najwyższe stężenie 1000 μM FAS w kolumnie 11, przy czym stężenie FAS zmniejsza się o połowę w kolumnach 10, 9, 8 w poprzek kolumny 2. Każda z otrzymanych studzienek z kolumn zawiera 1 μM kalceiny i rozcieńczenie FAS.</li>
	<li>Dodać 100 μl PBS do wiersza F kolumn 1–5 dla samej kontroli PBS. Dodać 100 μl z 2 mM FAS do rzędu F w kolumnach 6–10 dla samej kontroli FAS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności.</li>
	<li>Analizę przeprowadzić na czytniku mikropłytek ustawionym na wzbudzenie 490 nm i detekcję 530 nm (lub odpowiednim zestawie filtrów do fluorescencji kalceiny).</li>
</ol>
4. Test do ilościowego określenia zdolności chelatorów żelaza do konkurowania ze słabym chelatorem Kalceiną ojony Fe2+
<ol>
	<li>Przygotować zapas kalceiny (cB) 10 μM, zapas FAS (fB) 100 μM i zapas chelatora żelaza 2 mM, jak przedstawiono w tabeli 1. Przechowuj bulion Calcein w ciemności, aby zapobiec fotodegradacji.</li>
	<li>Używając jednokanałowej pipety ręcznej lub wielokanałowej pipety ręcznej, dodaj 50 μl PBS do kolumn od 2 do 10, rzędy od A do E, płytki 96-dołkowej. Nie dodawaj PBS do kolumny 11.</li>
	<li>Dodać 100 μl 2 mM zapasu (fA) chelatorów żelaza do 96-dołkowej płytki w kolumnie 11, rzędy od A do E, używając jednokanałowej pipety ręcznej.</li>
	<li>Za pomocą wielokanałowej pipety ręcznej usunąć 50 μl fA z kolumny 11 i odpipetować go do PBS w kolumnie 10, rzędy od A do E, dokładnie mieszając przez pipetowanie.</li>
	<li>Kontynuować tę stopniową procedurę podwójnego rozcieńczania w pozostałych kolumnach 9-2, rzędy od A do E płytki, wymieszać każdą studzienkę pipetując. Usunąć 50 μl z kolumny 2 i wyrzucić. Zapewnia to podwójne rozcieńczenie 2 mM chelatora żelaza (deferypronu) w 96 kolumnach z płytkami dołkowymi 11 do 2, rzędy od A do E.</li>
	<li>Odpipetować 30 μl PBS do wszystkich studzienek z roztworem w nich (np. kolumny 2-11 rzędów od A do E).</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 10 μl 100 μM FAS (fB) do kolumn 2-12, wierszy od A do E. Powoduje to stężenie 1 μM kalceiny i 10 μM FAS w każdym dołku oraz podwójne rozcieńczenie chelatorów, przy czym stężenie zmniejsza o połowę każdą kolumnę w poprzek płytki, kolumny 11-2, przy najwyższym stężeniu chelatora żelaza na poziomie 1000 μM w kolumnie 11 dołków od A do E.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 10 μl 10 μM wywaru kalceinowego (cB) do kolumn 2-12, rzędy od A do E.</li>
	<li>Odpipetować pipetą 80 μl PBS i 10 μl bulionu kalceiny (cB) i 10 μl bulionu FAS (fB) do kolumny 1, rzędy A-E. Wymieszać próbki przez pipetowanie. Zapewnia to kontrolę 1 μM kalceiny za pomocą 10 μM FAS i bez chelatora.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl PBS do kolumn 1 do 5 rzędu F. Zapewnia to kontrolę ujemną PBS.</li>
	<li>Dodać 100 μl 2 mM chelatora żelaza (deferypronu) do rzędu F, kolumny 6-10. Zapewnia to kontrolę samego chelatora.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności. Analizę przeprowadzić na multimodalnym czytniku mikropłytek ustawionym na wzbudzenie przy 490 nm i detekcję przy 530 nm (lub odpowiednim zestawie filtrów do fluorescencji Calciena).</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Analiza w celu walidacji testu poprzez określenie liniowego zakresu fluorescencji kalceiny.
	<ol>
		<li>Obliczyć średnie względne jednostki fluorescencji (RFU) w wierszach A-H dla każdego stężenia kalceiny w kolumnach płytki 96-dołkowej z kroku 1 i wykreślić w stosunku do stężenia. Wykreśl wykres liniowy stężenia kalceiny na osi x w stosunku do średniej RFU na osi y i użyj regresji liniowej, aby zapewnić linię najlepszego dopasowania.</li>
		<li>Określ ilościowo istotność statystyczną, porównując stężenia kalceiny w każdej kolumnie (2-11) z kontrolą PBS w kolumnie 1 wiersze od A do E. Przeprowadź analizę wariancji (ANOVA) i zastosuj analizę post hoc przy użyciu najmniejszej istotnej różnicy (LSD) z progiem p <0,001 w celu określenia istotności statystycznej (oznaczonej przez ** w <silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza w celu walidacji testu przez wygaszanie jonów Fe2+ w celu zmniejszenia fluorescencji kalceiny.
	<ol>
		<li>Obliczyć średnie względne jednostki fluorescencji (RFU) w wierszach od A do E dla każdego stężenia FAS w kolumnach 2-11. Wykreślić średnią RFU dla każdego stężenia FAS na osi y. Na osi x wykreśla się stężenia FAS za pomocą skali Log2, ponieważ lepiej rozprowadza dane. Wykreśl linię najlepszego dopasowania przy użyciu regresji liniowej.</li>
		<li>Określić ilościowo istotność statystyczną, porównując średnią z każdej kolumny ze średnią RFU kontroli PBS, 1 μM Calcein, 0 μM FAS (kolumna 1 wiersz A do E). Przeprowadzić analizę post hoc ANOVA z LSD z progiem p <0,001 w celu określenia istotności statystycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza do testu: Kwantyfikacja zdolności chelatorów żelaza do konkurowania ze słabym chelatorem Calceina o jony Fe2+.
	<ol>
		<li>Obliczyć średnie względne jednostki fluorescencji (RFU) w wierszach od A do E dla każdego stężenia chelatora w kolumnach 2-11. Wykreślić średnią RFU dla każdego stężenia chelatora na osi y. Na osi x wykreśl stężenia chelatora za pomocą skali Log2, ponieważ lepiej rozprowadza dane.</li>
		<li>Określić ilościowo istotność statystyczną, porównując średnią z każdej kolumny ze średnią RFU kontroli PBS 1 μM Calcein i 10 μM FAS (kolumna 1 wiersz A–E). Przeprowadzić analizę post hoc ANOVA z LSD z progiem p <0,001 w celu określenia istotności statystycznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Fluorescent Assay for Detection of Novel Iron Chelators

<ol><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%3A+An+essential+element+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Iron: An essential element of cancer metabolism.</a> Cells. 9 (12), 2591(2020).</li>
<li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%3A+More+ore+to+be+mined%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer: More ore to be mined.</a> Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li>
<li>Zhang, C., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+homeostasis+and+tumorigenesis%3A+Molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).</li>
<li>Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer.</a> Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).</li>
<li>Welch, D. R., Hurst, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+hallmarks+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the hallmarks of metastasis.</a> Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).</li>
<li>Lehmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+defects+of+hepatocellular+carcinoma+are+already+found+in+non-neoplastic+liver+cells+from+patients+with+hereditary+haemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis.</a> Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).</li>
<li>Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer+risk--a+systematic+review+and+meta-analysis+of+the+epidemiological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer risk--a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).</li>
<li>Abdelaal, G., Veuger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+oncogenic+transformation+with+iron+chelation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Reversing oncogenic transformation with iron chelation.</a> Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+iron+metabolism+and+impact+in+cancer+biology%2C+metastasis%2C+and+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology.</a> Front Oncol. 10, 476(2020).</li>
<li>Menyhárt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+selection+of+functional+assays+to+evaluate+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).</li>
<li>Basu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+and+diverse+iron-chelators+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Discovering novel and diverse iron-chelators in silico.</a> J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).</li>
<li>Prus, E., Fibach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+measurement+of+the+labile+iron+pool+in+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells.</a> Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harb. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphate-buffered+saline+%28pbs%29%22">Phosphate-buffered saline (pbs)</a>. 2006 (1), Cold Spring Harb Prot. (2006).</li>
<li>Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+development+of+deferiprone+%28l1%29+and+other+iron+chelators+for+clinical+use%3A+Targeting+methods+and+application+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects.</a> Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Nadmierne uzależnienie nowotworów od żelaza w celu napędzania ich metabolizmu sprawia, że chelatacja żelaza jest potencjalnym dodatkiem do schematów terapeutycznych4. Istnieje jednak ograniczona zdolność do szybkiego badania przesiewowego nowych chelatatorów jonów metali pod kątem ich zdolności do wiązania jonów żelaza. Powszechnie stosowana i powszechnie dostępna sonda fluorescencyjna Calcein jest znana z tego, że działa jako słaby chelator żelaza, a wiązanie przez jony żelaza wygasza fluorescencję kalceiny. Fluorescencję można następnie odzyskać, rywalizując o wiązanie z żelazem za pomocą silniejszego chelatora żelaza. Zmniejszenie fluorescencji obserwowane w wyniku wiązania żelaza przez kalceinę i przywrócenie fluorescencji, gdy jest ona konkurowana przez silniejszy chelator, zapewnia szybką i prostą metodę badań przesiewowych nowych związków o potencjale chelatacji żelaza. Podczas gdy techniki oparte na kalceinie13 są już stosowane do wizualizacji zdolności chelatorów do wiązania żelaza w komórkach, techniki te wymagają kosztownej aparatury do cytometrii przepływowej, są tylko częściowo ilościowe, wymagają intensywnego szkolenia personelu i stosowania droższej formy kalceiny przepuszczanej przez komórki, Calcien-AM. Co więcej, technika ta jest słabo odtwarzalna i nie ułatwia łatwego określania istotności danych za pomocą analizy statystycznej. Dlatego stworzyliśmy prostą, niedrogą metodę in vitro , która może działać jako pierwsze przejście przesiewowe nowych związków chelatujących żelazo. Ten bezkomórkowy test znosi wymóg stosowania kosztownych metod hodowli komórkowych jako pierwszego przejścia wysokoprzepustowego badania przesiewowego pod kątem zdolności chelatacji żelaza.
Rośnie zainteresowanie badaniami przesiewowymi lub opracowywaniem nowych chelatorów żelaza, które mogą być stosowane w leczeniu nowotworów ze względu na ich zależność od żelaza w celu napędzania ich adaptacji metabolicznych2. W artykule opisano technikę in vitro , która może być wykorzystana do potwierdzenia zdolności nowych związków do chelatowania żelaza poprzez konkurencję ze słabym chelatorem Calceiną. Pozwala to na proste, ilościowe i niedrogie badania przesiewowe nowych związków pod kątem ich zdolności do chelatacji żelaza.
Jednym z kluczowych etapów protokołu jest ustalenie zakresu liniowego czytnika fluorescencyjnych płytek do mikromiareczkowania (rysunek 1). Kalceina ma szerokie widma wzbudzenia i emisji fluorescencji, które koncentrują się wokół piku wzbudzenia 501 nm i piku emisji 521 nm. Jednak zakres liniowy kalceiny może być zależny od filtrów stosowanych do wzbudzania i wykrywania emisji fluorescencji kalceiny, zakres liniowy fotopowielacza użytego do wykrywania również częściowo określi zakres liniowy. Dlatego ważne jest, aby najpierw ustalić zakres stężeń, przy których fluorescencja kalceiny jest liniowa, aby upewnić się, że test działa w liniowym zakresie kalceiny na czytniku płytek fluorescencyjnych. Biorąc pod uwagę, że zaobserwowaliśmy liniowość między 0 a 100 mM Calceiny, pokazuje to, że Calcein ma szeroki zakres liniowy. Co więcej, fluorescencyjne czytniki płytek mikromiareczkowych są zwykle wyposażone w zestawy filtrów, które mogą mierzyć fluorescencję kalceiny, ponieważ ma ona podobne widmo do niektórych z najczęściej używanych fluoroforów emitujących zielone światło. Dlatego test ten ma szerokie zastosowanie u szerokiego grona użytkowników.
Preferowane jest stosowanie FAS jako donora jonów żelaza, ponieważ dostarcza jonów Fe2+ , które są głównym jonem żelaza w labilnej puli żelaza w komórkach. Jednak wyniki podobne do pokazanych tutaj (ryc. 2) osiągnięto za pomocą chlorku żelazowo-amonowego (FAC), który dostarcza Fe3+ (dane nie pokazane). W związku z tym test jest zgodny z obydwoma stanami redoks jonów żelaza, co rozszerza zastosowanie do chelatorów z preferencją dla każdego z tych stanów redoks.
W tym badaniu przedstawiamy dane dotyczące chelatora żelaza deferypronu, jednak oceniliśmy również zdolność innych chelatorów żelaza, w tym mimozyny, do konkurowania z kalceiną w wiązaniu jonów żelaza za pomocą tego testu (dane nie pokazane). Jednym z ograniczeń testu jest to, że powyżej 512 mM deferypronu chelatora nie stwierdzono statystycznie istotnego wzrostu fluorescencji w porównaniu z kontrolą 1 μM kalceiny i 10 μM FAS. Nie jest jasne, dlaczego wyższe stężenia chelatora nie powodują wzrostu fluorescencyjności, chociaż zaobserwowano to w przypadku innych chelatorów (dane nie pokazane). Jednak wiodący związek terapeutyczny powinien działać <100 μM, aby test działał w zakresach stężeń wymaganych do skuteczności związku ołowiu.
Test ten pozwala zatem na szybkie przebadanie każdego potencjalnego chelatora żelaza pod kątem zdolności do chelatowania żelaza jako dowodu mechanizmu. Jest to ważny pierwszy krok przed przeprowadzeniem nowych chelatatorów w kosztownych i pracochłonnych testach komórkowych lub in vivo . Ograniczeniem tego testu jest to, że przeprowadza się go przy użyciu wodnego rozpuszczalnika i dlatego wymaga, aby chelator był rozpuszczalny w wodnych. Biorąc jednak pod uwagę, że najwyższym stężeniem zastosowanym w tym badaniu był 10 mM deferypron, który jest małym lipofilowym chelatorem żelaza15, chelatory o ograniczonej rozpuszczalności w wodzie mogą być nadal testowane.
Podsumowując, opisany tutaj test może okazać się cenny w badaniach przesiewowych nowych chelatatorów żelaza, które są przedmiotem ciągłego rozwoju terapii przeciwnowotworowej.

Zmiany fenotypowe w komórkach, które odnoszą się do rozwoju raka poprzez wspólny zestaw zmienionych zdolności biologicznych, są teraz powszechnie określane jako cechy charakterystyczne raka. Wśród nich są zmiany wynikające z przeprogramowania metabolizmu energetycznego, które są szeroko rozpowszechnione w biologii komórek nowotworowych1. Takie przeprogramowanie metaboliczne obejmuje zwiększone zapotrzebowanie na żelazo, aby wspierać szybką proliferację i wzrost guza2. To pragnienie żelaza prowadzi do rozregulowanego metabolizmu żelaza, który sam w sobie jest uważany za cechę charakterystyczną raka3,4, przy czym dysregulacja występuje na wszystkich etapach5. Cechy charakterystyczne przerzutów, ostatnio zaproponowane przez Welcha i Hursta, obejmują rolę iron6, ponieważ żelazo może indukować stres oksydacyjny, a to z kolei może pośredniczyć w zmianach w genomie, epigenomie i proteomie, zwiększając możliwość przerzutów7. Związek między poziomem żelaza a zwiększoną częstością występowania raka wykazano w badaniach epidemiologicznych8.
Ponieważ komórki rakowe wymagają dużych ilości żelaza, są podatne na niedobór żelaza, a co za tym idzie, chelatację żelaza. Niedawno opublikowaliśmy artykuł przeglądowy, w którym podkreśliliśmy potencjał chelatacji żelaza w odwracaniu kilku cech charakterystycznych raka poprzez NDRG1 zakłócający onkogenne szlaki sygnałowe9. Jednak zastosowanie chelatacji żelaza jako samodzielnej terapii przeciwnowotworowej nie przyniosło pozytywnych wyników w badaniach klinicznych ze względu na ich toksyczność, krótki okres półtrwania, szybki metabolizm i pojawiające się mechanizmy oporności. Niemniej jednak chelatory żelaza okazały się obiecujące w badaniach in vitro i in vivo, co wskazuje, że potrzebne są dalsze prace nad opracowaniem skutecznych chelatorów żelaza w terapii raka. Specyficzna chelatacja żelaza jest sprawdzoną strategią w odkrywaniu leków przeciwnowotworowych, ale do tej pory zgłoszono tylko kilka klas10.
Identyfikacja i charakterystyka nowych chelatorów żelaza wymaga możliwości zmierzenia ich wpływu na kilka punktów końcowych. Wiele z nich (takich jak proliferacja, apoptoza, powstawanie reaktywnych form tlenu) jest rutynowo mierzonych i zostało opisanych i zrecenzowanych w literaturze jako metody oceny cech charakterystycznych raka11. Oceniając nowy chelator żelaza, wiele grup rutynowo bada wpływ na aktywność antyproliferacyjną i redoks, a także wpływ na napływ lub odpływ żelaza. Techniki przewidywania in silico12 dodatkowo zwiększają rosnącą pulę chelatorów żelaza, które można badać.
Stworzenie chelatatorów żelaza wymaga możliwości zmierzenia ich wpływu na poziom żelaza, aby skutecznie zademonstrować dowód zasady. Obecnie najpowszechniejszą metodą jest cytometria przepływowa13, która jest kosztowna, czasochłonna i słabo kwantyfikowalna. Wybór testu często opiera się na dostępności sprzętu eksperymentalnego, szybkości i koszcie testu. W związku z tym zdolność do chelatowania żelaza może być pomijaną miarą punktu końcowego ze względu na wysokie koszty sprzętu oraz wyzwanie związane z szybkim i powtarzalnym określeniem ilościowym siły chelatacji. W tym miejscu opisujemy wymierną i niedrogą metodę fluorescencyjną bez komórek, aby potwierdzić zdolność nowych związków do chelatowania żelaza.

<table><tbody><tr><td>Sześciowodny siarczan amonu żelaza(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215406</td><td>inny znany jako FAS</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Deferypran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379409</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>bez magnezu i wapnia</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812</td><td>każda optycznie przezroczysta płytka 96-dołkowa będzie działać</td></tr></tbody></table>

ilościowa i niedroga bezkomórkowa metoda fluorescencyjna potwierdzająca zdolność nowych związków do chelatowania żelaza

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Komórki rakowe wymagają dużych ilości żelaza, aby utrzymać swoją proliferację. Metabolizm żelaza jest uważany za cechę charakterystyczną raka, co sprawia, że żelazo jest ważnym celem w podejściach przeciwnowotworowych. Opracowywanie nowych związków i identyfikacja tropów do dalszej modyfikacji wymaga przeprowadzenia testów potwierdzających działanie mechanizmu. Istnieje wiele testów oceniających wpływ na proliferację; Jednak zdolność do chelatowania żelaza jest ważnym, a czasem pomijanym wskaźnikiem punktu końcowego ze względu na wysokie koszty sprzętu i wyzwanie związane z szybkim i powtarzalnym określeniem ilościowym siły chelatacji. W tym miejscu opisujemy wymierną i niedrogą metodę fluorescencji bezkomórkowej, aby potwierdzić zdolność nowych związków do chelatowania żelaza. Nasz test opiera się na dostępnym na rynku, niedrogim barwniku fluorescencyjnym Calcein, którego fluorescencję można określić ilościowo na większości fluorescencyjnych czytników płytek do mikromiareczkowania. Kalceina jest słabym chelatorem żelaza, a jej fluorescencja jest wygaszona, gdy wiąże Fe2 + / 3 +; fluorescencja jest przywracana, gdy nowy chelator konkuruje z kalceiną o związany Fe2 +/3 +. Usunięcie wygaszania fluorescencyjnego i wynikający z tego wzrost fluorescencji pozwala na określenie zdolności chelatacyjnej nowego przypuszczalnego chelatora. Dlatego oferujemy niedrogi, wysokoprzepustowy test, który umożliwia szybkie badanie przesiewowe nowych potencjalnych związków chelatorowych.

W odniesieniu do metody przedstawionej w kroku 2, ten pierwszy eksperyment (Rysunek 1) pozwolił na określenie zakresu liniowego mikroplo płytkowego czytnika fluorescencji podczas wykrywania emisji fluorescencyjnych kalceiny. Nasze reprezentatywne wyniki wykazują szeroki zakres liniowy fluorescencji kalceiny od 0-100 µM. Analiza ANOVA z testem post hoc LSD wykazuje, że istnieją statystycznie istotne różnice w średnich RFU dla wszystkich stężeń kalceiny w porównaniu z kontrolą 0 µM kalceiny. W dalszych eksperymentach zastosowano 1 µM kalceiny (kroki 3 i 4), ponieważ stężenie to wywołuje statystycznie istotne różnice względem kontroli 0 µM i mieści się w zakresie, w jakim kalceina AM jest powszechnie stosowana w hodowlach komórkowych w cytometrii przepływowej13.
W przypadku metody przedstawionej w kroku 3 wykazujemy, że gdy żelazo w formie Fe2+ dodaje się w zakresie 0-1000 µM (jako FAS) do 1 µM Kalkein, Fe2+ jony powodują liniowy spadek fluorescencji kalceiny (RFU). Pozwala to na obserwację Fe2+ wygaszaniu fluorescencji kalceiny. Kalceina, jako słaby chelator żelaza, wiąże żelazo, co redukuje sygnał fluorescencyjny. W Rycina 2, stężenia 8.9 µM W przypadku FAS i wyższych odnotowano istotny spadek, p&lt;0,001 w fluorescencji kalceiny w porównaniu do 1 µM Sam calcein. Zastosowanie 8.9 µM zawartości FAS odpowiadało 33-procentowemu zmniejszeniu fluorescencji kalceiny (średnia RFU). W celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów (krok 4) 10 µM Zastosowano FAS, ponieważ mieścił się on w zakresie wygaszania fluorescencji kalceiny.
W przypadku metody przedstawionej w kroku 4, wypieranie jonów Fe2+ z kompleksu z Calceiną przez chelator żelaza można zaobserwować na Rysunku 3. Żelazo w formie Fe2+ zmniejsza fluorescencję Calceiny w porównaniu z kontrolą 1 µM, a chelator żelaza deferyprone zwiększa tę fluorescencję aż do osiągnięcia szczytu, uwalniając Calceinę z wygaszania przez żelazo i zwiększając fluorescencję (średnia wartość RFU). Deferyprone (użyty jako przykład) w stężeniach od 0,97-512 µM spowodował statystycznie istotne wzrosty fluorescencji, co stwierdzono w analizie ANOVA i teście post hoc LSD (p&lt;0,001). Największa krotność zmiany wyniosła 3-krotny wzrost średniej wartości RFU przy stężeniu chelatora 62,5 µM w porównaniu z kontrolą zawierającą 1 µM calcein AM i 10 µM FAS. Powyżej stężenia 512 µM deferyprone nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy między chelatorem a kontrolą 1 µM Calceiny i 10 µM FAS.
<img alt="Wykres stężenia kalceiny względem średniego RFU, analiza danych korelacji natężenia fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Stężenia kalceiny i fluorescencja (RFU) oznaczone za pomocą mikrotytracyjnego czytnika płytek fluorescencyjnych. Przedstawiono tutaj stężenia kalceiny od 0-100 µM inkubowane przez 30 min oraz oznaczoną fluorescencję (RFU). Dane przedstawiają średnią z 8 powtórzeń na eksperyment i trzech niezależnych eksperymentów; słupki błędów wskazują 95% przedział ufności dla średniej. Istotność statystyczna została oznaczona jako ** dla p&lt;0,001, określonej za pomocą analizy ANOVA i testu post hoc LSD (obliczonej w programie GraphPad Prism). Średnie RFU kalceiny dla każdego stężenia porównano z kontrolą PBS i 0 µM kalceiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres wygaszania fluorescencji; Log₂ FAS vs średnie RFU; analiza danych eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zwiększenie stężenia FAS prowadzi do liniowego spadku fluorescencji kalceiny. Stężenie FAS zwiększono z 0-1000 µM, co spowodowało liniowy spadek fluorescencji 1 µM kalceiny po 30 min inkubacji w PBS. Przedstawione dane stanowią średnią z 5 powtórzeń na eksperyment oraz z trzech niezależnych eksperymentów; słupki błędów wskazują 95% przedział ufności dla średniej. Istotność statystyczną oznaczono jako **, gdzie p&lt;0,001, co ustalono za pomocą analizy ANOVA i testu post hoc LSD (obliczonego przy użyciu programu GraphPad Prism). Średnie RFU kalceiny dla każdego stężenia FAS i 1 µM kalceiny porównano do kontroli zawierającej 1 µM kalceiny i 0 µM FAS w PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy fluorescencji, stężenie deferypronu względem średniego RFU, wskazujący na oddziaływanie z kalceiną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Rosnące stężenia deferypronu. Stężenie deferypronu zwiększano w zakresie 0-1000 µM podczas inkubacji z 1 µM kalceiny i 10 µM FAS w PBS. Fluorescencję mierzono za pomocą multimodalnego czytnika mikropłytek. Przedstawione dane stanowią średnią z 5 powtórzeń w każdym eksperymencie oraz z trzech niezależnych eksperymentów; słupki błędów wskazują 95% przedział ufności dla średniej. Istotność statystyczną oznaczono symbolem **, gdzie p&lt;0.001, co określono za pomocą analizy ANOVA i testu posthoc LSD (obliczono przy użyciu programu GraphPad Prism). Średnie RFU porównano z 1 µM kalceiny w PBS z 10 µM FAS i 0 µM deferypronu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stężenie (μm) </td>
			<td>Objętość z (stoku 1 mM)</td>
			<td>Objętość PBS</td>
			<td>Objętość całkowita </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800</td>
			<td>800 µL</td>
			<td>200 µL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400</td>
			<td>400 µL</td>
			<td>600 µL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>200 µL</td>
			<td>800 µL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100 µL</td>
			<td>900 µL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>950 µL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>25 µL</td>
			<td>975 µL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>990 µL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>6 µL</td>
			<td>994 µL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>2 µL</td>
			<td>998 µL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1 µL</td>
			<td>999 µL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przygotowanie zapasu wtórnego kalceiny.

Opisujemy test fluorescencyjny, który może szybko i tanio potwierdzić zdolność nowych związków do chelatowania żelaza. Test mierzy zdolność związków do konkurowania z aktywnością wiązania żelaza przez słabą sondę fluorescencyjną chelatującą żelazo Calceinę, co skutkuje wymiernym wzrostem fluorescencji, gdy zachodzi chelatacja.

Ilościowa i niedroga bezkomórkowa metoda fluorescencyjna potwierdzająca zdolność nowych związków do chelatowania żelaza

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

Opracowaliśmy test fluorescencyjny, który może szybko i niedrogo potwierdzić zdolność nowych związków do chelatowania żelaza. Chelatatory żelaza to obiecująca klasa związków, które mogą być stosowane w leczeniu nowotworów. Zakłócenie adaptacji metabolicznej nowotworu przez chelatory może prowadzić do nowej strategii terapeutycznej w leczeniu raka.Badania koncentrują się na rozwoju chelatorów żelaza w celu zakłócenia adaptacji metabolicznych nowotworów. Nie ma jednak tanich i prostych technik przesiewowych do obserwacji zdolności nowej cząsteczki do chelatowania żelaza. Istnieje niezaspokojona potrzeba prostego, niedrogiego testu do badań przesiewowych nowych chelatorów żelaza.Test ten pozwoli biologom zajmującym się nowotworami obserwować zdolność chelatacji nowych związków przed zainwestowaniem czasu i zasobów w komórkowe badania przesiewowe aktywności biologicznej. Za pomocą tego testu byliśmy w stanie zaobserwować zdolność chelatacji żelaza nowo opracowanych chelatorów żelaza. Następnie skupiliśmy się na pytaniu, w jaki sposób te chelatory zakłócają metabolizm w komórkach nowotworowych i jak te komórki reagują na to zakłócenie.Jesteśmy zafascynowani tym, jak komórki nowotworowe reagują na zakłócenia metaboliczne powstałe w wyniku leczenia chelatorami żelaza. Zrozumienie metabolizmu żelaza w nowotworach ma zasadnicze znaczenie dla opracowania nowych metod leczenia i nowych schematów leczenia. Na początek użyj pipety wielokanałowej, aby rozprowadzić 50 mikrolitrów PBS w kolumnach od 2 do 10 rzędów od A do E na 96-dołkowej płytce.Odpipetować 100 mikrolitrów dwumilimolowego roztworu podstawowego siarczanu żelazowo-amonowego do kolumny 11. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 50 mikrolitrów wywaru siarczanu żelazowo-amonowego z kolumny 11 do kolumny 10. Kilkakrotnie pipetować roztwory, aby dobrze wymieszać.Przeprowadzić stopniowe podwójne rozcieńczanie w kolumnach od 9 do 2 i w rzędach A do 2. Teraz odpipetować 50 mikrolitrów roztworu z kolumny 2 do wyrzucenia. Po dodaniu PBS do wszystkich studzienek, odpipetuj 10 mikrolitrów 10 mikromolowych zapasów kalceiny do każdej studzienki.W przypadku autonomicznej kontroli PBS należy odpipetować 100 mikrolitrów PBS do rzędu F kolumn od 1 do 5. Następnie dodać 100 mikrolitrów dwóch milimolowych siarczanu żelazowo-amonowego do rzędu F kolumn 6 do 10 w celu kontroli FAS. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut.Przeanalizuj fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek. Odpipetować 50 mikrolitrów PBS do kolumn od 2 do 10 rzędów od A do E płytki 96-dołkowej. Do kolumny 11 dodać 100 mikrolitrów dwumikromolowego roztworu podstawowego roztworu chelatora żelaza.Za pomocą wielokanałowej pipety ręcznej usunąć 50 mikrolitrów roztworu chelatora żelaza z kolumny 11, a następnie przenieść go do PBS w kolumnie 10 z rzędów A do E. Pipetować w górę i w dół, aby dobrze wymieszać roztwór. Kontynuować rozcieńczanie roztworu chelatora w pozostałych kolumnach. Wylać 50 mikrolitrów roztworu ze studzienek w kolumnie 2, a następnie pipetować 30 mikrolitrów PBS do wszystkich studzienek.Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 10 mikrolitrów 100 mikromolowego bulionu siarczanu żelazowo-amonowego do kolumn od 2 do 12 rzędów od A do E. Dodaj 10 mikrolitrów 10 mikromolowych bulionów kalceinowych do tych samych studzienek. Następnie, w celu kontroli pozytywnej, odpipetuj PBS, kalceinę i bulion siarczanu żelazowo-amonowego do kolumny 1 w rzędach A dwa E. Dobrze wymieszaj próbki, pipetując roztwory w górę iw dół, a następnie dodaj 100 mikrolitrów PBS do rzędu F kolumn od 1 do 5, aby utworzyć kontrolę ujemną PBS. Odpipetować tę samą objętość roztworu chelatora żelaza do rzędu F od kolumny 6 do 10, aby utworzyć samodzielną kontrolę chelatora.Umieść płytkę studzienki w temperaturze pokojowej na 10 minut w ciemności. Następnie przeanalizuj na multimodalnym czytniku mikropłytek, tak jak poprzednio. Dodanie jonów żelazawych do kalceiny spowodowało liniowy spadek fluorescencji kalceiny.Chelator żelaza wyprzedził kalceinę w walce o jony żelaza. Chelator zwiększył fluorescencję kalceiny do wartości szczytowej.

quantifiable-inexpensive-cell-free-fluorescent-method-to-confirm

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie opisujemy opartą na kolorymetrii metodę określania zawartości żelaza niehemowego w tkance wątroby myszy. Sulfonian batofenantroliny jest stosowany jako substrat chromogenny w obecności środka redukującego, który przekształca żelazo żelazowe w chelatowalne żelazo żelaza.

Test kolorymetryczny na bazie sulfonianu batofenantroliny: prosta i szybka metoda oznaczania ilościowego żelaza niehemowego w tkance wątroby myszy

Ten film demonstruje technikę in vitro do oceny biodostępności żelaza w złożonych źródłach żywności. Technika ta łączy symulację trawienia człowieka wraz z wychwytem żelaza przez zróżnicowane komórki Caco-2. Wewnątrzkomórkowe tworzenie ferrytyny działa jako marker komórkowego wychwytu żelaza.

Test biologiczny komórek Caco-2: metoda in vitro do pomiaru biodostępności żelaza w złożonych źródłach żywności

Askorbinian odgrywa wiele ważnych ról w metabolizmie komórkowym, z których wiele wyszło na jaw dopiero w ostatnich latach. Tutaj opisujemy średnioprzepustowy, specyficzny i niedrogi test mikropłytkowy do oznaczania zarówno wewnątrzkomórkowego, jak i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowli komórkowej.

Szybki i specyficzny test mikropłytkowy do oznaczania wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowanych komórkach

Przedstawiamy prosty i niezawodny protokół pomiaru zawartości żelaza w tkankach roślinnych za pomocą metody kolorymetrycznej błękitu pruskiego.

Kolorymetryczna metoda pomiaru zawartości żelaza w roślinach

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Prezentujemy test do łatwej kwantyfikacji metali wprowadzonych do próbek przygotowanych za pomocą chromatografii powinowactwa do metali unieruchomionych. Metoda wykorzystuje błękit hydroksynaftolowy jako kolorymetryczny wskaźnik metalu i spektrofotometr UV-Vis jako detektor.

Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Ten artykuł pokazuje, jak przygotować i podawać nieradioaktywne izotopowe żelazo związane z transferyną do badań nad transportem żelaza w ciąży myszy. Opisano również podejście do ilościowego oznaczania izotopowego żelaza w przedziałach płodowo-łożyskowych.

Kwantyfikacja transportu żelaza przez łożysko myszy in vivo przy użyciu nieradioaktywnych izotopów żelaza

Tutaj dostępny jest protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych, przy użyciu prostego, dobrze znanego testu kolorymetrycznego, który można łatwo wdrożyć w większości laboratoriów.

Pomiar zawartości żelaza niehemowego w tkankach za pomocą testu kolorymetrycznego na bazie batofenantroliny

Test biologiczny komórek Caco-2 na biodostępność żelaza (Fe) stanowi opłacalne i wszechstronne podejście do oceny biodostępności Fe z żywności, produktów spożywczych, suplementów, posiłków, a nawet schematów dietetycznych. Dokładnie zwalidowany w badaniach na ludziach, reprezentuje stan wiedzy w zakresie badań nad biodostępnością Fe.

Test biologiczny komórek Caco-2 do pomiaru biodostępności żelaza w żywności

Ten protokół przedstawia metody oceny rozkładu i ilości odkładania się żelaza w tkankach, zwłaszcza w mózgu. Protokół szczegółowo opisuje procedury przygotowania próbek, barwienia Perls/DAB, przechwytywania obrazu i analizy danych.

Ocena osadzania się żelaza w mózgach myszy 5xFAD za pomocą barwienia Perls/DAB

Poznaj ilościową metodę fluorescencyjną do badania chelatowania żelaza przez nowe związki z użyciem sondy Calcein. Ta technika umożliwia szybką i niedrogą selekcję chelatorów żelaza w badaniach nad rakiem.

Ilościowa i niedroga bezkomórkowa metoda fluorescencyjna potwierdzająca zdolność nowych związków do chelatowania żelaza

Przeglądaj więcej filmów