Test oparty na rezonansie bioluminescencyjnym (BRET) do pomiaru oddziaływań CRAF z białkami 14-3-3 w żywych komórkach

Głównym celem naszych badań jest odkrycie nowych podatności na szlak kinazy RAS-MAP poprzez badanie mutacji związanych z chorobami rzadkimi. Niedawno opracowaliśmy kolejny test oparty na BRET do pomiaru aktywności autohamującej kinaz RAF w żywych komórkach. Co ważne, test ten był niezbędny do scharakteryzowania grupy rzadkich mutacji linii zarodkowej w domenie bogatej w cysteinę B-RAF, co wykazało krytyczne znaczenie tej domeny dla utrzymania automatycznego hamowania B-RAF i zapobiegania konstytutywnej aktywności biologicznej B-RAF.

Test ten mierzy interakcje białek 1433 z kinazą RAF C-RAF, a interakcje te odgrywają istotną rolę w pośredniczeniu w funkcji RAF zarówno w rozwoju, jak i chorobie. Ponadto test ten, w połączeniu z wcześniej ustalonymi testami do pomiaru automatycznego hamowania RAF i interakcji RAS RAF, stanowi podstawę zestawu narzędzi do analizy mechanizmów regulacyjnych kinaz RAF w żywych komórkach. Na początek weź 293 komórki FT wyhodowane w 10-centymetrowym naczyniu i odessaj pożywkę.

Umyj komórki pięcioma mililitrami PBS. Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny EDTA i inkubuj przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby oderwać komórki od naczynia. Po inkubacji dodaj dziewięć mililitrów kompletnego DMEM do komórek, aby zneutralizować trypsynę.

Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby wytworzyć jednorodną zawiesinę pojedynczej komórki, a następnie przenieść komórki do 15-mililitrowej probówki. Natychmiast przenieś 20 mikrolitrów komórek do probówki o pojemności 1,7 mililitra i wymieszaj z 20 mikrolitrami niebieskiej plamy trypanowej. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.

Przenieś odpowiednią objętość komórek do 50-mililitrowej probówki i rozcieńcz w pełnym DMEM. Dodaj dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki sześciodołkowej. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 10% dwutlenku węgla przez noc.

Przed transfekcją rozcieńczyć nanolucyferazy C-RAF i plazmidy halo zeta 1433 wraz z pustym wektorem PC DNA three w buforze TE. Oznacz zestaw sterylnych probówek o pojemności 1,7 mililitra. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki do transfekcji do każdej probówki wraz z konstruktami wyrażeń.

Teraz dodaj dwa mikrolitry odczynnika do transfekcji i delikatnie zmieszaj, aby wymieszać. Pulsacyjnie obracaj probówki krótko w mikrowirówce, a następnie inkubuj probówki w temperaturze około 25 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby umożliwić utworzenie kompleksów transfekcyjnych. Następnie dodaj kompleksy transfekcyjne do komórek, kroplami i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin, aby wyrazić białka znakowane halo i nano.

Na początek oznacz trzy zestawy sterylnych probówek o pojemności 1.7 mililitra i jeden zestaw sterylnych 15-mililitrowych stożkowych probówek dolnych. Napraw wirówkę z wiadrem obrotowym z 15-mililitrowymi wkładkami probówkowymi i wstępnie schłodzić do czterech stopni Celsjusza. Weź sześciodołkową płytkę do hodowli komórkowej z transfekowanymi komórkami o średnicy 293 stóp.

Odessać pożywkę ze studni. Dodaj 250 mikrolitrów trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni, aż komórki zaczną się odłączać. Następnie dodaj jeden mililitr 10% pożywki do testów FBS do każdej studzienki i energicznie pipetuj, aby utworzyć zawiesinę pojedynczej komórki.

Przenieś jeden mililitr zawiesiny komórek do wstępnie oznakowanych probówek o pojemności 15 mililitrów. Dodaj jeden mililitr 10% pożywki do oznaczania uzupełnionego FBS do każdej z tych probówek i odwróć pięć razy, aby wymieszać. Następnie natychmiast przenieś 20 mikrolitrów zawiesiny komórek do pierwszego zestawu probówek.

Teraz odwiruj 15-mililitrowe probówki przez pięć minut przy 250 G we wstępnie schłodzonej wirówce. Wytwarza 20 mikrolitrów barwienia niebieskich komórek trypanowych z komórkami w zestawie pierwszym i liczy za pomocą licznika komórek lub hemocytometru. Po wyjęciu 15-mililitrowych probówek z wirówki, odessać pożywkę z granulek komórkowych i ponownie zawiesić granulki w pożywce do oznaczania bez surowicy, aby utworzyć zawiesinę pojedynczej komórki.

Aby ponownie umieścić komórki w płytkach 384-dołkowych i sześciodołkowych, kilkakrotnie odwróć 15-mililitrowe probówki, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek, i przenieś 500 mikrolitrów do 1,7 mililitrowych probówek w zestawie drugim i trzecim. Dodaj 0,5 mikrolitra DMSO do zestawu drugiego i 0,5 mikrolitra liganda Halo 618 do trzeciego zestawu probówek i dobrze wymieszaj. Przenieś DMSO i zawiesiny komórek dodatnich ligandów do oddzielnych studzienek zbiorników odczynników.

Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 40 mikrolitrów każdej zawiesiny na 384-dołkową płytkę hodowlaną. Przenieś pozostałe komórki na świeże sześciodołkowe płytki hodowlane w celu późniejszej analizy western blot i inkubuj zarówno 384 dołki, jak i sześć dołków przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Weź pożywkę do oznaczania bez surowicy wstępnie podgrzaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Rozcieńczyć rozmrożony substrat nano lucyferazy w stosunku 1 do 100 w pożywce do oznaczania bez surowicy i przenieść ją do zbiornika odczynnika. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 10 mikrolitrów mieszaniny substratów do każdego dołka płytki hodowlanej z 384 dołkami. Delikatnie obracaj płytkę przez jedną minutę.

Włóż płytkę 384-dołkową do wielomodowego czytnika płytek i zarejestruj emisje 460 i 618 nanometrów ze wszystkich studzienek z komórkami. Oblicz surowe współczynniki BRET dla dodatniego nośnika i dodatniego liganda w jednostkach mili-BRET, korzystając z podanego równania. Obliczyć skorygowany współczynnik BRET, odejmując dodatni współczynnik BRET nośnika od dodatniego liganda.

Mutant nano C-RAF S 259A redukuje sygnał BRET o około 45%, a mutant nano C-RAF S 621 A o około 25%Podwójny mutant prawie eliminuje sygnał BRET.