Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Moje badania koncentrują się na zrozumieniu szlaków transkrypcyjnych i metabolicznych leżących u podstaw zmian w zachowaniach żywieniowych wywołanych przez leki. Pracuję nad identyfikacją leków, które obniżają spożycie pokarmu i wydłużają życie, co wskazuje na aktywację zdrowych ścieżek postu. Korzystając z naszego testu klirensu bakteryjnego, zidentyfikowaliśmy dwa odrębne szlaki, które modulują przyjmowanie pokarmu indukowane serotoniną i przyjmowanie pokarmów indukowane lekami przeciwpsychotycznymi.

Obecnie badam, jak te szlaki odnoszą się do odżywiania i długowiecznych mutantów. Protokół ten pozwala naukowcom badać związek między karmieniem a długowiecznością. Szybkość karmienia zwykle charakteryzuje się pompowaniem gardłowym.

Jednak szybkość pompowania u C.Elegans niekoniecznie jest proporcjonalna do ilości spożywanego pokarmu. Po dodaniu do tych poprzednich testów, protokół ten daje wymierną ilość spożycia pokarmu na populację robaków. Nasz test pozwala nam ilościowo modulować karmienie za pomocą małych cząsteczek i określić, w jaki sposób indukowana zmiana zmienia jednocześnie długość życia.

Na początek zaszczepij pojedynczą kolonię OP50 w pięciomililitrach LB ampicyliną i amfoterycyną B i inkubuj przez około sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce bakteryjnej. Gdy kultura stanie się mętna, rozcieńczyć wstępnie zaszczepioną kulturę OP50 w stosunku 1:2 000 w 250 mililitrach gruźlicy ampicyliną i glicerolem. Następnie przenieś płynną kulturę OP50 do sterylnej probówki wirówkowej.

Odwirować probówkę przez 15 minut w temperaturze 3,100 g w wirówce stołowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulat OP50 w sterylnej wodzie przed ponownym odwirowaniem. Po drugim przemyciu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulat OP50 w sterylnej wodzie do objętości 50 mililitrów.

Przenieś go do wstępnie zważonej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów Probówka wirówkowa na 20 minut, aby granulować OP50. Pod koniec wirowania ostrożnie usunąć cały pozostały supernatant, upewniając się, że w probówce nie pozostała woda. Obliczyć masę osadu, odejmując masę pustej probówki wirówkowej od masy probówki wirówkowej z osadem.

Dokładnie zawiesić granulat OP50 w buforze S-Complete, aby osiągnąć stężenie 100 miligramów na mililitr. Przetestuj zawiesinę OP50 na płytce agarowej, aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczeń. Zawiesinę OP50 należy przechowywać w buforze S-Complete Buffer w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby rozpocząć, wybierz pożywkę wzrostową nicieni lub płytkę NGM zajętą przez wygłodzone larwy Caenorhabditis elegans w stadium L1. Używając jednego mililitra sterylnej wody, delikatnie zmyj robaki z talerza. Podwielokrotność około 300 mikrolitrów populacji robaków na płytki NGM wysiane skoncentrowanym OP50.

Pozostaw płytki do wyschnięcia za pomocą suszarki płytowej lub palnika Bunsena, a następnie inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż znaczna populacja stanie się ciężarnymi dorosłymi osobnikami. Aby zebrać robaki, zmyj je z talerza do 10 mililitrów sterylnej wody i przenieś mieszaninę wody z robakami do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Pozwól robakom osiąść grawitacyjnie na dnie rurki przez około cztery minuty.

Używając małej końcówki do pipety, ostrożnie nacisnąć i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj do 15 mililitrów sterylnej wody. Po ostatnim umyciu usuń supernatant i dodaj pięć mililitrów świeżo przygotowanego roztworu wybielacza i wodorotlenku sodu.

Wysiaduj robaki przez pięć minut w temperaturze pokojowej, wirując co minutę przez co najmniej 10 sekund. Monitoruj postęp za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Gdy wszystkie dorosłe osobniki otworzą się lub rozpuszczą, dodaj bufor M9, aby zneutralizować reakcję, doprowadzając końcową objętość do 15 mililitrów.

Następnie odwirować probówkę przez dwie minuty przy stężeniu 1,300 g. Umyj jaja jeszcze dwa razy 13 mililitrami buforu M9 przez odwirowanie, a następnie ponownie umyj 15 mililitrami buforu S-Complete. Następnie odwirować jajka przez dwie minuty w temperaturze 1 300 g.

Po odwirowaniu odessać supernatant i dodać 10 mililitrów buforu S-Complete. Delikatnie obróć rurkę w temperaturze pokojowej przez noc za pomocą mutatora lub podobnego urządzenia. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego oceń, czy robaki się wykluły.

Policz robaki w 10 mikrolitrowych kroplach buforu S pod mikroskopem. Przygotować płynną mieszaninę robaków z 60 robakami na mililitr w pożywce S-Complete zawierającej karbenicylinę, amfoterycynę B i OP50. Dodaj 120 mikrolitrów pożywki ze ślimakami do rzędów od A do G i bez robaków pożywki do rzędu H. Następnie uszczelnij płytkę uszczelniaczem taśmowym, aby zapobiec zanieczyszczeniu i parowaniu.

Inkubować szczelnie zamknięte płytki przez około 65 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż zwierzęta staną się robakami L4. Dodaj 30 mikrolitrów 0,6-milimolowego roztworu podstawowego fluoro-deoksyurydyny do każdej studzienki, aby wysterylizować zwierzęta na etapie L4. Ponownie uszczelnić płytkę za pomocą taśmy uszczelniającej i mieszać ją przez 20 minut z prędkością 800 obr./min na wytrząsarce do płytek do mikromiareczkowania.

Włóż płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj interesujący lek do kultury robaków dnia 1. Ponownie uszczelnij płytki taśmą uszczelniającą i potrząsaj przez 20 minut z prędkością 800 obr./min na wytrząsarce do płyt.

Następnie, po zdjęciu pokrywy i uszczelki, zmierz OD600 w czytniku płytek do pomiaru dnia 1. Ponownie zamknij płytki i umieść je z powrotem w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Za pomocą odwróconego mikroskopu, najlepiej z obiektywem 2x, policz populację robaków w każdej studzience i zapisz liczby w arkuszu kalkulacyjnym.

Po zliczeniu włóż płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Krzywe dawka-odpowiedź zmiany krotności spożycia pokarmu w funkcji stężenia serotoniny wykazały, że szczep N2 może przejadać się w sposób zależny od dawki. Mutant daf-16 mu86 wykazuje wyższe żywienie podstawowe niż N2. Nie może jednak reagować na serotoninę w taki sam sposób zależny od dawki, jak szczep N2.

Zaobserwowano istotną różnicę w przyjmowaniu pokarmu przez robaki leczone loksapiną, ale karmione bakteriami zabitymi przez promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie gamma lub paraformaldehyd. Porównanie spożycia pokarmu przez szereg szczepów genetycznych pokazuje, że mutanty exc-4 i cgr-1 jedzą mniej, podczas gdy mutanty srp-6 jedzą więcej.