Name: Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji spożycia pokarmu u Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego w hodowli ciekłej. Protokół umożliwia badanie związku między zachowaniem pokarmowym a długością życia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcemy podziękować Xiaolan Ye, ponieważ ten protokół został opracowany w wyniku obserwacji, którą pierwotnie poczyniła. Dziękujemy wszystkim byłym i obecnym członkom Petrascheck Lab za ich pomoc w rozwoju i optymalizacji tego protokołu. Praca ta została sfinansowana przez R21 AG080376 (do M.P.). Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig01.jpg"> 
Rysunek 1: Schemat testu klirensu bakteryjnego.Graficzny zarys głównych sekcji protokołu (od góry do dołu): Przygotowanie bakterii, synchronizacja populacji robaków, wysiew na 96-dołkowych płytkach, sterylizacja robaków, dodawanie leków, pomiar OD600 w dniu 1 i dniu 4. Szczegółowy opis tych konkretnych kroków znajduje się po lewej stronie każdego obrazu. Skróty: OD = gęstość optyczna; FUdR = fluorodeoksyurydyna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
1. Przygotowanie bakterii
UWAGA: W tej sekcji szczegółowo opisano przygotowanie bakterii pokarmowych stosowanych w tym teście. Specyficzny szczep E. coli użyty w teście nazywa się OP50. OP50 jest najczęściej stosowanym szczepem do karmienia C. elegans. Zastosowany szczep OP50 jest oporny na karbenicylinę/ampicylinę, co zapobiega zanieczyszczeniu krzyżowemu kultury robaków z innymi bakteriami9.
<ol>
	<li>Przygotuj OP50 4-5 dni wcześniej, a dzień przed użyciem prześwietlaj prześwietlić. Upewnij się, że wszystkie materiały napotykające OP50 są sterylne29,30.</li>
	<li>Dzień -8: Środa (tydzień 1):<ol>
		<li>Przygotować preinokulum przez zaszczepienie 5 ml LB 100 μg/ml ampicyliny i 0,1 μg/ml amfoterycyny B oraz pojedynczej kolonii OP50 i inkubować przez około 6 godzin w temperaturze 37 °C w wytrząsarce bakteryjnej. Zaszczepić wcześnie, aby umożliwić wystarczający wzrost, aby kultura stała się mętna.</li>
		<li>Gdy hodowla jest mętna, rozcieńczyć kulturę preinokulum OP50 w stosunku 1:2,000 w 250 ml gruźlicy zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować kulturę przez noc w wytrząsarce bakteryjnej przez 17-19 godzin w temperaturze 37 °C. UWAGA: Kultura nie powinna rosnąć dłużej niż 19 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień -7: Czwartek (tydzień 1)<ol>
		<li>Po 17-19 godzinach inkubacji przenieść płynną kulturę OP50 do sterylnej probówki wirówkowej i wirować przez 15 minut w temperaturze 3 100 × g w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad OP50 sterylną wodą i ponownie odwirować. Powtórz to pranie 2x.</li>
		<li>Po drugim przepłukaniu wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić granulat OP50 w sterylnej wodzie do objętości 50 ml i przenieść go do wstępnie zważonej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Granulować OP50 przez odwirowywanie przez 20 minut w temperaturze 3 100 × g w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po trzecim praniu ostrożnie usuń cały pozostały supernatant, upewniając się, że w probówce nie pozostała woda. Obliczyć masę osadu, odejmując masę pustej probówki wirówkowej od masy probówki wirówkowej z osadem. UWAGA: Waga pelletu zwykle waha się od 3-3,5 g.</li>
		<li>Dokładnie zawiesić granulat OP50 w buforze S-complete do stężenia 100 mg/ml, upewniając się, że nie ma grudek.</li>
		<li>Upewnij się, że stężenie OP50 przy 100 mg/ml odpowiada 2 ×10 10 bakteriom/ml. Jeśli znana jest zależność między gęstością optyczną a liczbą bakterii na ml, należy określić stężenie bakterii na ml spektrofotometrycznie. W razie potrzeby użyj buforu S-complete, aby dostosować stężenie roztworu zasilającego OP50 do 2 × 1010 bakterii/ml.</li>
		<li>Przetestuj OP50 na płytce agarowej, aby określić, czy został zanieczyszczony.</li>
		<li>Przechowywać OP50 zawieszony w buforze S-complete w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol start="4">
	<li>Dzień -3: Poniedziałek (tydzień 2)<ol>
		<li>Zabij bakterie za pomocą promieniowania rentgenowskiego, aby zapobiec rozwojowi bakterii podczas testu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Synchroniczne przygotowanie hodowli robaków
UWAGA: W tej sekcji omówiono przygotowanie synchronicznej populacji robaków. Wszystkie materiały, które mają kontakt z populacjami robaków, są sterylne. Wszystkie tabliczki są przechowywane w temperaturze 20 °C, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Dzień -6: Piątek (tydzień 1), godz. 16:00<ol>
		<li>Przełóż zwierzęta na świeży talerz.<ol>
			<li>Weźmy płytkę NGM, na której większość populacji robaków składa się z wygłodzonych larw L1. UWAGA: Mieszana populacja również przyniesie wyniki. Używanie robaków L1, które były głodzone przez długi czas, może wpływać na zachowania żywieniowe w obecnych lub przyszłych pokoleniach, ponieważ głód może pozostawić ślady epigenetyczne przez co najmniej trzy pokolenia.</li>
			<li>Zmyj robaki nie więcej niż 1 ml sterylnej wody. Porcja ~300 μL zmytej populacji robaków na płytki NGM wysiane skoncentrowanym OP50 (~300 mg/mL). Pozostaw talerze do wyschnięcia pod suszarką do płyt lub palnikiem Bunsena. Inkubować płytki w temperaturze 20°C, aż większość populacji będzie zawierała ciężarne dorosłe osobniki (poniedziałek). UWAGA: Ten przedział czasowy jest zoptymalizowany pod kątem populacji robaków N2 typu dzikiego i może się różnić w zależności od szczepu. Robaki z opóźnieniami w rozwoju powinny być brane pod uwagę i wcześniej pokrojone i/lub wysiane, tak aby wszystkie testowane szczepy osiągnęły dorosłość jednocześnie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień -3: Poniedziałek (tydzień 2) godz. 10:00<ol>
		<li>Ustanawianie populacji synchronicznej OSTROŻNOŚĆ! Wybielacz działa żrąco na skórę i oczy. Obchodzenie się z nim wymaga rękawic i okularów ochronnych.<ol>
			<li>Zbierz robaki, zmywając je z talerza do 10 ml sterylnej wody. Przenieś ten roztwór robaka/wody do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
			<li>Umyj robaki w zlewie grawitacyjnym na blacie przez około 4 minuty (odwrotnie, myj przez wirowanie przez 2 minuty w wirówce stołowej o masie 310 × g.</li>
			<li>Wyrzucić supernatant przez aspirację za pomocą małej końcówki i dodać do 15 ml sterylnej wody. Powtórz 3 razy.</li>
			<li>Usunąć sklarowany osad i dodać 5 ml świeżo przygotowanego roztworu wybielacza/NaOH (1,8 ml wybielacza domowego, 0,5 ml 10 N NaOH, 7,7 ml dH2O).</li>
			<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy robaki pękną. Wiruj delikatnie co minutę przez co najmniej 10 s. Monitoruj postęp pod mikroskopem preparacyjnym. UWAGA: Czas potrzebny do otwarcia robaków może się różnić w zależności od odmiany. Pozostawienie robaków w roztworze wybielacza zbyt długo może spowodować, że jaja nie będą zdolne do życia.</li>
			<li>Dodać bufor M9 w celu zneutralizowania reakcji, gdy wszystkie dorosłe osobniki pękną lub rozpuszczą się (końcowa objętość powinna wynosić 15 ml) i odwirować przez 2 minuty przy 1 300 × g.</li>
			<li>Umyj jajka 3x 13 ml buforu M9.</li>
			<li>Umyć jaja raz 10 ml buforu S-complete, odwirowując przez 2 minuty przy 1 300 × g.</li>
			<li>Odessać supernatant, dodać 10 ml S-complete i przenieść zawiesinę do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie obróć rurkę w temperaturze pokojowej przez noc na nutatorze lub podobnym urządzeniu.</li>
			<li>Fakultatywnie: Jeżeli po końcowym odwirowaniu w buforze S-complete znajdują się dorosłe tusze, przefiltrować roztwór robaka przez sitko o wielkości 40 μm.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień -2: Wtorek (tydzień 2), godz. 13:00<ol>
		<li>Wysiewanie zwierząt na talerze<ol>
			<li>Za pomocą lunety sekcyjnej sprawdź, czy robaki się wykluły. Określić stężenie robaków w buforze S-complete, zliczając populację robaków w kroplach o objętości 10 μl za pomocą lunety preparcyjnej; Policz 5-10 kropli na każdą próbkę. Jeśli stężenie robaków w każdej kropli o objętości 10 μl przekracza 30 robaków na kroplę, należy rozcieńczyć cały materiał z S-complete do niższej gęstości robaków na kroplę, aby ułatwić liczenie.</li>
			<li>Wysiewać płynną mieszaninę robaków do każdego dołka 96-dołkowej płytki o objętości 120 μl w następujący sposób (stężenia końcowe): 60 robaków/ml w S-complete, 50 μg/ml karbenicyliny, 0,1 μg/ml amfoterycyny i 6 mg/ml OP50 przygotowanych w sekcji 1. UWAGA: Całkowita objętość do przygotowania zależy od liczby płytek (~12 ml na płytkę 96-dołkową). W każdej studzience powinno znajdować się 6-12 robaków. Alternatywnie, cytometria przepływowa dużych cząstek, taka jak COPAS FP firmy Union Biometrica, może być użyta do precyzyjnego sortowania 10 robaków do każdej studzienki (patrz sekcja Efekt stłoczenia).</li>
			<li>Dołącz również płynną mieszaninę bez robaków : 50 μg/ml karbenicyliny, 0,1 μg/ml amfoterycyny i 6 mg/ml OP50 przygotowanej w sekcji 1.</li>
			<li>Umieść 120 μl mieszaniny bez robaków w rzędzie H 96-dołkowej płytki, która służy do określania wartości samolizy, jak wspomniano wcześniej. Umieść 120 μl na studzienkę mieszaniny z robakami w rzędach A-G. UWAGA: Upewnij się, że ślimaki są utrzymywane w zawiesinie podczas pipetowania (patrz Rysunek 2A, B). Używamy przezroczystych 96-dołkowych płytek z płaskim dnem. Nasz układ płytek dzieli płytkę, aby uzyskać 4 lub 6 warunków, w których każda para kolumn będzie innym lekiem lub szczepem robaka, a dolny rząd będzie służył jako kontrola "bez robaków" (Rysunek 2A, B).</li>
			<li>Aby uniknąć zanieczyszczenia i parowania, uszczelnij płytkę za pomocą zgrzewarki taśmowej. Inkubować płytki przez około 65 godzin w temperaturze 20 °C, aż zwierzęta staną się robakami L4.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 0: Czwartek (tydzień 2) przed południem.<ol>
		<li>Sterylizacja populacji robaków poprzez dodanie fluorodeoksyurydyny (FUdR).<ol>
			<li>Dodać 30 μl 0,6 mM roztworu podstawowego FUdR, aby wysterylizować zwierzęta w każdym dołku. Ponownie uszczelnić płytkę za pomocą taśmy uszczelniającej i potrząsać płytkami przez 20 minut na wytrząsarce do płytek do mikromiareczkowania z prędkością 800 obr./min. Włożyć płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 20 °C. UWAGA: Na tym etapie końcowe stężenie OP50 zmniejsza się z 6 mg/ml do 5 mg/ml (1 × 109 bakterii/ml), a każda studzienka ma końcową objętość 150 μl. Bardzo ważne jest, aby dodać FUdR do etapu L4, zanim zwierzęta osiągną dorosłość.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 1: Piątek (tydzień 2)<ol>
		<li>Dodaj leki do kultury.<ol>
			<li>Do godziny 9:00 upewnij się, że większość zwierząt jest ciężarna, a każda studzienka zawiera kilka jaj. W razie potrzeby dodaj dowolne leki do pożądanego stężenia (patrz dyskusja).</li>
			<li>Po dodaniu leku należy uszczelnić płytki taśmą uszczelniającą i wstrząsać płytkami przez 20 minut z prędkością 800 obr./min na wytrząsarce do płyt. UWAGA: Potrząsanie zapewnia, że wszystkie grudki bakteryjne zostaną rozpuszczone bez dotykania uszczelniacza. Zarówno grudki bakteryjne, jak i płyn na uszczelniaczu zniekształcą odczyt OD600 . Jeśli na zgrzewarce znajdują się krople cieczy, krótko obracaj ją przez 10-20 s w temperaturze 310 × g. Wstrząsaj ponownie na wytrząsarce przez 5 minut i odmierz.</li>
			<li>Po 20 minutach wytrząsania na płytce do mikromiareczkowania, zdjąć pokrywę i uszczelkę, a następnie zmierzyć średnicę zewnętrzną600 w czytniku płytek; jest to pomiar OD600 dnia 1. Uszczelnić i zwrócić płytki do inkubatora o temperaturze 20 °C. UWAGA: Ponieważ bakterie szybko się osadzają, odczyt powinien nastąpić w ciągu 10 minut po potrząśnięciu płytkami.</li>
			<li>Użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić populację robaków pod kątem oznak zanieczyszczenia lub toksyczności, jeśli dodano lek. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 4: Poniedziałek (tydzień 3)<ol>
		<li>Weź odczyt dnia 4 OD600 .<ol>
			<li>Powtórz procedurę odczytu od dnia 1 (krok 2.5.1.3), aby uzyskać wartość OD dnia 4 600 . Przed pomiarem średnicy zewnętrznej600 należy wstrząsać płytkami przez 20 minut z prędkością 800 obr./min na wytrząsarce płytki do mikromiareczkowania.</li>
			<li>Na odwróconym mikroskopie, najlepiej z obiektywem 2x, policz populację robaków w każdej studzience i zapisz ją w arkuszu kalkulacyjnym. Po przeliczeniu należy umieścić płytki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 20 °C. UWAGA: Zobacz próbkę naszego arkusza punktacji znajdującego się w materiałach uzupełniających.</li>
			<li>Po odczycie z dnia 4 pomiary spożycia pokarmu są zakończone. W razie potrzeby zachowaj te tabliczki do analizy żywotności. UWAGA: Ten protokół jest kompatybilny z Solis i Petrascheck31.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

3. Analiza danych dotyczących spożycia żywności
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig2_v1.jpg"> 
Rysunek 2: Projektowanie i analiza.(A, B) Możliwe konstrukcje płyt dla 4 i 6 warunków z studzienkami kontrolnymi "bez ślimaka" w rzędzie H. Studnie te są niezbędne do określenia szybkości samolizy. Na każdej tabliczce należy zawsze uwzględnić nieleczoną populację kontrolną N2 jako odniesienie. (C) Przykładowe dane zebrane w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym z liczbą robaków (zielona ramka), dwoma pomiarami OD600 w dniu 1 i 4 (pomarańczowe pola), wartościami samolizy (niebieska ramka) oraz oceną przy użyciu wzoru (2) ((OD600 -samoliza)/X0) w czerwonej ramce. W konkretnym przykładzie pokazanym tutaj wykorzystano konstrukcję płyty pokazaną w (B). Skróty: OD = gęstość optyczna; X0 = liczba robaków w studzience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig2large_v1.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
UWAGA: W tej sekcji opisano, w jaki sposób analizowane są dane dotyczące spożycia pokarmu z sekcji 2 niniejszego protokołu. Pierwszymi wartościami, które należy obliczyć, są wartości kontroli samolizy . Bakterie z czasem ulegają lizie w płynie, nawet przy braku robaków. Na tę wartość autolizy może również wpływać wiele substancji chemicznych i należy ją kontrolować, ponieważ jest ona stosunkowo duża w porównaniu z pokarmem pobieranym przez robaka. Jak opisano w kroku 2.3.1.4 i pokazano w układzie tabliczek na rysunku 2A, B, wiersz H zawiera ten sam roztwór, z wyjątkiem robaków. W naszym układzie płyt pokazanym na rysunku 2B znajduje się 14 studzienek na warunek z dwoma odpowiednimi studzienkami kontrolnymi samolizy (rząd H, "bez robaków").
<ol>
	<li>Obliczyć wartości kontroli samolizy dla studzienek kontrolnych bez robaków w każdym stanie, korzystając z równania ( 1). Dla każdej powtórzonej grupy studzienek upewnij się, że istnieją co najmniej dwie studzienki kontrolne bez robaków , jak wspomniano w kroku 2.3.1.4. Użyj średniej ze wszystkich studzienek kontrolnych bez robaków dla wartości samolizy dla grupy powtórzonej. 
	Selfysis = średnia(OD600 Dzień 1 - OD600 Dzień 4) (1) UWAGA: Dla konfiguracji płytek pokazanej na rysunku 2B obliczylibyśmy sześć wartości samolizy , po jednej dla każdej z sześciu grup, obliczając średnią z dwóch studzienek kontrolnych samolizy w rzędzie H.</li>
	<li>Oblicz spożycie pokarmu na robaka za pomocą równania 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66422/66422equation2v2.jpg">(2). UWAGA: Wzór użyty w arkuszu kalkulacyjnym (czerwona ramka, rysunek 2C), gdzie X0 to liczba robaków na studzienkę.</li>
	<li>Po określeniu spożycia pokarmu przez robaka dla każdej studzienki oblicz średnie i odchylenie standardowe dla całego stanu. UWAGA: W przypadku konfiguracji płytek pokazanej na rysunku 2B do porównań statystycznych wystarczy 14 powtórzonych studzienek na warunek.</li>
	<li>Znormalizuj każdy stan do odpowiedniej nieleczonej populacji kontrolnej N2. Wskaż zmianę karmienia jako zmianę fałdu lub procent karmienia N2. UWAGA: Normalizacja jest wykonywana, ponieważ wartości bezwzględne OD600/X0 z równania (2) mogą się różnić między eksperymentami przeprowadzonymi w różnych dniach.</li>
</ol>

High-Throughput Assay to Measure Caenorhabditis elegans Food Intake and Lifespan

<ol><li>Taormina, G., Mirisola, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+in+mammals+and+simple+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction in mammals and simple model organisms.</a> Biomed Res Int. 2014, 308690(2014).</li>
<li>Cunningham, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amp-activated+kinase+links+serotonergic+signaling+to+glutamate+release+for+regulation+of+feeding+behavior+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Amp-activated kinase links serotonergic signaling to glutamate release for regulation of feeding behavior in C.</a> elegans. Cell Metab. 16 (1), 113-121 (2012).</li>
<li>You, Y. J., Kim, J., Raizen, D. M., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2C+cgmp%2C+and+tgf-beta+signals+regulate+food+intake+and+quiescence+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans%3A+A+model+for+satiety.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin, cgmp, and tgf-beta signals regulate food intake and quiescence in C.</a> elegans: A model for satiety. Cell Metab. 7 (3), 249-257 (2008).</li>
<li>Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age-1+and+daf-2+genes+function+in+a+common+pathway+to+control+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141 (4), 1399-1406 (1995).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+nonautonomy+of+C.+elegans+daf-2+function+in+the+regulation+of+diapause+and+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell nonautonomy of C. elegans daf-2 function in the regulation of diapause and life span.</a> Cell. 95 (2), 199-210 (1998).</li>
<li>Srinivasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+control+of+lipid+metabolism%3A+Lessons+from+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine control of lipid metabolism: Lessons from C.</a> elegans. J Neurogenet. 34 (3-4), 482-488 (2020).</li>
<li>Calculli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+regulation+of+mitochondria+by+germline+proteostasis+prevents+protein+aggregation+in+the+soma+of%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Systemic regulation of mitochondria by germline proteostasis prevents protein aggregation in the soma of.</a> elegans. Sci Adv. 7 (26), eabg3012(2021).</li>
<li>Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+feeding+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of feeding in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 133 (4), 897-917 (1993).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+restriction+extends+lifespan+through+metabolic+regulation+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Dietary restriction extends lifespan through metabolic regulation of innate immunity.</a> Cell Metab. 29 (5), 1192-1205.e8 (2019).</li>
<li>Chen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+convergence+reveals+a+lipid+pathway+that+regulates+C.+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological convergence reveals a lipid pathway that regulates C. elegans lifespan.</a> Nat Chem Biol. 15 (5), 453-462 (2019).</li>
<li>Gomez-Amaro, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+food+intake+and+nutrient+absorption+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Measuring food intake and nutrient absorption in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 443-454 (2015).</li>
<li>Mckay, J. P., Raizen, D. M., Gottschalk, A., Schafer, W. R., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eat-2+and+eat-18+are+required+for+nicotinic+neurotransmission+in+the+Caenorhabditis+elegans+pharynx%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Eat-2 and eat-18 are required for nicotinic neurotransmission in the Caenorhabditis elegans pharynx.</a> Genetics. 166 (1), 161-169 (2004).</li>
<li>Hobson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser-7%2C+a+Caenorhabditis+elegans+5-ht7-like+receptor%2C+is+essential+for+the+5-ht+stimulation+of+pharyngeal+pumping+and+egg+laying%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ser-7, a Caenorhabditis elegans 5-ht7-like receptor, is essential for the 5-ht stimulation of pharyngeal pumping and egg laying.</a> Genetics. 172 (1), 159-169 (2006).</li>
<li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+Comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology.</a> Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
<li>Webster, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+rnai+screen+for+fat+regulatory+genes+in+C.+elegans+identifies+a+proteostasis-ampk+axis+critical+for+starvation+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide rnai screen for fat regulatory genes in C. elegans identifies a proteostasis-ampk axis critical for starvation survival.</a> Cell Rep. 20 (3), 627-640 (2017).</li>
<li>Reis Rodrigues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+ligands+of+cannabinoid+receptors+affect+dauer+formation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Synthetic ligands of cannabinoid receptors affect dauer formation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 6 (6), 1695-1705 (2016).</li>
<li>Levichev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+endocannabinoid+anandamide+modulates+olfactory+sensitivity+to+induce+hedonic+feeding+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The conserved endocannabinoid anandamide modulates olfactory sensitivity to induce hedonic feeding in C.</a> elegans. Curr Biol. 33 (9), 1625-1639.e4 (2023).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+behavioral+screen+identifies+an+orphan+anti-opioid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic behavioral screen identifies an orphan anti-opioid system.</a> Science. 365 (6459), 1267-1273 (2019).</li>
<li>Cheong, M. C., Artyukhin, A. B., You, Y. J., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+opioid-like+system+regulating+feeding+behavior+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Elife%22%5BJournal%5D)">An opioid-like system regulating feeding behavior in C.</a> elegans. Elife. 4, e06683(2015).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13091-13096 (1998).</li>
<li>Huang, C., Xiong, C., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+age-related+changes+of+physiological+processes+that+predict+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measurements of age-related changes of physiological processes that predict lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (21), 8084-8089 (2004).</li>
<li>Witham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+body+cavity+neurons+are+homeostatic+sensors+that+integrate+fluctuations+in+oxygen+availability+and+internal+nutrient+reserves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">C. elegans body cavity neurons are homeostatic sensors that integrate fluctuations in oxygen availability and internal nutrient reserves.</a> Cell Rep. 14 (7), 1641-1654 (2016).</li>
<li>Hussey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-sensing+neurons+reciprocally+regulate+peripheral+lipid+metabolism+via+neuropeptide+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Oxygen-sensing neurons reciprocally regulate peripheral lipid metabolism via neuropeptide signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genet. 14 (3), e1007305(2018).</li>
<li>Zapata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+control+food+intake+and+weight+regain+via+vacuolar-type+h%28%2B%29+atpase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Adipocytes control food intake and weight regain via vacuolar-type h(+) atpase.</a> Nat Commun. 13 (1), 5092(2022).</li>
<li>Clay, K. J., Yang, Y., Clark, C., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteostasis+is+differentially+modulated+by+inhibition+of+translation+initiation+or+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Proteostasis is differentially modulated by inhibition of translation initiation or elongation.</a> Elife. 12, e76465(2023).</li>
<li>Perez-Gomez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phenotypic+caenorhabditis+elegans+screen+identifies+a+selective+suppressor+of+antipsychotic-induced+hyperphagia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A phenotypic caenorhabditis elegans screen identifies a selective suppressor of antipsychotic-induced hyperphagia.</a> Nat Commun. 9 (1), 5272(2018).</li>
<li>Zapata, R. C., Zhang, D., Chaudry, B., Osborn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-administration+of+drugs+in+mouse+models+of+feeding+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Self-administration of drugs in mouse models of feeding and obesity.</a> J Vis Exp. (172), 62775(2021).</li>
<li>Zapata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+clic1+for+the+treatment+of+obesity%3A+A+novel+therapeutic+strategy+to+reduce+food+intake+and+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Targeting clic1 for the treatment of obesity: A novel therapeutic strategy to reduce food intake and body weight.</a> Mol Metab. 76, 101794(2023).</li>
<li>Stuhr, N. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+diets+differentially+alter+lifespan+and+healthspan+trajectories+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C.</a> elegans. Commun Biol. 3 (1), 653(2020).</li>
<li>Stuhr, N. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+killing+bacteria+diets+differentially+influence+Caenorhabditis+elegans+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22MicroPubl+Biol%22%5BJournal%5D)">Different methods of killing bacteria diets differentially influence Caenorhabditis elegans physiology.</a> MicroPubl Biol. 2023, (2023).</li>
<li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Wofford, M. R., King, D. S., Harrell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Hypertens+%28Greenwich%29%22%5BJournal%5D)">Drug-induced metabolic syndrome.</a> J Clin Hypertens (Greenwich). 8 (2), 114-119 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W przedstawionym protokole mierzono klirens bakteryjny jako odczyt dla pobrania pokarmu przez C. elegans na 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych. Krzywe dawka-odpowiedź w sekcji reprezentatywnych wyników pokazują, że test ilościowo mierzy spożycie pokarmu, co zostało niezależnie potwierdzone przy użyciu bakterii znakowanych izotopowo11. Korzystając z tego testu, z powodzeniem przetestowaliśmy leki zatwierdzone przez FDA, takie jak leki przeciwpsychotyczne ze znanymi metabolicznymi skutkami ubocznymi u ludzi i wykazaliśmy, że leki te zwiększają żerowanie u C. elegans10,26. Test jest przydatny do badania genetyki lub farmakologii żywienia i dodaje nowe narzędzie do badań nad C. elegans w celu zbadania metabolizmu. Test ten zapewnia tanią metodę badania karmienia w sposób skalowalny i przyjazny dla czasu, co nie jest możliwe w przypadku większości innych organizmów. Nasza praca nad lekami zatwierdzonymi przez FDA pokazuje, że wiele skutków ubocznych obserwowanych u ludzi obserwuje się również u C. elegans, ujawniając zachowanie ewolucyjne 24,26,32.
Test jest ograniczony stężeniem bakterii, które można zmierzyć w liniowym zakresie pomiaru OD600 . W rezultacie liczba robaków i zakres stężeń bakterii, które można oznaczyć, są ograniczone. Zbyt wiele robaków wpłynie na OD600 poprzez zbyt szybkie zjadanie bakterii, a tym samym "zjadanie" stężenia bakterii z liniowego OD600. Z naszego doświadczenia wynika, że zmienność w przygotowaniu bakterii jest krytycznym parametrem, który powoduje, że wyniki różnią się w zależności od eksperymentu. Bezskutecznie próbowaliśmy zamrażać duże partie bakterii lub stosować bakterie liofilizowane. W tych przypadkach albo wskaźnik samolizy stał się zbyt wysoki, albo bakterie miały jakość, która spowalniała rozwój C. elegans . Jednak nasze testy nie były wyczerpujące, a ten problem może być rozwiązany.
Ogólnie rzecz biorąc, szybkość samolizy bakterii jest najtrudniejsza do kontrolowania i może powodować znaczną zmienność. Odkryliśmy, że niektóre leki mogą zwiększać wskaźnik samolizy do poziomów, których test nie był w stanie wiarygodnie określić spożycia pokarmu. Ponieważ wskaźnik samolizy wzrasta z czasem w teście, nie mierzyliśmy spożycia pokarmu po 5 dniu dorosłości. W tym wieku bakterie są ~10 dni w hodowli. Aby zmierzyć spożycie pokarmu po 5 dniu dorosłości, stare bakterie muszą zostać zmyte i zastąpione świeżymi.
Prezentowany test jest rozszerzeniem naszego 96-dołkowego testu żywotności opartego na płytkach mikromiareczkowych31. Ta kombinacja umożliwia pomiar długości życia i spożycia pokarmu w tej samej populacji. Chociaż przedstawiony tutaj test klirensu bakteryjnego nie pozwala na określenie spożycia pokarmu przez całe życie C. elegans z powodu samolizy bakteryjnej, dostarcza solidnych danych dla pierwszych czterech dni dorosłości, czyli czasu z najwyższym spożyciem pokarmu. Szczególnie w przypadku odkrywania leków małocząsteczkowych kontrola spożycia pokarmu jest niezbędna. Podsumowując, przewidujemy, że zaprezentowany test będzie przydatny dla społeczności C. elegans i rozszerzy zestaw narzędzi do badania metabolizmu lub jego kontroli w kontekście badań nad starzeniem się i długością życia.
Planowanie: 
Przed planowaniem pomiaru spożycia pokarmu należy wziąć pod uwagę kilka kwestii.
Zabijanie bakterii:
Zabijamy bakterie poprzez naświetlanie promieniami rentgenowskimi w stożkowej probówce o pojemności 50 ml (900 Grayów przez 4 godziny ustawione na 160,0 kV i 25,0 mA). Do naświetlania używamy RS2000 firmy Rad Source. W zależności od sprzętu, konkretny czas i dawka promieniowania mogą się różnić w zależności od placówki. Całkowite zabicie bakterii musi zostać określone przez posiew bakterii po napromieniowaniu w celu wykrycia ocalałych przez wzrost. Konieczne jest zabicie wszystkich bakterii, aby zapobiec wzrostowi podczas testu, ponieważ spowoduje to niedoszacowanie wartości karmienia lub nawet ujemne. Co ważne, bakterie muszą zostać zabite, aby C. elegans nadal je zjadały. Z naszego doświadczenia wynika, że istnieją trzy sposoby niezawodnego zabijania dużych ilości bakterii: (i) naświetlanie promieniami rentgenowskimi, (ii) promieniami γ oraz (iii) dodanie formaldehydu29,30. Wskaźniki samolizy między tymi trzema metodami są porównywalne, z 8% współczynnikiem zmienności między wskaźnikami samolizy dla eksperymentów pokazanych na rysunku 3B. Metody, które nie działały niezawodnie w naszych rękach to naświetlanie promieniami UV, koktajle antybiotykowe, inaktywacja termiczna i azydek sodu. Metody te albo nie są w stanie całkowicie zabić bakterii (promieniowanie UV i antybiotyki), albo wytworzyć bakterie, których C. elegans nie zjada (ciepło), albo zmienić sposób przyjmowania pokarmu (azydek sodu).
Liczba powtórzeń: 
Z naszego doświadczenia wynika, że zmiany fałdowania w karmieniu są na ogół niewielkie w porównaniu z obserwowaną zmiennością. W związku z tym pomiar zmian w spożyciu pokarmu wymaga kilku powtórzonych studzienek. Rysunek 2A,B przedstawia 96-dołkowe płytki zaprojektowane dla czterech lub sześciu różnych warunków, z 21 lub 14 dołamkami replikowanymi i dwoma studzienkami kontrolnymi samolizy bez ślimaków. Biorąc pod uwagę dużą zmienność i stosunkowo niewielkie zmiany, których należy się spodziewać, 0,5-2,5-krotne zmiany w karmieniu są zwykle dolną i górną granicą. Zalecamy od 14 do 21 studzienek replikowanych dla każdego stanu i co najmniej dwóch studzienek kontrolnych samolizy, opisanych poniżej. Te kontrpróby są wystarczające do wygenerowania ilościowych krzywych dawka-odpowiedź dla leków, które zmieniają karmienie11,26.
Kontrole samolizy: 
OD600 mierzy liczbę cząstek w roztworze, w większości niezależnie od wielkości cząstek. Jednak martwe bakterie ulegną lizie, tracąc swój charakter cząsteczkowy. Nazywamy to samolizą, która zachodzi niezależnie w obecności robaków i obniża pomiary OD600 bez jedzenia przez robaki. Samoliza zachodzi podczas testu i musi być niezależnie mierzona w co najmniej dwóch studzienkach na warunek. Studnie te są traktowane tak samo jak inne w tym samym stanie, z wyjątkiem tego, że nie zawierają żadnych robaków. Odkryliśmy, że wiele leków może również zmieniać wskaźnik samolizy. W związku z tym każdy stan wymaga niezależnych studzienek kontrolnych samolizy o odpowiednim stężeniu. Rysunek 2 przedstawia konfigurację płytek dla czterech lub sześciu warunków ze wszystkimi studzienkami kontrolnymi samolizy na dole płytki w rzędzie H.
Populacja referencyjna N2: 
Zauważyliśmy również, że bezwzględna ilość spożywanych bakterii może się wahać między eksperymentami, najprawdopodobniej związana z jakością bakterii. Pomimo naszych najlepszych starań, aby za każdym razem przygotowywać je dokładnie w ten sam sposób, występują wahania. Na przykład bakterie mogą być zbierane w stanie podziału w fazie wzrostu logarytmicznego, a zatem mogą być znacznie większe niż bakterie zebrane w fazie stacjonarnej. W związku z tym te proste różnice w wielkości bakterii mogą prowadzić do zmian w liczbie spożywanych bakterii i różnych wartości OD600 , ponieważ pomiary OD600 nie rozróżniają rozmiarów. Z tego powodu zawsze uwzględniamy jedną populację nieleczonych zwierząt kontrolnych N2, które służą jako wartość referencyjna, ustawiona na 1 lub 100%, aby określić, czy grupy eksperymentalne jedzą więcej czy mniej niż grupa kontrolna N2. Ta praktyka umożliwia porównania między eksperymentami, nawet jeśli wartości OD600 są różne.
Przedziały czasowe: 
Użycie wartości OD600 do pomiaru spożycia pokarmu wymaga, aby stężenie bakterii spadło w mierzalny sposób. Ponieważ objętość hodowli jest znacznie większa niż w przypadku robaków, muszą one zjeść znaczną ilość bakterii, aby uzyskać wykrywalną różnicę. Utrzymanie w zakresie liniowym dla wartości OD600 wymaga, aby stężenie bakterii utrzymywało się między ~1 mg/ml a 10 mg/mL, tak aby znaczna ilość bakterii musiała zniknąć, aby je wykryć. Robaki jedzą najwięcej od późnego L4 do 4 dnia dorosłości ze względu na produkcję jaj. Dlatego ten interwał jest idealny. Krótsze interwały, takie jak 24 godziny, można zmierzyć11, ale jest to znacznie trudniejsze i wymaga ~40 dołków na warunek. Inną opcją pomiaru spożycia pokarmu przez larwy jest podwojenie liczby zwierząt w studzience. Jednak problem z tym podejściem polega na tym, że zbyt wiele robaków zacznie wpływać na odczyty OD600 , gdy dorosną.
Roztwory podstawowe dla leków, które mają być badane: 
Jeśli leki takie jak serotonina są testowane pod kątem ich zdolności do modulowania karmienia, podczas przygotowywania roztworów podstawowych należy wziąć pod uwagę następujące kwestie. Zazwyczaj przygotowujemy 50-krotny zapas dla leków rozpuszczalnych w wodzie i dodajemy 3 μl do każdego dołka (1:50), ale inne stężenia podstawowe (100x, 300x) również działają. Jeśli jednak leki są rozcieńczane w rozpuszczalnikach innych niż woda (np. DMSO), końcowe stężenie nie powinno przekraczać 0,5%. Rozpuszczalniki szybko stają się szkodliwe dla C. elegan. W związku z tym roztwory podstawowe leków rozpuszczonych w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak DMSO, muszą być 300x lub wyższe.
Punktacja żywych i martwych robaków: 
Określanie żywych i martwych zwierząt opiera się na ruchu robaka. Silne światło, zwłaszcza światło niebieskie, jest używane, ponieważ powoduje ruch zwierząt. Co więcej, ocena liczby zwierząt w studni ujawni, czy występuje nadmiarowa liczba zgonów. Nadmierne zgony mogą wystąpić w przypadku substancji toksycznych lub wysokich stężeń (>0,5%) kilku rozpuszczalników, w tym DMSO. Ogólnie rzecz biorąc, powinno być mniej niż 1:100 (1%) martwych zwierząt. Talerze można wstrząsać przez 30 s z prędkością 800 obr./min na wytrząsarce do płytek do mikromiareczkowania, jeśli żywność osiadła, a populacja staje się trudna do policzenia. Zignoruj studnie z samcami lub więcej niż 16 robakami (patrz problemy).
Potencjalne problemy:
Nieodpowiednie potrząsanie: 
W płynnym podłożu bakterie mogą łatwo zbrylać się i osadzać na dnie studzienek. Z naszego doświadczenia wynika, że potrząsanie przez mniej niż 20 minut może nie rozbić grudek bakteryjnych i spowodować ich ponowne zawieszenie, powodując niedokładne pomiary OD600 . Pomiary OD600 w obecności grudek bakteryjnych zaniżą stężenie bakterii. Nadmierne ustawienia wytrząsarki mogą spowodować przyklejenie się płynu do zgrzewarki. Po wyjęciu uszczelniacza w celu odczytu OD600 , płyn przyklejony do uszczelniacza spowoduje niższy odczyt OD600 . Jeśli na zgrzewarce znajduje się płyn, szybko zakręć płytką na niskich obrotach (500-1 000 obr./min) i ponownie potrząśnij przez 5 minut. Ponadto upewnij się, że zgodnie z odczytami z dnia 1 i dnia 4 przeczytałeś w ciągu 10 minut od potrząśnięcia płytkami, aby uniknąć osiedlenia się bakterii.
Różne bezwzględne wartości spożycia pokarmu między eksperymentami: 
Pomimo naszych najlepszych starań w celu standaryzacji preparatów bakteryjnych, często różnią się one sposobem, w jaki wpływają na przyjmowanie pokarmu przez robaki. Na przykład, ze względu na stan podziału, bakterie różnią się wielkością w zależności od tego, czy zostały zebrane w fazie wzrostu logarytmicznego, czy stacjonarnego, przy czym bakterie logarytmiczne są większe. Ze względu na to, że pomiary OD600 nie rozróżniają rozmiarów, różnice w wielkości bakterii wynikające z fazy, w której bakterie zostały zebrane, mogą prowadzić do pozornych różnic obserwowanych w podstawowym pobieraniu pokarmu między preparatami bakteryjnymi. Najlepszym sposobem porównywania eksperymentów jest zawsze uwzględnianie nieleczonej populacji kontrolnej N2 i normalizacja wyników do tej populacji N2.
Efekty zatłoczenia: 
Stężenie bakterii w tym protokole jest wystarczające, aby utrzymać OD600 w zakresie liniowym dla 2-16 robaków na studzienkę przez ~72 godziny. W zależności od interesującego leku, studzienka zawierająca więcej niż 16 robaków może obniżyć stężenie bakterii przed drugim pomiarem. Odkryliśmy również, że studnie z jednym zwierzęciem są zwykle zawodne. Czynnik lizy przeważa nad tym, co zjada pojedynczy robak. W związku z tym drobne błędy w określaniu współczynnika lizy nieproporcjonalnie wpływają na studnie z mniejszą liczbą robaków.
Zalecamy wyłączenie odwiertów z analiz statystycznych, jeśli spełniony jest jeden z poniższych warunków. W studni są samce (nie mamy danych porównujących spożycie pokarmu przez samce i hermafrodyty); w studni są mniej niż 2 robaki lub więcej niż 16 robaków w studni; Robaki są martwe w drugim czytaniu; lub jeśli w studniach znajduje się potomstwo, ponieważ FUdR zawiódł. FUdR jest wrażliwy na ciepło i dezaktywuje się nawet przy temperaturach tak niskich jak 37 °C. FUdR należy zawsze rozmrażać w wodzie o temperaturze pokojowej.
Ujemne wartości spożycia pokarmu:
Wartości spożycia pokarmu są czasami ujemne, co sugeruje więcej jedzenia w dniu 4 niż w dniu 1. Ujemne wartości spożycia pokarmu mogą wskazywać na jeden z następujących czynników: wysoki wskaźnik samolizy , prawdopodobnie spowodowany dodatkiem leku działającego na bakterie, lub ujemne wartości spożycia pokarmu, co może sugerować, że studnia jest skażona i rośnie w niej coś innego niż robaki. Wskaźniki samolizy również rosną wraz z wiekiem bakterii; Dlatego zalecamy stosowanie bakterii nie starszych niż tydzień. Dodano lek, który wytrąca się z czasem, wpływając na wartość OD600 . Niewystarczające potrząsanie w dniu 1 może prowadzić do niższego odczytu OD600 z powodu grudek bakteryjnych. Robaki zostały poddane stresowi hipoksyjnemu. Dzieje się tak, gdy stosunek powierzchni do powietrza nie jest wystarczający, aby umożliwić wymianę tlenu. Używaj specjalnej płytki 96-dołkowej w materiałach i nie przekraczaj 150 μl (120 μl + 30 μl FUdR) na studzienkę. Odległość między powierzchnią studni a dnem, w którym żyją robaki, określa stężenie tlenu.
Ograniczenia:
Ten test jest ograniczony do płynnej hodowli. Zachowania żywieniowe obserwowane na solidnych płytach, takie jak poruszanie się po trawnikach spożywczych i poza nimi, nie mogą być oceniane za pomocą testu.

Caenorhabditis elegans jest szeroko stosowany w badaniach nad starzeniem się. Był to potężny model do badania genetyki leżącej u podstaw długowieczności zależnej od metabolizmu, indukowanej ograniczeniami dietetycznymi, zmniejszoną aktywnością mitochondriów lub zmniejszoną sygnalizacją insuliny. 1,2,3,4,5,6,7. Jednak pomiar karmienia w kontekście długowieczności okazał się trudny dla C. elegans ze względu na mały rozmiar zwierzęcia 3,8,9,10,11,12,13,14,15.
Karmienie jest podstawowym zachowaniem biologicznym wymaganym do przetrwania, a jego ścisła regulacja leży u podstaw utrzymania zdrowia metabolicznego, reprodukcji i starzenia się. Zachowania żywieniowe są kontrolowane przez wiele szlaków sygnałowych zarówno w układzie nerwowym, jak i na obrzeżach, a zatem mogą być badane tylko in vivo 16,17,18,19. Odżywianie stanowi pierwszy z trzech filarów: (i) pobór energii, (ii) magazynowanie energii oraz (iii) wydatek energetyczny, który rządzi homeostazą energetyczną organizmu. Żerowanie u C. elegans badano głównie poprzez pomiar pompowania gardła, zdefiniowanego przez szybkość skurczów gardła. Podejście to dostarczyło kluczowych informacji na temat zachowań żywieniowych C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; Jednak pompowanie gardła, zwłaszcza mierzone w krótkich odstępach czasu, niekoniecznie jest skorelowane ze spożyciem pokarmu.
Spożycie pokarmu zależy nie tylko od szybkości pompowania przez gardło, ale także od takich parametrów, jak czas trwania i częstotliwość napadów karmienia oraz zagęszczenie bakterii pokarmowych. Zwierzę może mieć bardzo wysokie pompowanie gardło, ale długość jego napadów karmienia może być krótsza, co równoważy zwiększoną szybkość. Innym czynnikiem zakłócającym jest wydajność, z jaką pompowanie może, ale nie musi, połykać i mielić bakterie. Skrajnym przykładem odłączenia pobierania pokarmu od pompowania gardłowego jest dodanie serotoniny bez obecności pokarmu (bakterii). W obecności egzogennej serotoniny zwierzęta pompują z dużą prędkością, ale bez obecności bakterii, wysoka szybkość pompowania nie prowadzi do przyjmowania pokarmu 2,6,13,22,23.
Przedstawiona tutaj metoda usuwania bakterii mierzy pobieranie pokarmu przez populacje robaków w poszczególnych studzienkach jako spadek stężeń bakterii w czasie (ryc. 1). Podejście to jest podobne do tych stosowanych u innych gatunków, w których zniknięcie pokarmu stanowi miarę spożycia pokarmu 10,11,24,25,26,27,28. W oryginalnej publikacji zwalidowaliśmy tę metodę pomiaru spożycia pokarmu poprzez karmienie C. elegans bakteriami znakowanymi izotopem 15N11. Późniejsze pomiary za pomocą spektrometrii mas wykazały, że pomiar znikania bakterii silnie korelował z występowaniem znakowania izotopowego, ujawniając faktyczny wychwyt bakterii przez zwierzę11. W związku z tym jesteśmy przekonani, że test klirensu bakteryjnego reprezentuje przyjmowanie pokarmu w większości przypadków. Celem testu nie jest zastąpienie testu pompowania gardłowego, ale dodanie do zestawu narzędzi do badania karmienia i metabolizmu C. elegans oraz ich związku ze starzeniem się i długowiecznością.

<table><tbody><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>RPI</td><td>A40030-0.1</td><td>rozpuszczalnik: EtOH</td></tr><tr><td>Ampicyliny</td><td>Fisher Naukowy</td><td>BP176025</td><td>Rozpuszczalnik: woda</td></tr><tr><td>Pepton baktonowy</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>211677</td><td>służy do produkcji płyt NGM</td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>Fisher Naukowy</td><td>46-100-RG</td><td>Rozpuszczalnik: woda</td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Fisher Naukowy</td><td>22363547</td><td>40 i mikro; m, aby usunąć osoby dorosłe</td></tr><tr><td>Cholesterol&nbsp;</td><td>MP Biomedycyna</td><td>Numer katalogowy 02101380-CF</td><td>Zapas 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Difco, agar, bakteriologiczne</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>214510</td><td>służy do produkcji płyt NGM</td></tr><tr><td>Fluorodeoksyurydyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0503 powiedział:</td><td>do sterylizacji robaków na L4</td></tr><tr><td>Rosół z Lurii</td><td>RPI</td><td>L24045-1000.0</td><td>otwarta kapsułka, wymieszać z 1 l wody, autoklaw</td></tr><tr><td>Bufor M9&nbsp;</td><td>Przygotowane laboratorium</td><td></td><td>Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Aby przygotować 1 L: &nbsp; 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) &nbsp; 5 g NaCl (FW: 58), 0,25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) &nbsp; autoklaw</td></tr><tr><td>Zgrzewarka do mikropłytek</td><td>Fisher Naukowy</td><td>236707</td><td></td></tr><tr><td>Zobacz materiał OP50</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Talerz 96-dołkowy&nbsp;</td><td>Sokół</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Tecan (tekan)</td><td>30016056</td><td>Użyj obiektywu z filtrem 600 nm</td></tr><tr><td>Cytrynian potasu, 1 M, pH 6</td><td>Przygotowane laboratorium</td><td></td><td>Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Przygotowanie 1 L: 268,8 g cytrynianu potasu trójzasadowego jednowodnego (FW: 324) 26,3 g monohydratu kwasu cytrynowego (FW: 210) 900 ml dH2O pH do 6 przy użyciu 5 M autoklawu KOH &nbsp;</td></tr><tr><td>Fosforan potasu, 1 m, pH 6&nbsp;</td><td>Przygotowane laboratorium</td><td></td><td>Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Aby przygotować 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O &nbsp; pH do 6 przy użyciu autoklawu 5 M KOH </td></tr><tr><td>S-Podstawowy</td><td>Przygotowane laboratorium</td><td></td><td>Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Aby przygotować 1 L: 5,9 g NaCl (FW: 58) &nbsp; 50 ml 1 M fosforanu potasu (pH 6) dodać 900 ml autoklawu dH2O , schłodzić do 55 °; C</td></tr><tr><td>S-kompletny</td><td>Przygotowane laboratorium</td><td></td><td>Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Aby przygotować 1 l: Dodać do 1 l S-basal (schłodzony do 55 & stopni; C lub RT) &nbsp; 10 ml 1 M cytrynianu potasu &nbsp; pH 6, 10 ml roztworów metali śladowych &nbsp; 3 ml 1 M CaCl2 3 ml 1 M MgSO4</td></tr><tr><td>Chlorowodorek serotoniny</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAB2126309</td><td>używany przy 5 mM</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td>do wykonywania zderzaków i płyt NGM</td></tr><tr><td>Wspaniały rosół</td><td>Thermo Scientific</td><td>Zobacz materiał J75856-A1</td><td>12,5 g w 250 ml wody, autoklaw</td></tr><tr><td>Wytrząsarka z płytą mianowania</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880023</td><td>Wytrząsany przy 800 obr./min, w zależności od wytrząsarki</td></tr><tr><td>Roztwór metali śladowych&nbsp;</td><td>Przygotowane laboratorium</td><td></td><td>Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Aby przygotować 1 L: 1,86 g Na2EDTA (FW: 372,24) 0,69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) &nbsp; 0,20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0,29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) &nbsp; 0,016 g CuSO4 (FW: 158) autoklawu zawinąć w folię aluminiową, aby przechowywać w ciemności</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja spożycia pokarmu w caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Karmienie jest niezbędnym procesem biologicznym dla wzrostu, rozmnażania i przetrwania organizmu. Test ten ma na celu zmierzenie spożycia pokarmu przez Caenorhabditis elegans (C. elegans), ważny parametr podczas badania genetyki starzenia się lub metabolizmu. U większości gatunków żywienie określa się poprzez pomiar różnicy między ilością dostarczonego pokarmu a ilością pozostałą po określonym czasie. Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje tę samą strategię do określenia żywienia C. elegans. Mierzy ilość bakterii, źródła pożywienia C. elegans, usuniętych w ciągu 72 godzin. Metoda ta wykorzystuje 96-dołkowe płytki mikromiareczkowe i umożliwiła badanie przesiewowe setek leków pod kątem ich zdolności do modulowania przyjmowania pokarmu z prędkością i głębokością niemożliwą w innych modelach zwierzęcych. Mocną stroną tego testu jest to, że pozwala on na jednoczesny pomiar żerowania i długości życia oraz bezpośrednio mierzy zanik pokarmu, a zatem opiera się na tych samych zasadach, które są stosowane w przypadku innych organizmów, ułatwiając porównywanie między gatunkami.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig3_v1.jpg"> 
Rysunek 3: Dane reprezentatywne. (A) Wykres przedstawia krzywe dawka-odpowiedź zmiany krotności spożycia pokarmu w funkcji stężenia serotoniny. Wszystkie dane wskazują, że niestymulowane podstawowe spożycie pokarmu znormalizowane do nawożenia podstawowego N2. Należy zauważyć, że zwierzęta daf-16 (mu86) jedzą więcej niż dzikie typy N2, gdy nie dodano serotoniny, ale wykazują stępiony zakres w swojej zdolności do kontrolowania karmienia. (B) Wykres przedstawia wykres skrzypcowy zmiany fałdowania w przyjmowaniu pokarmu u robaków potraktowanych 50 μM przeciwpsychotycznej loksapiny, ale karmionych bakteriami zabitymi przez promieniowanie rentgenowskie, γ-promienie lub paraformaldehyd (C) Wykres pokazuje wykres skrzypcowy zmiany fałdowania w przyjmowaniu pokarmu przez różne mutanty z ich genotypami wskazanymi na osi x. Dane te sugerują, że mutanty exc-4 i cgr-1 jedzą mniej, podczas gdy mutanty srp-6 jedzą więcej. Gwiazdki reprezentują ** p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001 zgodnie z ustaleniami ANOVA i Browna-Forsythe'a-Welcha, skorygowanymi post hoc w celu uwzględnienia testów wielu hipotez. Słupki błędów pokazują ±S.E.M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig3large_v1.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Rysunek 1 przedstawia ogólny przebieg pracy tego protokołu. Ilustruje cały proces, od wytworzenia bakterii do uzyskania odczytu OD600 w dniu 1 i 4. Ponadto infografika odnosi się do konkretnych etapów stosowanych metod. Rysunek 2A, B pokazuje dwa możliwe eksperymentalne układy płytek, w tym studzienki kontrolne "bez robaków" w rzędzie H, niezbędne do obliczenia wskaźników samolizy opisanych w sekcji dyskusji. Z doświadczenia naszego laboratorium wynika, że konieczne jest, aby jeden z warunków, który nie był leczony, kontrola N2, aby uwzględnić zmienność spożycia bakterii przez robaki obserwowaną między eksperymentami (patrz dyskusja: Planowanie [populacja referencyjna N2]).
Rysunek 2C jest przykładem arkusza kalkulacyjnego używanego do analizy danych generowanych w tym protokole. Na zielono zaznaczona jest liczba robaków, na niebiesko samoliza , dzień 1 OD600 i dzień 4 OD600 na pomarańczowo, a spożycie pokarmu przez robaka na czerwono. Ponadto każdy studzienka jest śledzony pod kątem szczepu, leku, stężenia, daty eksperymentu i innych dodanych zabiegów. Więcej informacji na temat konkretnych stosowanych równań można znaleźć w rozdziale 3 protokołu. Ogólnie rzecz biorąc, te arkusze kalkulacyjne (szablon dostarczony jako materiały uzupełniające) zapewniają wydajne gromadzenie i analizę danych tego protokołu.
Rycina 3A przedstawia reprezentatywne wyniki dla krzywej dawka-odpowiedź pokazującej, w jaki sposób serotonina moduluje karmienie mutantów N2 i daf-16 przy użyciu tego protokołu. W tym eksperymencie zmiana krotności w stosunku do podstawowego spożycia pokarmu (pierwsza kropka na krzywej) została obliczona dla pięciu rosnących dawek serotoniny. Jak pokazują te wyniki, szczep N2 jest w stanie przejadać się w sposób zależny od dawki. Jednak w przypadku mutanta daf-16 (mu86), chociaż żywienie podstawowe jest wyższe niż N2, mutant nie może reagować na serotoninę w taki sam sposób zależny od dawki, jak szczep N2. Protokół ten pozwala nam określić zachowania żywieniowe między dwoma szczepami, w których stężenie serotoniny było zmiennym czynnikiem generującym krzywe dawka-odpowiedź. Rycina 3B przedstawia sposób przyjmowania pokarmu przez robaki leczone lekiem przeciwpsychotycznym loksapiną, ale karmione bakteriami zabitymi przez promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie γ lub paraformaldehyd. Należy zauważyć, że eksperymenty te nie były prowadzone równolegle i że różnice nie są reprezentatywne dla różnych metod zabijania bakterii, ale wynikają ze zmienności międzyeksperymentalnej. Rycina 3C przedstawia spożycie pokarmu przez szereg szczepów genetycznych, przy czym dwa szczepy wykazują spadek, a jeden szczep wykazuje wzrost zachowań żywieniowych w stosunku do N2. Takie zastosowanie protokołu umożliwia testowanie jednego leku w jednym stężeniu na różnych podłożach genetycznych. Nadaje się do identyfikacji tła genetycznego, które wykazuje inną reakcję na przyjmowanie pokarmu niż grupy kontrolne N2 typu dzikiego po podaniu tego samego leku. Można go sparować z naszym protokołem długości życia, aby szybko przebadać spożycie pokarmu i długość życia w tej samej konfiguracji talerzy31.
Materiał uzupełniający: Szablony arkuszy kalkulacyjnych pokazane na rysunku 2C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać te materiały.</a>

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Moje badania koncentrują się na zrozumieniu szlaków transkrypcyjnych i metabolicznych leżących u podstaw zmian w zachowaniach żywieniowych wywołanych przez leki. Pracuję nad identyfikacją leków, które obniżają spożycie pokarmu i wydłużają życie, co wskazuje na aktywację zdrowych ścieżek postu. Korzystając z naszego testu klirensu bakteryjnego, zidentyfikowaliśmy dwa odrębne szlaki, które modulują przyjmowanie pokarmu indukowane serotoniną i przyjmowanie pokarmów indukowane lekami przeciwpsychotycznymi.Obecnie badam, jak te szlaki odnoszą się do odżywiania i długowiecznych mutantów. Protokół ten pozwala naukowcom badać związek między karmieniem a długowiecznością. Szybkość karmienia zwykle charakteryzuje się pompowaniem gardłowym.Jednak szybkość pompowania u C.Elegans niekoniecznie jest proporcjonalna do ilości spożywanego pokarmu. Po dodaniu do tych poprzednich testów, protokół ten daje wymierną ilość spożycia pokarmu na populację robaków. Nasz test pozwala nam ilościowo modulować karmienie za pomocą małych cząsteczek i określić, w jaki sposób indukowana zmiana zmienia jednocześnie długość życia.Na początek zaszczepij pojedynczą kolonię OP50 w pięciomililitrach LB ampicyliną i amfoterycyną B i inkubuj przez około sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce bakteryjnej. Gdy kultura stanie się mętna, rozcieńczyć wstępnie zaszczepioną kulturę OP50 w stosunku 1:2 000 w 250 mililitrach gruźlicy ampicyliną i glicerolem. Następnie przenieś płynną kulturę OP50 do sterylnej probówki wirówkowej.Odwirować probówkę przez 15 minut w temperaturze 3,100 g w wirówce stołowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulat OP50 w sterylnej wodzie przed ponownym odwirowaniem. Po drugim przemyciu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulat OP50 w sterylnej wodzie do objętości 50 mililitrów.Przenieś go do wstępnie zważonej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów Probówka wirówkowa na 20 minut, aby granulować OP50. Pod koniec wirowania ostrożnie usunąć cały pozostały supernatant, upewniając się, że w probówce nie pozostała woda. Obliczyć masę osadu, odejmując masę pustej probówki wirówkowej od masy probówki wirówkowej z osadem.Dokładnie zawiesić granulat OP50 w buforze S-Complete, aby osiągnąć stężenie 100 miligramów na mililitr. Przetestuj zawiesinę OP50 na płytce agarowej, aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczeń. Zawiesinę OP50 należy przechowywać w buforze S-Complete Buffer w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby rozpocząć, wybierz pożywkę wzrostową nicieni lub płytkę NGM zajętą przez wygłodzone larwy Caenorhabditis elegans w stadium L1. Używając jednego mililitra sterylnej wody, delikatnie zmyj robaki z talerza. Podwielokrotność około 300 mikrolitrów populacji robaków na płytki NGM wysiane skoncentrowanym OP50.Pozostaw płytki do wyschnięcia za pomocą suszarki płytowej lub palnika Bunsena, a następnie inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż znaczna populacja stanie się ciężarnymi dorosłymi osobnikami. Aby zebrać robaki, zmyj je z talerza do 10 mililitrów sterylnej wody i przenieś mieszaninę wody z robakami do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Pozwól robakom osiąść grawitacyjnie na dnie rurki przez około cztery minuty.Używając małej końcówki do pipety, ostrożnie nacisnąć i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj do 15 mililitrów sterylnej wody. Po ostatnim umyciu usuń supernatant i dodaj pięć mililitrów świeżo przygotowanego roztworu wybielacza i wodorotlenku sodu.Wysiaduj robaki przez pięć minut w temperaturze pokojowej, wirując co minutę przez co najmniej 10 sekund. Monitoruj postęp za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Gdy wszystkie dorosłe osobniki otworzą się lub rozpuszczą, dodaj bufor M9, aby zneutralizować reakcję, doprowadzając końcową objętość do 15 mililitrów.Następnie odwirować probówkę przez dwie minuty przy stężeniu 1,300 g. Umyj jaja jeszcze dwa razy 13 mililitrami buforu M9 przez odwirowanie, a następnie ponownie umyj 15 mililitrami buforu S-Complete. Następnie odwirować jajka przez dwie minuty w temperaturze 1 300 g.Po odwirowaniu odessać supernatant i dodać 10 mililitrów buforu S-Complete. Delikatnie obróć rurkę w temperaturze pokojowej przez noc za pomocą mutatora lub podobnego urządzenia. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego oceń, czy robaki się wykluły.Policz robaki w 10 mikrolitrowych kroplach buforu S pod mikroskopem. Przygotować płynną mieszaninę robaków z 60 robakami na mililitr w pożywce S-Complete zawierającej karbenicylinę, amfoterycynę B i OP50. Dodaj 120 mikrolitrów pożywki ze ślimakami do rzędów od A do G i bez robaków pożywki do rzędu H. Następnie uszczelnij płytkę uszczelniaczem taśmowym, aby zapobiec zanieczyszczeniu i parowaniu.Inkubować szczelnie zamknięte płytki przez około 65 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż zwierzęta staną się robakami L4. Dodaj 30 mikrolitrów 0,6-milimolowego roztworu podstawowego fluoro-deoksyurydyny do każdej studzienki, aby wysterylizować zwierzęta na etapie L4. Ponownie uszczelnić płytkę za pomocą taśmy uszczelniającej i mieszać ją przez 20 minut z prędkością 800 obr./min na wytrząsarce do płytek do mikromiareczkowania.Włóż płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj interesujący lek do kultury robaków dnia 1. Ponownie uszczelnij płytki taśmą uszczelniającą i potrząsaj przez 20 minut z prędkością 800 obr./min na wytrząsarce do płyt.Następnie, po zdjęciu pokrywy i uszczelki, zmierz OD600 w czytniku płytek do pomiaru dnia 1. Ponownie zamknij płytki i umieść je z powrotem w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Za pomocą odwróconego mikroskopu, najlepiej z obiektywem 2x, policz populację robaków w każdej studzience i zapisz liczby w arkuszu kalkulacyjnym.Po zliczeniu włóż płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Krzywe dawka-odpowiedź zmiany krotności spożycia pokarmu w funkcji stężenia serotoniny wykazały, że szczep N2 może przejadać się w sposób zależny od dawki. Mutant daf-16 mu86 wykazuje wyższe żywienie podstawowe niż N2. Nie może jednak reagować na serotoninę w taki sam sposób zależny od dawki, jak szczep N2.Zaobserwowano istotną różnicę w przyjmowaniu pokarmu przez robaki leczone loksapiną, ale karmione bakteriami zabitymi przez promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie gamma lub paraformaldehyd. Porównanie spożycia pokarmu przez szereg szczepów genetycznych pokazuje, że mutanty exc-4 i cgr-1 jedzą mniej, podczas gdy mutanty srp-6 jedzą więcej.

quantifying-food-intake-caenorhabditis-elegans-measuring-bacterial

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ten film przedstawia metodę wizualizacji i pomiaru integralności światła jelita C. elegans poprzez karmienie robaków dekstranem znakowanym FITC. Przykładowy protokół pokazuje test wykonany na robakach 3,3'-diindolilometanu (DIM) i karmionych patogenami.

Karmienie FITC-dekstranem: metoda ilościowego określania przepuszczalności jelit u C. elegans

Źródło: Taylor, M. N., et.al. Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności interakcji Caenorhabditis elegans z bakteriami. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje narażenie wolnych od zarazków, dopasowanych do wieku robaków Caenorhabditis elegans na szczep bakteryjny w celu kolonizacji jelit. Wyjaśnia selektywne usuwanie nieprzylegających i zewnętrznych bakterii, pozostawiając tylko żywe bakterie przylegające do nabłonka jelitowego w celu...

Ocena kolonizacji bakteryjnej jelit u C. elegans wolnych od zarazków

Źródło: Le, T. A. N., i in., Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Jelit of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje test oparty na fluorescencji mającycy na celu ilościową przepuszczalność jelit u osób C. elegans, które były narażone na Pseudomonas aeruginosa. W porównaniu z kontrolami karmionymi Escherichia coli, robaki poddane patogenom wykazują zwiększoną przeciekliwość fluoroforu do jamy ciała, co wskazuje na uszkodzenie bariery nabłonkowej.

Ocena przepuszczalności jelit u C. elegans po ekspozycji na bakterie

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru obciążenia bakteriami E. coli po wstrzyknięciu E. coli do klatki piersiowej Drosophila melanogaster.

Pomiar obciążenia bakteryjnego E. coli u Drosophila melanogaster po zakażeniu E. coli

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje, jak mierzyć przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest pomocna w podstawowych badaniach biologicznych nad zdrowiem jelit związanych z interakcją między bakteriami jelitowymi a ich gospodarzem oraz w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji czynników probiotycznych i chemicznych w leczeniu zespołu nieszczelnego jelita i chorób zapalnych jelit.

Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Opisana jest procedura, która pozwala na demonstrację solidnego wspomagania poszukiwania narkotyków u szczurów z ograniczeniami żywieniowymi. Po szkoleniu w zakresie samodzielnego podawania heroiny, szczury przechodzą przez okres abstynencji w środowisku wolnym od narkotyków, podczas którego są łagodnie ograniczane w jedzeniu. Poszukiwanie narkotyków jest następnie testowane w środowisku związanym z narkotykami.

Procedura mająca na celu zbadanie wpływu długotrwałego ograniczenia pokarmowego na poszukiwanie heroiny u szczurów abstynentów

Poznaj metodę kwantyfikacji spożycia pokarmu u Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego w hodowli ciekłej. Protokół umożliwia badanie związku między zachowaniem pokarmowym a długością życia.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Przeglądaj więcej filmów