Dynamika cAMP w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego detektora różnic cAMP in situ
22 marca 2024
Protokół przedstawiony w tym badaniu ilustruje skuteczność detektora różnic cAMP In Situ w pomiarze cAMP za pomocą dwóch metod. Jedna z metod wykorzystuje 96-dołkowy spektrofotometr do odczytu płytek z ogniwami HEK-293. Druga metoda polega na demonstracji pojedynczych komórek HASM pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Służymy organizacji mikrodomen kolarskich KP z naciskiem na wyjaśnienie, w jaki sposób te przedziały są tworzone i utrzymywane. Staramy się odkryć kluczowe komponenty, które umożliwiają komórkom rozpoznawanie sygnałów przestrzennych w tych domenach, badając różnice w ich interpretacji i sposób, w jaki te cechy są zmieniane w chorobach takich jak astma i POChP. Infekowanie komórek pierwotnych za pomocą wektora Beckmana jest trudne.
W tym celu warunek powinien być zoptymalizowany pod kątem indywidualnego typu komórki, aby osiągnąć wystarczającą ekspresję biosensora cAMP. Protokół ten umożliwia wykrywanie i monitorowanie w czasie rzeczywistym w zakresie od minut do godzin oraz pomiar dynamiki cyklo cAMP P w żywych komórkach. Ten bioczujnik ma wysoką swoistość w przestrzeganiu cyklo cAMP P. W związku z tym sygnały generowane przez ten test bezpośrednio korelują z poziomami cyklo cAMP P, znacznie zmniejszając potencjalne zakłócenia ze strony innych składników komórkowych i zapewniając wiarygodne wyniki.
Na początek uzyskaj hodowlę mięśni gładkich ludzkich dróg oddechowych lub komórek HASM. Za pomocą pipety serologicznej usunąć i wyrzucić pożywkę HASM z kolby hodowlanej. Aby umyć komórki, dodaj pięć mililitrów wolnego od magnezu i wapnia Delbecos PBS lub DPBS, podgrzanego do 37 stopni Celsjusza i delikatnie przechyl kolbę.
W celu odłączenia komórek dodaj trzy mililitry 0,25% trypsyny EDTA i inkubuj komórki przez trzy do pięciu minut. Po dodaniu pięciu mililitrów świeżej pożywki zawierającej antybiotyki, przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 200 G przez pięć minut. Usunąć supernatant i delikatnie dodać 500 mikrolitrów DPBS bez magnezu i wapnia wzdłuż ścianki probówki.
Po usunięciu płynu policz komórki mikroskopijnie, aby dostosować gęstość komórek do 40 000 komórek na mililitr. Przygotuj mieszankę wzorcową zawierającą wektor, odczynniki i wymaganą liczbę komórek. Dozuj 500 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdej studzienki 35-milimetrowego naczynia i inkubuj ją.
Drugiego dnia ostrożnie odessaj pożywkę z każdej studzienki i dodaj 450 mikrolitrów DPBS zawierającego magnez i wapń, wstępnie podgrzanych do 37 stopni Celsjusza. Zawiń płytkę hodowlaną w folię aluminiową i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut do godziny. Mikroskopowo sprawdź stan zdrowia komórek i wykonaj seryjne rozcieńczenia, aby przygotować 100 mikromolowych forskoliny i 100 nanomolowych izoproterenolu do leczenia farmakologicznego.
Na początek posiew, wektor przekształcił ludzkie mięśnie gładkie dróg oddechowych lub komórki HASM. Do obrazowania włącz centralny koncentrator i odwrócony mikroskop fluorescencyjny. Uruchom wyznaczone oprogramowanie i wybierz funkcję przechwytywania poklatkowego do nagrywania.
Zamontuj naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu. Korzystając z automatycznego ustawiania ostrości i automatycznej jasności, uzyskaj obraz poszczególnych komórek. Dostosuj balans czerni i długość fali wzbudzenia.
Następnie kliknij autofokus. Po znalezieniu obszaru view z kilkoma cytoplazmatycznymi komórkami fluorescencyjnymi, ustaw przechwytywanie poklatkowe na 30 sekund, co daje łączny okres 20 minut. Następnie kliknij OK, aby rozpocząć pobieranie danych.
Po trzech minutach delikatnie dodaj 50 mikrolitrów leku do odpowiedniej studzienki i pozwól eksperymentowi trwać jeszcze przez 17 minut. Otwórz pliki obrazów przechwycone podczas eksperymentu. Za pomocą narzędzia wielokąta lub okręgu wybierz obszar zainteresowania każdej komórki i przeprowadź analizę.
Następnie otwórz przeanalizowane dane w arkuszu Excela i oblicz średnią jasność dla każdego stanu na każdym zdjęciu, zaczynając od zdjęcia tuż przed dodaniem środka farmakologicznego. Po obliczeniu zmiany fluorescencji od początkowej fluorescencji dla każdej średniej wartości w każdym warunku, załaduj wartości do oprogramowania do analizy statystycznej i wykreśl deltę F przez F zero w funkcji czasu w sekundach. W porównaniu z grupą kontrolną, obserwowany spadek intensywności fluorescencji w czasie zaobserwowano po stymulacji komórek HASM 10 mikromolową forskoliną i 10 nanomolowym izoproterenolem.
Przegląd
To badanie przedstawia protokół pomiaru poziomów cAMP przy użyciu detektora różnic cAMP In Situ. Prezentuje dwie metody: jedną z wykorzystaniem spektrofotometru do odczytu płytek 96-dołkowych z komórkami HEK-293 i drugą z wykorzystaniem pojedynczych komórek HASM pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Transdukcja sygnału
Tło
- Rozumienie dynamiki cAMP jest kluczowe dla wyjaśnienia sygnalizacji komórkowej.
- Badanie koncentruje się na tym, jak komórki interpretują sygnały przestrzenne w mikrodomenach.
- Zmiany w tych procesach są związane z chorobami takimi jak astma i POChP.
- Istnieją wyzwania w optymalizacji warunków dla infekcji komórek pierwotnych.
Cel badania
- Rozwój niezawodnej metody do wykrywania poziomów cAMP w czasie rzeczywistym.
- Badanie dynamiki cyclo cAMP P w żywych komórkach.
- Zmniejszenie ingerencji innych komponentów komórkowych w pomiarach.
Stosowane metody
- Wykorzystanie spektrofotometru do odczytu płytek 96-dołkowych.
- Mikroskopia fluorescencyjna do analizy pojedynczych komórek.
- Zastosowanie biosensora cAMP o wysokiej specyficzności.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki cAMP przez kilka minut do godzin.
Główne wyniki
- Biosensor cAMP zapewnia niezawodne wyniki korelujące z poziomem cyclo cAMP P.
- Wysoka specyficzność minimalizuje ingerencję innych komponentów komórkowych.
- Ustanowiono efektywne techniki pomiaru zarówno dla komórek HEK-293 jak i HASM.
- Uzyskano wgląd w mechanizmy sygnalizacji przestrzennej w komórkach.
Wnioski
- Protokół poprawia rozumienie sygnalizacji cAMP w różnych typach komórek.
- Stanowi podstawę dla przyszłych badań nad reakcjami komórkowymi w chorobach.
- Metody mogą być adaptowane dla różnych warunków eksperymentalnych i typów komórek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Real-time quantification of cAMP dynamics in live cells is critical for de-risking early discovery and validating signaling targets in disease-relevant systems. The cADDis biosensor enables continuous, quantitative measurement of cAMP in both immortalized and primary cells, supporting predictive confidence in pathway interrogation. This capability strengthens portfolio triage by providing robust, reproducible data on intracellular signaling events relevant to respiratory and other disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cAMP signaling pathways in live, disease-relevant cells.
- Supports mechanistic de-risking by providing real-time, quantitative readouts of pathway activation.
- Facilitates functional target validation through dynamic monitoring of cellular responses to pharmacological agents.
- Improves predictive confidence for advancing targets with validated signaling mechanisms.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, plate-based quantification of cAMP for compound screening campaigns.
- Standardizes assay outputs with robust, reproducible fluorescence measurements across cell types.
- Enables rapid comparison of compound effects on cAMP dynamics in both population and single-cell formats.
- Supports scalable assay development for screening and lead identification workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cAMP signaling measurements with disease-relevant primary cell models, such as HASM cells.
- Provides translational continuity from discovery through preclinical validation by enabling single-cell and population-level analyses.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, real-time pathway data.
- Supports biomarker alignment for respiratory and other disease indications where cAMP signaling is implicated.
Pipeline & Workflow Integration
The cADDis biosensor integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, screening, and translational research in live cell systems.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through real-time cAMP quantification.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for high-throughput compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative fluorescence outputs and statistical analysis of cAMP dynamics across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation in primary human cell models.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, reusable platform for diverse cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cAMP assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust pathway data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and fluorescence assay development.
- Needs access to plate readers and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell culture and assay protocols.
- Adaptable to both immortalized and primary cell systems with protocol optimization.
- Dependent on reliable vector delivery and expression in target cell types.
