Name: Izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 44 s
Description: Poznaj metodę izolacji mutantów o zerowej interakcji przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży w badaniach cyklu komórkowego eukariotów. Technika ta umożliwia zrozumienie funkcji kinaz zależnych od cyklin w regulacji replikacji DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Y. Tanaka przeprowadził techniczne ulepszenie Y2H. Prace te są wspierane przez JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 oraz Instytut Fermentacji w Osace.

1. Budowa biblioteki mutantów
<ol>
	<li>Ustaw reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) (przykład pokazano poniżej). Ogólnie rzecz biorąc, należy przygotować 50 μl reakcji, która jest podzielona na dziesięć podwielokrotności po 5 μl, i amplifikować docelowy fragment genu w maszynie do PCR4. 
	UWAGA: Użytkownicy powinni dobrać odpowiednią polimerazę, aby skutecznie wprowadzać mutacje. Jeśli fragment DNA, który ma być amplifikowany, jest krótki, potrzebna jest polimeraza o wyższym wskaźniku błędów, taka jak polimeraza Taq, która nie ma aktywności korektorskiej. Jeśli fragment DNA, który ma być amplifikowany, jest długi, potrzebna jest polimeraza o wyższej wierności, aby zmniejszyć liczbę mutacji. Mutacje zachodzą co kilkaset par zasad po 30 cyklach amplifikacji zwykłą polimerazą Taq4. W wynikach reprezentatywnych zastosowano inną polimerazę Taq (patrz tabela materiałów), która ma wyższą wierność niż zwykła polimeraza Taq, a częstość mutacji wynosiła jedną na 600 par zasad. Przykład mieszanin PCR, szczegółowe informacje na temat startera i warunki reakcji znajdują się w pliku uzupełniającym 1.</li>
	<li>Po zakończeniu PCR połącz wszystkie podwielokrotności reakcji, potwierdź, że interesujące nas fragmenty DNA zostały amplifikowane za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym itp., a następnie oczyść DNA5.</li>
	<li>Złóż fragment DNA wygenerowany w kroku 1.2 z odpowiednim wektorem Y2H, stosując "bezszwową" strategię klonowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Bezproblemowy system klonowania, taki jak Gibson assembly6, minimalizuje zanieczyszczenie skonstruowanej biblioteki mutantów pustymi wektorami generowanymi przez samoligację. Lista wektorów Y2H znajduje się w tabeli 1. Można je przygotować przez trawienie BamHI przed montażem. Wszystkie plazmidy są dostępne w National BioResource Project - drożdże (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wprowadzić mieszaninę reakcyjną wytworzoną w kroku 1.3 do komórek kompetentnych Escherichia coli przygotowanych zgodnie z wysoce wydajnym protokołem transformacji E. coli (np. Inoue i wsp.7). Rozłóż wszystkie kompetentne komórki na kilku płytkach LB (1% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 1% NaCl i 2% agaru) zawierających odpowiednie antybiotyki (patrz Tabela materiałów). W tym momencie rozprowadź niewielką ilość (~1/100 całkowitej reakcji) na tej samej płytce selekcyjnej, aby obliczyć miano biblioteki. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Gdy pojawi się duża liczba kolonii E. coli, zeskrob wszystkie komórki z powierzchni płytki za pomocą jednorazowej plastikowej pętli. Odzyskaj plazmidowe DNA z tych komórek za pomocą popularnych metod, takich jak alkaliczna liza8. W tym samym czasie policz liczbę kolonii, które pojawiają się po rozprowadzeniu małych porcji mieszaniny transformacyjnej na płytce. Korzystając z tej liczby, oszacuj całkowitą liczbę niezależnych klonów w bibliotece. 
	UWAGA: W tym momencie zbierz kilka niezależnych kolonii (4-6), które pojawiają się na płytce, na której rozprowadzono małe porcje reakcji transformacji, hoduj je oddzielnie i wyizoluj z nich plazmidy, aby potwierdzić, że praktycznie wszystkie klony zawierają pożądane fragmenty DNA5. Dostępnych jest wiele komercyjnych zestawów do izolowania plazmidów z E. coli. Liczbę kolonii, które pojawiają się na talerzu po rozrzuceniu małych porcji, można policzyć ręcznie.</li>
	<li>Zmierz stężenie w puli DNA biblioteki. Zazwyczaj kilkaset nanogramów bibliotecznego DNA wystarcza do uzyskania kilku tysięcy transformantów w kolejnym kroku. 
	UWAGA: Zaleca się pomiar stężenia DNA za pomocą barwnika fluorescencyjnego, który wiąże się z DNA, ponieważ pomiar A260 jest często niedokładny.</li>
</ol>
2. Transformacja drożdży za pomocą biblioteki mutantów i posiewu repliki
<ol>
	<li>Wprowadź zmutowaną bibliotekę do szczepu drożdży gospodarza (TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ) do testu Y2H przy użyciu około 100 ng DNA. Wstępnie przekształc komórki gospodarza za pomocą plazmidu "przynęty".
	<ol>
		<li>Po procedurze przemiany zawiesić komórki drożdży w sterylnej wodzie i rozprowadzić porcje o różnych ilościach na odpowiednich płytkach (zwykle pożywka SC pozbawiona leucyny i tryptofanu: SC-LW [0,67% drożdżowej bazy azotowej, 2% glukozy, 1,546 g/L SC double drop-out mix -Leu -Trp, i 2% agar, patrz Tabela Materiałów]). Inkubować te płytki przez noc w temperaturze 30 °C. 
		UWAGA: Standardowy protokół, taki jak metoda octanu litu-PEG11 z ~5 × 106 logarytmicznie rosnącymi komórkami, jest wystarczający do transformacji drożdży. Można również zastosować inną metodę o wysokiej sprawności przemiany, taką jak elektroporacja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia, gdy pojawią się maleńkie kolonie, wybierz płytki z odpowiednią liczbą komórek (500-2000) i wykonaj z nich repliki w następujący sposób.</li>
	<li>Umieść dwa arkusze bibuły filtracyjnej na bloku repliki, aby wykonać kilka replik (medium to SC-LW i SC-LW zawierające kanamycynę) (patrz Tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 30 °C przez 1-2 dni. 
	UWAGA: Stężenie kanamycyny (G418) wynosi 600 μg/ml. Nie używaj aksamitu do powlekania replik, ponieważ rozdzielczość kolonii zostanie utracona.</li>
	<li>Gdy kolonie wyrosną, porównaj talerze i wybierz kandydatów. Wykonaj test koloru Y2H (patrz krok 3), jeśli lacZ jest używany jako reporter. 
	UWAGA: W przypadku reportera Y2H, lacZ jest zwykle lepszy w wykrywaniu słabych oddziaływań niż HIS3.</li>
</ol>
3. Test koloru Y2H
<ol>
	<li>Umieść arkusz bibuły filtracyjnej przycięty wcześniej do odpowiedniego rozmiaru na płycie repliki przygotowanej w kroku 2. Należy uważać, aby między bibułą filtracyjną a płytką nie tworzyły się pęcherzyki powietrza. 
	UWAGA: Użyj bibuły filtracyjnej nr 4A lub bibuły filtracyjnej klasy 50 (patrz tabela materiałów). Do testu barwy można użyć dowolnych płytek SC-LW lub SC-LW zawierających kanamycynę, które są wytwarzane przez replikowanie posiewu.</li>
	<li>Gdy bibuła filtracyjna na talerzu jest całkowicie zwilżona (gdy kolor bibuły filtracyjnej całkowicie się zmieni), połóż kilka arkuszy ręcznika papierowego na wierzchu i doprowadź go do kontaktu z bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar wilgoci. Zdejmij ręcznik papierowy, gdy wchłonie wodę i zmieni kolor. Powtórz ten proces dwa lub trzy razy.</li>
	<li>Podnieś krawędzie bibuły filtracyjnej pęsetą, szybko oderwij ją od płytki, zanurz w ciekłym azocie i zamroź. Jeśli ciekły azot nie jest dostępny, umieść bibułę filtracyjną na plastikowej tacy stroną z kolonią do góry i natychmiast umieść ją w zamrażarce (-20 °C do -80 °C) do całkowitego zamrożenia.</li>
	<li>Wyjmij zamrożoną bibułę filtracyjną i umieść ją kolonią do góry na suchym ręczniku papierowym do rozmrożenia. Natychmiast po rozmrożeniu umieścić bibułę filtracyjną stroną z kolonią do góry na innej bibule filtracyjnej, która została umieszczona na plastikowej tacy lub zamykanym pojemniku i nasączona buforem Z (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl i 1 mMMgSO4, pH 7,0) zawierającą X-gal (5-bromo-5-chloro-3-indolilo-β-D-galaktozyd) i 2-merkaptoetanol9 (patrz Tabela materiałów). Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza między górną i dolną bibułą filtracyjną.</li>
	<li>Przykryj plastikową tackę zawierającą bibułę filtracyjną i włóż ją do hermetycznego pojemnika lub plastikowej torby. Zamknąć hermetyczny pojemnik lub plastikową torbę i inkubować w temperaturze 37 °C, aż pojawi się niebieski kolor.</li>
	<li>Gdy pojawi się niebieski kolor, umieść bibułę filtracyjną stroną z kolonią do góry na około 500 μl roztworu zatrzymującego (1 M Na2CO3) umieszczonego na czystej plastikowej tacce. Roztwór zatrzymujący szybko wsiąka; Dlatego natychmiast wyjmij filtr, połóż go na świeżym ręczniku papierowym stroną z kolonią do góry i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	<li>Po wymianie ręcznika papierowego i wyschnięciu filtra użyj skanera lub innego urządzenia, aby przechwycić dane.</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie i potwierdzanie kandydatów na klony
<ol>
	<li>Wybierz białe i kandydujące klony KanR z oryginalnej tabliczki repliki (lub zduplikowanej płytki, która nie jest używana do testu koloru). Przykłady są pokazane w Rysunek 1C. Potwierdzić, że kandydujące klony są białe i KanR, ponownie nanosząc je jako mały plaster na pożywce SC-LW zawierającej kanamycynę i inkubując je w temperaturze 30 °C przez 1-2 dni. Wykonaj co najmniej dwie serie lub powtórz je następnego dnia. 
	UWAGA: Białe kolonie powinny być wybierane, ponieważ bladoniebieskie kolonie mogą zachować interakcję.</li>
	<li>Gdy potencjalne klony dobrze odrosną, powtórz test koloru z co najmniej jedną płytką wygenerowaną w kroku 4.1, jak opisano w kroku 3, i potwierdź, że pozostają białe i nie zmieniają koloru na niebieski (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: Podczas ponownego nakładania pasków na kandydatów nie należy przenosić dużych ilości komórek. Zbyt wiele komórek uniemożliwia rozróżnienie klonów KanR i KanS.</li>
	<li>Weź klony, które są nadal białe i KanR wygenerowany w kroku 4.2 z resztek płytki i hoduj je niezależnie w 1 ml pożywki selekcyjnej (SC-L lub SC-W, w zależności od tego, który wektor jest używany do budowy biblioteki) przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Przenieś kulturę do mikroprobówki i zbierz komórki przez odwirowanie (~15 000 × g, przez 10-30 sekund w temperaturze pokojowej). Wyizoluj całe DNA z osadu komórkowego w następujący sposób.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu do lizy (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8,0) i 1 mM EDTA) zawierającym po 1 μl 2-merkaptoetanolu i 20 mg/ml zymoliazy 100T (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu wytrawienia ścian komórkowych. W tym czasie delikatnie mieszaj, odwracając probówkę co 5-10 minut.</li>
	<li>Gdy zawiesina komórek stanie się nieprzezroczysta lub przezroczysta, dodać równą objętość mieszaniny alkoholu fenolowo-chloroformowo-izoamylowego (25:24:1) i dobrze wymieszać, wirując z umiarkowaną prędkością przez 10-20 s.</li>
	<li>Odwirować mikroprobówki w mikrowirówce przez 5 minut na pełnych obrotach (~15 000 × g, w temperaturze pokojowej) i odzyskać fazę wodną zawierającą DNA w nowej mikroprobówce. Dodać 0,8 objętości izopropanolu i dobrze wymieszać, odwracając rurkę.</li>
	<li>Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na 2-3 minuty, a następnie odwiruj w mikrowirówce przez 4-5 minut na pełnych obrotach (~15 000 × g, w temperaturze pokojowej), aby wytrącić DNA.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć osad około 500 μl 70% etanolu. Całkowicie usunąć etanol i krótko wysuszyć osad.</li>
	<li>Dodać 20 μl buforu TE (10 mM Tris-Cl (8,0) i 1 mM EDTA) do osadu, krótko wymieszać i pozostawić probówkę na noc w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia osadu. 
	UWAGA: Jeśli użytkownicy się spieszą, utrzymuj probówki w temperaturze 37-50 °C. Osad DNA rozpuści się w ciągu kilku godzin.</li>
	<li>Gdy osad całkowicie się rozpuści, przekształć E. coli za pomocą niewielkiej ilości tego roztworu DNA. 
	UWAGA: Około 0,5 μl roztworu DNA jest wystarczające, jeśli stosuje się E. coli o wysokiej wydajności transformacji.</li>
	<li>Kiedy pojawią się kolonie E. coli, wybierz kilka niezależnych kolonii, hoduj je i odzyskuj plazmidy standardowymi metodami, takimi jak liza alkaliczna.</li>
	<li>Wprowadzić plazmidowe DNA uzyskane w kroku 4.12 do komórek gospodarza Y2H, w których znajduje się plazmid przynęty. Gdy pojawią się transformanty, sprawdź je za pomocą testu kolorów (powinny wyglądać na białe) i western blotting4 (powinny wyrażać białko o pożądanej wielkości). 
	UWAGA: Metoda postalkaliczna12 to łatwy i szybki sposób na przygotowanie ekstraktu z całych komórek drożdży.</li>
	<li>Jeśli powyższe dwa kryteria są spełnione, określ miejsce mutacji klonów za pomocą sekwencjonowania nukleotydów4.</li>
</ol>

Biomolecular Interaction Studies Using Yeast Two-Hybrid Technique 

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Leanna, C. A., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reverse+two-hybrid+system%3A+A+genetic+scheme+for+selection+against+specific+protein%2Fprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).</li>
<li>Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+two-hybrid+and+one-hybrid+systems+to+detect+dissociation+of+protein-protein+and+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).</li>
<li>Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+isolation+of+interaction-null%2Fimpaired+mutants+using+the+yeast+two-hybrid+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the isolation of interaction-null/impaired mutants using the yeast two-hybrid technique.</a> Genes Cells. 24 (12), 781-788 (2019).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual.+4th+edn%22">Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edn</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li>
<li>Bartel, P. L., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein-protein+interactions+using+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system.</a> Meth Enzymol. 254, 241-263 (1995).</li>
<li>Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li>
<li>Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+associates+with+the+loaded+DNA+helicase+at+replication+origins+and+defines+a+novel+step+in+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation.</a> EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).</li>
<li>Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+plays+a+role+in+functioning+of+the+eukaryotic+replicative+DNA+helicase%2C+cdc45-mcm-gins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins.</a> Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).</li>
<li>Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-initiation+complex+assembly+functions+as+a+molecular+switch+that+splits+the+mcm2-7+double+hexamer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer.</a> EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

W tym artykule opisano, jak wyizolować mutanty o zerowej interakcji/upośledzonej przy użyciu testu Y2H. Takie mutanty są potężnymi narzędziami do analizy funkcji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Aby wyizolować takie mutanty, wcześniej opracowano testy rY2H poprzez modyfikację szczepu gospodarzaY2H 2,3. Nie zmniejszyły jednak znacznie ilości pracy. W przeciwieństwie do tego, mutanty można wyizolować tą metodą bez znacznego nakładu pracy. W tej metodzie...

Interakcje między biomolekułami są najbardziej podstawową częścią zjawisk biologicznych. Oddziaływania białko-białko stanowią istotną część takich interakcji. W związku z tym identyfikacja partnera (partnerów) interakcji białka będącego przedmiotem zainteresowania ma kluczowe znaczenie dla dalszego wyjaśnienia funkcji białka/genu będącego przedmiotem zainteresowania. Metoda dwuhybrydowa drożdży (Y2H) jest popularną techniką identyfikacji interakcji białko-białko in vivo1. W tym systemie dwa białka (X i Y), których interakcja ma być badana, są połączone odpowiednio z domeną wiążącą DNA (DB) i domeną aktywacji transkrypcyjnej (AD). Białko fuzyjne DB-X wiąże się z sekwencją rozpoznającą domenę DB; w związku z tym, gdy białka X i Y oddziałują na siebie, białko fuzyjne AD-Y znajduje się w pobliżu sekwencji rozpoznawania. W związku z tym aktywowana jest transkrypcja genu reporterowego za sekwencją rozpoznawania. W związku z tym obecność lub brak aktywności genu reporterowego może być wykorzystana do określenia obecności lub braku interakcji białko-białko1.
Po zidentyfikowaniu konkretnego partnera interakcji interesującego białka, należy przeprowadzić dalsze analizy, aby wyjaśnić biologiczną funkcję tej interakcji. W tym celu, jeśli uda się wyizolować mutanty białek, które upośledzają lub usuwają specyficzną interakcję białko-białko, posłużą one jako potężne narzędzia. System Y2H może być używany bezpośrednio do izolowania takich mutantów poprzez badania przesiewowe klonów "ujemnych pod względem interakcji", zaczynając od klonu typu dzikiego "dodatniego pod względem interakcji". Aby przyspieszyć ten proces, opracowano systemy "odwrócone" Y2H (rY2H)2,3. W systemach rY2H szczepy drożdży gospodarza zawierają geny markerowe podlegające kontrselekcji jako geny reporterowe, co oznacza, że komórki drożdży rosną tylko wtedy, gdy białka AD-Y i DB-X nie wchodzą w interakcje.
Chociaż zarówno systemy Y2H, jak i rY2H pozwalają na izolację mutantów negatywnych pod względem interakcji, proces izolowania mutantów jest pracochłonny, ponieważ nie wszyscy kandydaci uzyskani przez badania przesiewowe posiadają pożądany typ mutacji (zwykle mutacje typu missense). Najpoważniejszym problemem jest to, że znaczna część kandydatów jest nosicielami mutacji z przesunięciem ramki odczytu lub mutacji nonsensownych i konieczne jest przeprowadzenie western blotting w celu wykluczenia niepożądanych klonów. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowano nowe wektory plazmidowe4. W tych wektorach KanMX, marker oporności na leki, jest umieszczony poza ramką za domeną DB lub AD. Gen markerowy staje się w ramce z domeną DB lub AD tylko wtedy, gdy wstawiony jest gen będący przedmiotem zainteresowania. Gdy losowa mutacja (mutacje) zostanie wprowadzona do genu będącego przedmiotem zainteresowania, niepożądane mutanty, takie jak te z mutacjami z przesunięciem ramki odczytu lub mutacjami nonsensownymi, mogą być łatwo wyeliminowane przez przeprowadzenie selekcji oporności na leki, a kandydaci z pożądanymi mutacjami missense mogą być łatwo zidentyfikowani za pomocą Y2H screen4. W artykule przedstawiono protokół izolacji mutantów o zerowej/upośledzonej interakcji białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej strategii.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA (8.0)</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>14347-21</td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór SDS</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>313-90275</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>135-07522</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Kishida Chemical Co., Ltd.</td><td>110-64785</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolilo-&beta;-D-galaktopyranozyd (X-Gal)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>021-07852</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGR60</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina Sodowa</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>68-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Znacznik anty-HA mAb-HRP-DirecT&nbsp; &nbsp;</td><td>Medycyna & Laboratoria Biologiczne Co. Sp. z o.o.</td><td>DNA M180-7</td><td></td></tr><tr><td>z jąder łososia</td><td>Merck KGaA.</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck KGaA.</td><td>9-0770-4-4L-J</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna do podnoszenia kolonii (klasa 50)</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>1450-090</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna do podnoszenia kolonii (nr 4A)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>01411090</tr><tr><td>Bibuła filtracyjna do replikowania (nr 1)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>00011150</tr><tr><td>Siarczan G-418</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>075-05962</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Kishida Chemical Co., Ltd.</td><td>230-37585</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Octan litu dwuwodny</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>20604-22</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 byk; 7H2O</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>131-00405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&byk; 12H2O</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>10039-32-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>31319-45</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&byk; 2H2O</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>31717-25</td><td></td></tr><tr><td>Ręcznik papierowy</td><td>AS ONE Corp.</td><td>7-6200-02</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy 25:24:1</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>25970-56</td><td></td></tr><tr><td>DNAs plazmidowe,</td><td>National BioResource Project - zestaw do izolacji plazmidu drożdży (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml),</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Nippon Genetics Co., Ltd.</td><td>FG-90502</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy # 4,000</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>11574-15</td><td></td></tr><tr><td>SC double drop-out mix -Leu -Trp</td><td>Formedium</td><td>DSCK172</td><td></td></tr><tr><td>Bezszwowy zestaw do klonowania (montaż In-Fusion)</td> <td>Takara Bio Inc.</td><td>#639648</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>190-12865</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza Taq (GoTaq Green Master Mixes)</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (hydroksymetylo)aminometan</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>12967-45</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowa zasada azotowa (YNB)</td><td>Formedium</td><td>CYN0210</td><td></td></tr><tr><td>Zymoliaza 100T</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>Numer katalogowy: 07665-55</td><td></td></tr></tbody></table>

izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Interakcje białko-białko są jednym z najbardziej podstawowych procesów leżących u podstaw zjawisk biologicznych. Jednym z najprostszych i najlepszych sposobów zrozumienia roli i funkcji określonej interakcji białko-białko jest porównanie fenotypu dzikiego (z odpowiednią interakcją białko-białko) i fenotypów mutantów, które nie mają odpowiedniej interakcji. Dlatego, jeśli takie mutanty można wyizolować, pomogą one wyjaśnić powiązane procesy biologiczne. Procedura dwuhybrydowa (Y2H) drożdży jest skutecznym podejściem nie tylko do wykrywania interakcji białko-białko, ale także do izolowania mutantów o zerowej/upośledzonej interakcji. W tym artykule przedstawiono protokół izolacji mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu technologii Y2H. Po pierwsze, biblioteka mutacji jest konstruowana poprzez połączenie reakcji łańcuchowej polimerazy i wydajnej technologii bezszwowego klonowania, która skutecznie wyklucza pusty wektor z biblioteki. Po drugie, mutanty bez interakcji/z upośledzoną interakcją są badane przesiewowo za pomocą testu Y2H. Ze względu na sztuczkę w wektorze Y2H, niepożądane mutanty, takie jak te z mutacjami z przesunięciem ramki odczytu i nonsensownymi mutacjami, są skutecznie eliminowane z procesu przesiewowego. Strategia ta jest prosta i dlatego może być stosowana do dowolnej kombinacji białek, których interakcja może być wykryta przez system dwuhybrydowy.

Niedawno odkryto, że połowa C-końcowa białka Pol2 (Pol2-C) oddziałuje z Mcm10. Oba białka są niezbędne do inicjacji replikacji DNA, a tym samym do wzrostu komórek drożdży pączkujących Saccharomyces cerevisiae13,14,15. Aby pomóc w zrozumieniu biologicznego znaczenia tej interakcji, przy użyciu opisanej tutaj metody wyizolowano mutanty Pol2-C, które nie wykazują lub wykazują osłabioną interakcję z Mcm10.
<p class="jov...

Interakcje biomolekuł, takie jak interakcje białko-białko, są molekularną podstawą funkcji biologicznych. Jeśli uda się wyizolować mutanty bez interakcji/upośledzone, które specyficznie nie mają odpowiedniej interakcji, znacznie pomogą one w zrozumieniu funkcji tej interakcji. W tym artykule przedstawiono skuteczny sposób izolowania mutantów bez interakcji/z upośledzeniem.

Izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem mechanizmów regulacyjnych cyklu komórkowego u eukariontów, zwłaszcza związku między replikacją DNA, stabilnym utrzymaniem zarazków i proliferacją komórek. Postęp cyklu komórkowego jest regulowany przez kinazy zależne od cyklin lub CDK u eukariontów. Dzieje się tak w przypadku inicjacji replikacji DNA.Zidentyfikowaliśmy sposób, na substratach CDK, na zainicjowanie replikacji DNA. Aby zrozumieć funkcję białka, które Cię interesuje, porównanie typu dzikiego i zmutowanego jest bezpośrednim i skutecznym sposobem. Test dwuhybrydowy drożdży, będący prostym wykrywaniem i usprawni proces izolacji mutantów o zerowej interakcji.Przyczyni się to do postępu badań w tej dziedzinie.

isolating-interaction-nullimpaired-mutants-using-yeast-two-hybrid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda MYTH umożliwia czułą detekcję przejściowych i trwałych oddziaływań między białkami ekspresowanymi w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae. Została ona z powodzeniem zastosowana do badania egzogennych oraz drożdżowych białek błonowych w celu wysokoprzepustowej identyfikacji ich partnerów interakcji.

System błonowego dwuhybrydowego badania drożdży (MYTH) oparty na rozszczepionej ubikwitynie: potężne narzędzie do identyfikacji oddziaływań białko-białko

Zmodyfikowaliśmy konwencjonalny screening dwuhybrydowy drożdżowy, który jest skutecznym narzędziem genetycznym w identyfikacji oddziaływań białkowych. Modyfikacja ta znacznie skraca cały proces, zmniejsza nakład pracy i, co najważniejsze, redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich. Ponadto podejście to jest powtarzalne i wiarygodne.

Zmodyfikowany system dwuhybrydowy drożdżowy do identyfikacji białek oddziałujących z czynnikiem wzrostu progranuliną

Ten film demonstruje test dwóch hybryd drożdży do wykrywania specyficznych interakcji między białkami. W tym teście białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane do dwóch domen czynnika transkrypcyjnego, który koduje enzym β-galaktozydazy. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, powoduje to transkrypcję i translację, które tworzą enzym, który jest następnie wykrywany za pomocą testu biochemicznego.

Test dwuhybrydowy drożdży w celu określenia samoasocjacji białek w komórkach drożdży

W tym filmie demonstrujemy zmodyfikowany test hybrydowy drożdży, który wykrywa wiele białek oddziałujących z docelowym DNA. Przekształcone komórki drożdży zawierają docelową sekwencję DNA przed genem reporterowym. Dodatkowo wykazują ekspresję białek czynnika transkrypcyjnego. Kiedy białka tworzą kompleksy i wiążą się z docelowym DNA, gen reporterowy ulega ekspresji i może być wykryty enzymatycznie.

Zmodyfikowany test hybrydowy drożdży i jeden do wykrywania interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Ketokonazol wiąże się z aktywacją receptora Pregnane X (PXR) i antagonizuje ją. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutantów PXR u drożdży definiują unikalny region wiązania ketokonazolu. Ta metoda genetyczna oparta na drożdżach odkrywa nowe interakcje receptorów jądrowych z ligandami, które wiążą się z miejscami wiązania powierzchniowego.

Odwrócony dwuhybrydowy system drożdży w celu identyfikacji reszt receptorów jądrowych ssaków, które oddziałują z ligandami i / lub antagonistami

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół badań przesiewowych drożdży z jedną hybrydą, aby zidentyfikować czynniki transkrypcyjne (TF), które mogą wiązać się z interesującym nas regionem ludzkiego DNA. Ta metoda wykorzystuje potok przesiewowy o wysokiej przepływności, który może badać wiązanie &gt;1 000 TF w jednym eksperymencie.

Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA

Poznaj metodę izolacji mutantów o zerowej interakcji przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży w badaniach cyklu komórkowego eukariotów. Technika ta umożliwia zrozumienie funkcji kinaz zależnych od cyklin w regulacji replikacji DNA.

Izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży

Przeglądaj więcej filmów