Name: Mysi model niewydolności serca wywołanej hiperlipidemią z zachowaną frakcją wyrzutową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Poznaj mysi model niewydolności serca z zachowaną frakcją wyrzutową wywołanej hiperlipidemią. Badanie wykorzystuje wektor AAV9 i poloksamer-407 do indukcji lipotoksyczności oraz echokardiografię do oceny funkcji serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Penncore i NHLBI Gene Therapy Resource Program (GTRP) za sfinansowanie generacji wirusa związanego z Adeno-Associated w tym projekcie. Badania te zostały sfinansowane z grantów Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) (1R01HL140468) i Instytutu Badań nad Sercem w Miami dla LS. MW był laureatem nagrody NIH Diversity Supplement Award w latach 2020 - 2022 (R01HL140468- 03S1). JH jest finansowany przez 1R01 HL13735, 1R01 HL107110, 5UM1 HL113460, 1R01 HL134558, 5R01 CA136387 (z NIH), W81XWH-19-PRMRPCTA (z Departamentu Obrony) oraz Starr, Lipson i Soffer Family Foundations.

Protokół dla zwierząt został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie w Miami, zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) (protokół IACUC 23-103-ad03). Na potrzeby niniejszego badania myszy typu dzikiego (WT) na tle 129J zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów) i wyhodowane we własnym zakresie. Wszystkie myszy były rodzeństwem z miotu na tle 129J. Eksperymenty obejmowały zarówno samce, jak i samice myszy. Mysz LDLR/P-407 HFpEF została utworzona przez podanie pojedynczej dawki AAV9-cTnT-LDLR w pierwszym tygodniu i p407 co dwa tygodnie przez cztery tygodnie.
1. Przygotowanie i administracja AAV9-cTnT-LDLR
UWAGA: plazmid AAV9-cTNT-hLDLR (patrz Tabela Materiałów) koduje pełne ludzkie białko LDLR (2664bp) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
<ol>
	<li>Preparat wektora wirusowego AAV-LDLR
	<ol>
		<li>W zależności od liczby zwierząt rozmrażaj fiolki podstawowe AAV9 na lodzie przez 20 minut, a następnie rozcieńcz cząsteczki AAV w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco, aby uzyskać stężenie 1 x10 12 genomów wektorowych/mysz w 100 μl.</li>
		<li>Umieścić roztwór wirusa w igle 28-30 G na strzykawce o pojemności 1 ml. Należy uważać, aby nie wciągnąć pęcherzyków powietrza do igły.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabiegi dożylnego wstrzykiwania do żyły ogonowej
	<ol>
		<li>Włącz tlen do 0,5 l/min i ustaw system znieczulenia izofluranem na 4%-5%. Umieść mysz w komorze indukcyjnej na ~2 minuty, aż zwierzę przestanie reagować.</li>
		<li>Umieść zwierzę na ograniczniku oświetlającym ogon myszy (np. Braintree Scientific, Inc. (Braintree, MA)) i ułóż zwierzę leżące na boku. Stosować znieczulenie izofluranem do 2%-3% w celu konserwacji. 
		UWAGA: Ogrzewanie przez urządzenie ograniczające spowoduje rozszerzenie żyły ogonowej myszy, a tym samym znacznie ułatwi wstrzyknięcie.</li>
		<li>Zidentyfikuj boczną żyłę ogonową. Oczyścić miejsce wstrzyknięcia środkiem antyseptycznym za pomocą gaziku.</li>
		<li>Przytrzymaj koniec ogona, aby go przedłużyć, i masuj ogon myszy palcami, aż żyła zostanie uwidoczniona. Wbić igłę pod małym kątem (kąt 10-15 stopni) i wstrzyknąć 100 μl rozcieńczonego AAV do żyły ogonowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Wyjąć igłę i natychmiast uciskać palcem, aż krwawienie ustanie. Przywróć mysz do oryginalnej klatki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie i podawanie P-407
<ol>
	<li>Preparat P-407
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór, rozcieńczając środek P-407 (patrz Tabela Materiałów) DPBS do końcowego stężenia 100 mg/ml w dygestorium. Przechowywać roztwór w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc na rotatorze, aby ułatwić rozpuszczenie P-40710.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabieg wstrzyknięcia dootrzewnowego (i.p.) co dwa tygodnie
	<ol>
		<li>Zważ każdą mysz w pierwszym dniu wstrzyknięć domięśniowych. Korzystając ze wzoru 1 g/kg, obliczyć odpowiednią dawkę dla każdej myszy w zależności od masy i ampułkostrzykawek.</li>
		<li>Pod wyciągiem należy ręcznie przytrzymać mysz z głową i ciałem pochylonymi w dół, aby zmienić położenie narządów wewnętrznych w obrębie czaszki. Ta technika pozwala uniknąć przebicia ważnych struktur w pobliżu.</li>
		<li>Zidentyfikuj lewą jamę otrzewnej w dolnej ćwiartce brzucha, po bocznej stronie linii środkowej. Oczyść miejsce środkiem antyseptycznym.</li>
		<li>Pod kątem 45 stopni lub mniejszym wbij igłę do jamy otrzewnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Zassać strzykawkę, aby zapewnić prawidłowe wprowadzenie.</li>
		<li>Jeśli podczas aspiracji obecna jest krew lub tkanka, wyjąć igłę i powtarzać kroki 2.2.2 -2.2.4, aż strzykawka będzie czysta. Wyrzuć igłę do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty i umieść mysz z powrotem w oryginalnej klatce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena echokardiografii
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Nałóż krem do depilacji na klatkę piersiową i górną część brzucha myszy dzień wcześniej lub kilka godzin przed obrazowaniem. Krem usunąć mokrą gazą po 2 minutach.</li>
		<li>Znieczulij mysz izofluranem o stężeniu 2,5%-3,0% przy natężeniu przepływu 0,8 l/min i utrzymuj przy 1%-1,5% izofluranu. Następnie przymocuj mysz do odpowiedniej platformy w pozycji leżącej z łapkami na elektrodach z żelem przewodzącym i zakryj nos i usta stożkiem nosowym, aby zapewnić ciągłe znieczulenie izofluranem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Widok przymostkowy w osi długiej
	<ol>
		<li>Trzymając mysz ustawioną na wprost, przechyl prawą stronę platformy o 45 stopni.</li>
		<li>Następnie ustaw sondę przetwornika po przekątnej w systemie szynowym, ustawiając ją pod kątem 30-40 stopni w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara od prawej kończyny górnej do lewej kończyny brzusznej, aby uzyskać i przechowywać obrazy w trybie B.</li>
		<li>Przeanalizuj obrazy w trybie B za pomocą oprogramowania do analizy ultradźwiękowej (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać frakcję wyrzutową (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Widok przymostkowy w krótkiej osi
	<ol>
		<li>Obróć sondę przetwornika w systemie szynowym o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby uzyskać i zapisać obrazy w trybie B i M.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Widok wierzchołkowy
	<ol>
		<li>Przechyl lewy górny róg platformy w dół i w prawo. Ustaw przetwornik w kierunku prawego ramienia zwierzęcia.</li>
		<li>Wizualizacja zastawki mitralnej w trybie B i trybie kolorowego Dopplera. Pozyskiwanie i przechowywanie obrazów Dopplera falą pulsacyjną (PW) i dopplera tkankowego5.</li>
		<li>Przeanalizuj obrazy Dopplera PW i Dopplera tkankowego za pomocą oprogramowania do analizy ultrasonograficznej, aby uzyskać IVRT, E/E' i E/A (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B-E).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zapis danych w pętli ciśnienie-objętość (PV)
<ol>
	<li>Na zakończenie badania należy przeprowadzić analizy hemodynamiczne w celu oceny funkcji skurczowej i rozkurczowej lewej komory (LV), postępując zgodnie z wcześniej opisaną procedurą11,12.
	<ol>
		<li>Zacznij od indukowania myszy izofluranem (3-5%, komora indukcyjna).</li>
		<li>Gdy rozpocznie się działanie znieczulające, przenieś zwierzę na stół operacyjny i utrzymuj znieczulenie izofluranem (1-3%, maska na twarz).</li>
		<li>Wykonaj małe nacięcie w skórze nad szyją, aby umożliwić intubację dotchawiczą (przez usta).</li>
		<li>Przewietrzyć zwierzę mieszaniną tlenu i izofluranu za pomocą respiratora dla gryzoni (np. Micro vent model 848, Harvard Apparatus) ustawionego na ~0,15-0,2 ml objętości i częstość oddechów na 120-170 oddechów/min.</li>
		<li>Monitoruj temperaturę ciała na poziomie ~37 °C ± 1 °C przez cały czas trwania zabiegu za pomocą stołu chirurgicznego z kontrolowaną temperaturą.</li>
		<li>Odsłoń i kaniuluj lewą żyłę szyjną wewnętrzną za pomocą igły 30 G w celu podania płynu.</li>
		<li>Przeciąć skórę nad miejscem środkowej brzusznej szyi i odsłonić tętnicę szyjną. Po niedrożności dystalnej części prawej tętnicy szyjnej należy wykonać małe nacięcie w tętnicy, aby umożliwić wprowadzenie cewnika o objętości ciśnienia (PV) z mikrokońcówką (patrz tabela materiałów) do lewej komory (podejście zamknięte klatką piersiową).</li>
		<li>Nagrywaj pętle fotowoltaiczne podczas niedrożności żyły głównej dolnej i w stanie ustalonym.</li>
		<li>Pod koniec eksperymentu należy humanitarnie poddać zwierzę eutanazji (w głębokim znieczuleniu) przy użyciu zatwierdzonej metody AVMA (np. Izofluran, a następnie zwichnięcie szyjki macicy).</li>
		<li>Analizuj dane PV za pomocą oprogramowania LabChart (patrz tabela materiałów) i kalibruj objętości za pomocą pomiarów echokardiograficznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Investigating HFpEF Pathophysiology in a Hyperlipidemia&#45;Induced Mouse Model

<ol><li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+heart+failure%3A+A+contemporary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of heart failure: A contemporary perspective.</a> Circ Res. 128 (10), 1421-1434 (2021).</li>
<li>Kosiborod, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+baseline+characteristics+of+step-HFpEF+program+evaluating+semaglutide+in+patients+with+obesity+hfpef+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Design and baseline characteristics of step-HFpEF program evaluating semaglutide in patients with obesity hfpef phenotype.</a> JACC Heart Fail. 11 (8), Pt 1 1000-1010 (2023).</li>
<li>Borlaug, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+management+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and management of heart failure with preserved ejection fraction.</a> Nat Rev Cardiol. 17 (9), 559-573 (2020).</li>
<li>Badrov, M. B., Mak, S., Floras, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+autonomic+disturbances+in+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular autonomic disturbances in heart failure with preserved ejection fraction.</a> Can J Cardiol. 37 (4), 609-620 (2021).</li>
<li>Wu, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+adipose+deposition+and+the+development+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Myocardial adipose deposition and the development of heart failure with preserved ejection fraction.</a> Eur J Heart Fail. 22 (3), 445-454 (2020).</li>
<li>Hahn, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+gene+expression+signatures+in+human+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Myocardial gene expression signatures in human heart failure with preserved ejection fraction.</a> Circulation. 143 (2), 120-134 (2021).</li>
<li>Korolenko, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-stage+atherosclerosis+in+poloxamer+407-induced+hyperlipidemic+mice%3A+Pathological+features+and+changes+in+the+lipid+composition+of+serum+lipoprotein+fractions+and+subfractions%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Early-stage atherosclerosis in poloxamer 407-induced hyperlipidemic mice: Pathological features and changes in the lipid composition of serum lipoprotein fractions and subfractions.</a> Lipids Health Dis. 15, 16(2016).</li>
<li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteopontin+and+ldlr+are+upregulated+in+hearts+of+sudden+cardiac+death+victims+with+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+and+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Osteopontin and ldlr are upregulated in hearts of sudden cardiac death victims with heart failure with preserved ejection fraction and diabetes mellitus.</a> Front Cardiovasc Med. 7, 610282(2020).</li>
<li>Williams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+driven+by+hyperlipidemia+and+enhanced+cardiac+low-density+lipoprotein+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Mouse model of heart failure with preserved ejection fraction driven by hyperlipidemia and enhanced cardiac low-density lipoprotein receptor expression.</a> J Am Heart Assoc. 11 (17), e027216(2022).</li>
<li>Colly, A., Marquette, C., Courtial, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poloxamer%2Fpoly%28ethylene+glycol%29+self-healing+hydrogel+for+high-precision+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Poloxamer/poly(ethylene glycol) self-healing hydrogel for high-precision freeform reversible embedding of suspended hydrogel.</a> Langmuir. 37 (14), 4154-4162 (2021).</li>
<li>Kanashiro-Takeuchi, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+growth+hormone-releasing+hormone+agonist+in+a+murine+model+of+cardiometabolic+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a growth hormone-releasing hormone agonist in a murine model of cardiometabolic heart failure with preserved ejection fraction.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 324 (6), H739-H750 (2023).</li>
<li>Dulce, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+growth+hormone-releasing+hormone+agonist+ameliorates+the+myocardial+pathophysiology+characteristic+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic growth hormone-releasing hormone agonist ameliorates the myocardial pathophysiology characteristic of heart failure with preserved ejection fraction.</a> Cardiovasc Res. 118 (18), 3586-3601 (2023).</li>
<li>Borlaug, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%3A+New+insights+and+pathophysiological+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity and heart failure with preserved ejection fraction: New insights and pathophysiological targets.</a> Cardiovasc Res. 118 (18), 3434-3450 (2023).</li>
<li>Noll, N. A., Lal, H., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+heart+failure+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of heart failure with preserved or reduced ejection fraction.</a> Am J Pathol. 190 (8), 1596-1608 (2020).</li>
<li>Guarnieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considering+the+risks+and+safety+of+intraperitoneal+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Considering the risks and safety of intraperitoneal injections.</a> Lab Anim (NY). 45 (4), 131(2016).</li>
</ol>

JH jest wymieniony jako współwynalazca patentów na analogi GHRH, które zostały przypisane do Uniwersytetu Miami i Wydziału ds. Weteranów. JH wcześniej posiadał udziały w Biscayne Pharmaceuticals, licencjobiorcy własności intelektualnej wykorzystanej w tym badaniu. Firma Biscayne Pharmaceuticals nie zapewniła finansowania tego badania. JH poinformował, że posiada patent na terapię opartą na komórkach serca. Posiada udziały w Vestion Inc. i utrzymuje profesjonalne relacje z Vestion Inc. jako konsultant i członek Rady Dyrektorów oraz Naukowej Rady Doradczej. JH jest dyrektorem naukowym, płatnym konsultantem i członkiem rady doradczej Longeveron i posiada udziały w Longeveron. JH jest również współtwórcą własności intelektualnej na licencji udzielonej firmie Longeveron. Longeveron LLC i Vestion Inc. nie uczestniczyły w finansowaniu tych prac. Powiązania JH są ujawniane Uniwersytetowi w Miami, a plan zarządzania jest już gotowy.

Pomimo stałego wzrostu częstości występowania HFpEF w ciągu ostatniej dekady, dokładne zrozumienie leżącej u podstaw patofizjologii pozostaje nieuchwytne13. Co więcej, na dzień dzisiejszy istnieje ograniczona terapia oparta na dowodach13. Konieczne jest lepsze zrozumienie mechanizmów związanych z sercowo-metaboliczną HFpEF. Wcześniej wprowadzono mysi model hiperlipidemiczny, który naśladuje HFpEF bez przewlekłej choroby nerek (PChN), ani nadciśnienia wywołanego przez sercowe LDLR OE i zastrzyki p4079. 
Wyniki ujawniły, że połączenie sercowego LDLR OE i hiperlipidemii powoduje dysfunkcję rozkurczową, zaburzenia rytmu serca, przerost lewej komory (LV), nietolerancję wysiłku, akumulację lipidów w sercu i zwłóknienie u myszy po czterech tygodniach, jak wcześniej opublikowano9. Zaobserwowano również wzrost wychwytu cholesterolu LDL w sercach, wątrobie i mięśniach szkieletowych oraz obniżony poziom trójglicerydów w sercach i wątrobie tych myszy9. Zaletą tej metody jest szybkość badania szlaków zespołu kardiometabolicznego, które nie są dobrze poznane w porównaniu z innymi hiperlipidemicznymi modelami myszy HFpEF, takimi jak dieta wysokotłuszczowa (HFD), która wymaga do 16 i 20 tygodni, aby się rozwinąć14. Model ten rozwija się po czterech tygodniach i naśladuje nieprawidłowości metaboliczne u ludzi. Dlatego powtarzalność tego modelu ma zasadnicze znaczenie. 
Konieczne jest zapewnienie dokładnego przygotowania i podania AAV9-cTnT-LDLR i P-407. Powtarzalność tego modelu jest w dużym stopniu zależna od dokładnych obliczeń stężeń i dawek P-407 i AAV9-cTnT-LDLR, a także pomiarów masy. Równie ważne są przygotowanie roztworu oraz odpowiednie techniki iniekcji dożylnej i dootrzewnowej. Odchylenia w tych technikach mogą skutkować znacznymi zmianami i niepożądanymi wynikami. 
Pomimo skuteczności i wydajności tego modelu, istnieje kilka ograniczeń. Do wykonywania iniekcji dożylnych i dootrzewnowych potrzebne jest rygorystyczne szkolenie. Dodatkowo istnieje potencjalne ryzyko zachorowalności i śmiertelności związane z dożylnymi i częstymi wstrzyknięciami dootrzewnowymi. Podczas wykonywania wstrzyknięć dożylnych mogą wystąpić urazy ogona myszy, podczas gdy nakłucie jelita ślepego może wystąpić przy wstrzyknięciach dootrzewnowych, co prowadzi do zapalenia otrzewnej15. Urazy te są zazwyczaj spowodowane nieprawidłowymi technikami i mogą skutkować utratą uczestników eksperymentu i leczenia. Dlatego przed wykonaniem tych zabiegów konieczne jest obszerne szkolenie. Kolejnym ograniczeniem jest skupienie się tego modelu na szczepie 129J. Uzasadnienie wyboru szczepu 129J wynika ze wstępnych badań, które przyniosły szybszą dysfunkcję rozkurczową i wyniki HFpEF w tym szczepie w porównaniu z myszami C57BL / 6, które początkowo badaliśmy w niepublikowanych badaniach.
Niezależnie od tych ograniczeń, model ten pozwoli na szybsze badania mechanizmów leżących u podstaw HFpEF i potencjalnych skutecznych opcji leczenia. Wcześniejsze badania doprowadziły do opracowania patofizjologicznego modelu kardiometabolicznego HFD indukowanego przez HFpEF i estru metylowego N[w]-nitro-l-argininy (L-NAME) w ciągu 5-15 tygodni13. Jednak ze względu na stały wzrost częstości występowania HFpEF istnieje pilna potrzeba dalszego zrozumienia patofizjologii kardiometabolicznej HFpEF i opracowania skutecznej terapii. Ten mysi model sercowej hiperlipidemii wywołanej LDLR OE i p407 jest szybką i wykonalną metodą indukowania kardiometabolicznego HFpEF dla przyszłych przedsięwzięć badawczych.

Niewydolność serca z zachowaną frakcją wyrzutową (HFpEF) oznacza zespół kardiometaboliczny, któremu towarzyszą liczne choroby współistniejące i stanowi ponad 50% wszystkich przypadków niewydolności serca1,2. Co więcej, częstotliwość HFpEF stale rosła w ciągu ostatniej dekady3. Przy ograniczonych możliwościach leczenia, HFpEF stanowi najważniejszą niezaspokojoną konieczność medyczną w chorobach sercowo-naczyniowych, biorąc pod uwagę jej wieloaspektową patofizjologię4. W związku z tym istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw i patofizjologii HFpEF w celu opracowania skutecznych terapii.
Pomimo znacznego postępu w ostatnich latach, patofizjologia HFpEF przypisywana lipotoksyczności pozostaje niew pełni poznana. Ustalono, że pacjenci z HFpEF wykazują znaczną akumulację lipidów w mięśniu sercowym w porównaniu z osobami z niewydolnością serca ze zmniejszoną frakcją wyrzutową (HFrEF) i zdrowymi osobami z grupy kontrolnej5. Dane z sekwencjonowania RNA z biopsji serca wykazały regulację w dół genu lipazy lipoproteinowej (LPL) w grupie HFpEF w porównaniu z pacjentami zdrowymi i z HFrEF6. Poloksamer-407 (P-407) jest kopolimerem blokowym, który indukuje hiperlipidemię poprzez blokowanie LPL, a następnie zwiększanie stężenia trójglicerydów w osoczu i cholesterolu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL)<klasa sup='xref'>7. Wcześniejsze badania wykazały wysoką ekspresję receptora LDL (LDLR) w sercach myszy z HFpEF 8. 
Opierając się na tych wynikach i uznając pilną potrzebę modeli zwierzęcych dokładnie naśladujących HFpEF sercowo-metaboliczny, opracowano i zaprezentowano mysi model wywołany hiperlipidemią. Model ten został dostosowany do badania HFpEF, wyraźnie koncentrując się na udziale lipotoksyczności wraz z zespołem metabolicznym. Model ten, wywołany przez hiperlipidemię / blokadę LPL i zwiększoną ekspresję LDLR w sercu, został ustalony u myszy WT-129 na tle 129J poprzez dwutygodniowe wstrzyknięcia dootrzewnowe (i.p.) P-407 w połączeniu z pojedynczym dożylnym (iv.) wstrzyknięciem wirusa związanego z adenowirusem 9-sercowej troponiny T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)9.
Między 4 a 8 tygodniem po leczeniu przeprowadzono szeroki wachlarz ocen, obejmujący echokardiografię, zapisy ciśnienia krwi, pletyzmografię całego ciała (WBP), ciągłą telemetrię elektrokardiografii (EKG), monitorowanie koła aktywności (AWM), a także analizy biochemiczne i histologiczne9. Po czterech tygodniach myszy LDLR / P407 lub "podwójne leczenie" wykazywały wyraźne cechy HFpEF, w tym dysfunkcję rozkurczową, zachowaną frakcję wyrzutową i zwiększoną grubość ściany lewej komory9. Dodatkowo telemetria EKG i AWM ujawniły odpowiednio blokady serca i zmniejszoną aktywność. Warto zauważyć, że ciśnienie krwi i czynność nerek pozostały w normie9. Po ośmiu tygodniach funkcja rozkurczowa pogorszyła się, a pomiary WBP wykazały zmniejszoną częstość oddechów9. 
Dalsza eksploracja modelu podwójnego leczenia ujawniła zwłóknienie, podwyższony stosunek płuc mokrych do suchych oraz stosunek masy serca do masy ciała9. Sekcja zwłok wykazała wodobrzusze, niedokrwienie serca i żółtakty. Co ciekawe, nagłe zgony zostały udokumentowane między 6 a 12 tygodniem po leczeniu9. Ten mysi model HFpEF oparty na hiperlipidemii zapewnia szybkie, cenne i obiecujące narzędzie eksperymentalne do odkrywania złożoności zespołu metabolicznego przyczyniającego się do dysfunkcji rozkurczowej z HFpEF zależnym od lipotoksyczności.

<table><tbody><tr><td>Wirus 9-sercowy związany z adenowirusem T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)</td><td>U. Penn Vector Core, finansowany przez NHLBI Gene Therapy Program (GTRP)</td><td></td><td>Transgenowe plazmidy i cząsteczki AAV zostały wygenerowane przez U. Penn Vector Core, finansowany przez NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV zostały dostarczone w Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 0,001% Pluronic F68. Rdzeń oznaczał miana AAV za pomocą cyfrowej kropelkowej reakcji łańcuchowej polimerazy (ddPCR) i oceniał wszystkie preparaty pod kątem stosunku białka kapsydu za pomocą SDS-PAGE oraz pod kątem obecności endotoksyny. Konstrukty obejmują ludzkie (h) transkrypty oznaczone przez 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). Plazmid AAV9-cTNT-hLDLR koduje pełne ludzkie białko LDLR (2664bp).</td></tr><tr><td>Systemy obrazowania z sondą przetwornika wysokiej częstotliwości MS400&nbsp;</td><td>(VisualSonics, Toronto, ON, Kanada)</td><td>Vevo 2100 lub 3100</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Akorn Animal Health, Inc.</td><td>NDC: 59399-106-01</td><td></td></tr><tr><td>LabChart&nbsp; oprogramowanie</td><td>ADInstruments</td><td>Pro wersja 8.1.5</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 407</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16758</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik PV</td><td>Millar Instrument</td><td>PVR 1035</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy ultrasonograficznej&nbsp;</td><td>Myszy Vevo Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>typu dzikiego (WT) na tle 129J&nbsp;</td><td>Laboratorium Jacksona&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model niewydolności serca wywołanej hiperlipidemią z zachowaną frakcją wyrzutową

A Murine Model of Hyperlipidemia&#45;Induced Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Patofizjologia niewydolności serca z zachowaną frakcją wyrzutową (HFpEF) spowodowaną lipotoksycznością nie jest w pełni zrozumiała. Biorąc pod uwagę pilne zapotrzebowanie na modele zwierzęce, które dokładnie naśladują sercowo-metaboliczną HFpEF, opracowano mysi model wywołany hiperlipidemią za pomocą inżynierii odwrotnej fenotypów obserwowanych u pacjentów z HFpEF. Model ten miał na celu zbadanie HFpEF, koncentrując się na wzajemnych oddziaływaniach między lipotoksycznością a zespołem metabolicznym. Hiperlipidemię indukowano u myszy typu dzikiego (WT) na tle szczepu 129J poprzez dwutygodniowe wstrzyknięcia dootrzewnowe poloksamera-407 (P-407), kopolimeru blokowego, który blokuje lipazę lipoproteinową, w połączeniu z pojedynczym dożylnym wstrzyknięciem receptora lipoproteinowego T-lipoprotein o niskiej gęstości wirusa związanego z adenowirusem 9-sercowej troponiny (AAV9-cTnT-LDLR). Szeroko zakrojone oceny przeprowadzono między 4 a 8 tygodniem po leczeniu, w tym echokardiografię, zapis ciśnienia krwi, pletyzmografię całego ciała, telemetrię echokardiografii (EKG), monitorowanie koła aktywności (AWM) oraz analizy biochemiczne i histologiczne. Myszy LDLR / P-407 wykazywały charakterystyczne cechy po czterech tygodniach, w tym dysfunkcję rozkurczową, zachowaną frakcję wyrzutową i zwiększoną grubość ściany lewej komory. Warto zauważyć, że ciśnienie krwi i czynność nerek pozostały w normalnych zakresach. Dodatkowo EKG i AWM wykazały odpowiednio bloki serca i zmniejszoną aktywność. Funkcja rozkurczowa pogorszyła się po ośmiu tygodniach, czemu towarzyszył znaczny spadek częstości oddechów. Dalsze badania nad modelem podwójnego leczenia wykazały podwyższone zwłóknienie, stosunek mokrych do suchych płuc oraz stosunek masy serca do masy ciała. Myszy LDLR / P-407 wykazywały żółtakty, wodobrzusze i niedokrwienie serca. Co ciekawe, nagłe zgony nastąpiły między 6 a 12 tygodniem po leczeniu. Mysi model HFpEF stanowi cenne i obiecujące źródło eksperymentalne do wyjaśnienia zawiłości zespołu metabolicznego przyczyniającego się do dysfunkcji rozkurczowej w kontekście HFpEF zależnej od lipotoksyczności.

Po 4 tygodniach połączonego podania pojedynczej dawki i.v. AAV9-cTnT-LDLR oraz dwutygodniowych iniekcji i.p. P-407, echokardiografia wykazała obecność HFpEF, co potwierdzono poprzez zachowaną frakcję wyrzutową, wydłużony czas relaksacji komórkowej (IVRT) i stosunek E/E' oraz obniżone E/A (Rycina 3A-E). Po 8 tygodniach zaobserwowano gorszą dysfunkcję rozkurczową w porównaniu z danymi po 4 tygodniach. Analiza pętli ciśnienie-objętość (PV) po 8 tygodniach leczenia wykazała zwiększenie nachylenia relacji ciśnienie-objętość w końcowej rozkurczowej fazie, co potwierdziło wyniki echokardiografii dotyczące dysfunkcji rozkurczowej (Rycina 3F). Co istotne, u znacznej liczby myszy leczonych LDLR/P-407 nastąpiła śmierć nagła między 6. a 12. tygodniem po zastosowaniu LDLR/P-407 (Rycina 3G). Wyniki te wskazują na kardiometaboliczne HFpEF, potwierdzając skuteczność tego protokołu i projektu eksperymentalnego. U myszy leczonych LDLR/P407 w 4. i 8. tygodniu odnotowano hiperlipidemię, o czym świadczyły podwyższone poziomy cholesterolu całkowitego, triglicerydów, lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL), cholesterolu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) oraz prawidłowe poziomy cholesterolu lipoprotein o wysokiej gęstości, co potwierdziło nasze ustalenia dotyczące hiperlipidemii (Rycina 3H).
<img alt="Schemat mapy plazmidu; miejsce startu replikacji, gen AmpR, miejsca cięcia enzymów, strategia klonowania DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66442/66442fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Mapa plazmidu AAV9-cTnT-LDLR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66442/66442fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Procedura wstrzykiwania u szczura; układ eksperymentalny do badań nad podawaniem leków z użyciem strzykawki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66442/66442fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Procedury wstrzykiwania. (A) Reprezentatywny obraz pokazujący dożylne (i.v.) wstrzyknięcie AAV9-cTnT-LDLR do żyły ogonowej u myszy WT o tle szczepu 129J. (B) Ilustracja wstrzyknięcia doszprowego P-407 u myszy WT o tle szczepu 129J, która wcześniej otrzymała pojedynczą dawkę i.v. AAV9-cTnT-LDLR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66442/66442fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza funkcji serca i profilu lipidowego w badaniu LDLR/P407; echokardiogram i wykres przeżywalności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66442/66442fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Kardiometaboliczna HFpEF. (A-E) Parametry echokardiograficzne wskazujące na niewydolność serca z zachowaną frakcją wyrzutową (HFpEF) po 4 (n = 17) i 8 tygodniach (n = 11) leczenia LDLR/P-407 w porównaniu z myszami nieleczonymi (n = 15). Świadczy o tym zachowana frakcja wyrzutowa, wydłużony czas relaksacji izowolumetrycznej (IVRT), zwiększony stosunek E/E' oraz zmniejszony stosunek E/A, co stanowi wskaźniki dysfunkcji rozkurczowej. (F) Rejestracja i analiza pętli ciśnienie-objętość wykazały zwiększone nachylenie zależności ciśnienia od objętości w końcowej rozkurczowej fazie (EDPVR) po 8 tygodniach leczenia. (G) Do nagłych zgonów dochodziło między 6. a 12. tygodniem po zastosowaniu LDLR/P-407. (H) Panel lipidowy potwierdził występowanie hiperlipidemii u myszy leczonych LDLR/P407 w 4. (n = 4) i 8. tygodniu (n = 3), co objawiało się podwyższonym poziomem cholesterolu całkowitego, trójglicerydów, lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL), cholesterolu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) oraz prawidłowym poziomem cholesterolu lipoprotein o wysokiej gęstości w porównaniu z myszami nieleczonymi (n = 5). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01, ***P &lt; 0.001, ****P &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66442/66442fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół przedstawia szczegółowe podejście do replikacji mysiego modelu niewydolności serca wywołanej hiperlipidemią z zachowaną frakcją wyrzutową (HFpEF). Projekt łączy w sobie podawanie receptora lipoproteiny T-lipoproteiny o niskiej gęstości związanego z wirusem 9-sercowym troponiny (AAV9-cTnT-LDLR) i poloksamemu-407 (P-407).

Mysi model niewydolności serca wywołanej hiperlipidemią z zachowaną frakcją wyrzutową

The pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) driven by lipotoxicity is incompletely understood. Given the urgent need for ...

Nasze badania mają na celu zbadanie niewydolności serca z zachowaną frakcją wyrzutową znaną jako HFpEF, w szczególności zbadanie skutków lipotoksyczności. Staramy się wyjaśnić skomplikowany związek między zespołem metabolicznym a lipotoksycznością w napędzaniu progresji HFpEF i odkryć podstawowe mechanizmy napędzające patofizjologię HFpEF za pomocą tego eksperymentalnego modelu lustrzanego. Pomimo rosnącego rozpowszechnienia i ograniczonych możliwości leczenia HFpEF, jej mechanizmy patofizjologiczne związane głównie z zespołem metabolicznym pozostają słabo poznane.Model ten stanowi wyjątkową okazję do wypełnienia tej luki i potencjalnego opracowania nowych terapii HFpEF. Najważniejszą zaletą naszego modelu jest jego zdolność do naśladowania znacznego niewłaściwego obchodzenia się z lipidami obserwowanego u pacjentów z HFpEF. Ten mysi model dostarcza cennych informacji na temat patofizjologii HFpEF, zwłaszcza metabolizmu serca.Nasze wyniki nie uwzględniają znaczenia niewłaściwego obchodzenia się z kwasami tłuszczowymi i cholesterolem w kardiometabolicznym HFpEF. Model ten doskonale pokazuje, jak niedobór kwasów tłuszczowych zaburza metabolizm na różnych poziomach. Daje to naukowcom potencjalne możliwości odkrycia nowych pułapek dla pacjentów z HFpEF.Tutaj, w Laboratorium Shahada, skupimy się na przełożeniu tego modelu na duże zwierzęta. Będziemy badać kwestie związane z patogenezą, nagłą śmiercią i potencjalnymi interwencjami terapeutycznymi ukierunkowanymi na lipotoksyczność, stan zapalny i przebudowę serca. Instruktor[Na początek rozmrażaj fiolki z wektorami wirusowymi na lodzie przez 20 minut i rozcieńczaj cząsteczki AAV w 100 mikrolitrach DPBS.Załaduj rozcieńczony roztwór AAV do jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze od 28 do 30, unikając pęcherzyków powietrza. Zabezpiecz znieczuloną mysz w ograniczniku oświetlacza ogona i użyj gazika, aby oczyścić miejsce wstrzyknięcia środkiem antyseptycznym. Masuj ogon dwoma palcami, aż zauważysz żyłę.Następnie wstrzyknąć wektor do żyły ogonowej pod małym kątem i wyjąć igłę. Za pomocą palca natychmiast przyłożyć ucisk do miejsca wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie. Aby przygotować Poloxamer 407, należy go rozpuścić w DPBS na rotatorze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Następnie ręcznie unieruchom, trzymając mysz pod wyciągiem, ustawiając głowę i ciało w dół. Za pomocą środka antyseptycznego należy oczyścić miejsce wstrzyknięcia w lewym dolnym kwadrancie brzucha, po bokach do linii środkowej. Aby wstrzyknąć P 407, należy wprowadzić igłę do jamy otrzewnej pod kątem 45 stopni lub mniejszym.Po czterech tygodniach indukcji hiperlipidemii echokardiografia wykazała niewydolność serca z zachowaną frakcją wyrzutową w postaci wydłużenia czasu relaksacji wewnątrzkomorowej. Zaobserwowano zwiększony stosunek wczesnej prędkości przepływu beztłuszczowego mitralnego do pierścieniowej prędkości rozkurczowej mitralnej, wraz ze zmniejszoną wczesną i późną rozkurczową prędkością przepływu przezmitralnego.

a-murine-model-hyperlipidemia-induced-heart-failure-with-preserved

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niewydolność serca jest główną przyczyną hospitalizacji i główną przyczyną śmiertelności. Model trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy stosuje się do badania przebudowy komór i dysfunkcji serca po zawale mięśnia sercowego. Przedstawiono technikę inwazyjnych pomiarów hemodynamicznych u myszy.

Trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy: model przebudowy po zawale mięśnia sercowego i niewydolności serca

Rezerwa przepływu wieńcowego (CFR) jest przydatna do oceny zapotrzebowania tlenu w mięśniu sercowym i oceny ryzyka sercowo-naczyniowego. W badaniu tym ustanowiono krok po kroku metodę echokardiografii dopplerowskiej przezklatkowej (TTDE) do podłużnego monitorowania zmian CFR, mierzonych z tętnicy wieńcowej u myszy, pod eksperymentalnym przeciążeniem ciśnieniowym pasma aorty.

Ultradźwiękowa ocena przepływu w tętnicach wieńcowych i rezerwy przepływu wieńcowego przy użyciu modelu przeciążenia ciśnieniowego u myszy

Tutaj prezentujemy protokół generowania ludzkiego chimerycznego mysiego modelu hipercholesterolemii rodzinnej wątroby przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hepatocytów. Jest to cenny model do testowania nowych terapii hipercholesterolemii.

Rodzinny model myszy chimerycznej wątroby hipercholesterolemii przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych

Mysie modele miażdżycy są użytecznymi narzędziami do badania szlaków patogennych na poziomie molekularnym, ale wymagają standaryzowanej kwantyfikacji rozwoju zmian. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę określania wielkości zmiany w głównych naczyniach tętniczych, w tym w korzeniu aorty, łuku aortalnym i tętnicy ramienno-głowowej.

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Opisujemy tworzenie szczurzego modelu umiarkowanego przemodelowania wywołanego przeciążeniem ciśnieniem i wczesnej dysfunkcji skurczowej, gdzie aktywowane są szlaki transdukcji sygnału zaangażowane w inicjację procesu przebudowy. Ten model zwierzęcy pomoże w identyfikacji celów molekularnych do zastosowania wczesnych strategii terapeutycznych zapobiegających przebudowie niewydolności serca.

Szczurzy model przeciążenia ciśnieniem wywołał umiarkowaną przebudowę i dysfunkcję skurczową, w przeciwieństwie do jawnej skurczowej niewydolności serca

Obecny protokół opisuje krok po kroku procedurę tworzenia modelu miniświni niewydolności serca z zachowaną frakcją wyrzutową przy użyciu zstępującego zwężenia aorty. Przedstawiono również metody oceny morfologii, histologii i funkcji tego modelu choroby serca.

Chirurgiczny model niewydolności serca z zachowaną frakcją wyrzutową u tybetańskich świnek miniaturowych

Obecny protokół opisuje uzyskanie zależności ciśnienie-objętość poprzez stymulację przezprzełykową, co służy jako cenne narzędzie do oceny funkcji rozkurczowej w mysich modelach niewydolności serca.

Kontrolowana stymulacja procedura oceny funkcji rozkurczowych zależnych od częstości akcji serca w modelach mysiej niewydolności serca

Ten protokół przedstawia metodę wywoływania kardiomiopatii cukrzycowej poprzez połączenie diety wysokotłuszczowej i wstrzykiwania streptozotocyny. Podejście to ma na celu zapewnienie wiarygodnych ram dla badań naukowych nad kardiomiopatią cukrzycową oraz zbadanie potencjalnych możliwości zastosowań leczenia klinicznego.

Modelowanie i ocena modelu mysiej kardiomiopatii cukrzycowej

Opisano metodę transferu genów w leczeniu niedokrwiennej niewydolności serca z wykorzystaniem modelu zawału mięśnia sercowego u świń. Nasza prosta i powtarzalna metoda pozwala na łatwą ocenę skuteczności różnych transferów genów w sposób bardzo prosty i odtwarzalny.

Transfer genów w przedklinicznym modelu niedokrwiennej niewydolności serca

Mysi model gojenia się ran skórnych, który może być używany do oceny związków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Mysi model gojenia się ran

Poznaj mysi model niewydolności serca z zachowaną frakcją wyrzutową wywołanej hiperlipidemią. Badanie wykorzystuje wektor AAV9 i poloksamer-407 do indukcji lipotoksyczności oraz echokardiografię do oceny funkcji serca.

Mysi model niewydolności serca wywołanej hiperlipidemią z zachowaną frakcją wyrzutową

Przeglądaj więcej filmów